Nghiên cứu tính Đồng thuận của phương pháp line probe assay và bactec mgit trong xác Định tính kháng isoniazid và rifampicin tại bệnh viện phổi trung Ương

Nghiên cứu tính Đồng thuận của phương pháp line probe assay và bactec mgit trong xác Định tính kháng isoniazid và rifampicin tại bệnh viện phổi trung Ương

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt qu tr nh h t p v ho n th nh lu n v n n y, t i nh n ư s hư ng n, gi p ủ th y v n ng nghiệp iệt v i l ng k nh tr ng v iết ơn v ùng sâu sắ , t i xin hân th nh gửi lời ảm ơn ến PGS TS Nguyễn V n Hưng – Nguyên trưởng kho Vi sinh v L o l o huẩn Quố gi , Bệnh viện Phổi Trung ương, Trưởng Bộ m n Vi sinh y h v Kiểm so t nhiễm khuẩn trường i h Y Dư , i h Quố gi H Nội - người Th y truyền ảm hứng v ho t i những kinh nghiệm quý u trong nghiên ứu kho h , hết l ng y ỗ, kh h lệ, gi p t i ho n th nh lu n v n n y

T i xin y tỏ l ng iết ơn sâu sắ t i TS Tr n Thị Th nh Huyền khoa Sinh h - Trường i h Kho h T nhiên - HQGHN t n t nh góp ý, hỉ ảo ho t i những kiến thứ , kinh nghiệm ể ho n th nh nghiên ứu n y

T i ũng xin hân th nh ảm ơn n ộ ph ng xét nghiệm kh ng sinh l o, ph ng Sinh h phân tử, t p thể kho Vi sinh v L o l o huẩn Quố gi - Bệnh viện Phổi Trung ương gi p , ộng viên v kh h lệ t i rất nhiều trong suốt thời gi n th hiện lu n v n th sĩ

T i ũng xin hân th nh ảm ơn th y gi o trong Bộ m n Vi sinh v t h v th y thuộ Kho Sinh h , Trường i h Kho h T nhiên, i h Quố gi H Nội m ng ến kiến thứ quý u v t o iều kiện thu n l i ho t i ư h t p, nghiên ứu t i trường

S u ùng, t i xin y tỏ l ng iết ơn ến gi nh, người thân v n luôn sát cánh ộng viên, kh h lệ v gi p t i ho n th nh lu n v n tốt nghiệp n y

T i xin hân th nh ảm ơn tất ả những s gi p qu u ó!

Hà Nội, ngày tháng năm 2023

H viên

Lê Thị Nguyệt

LỜI CAM ĐOAN Tôi là Lê Thị Nguyệt, h c viên Cao h c K28, Trường i h c Khoa h c T

nhiên- i h c Quốc gia Hà Nội, khoa Sinh h c chuyên ngành Vi sinh v t h c, xin m o n:

1 ây l lu n v n o ản thân tôi tr c tiếp th c hiện ư i s hư ng d n của PGS TS Nguyên V n Hưng và TS Tr n Thị Thanh Huyền

2 Công trình này không trùng l p v i bất kỳ nghiên cứu n o kh ư c công bố t i Việt Nam

3 Các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn chính xác, trung th c và kh h qu n, ư c xác nh n và chấp nh n củ ơ sở nghiên cứu

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trư c pháp lu t về những cam kết này

T i xin m o n, ây l ng tr nh nghiên ứu kho h ủ riêng t i ư i s hư ng n ủ PGS.TS Nguyễn V n Hưng v TS Tr n Thị Th nh Huyền Các số liệu, kết quả trong lu n v n l trung th v hư từng ư i ng ố trong ất kỳ ng tr nh n o kh

H viên

Lê Thị Nguyệt

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

Chương 1-TỔNG QUAN 3

1.1.BỆNH LAO 3

1.1.1 Vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis 3

1.1.2 Tình hình bệnh lao trên thế gi i và t i Việt Nam 6

1.2.LAO KHÁNG THUỐC 7

1.2.1 Lao kháng Rifampicin 9

1.2.2 Lao kháng Isoniazid 13

1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU LAO KHÁNG THUỐC 16

1.3.1 Nghiên cứu trên Thế gi i 16

1.3.2 Nghiên cứu t i Việt Nam 18

1 4 CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN OÁN LAO KHÁNG THUỐC 19

1.4.1 Các phương pháp x ịnh kiểu hi nh 20

1.4.2 Các phương pháp x ịnh ột biến gen liên qu n ến tính kháng thuốc 20

Chương 2- VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2 1 ối tư ng nghiên cứu 26

2.1.1 Tiêu chuẩn l a ch n 26

2.1.2 Tiêu chuẩn lo i trừ 26

2 2 ị iểm, thời gian nghiên cứu 26

2.3 V t liệu – Thiết bị và hóa chất nghiên cứu 26

2.3.1 V t liệu nghiên cứu 26

2.3.2 Thiết bị dùng trong nghiên cứu 27

2.3.3 Hóa chất/Sinh phẩm 27

2.4 C m u 28

2 5 Phương ph p nghiên ứu 29

2.5.1 Kỹ thu t MTB kháng thuố h ng 1 trên m i trường lỏng BACTEC MGIT 29

2.5.2 Kỹ thu t MTB kh ng LPA (Line Pro e Ass y) 30

2.5.3 Kỹ thu t M tuberculosis kháng thuốc giải trình t gen h (Deeplex) 31

2.5.4 Kỹ thu t MTB ịnh danh và kháng Rifampicin Xpert 31

2.5.5 Kỹ thu t MTB ịnh danh và siêu kháng Xpert 32

2 5 6 Sơ nghiên cứu: 34

2.6 Các biện pháp h n chế sai số 352 7 o ức trong nghiên cứu 35

Chương 3- KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36

3.1 X ịnh tỉ lệ ng thu n củ phương ph p Line Pro e Ass y (kỹ thu t MTBDR Plus)

v BACTEC MGIT 960 trong x ịnh tính kháng Isoniazid và Rifampicin 363.1.1.Kết quả x ịnh tính kháng INH 363.1.2 Kết quả x ịnh tính kháng RMP 403.2 nh gi kết quả kh ng ng thu n giữ phương ph p Line Pro e Ass y v BACTEC MGIT trong x ịnh tính kháng Isoniazid và Rifampicin 433 2 1 nh gi 5 chủng kh ng tương ng tính kháng INH giữ 2 phương ph p LPA v KS : 463 2 2 nh gi 7 hủng kh ng tương ng tính kháng RMP giữ phương ph p LPA v KS 52

KẾT LUẬN, KHUYẾN NGHỊ VÀ KIẾN NGHỊ 61TÀI LIỆU THAM KHẢO………66

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AMK : Amikacin

AFB : Acid-fast bacilli (Tr khuẩn kh ng xit)

BDQ : Bedaquiline

BACTEC-MGIT :Bacteria technology- Mycobacterial growth indicator tubes (Môi

trường lỏng ấy Mycobacterium tuberculosis trên hệ thống BACTEC 960)

CAP : Capreomycin

CLO : Clofazimine

CTCLQG : Chương tr nh hống l o Quố Gi EMB : Ethambutol

ETH : Ethionamide

FLQ : Fluoroquinolones GTT : Giải tr nh t

KAN : Kanamycin

RMP : Rifampicin RIF : Rifampicin SOP : Standard Operating Proceduce (Quy tr nh th h nh huẩn ) STM : Streptomycin

TB: : Tuberculosis ( ệnh l o) WHO : Tổ hứ y tế Thế gi i (World Health Organization) XDR-TB : Extremely Drug-Resistant Tuberculosis (Bệnh l o siêu kh ng thuố )

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1 1 C ột iến gen liên qu n t nh kh ng thuố v thuố hống l o x ịnh ằng phương ph p Giải tr nh t Deeplex My -TB

Bảng 1 2 C nền tảng h y giải tr nh t thế hệ m i Bảng 1.3 So s nh phương ph p trong hẩn o n l o kh ng thuố Bảng 3.1 Phân lo i kết quả kháng INH bằng phương ph p LPA Bảng 3.2 kết quả INH th c hiện so sánh 2 phương ph p xét nghiệm

Bảng 3.3 Số liệu so sánh kết quả RMP giữ 2 phương ph p

Bảng 3.4 Danh sách các bệnh nhân có kết quả kh ng ng thu n giữ 2 phương pháp

Bảng 3.5 Tổng h p kết quả xét nghiệm của các m u kh ng tương ng tính kháng INH và RMP giữ phương ph p LPA v KS

Bảng PL1 1 Chuẩn ị thuố hống l o từ ộ kit Bảng PL1 2 Th hiện kh ng sinh thuố l o h ng 1 Bảng PL1 3 Quy ịnh o o kết quả kh ng sinh l o BACTEC MGIT Bảng PL2.1 C h ph ung ị h khử t p

Bảng PL2 2 Chu kỳ nhân gen th hiện LPA

Bảng PL2 3 C iểm m u ho ng i v ột iến trên gen rpoB Bảng PL2 4 C iểm m u ho ng i v ột iến trên gen katG Bảng PL2 5 C iểm m u ho ng i v ột iến trên gen inhA

Bảng PL2 6 Diễn giải kết quả LPA Bảng PL3 1 Sơ m u huẩn ị mix th hiện giải tr nh t Bảng PL3 2 Chu tr nh nhiệt th hiện Giải tr nh t

Bảng PL3.3 Ví dụ mã hóa chuẩn bị m u DNA Bảng PL3.4 Chuẩn bị phản ứng PCR gắn chỉ thị Index Bảng PL3.5 Chu trình nhiệt nhân gen gắn chỉ thị Bảng PL3.6 Công thức trộn thư viện m u v thư viện phiX Bảng PL3 7 Phiên giải t nh kh ng thuố kỹ thu t giải tr nh t

Bảng PL5.1 Các kết quả có thể xảy ra trong xét nghiệm Xpert MTB/XDR Bảng PL5.2 Kết quả về s có m t của MTB

Bảng PL5.3 kết quả về tính kháng các thuốc

DANH MỤC CÁC HÌNH

H nh 1 1 Vi khuẩn l o kh ng xit - AFB ư nhuộm ằng phương ph p Ziehl - Neelsen

H nh 1 2 Vi khuẩn l o kh ng xit - AFB ư nhuộm ằng huỳnh qu ng Aur mine

Hình 1.3 Cấu t o th nh tế bào của M tuberculosis

Hình 1.4 C ng thứ ấu t o ủ rif mpi in Hình 1.5 Cấu tr tinh thể kết kết giữ rif mpi in v ARN polymer se

Hình 1.6 Tr nh t nu leoti e trên o n “hot – spot” ủ gen rpoB

Hình 2.1 Vùng x ịnh t nh kh ng RMP 81bp trên gen rpoB

Hình 3.1: Tính kháng INH sử dụng phương ph p LPA Hình 3.2 Phân lo i kết quả kháng INH bằng phương ph p LPA Hình 3.3 Số lư ng và tỷ lệ các lo i kết quả kh ng sinh trên thuốc INH Hình 3.4 Kết quả kháng INH bằng 2 phương ph p A v tỷ lệ ng thu n Hình 3.5 Kết quả và tỷ lệ kháng RIF bằng phương ph p LPA

Hình 3.6 Số lư ng và tỷ lệ kết quả RMP sử dụng phương ph p KS Hình 3.7 Số lư ng và tỷ lệ các kết quả RMP khi so sánh 2 phương pháp Hình 3.8 Hình ảnh các chủng ư c cấy truyền trên m i trường LJ (Lowenstein Jensen)

Hình 3.9 Hình ảnh các m u ư c cấy truyền trên m i trường lỏng BACTEC MGIT

Hình 3.10 Kết quả giải trình t m u 2302002303 do kết quả INH kháng t i KatG,

KS nh y INH Hình 3.11 Kết quả Xpert MTB/XDR m u 2302002303: LPA kh ng INH, KS nh y INH

Hình 3.12 Kết quả giải trình t m u 2302002191: LPA kháng INH t i InhA, KS

nh y INH Hình 3.13 Kết quả Xpert MTB-XDR m u 2302002191: LPA kh ng INH, KS nh y INH

Hình 3.14 Kết quả giải trình t chủng PID 2307010642: LPA nh y INH, KS kháng INH

Hình 3.15 Kết quả Xpert MTB/XDR chủng 2307010642: LPA nh y INH, KS kháng INH

Hình 3.16 Kết quả GTT chủng PID 2011003319: LPA nh y INH, KS kh ng INH Hình 3.17: Kết quả Xpert MTB/XDR m u PID: 2011003319: LPA nh y INH, KS kháng INH

Hình 3.18 Kết quả GTT chủng PID 2304004938: LPA nh y INH, KS kh ng INH Hình 3.19 Kết quả Xpert MTB/XDR chủng PID: 2304004938: LPA nh y INH, KS kh ng INH

Hình 3.20 Kết quả GTT chủng PID: 2302010670: LPA nh y RMP, KS kh ng RMP

Hình 3.21 Kết quả Xpert MTB/RIF chủng PID: 2302010670: LPA nh y RMP và KS kh ng RMP

Hình 3.22 Kết quả GTT m u PID: 2305006492: LPA nh y RMP, KS kh ng RMP Hình 3.23 Kết quả Xpert MTB/RIF m u PID: 2305006492: LPA nh y RMP và KS kh ng RMP

Hình 3.24 Kết quả GTT m u PID:2306002500: LPA kh ng RMP, KS nh y RMP Hình 3.25 Kết quả Xpert MTB/RIF m u PID: 2306002500: LPA kh ng RMP, KS nh y RMP

Hình 3.26 Kết quả GTT m u PID: 2307010532: LPA kh ng RMP, KS nh y RMP Hình 3.27 Kết quả Xpert MTB/RIF m u PID: 2307010532: LPA kh ng RMP, KS nh y RMP

Hình 3.28 Kết quả GTT m u PID: 2306007199: LPA kh ng RMP, KS nh y RMP

Hình 3.29 Kết quả Xpert MTB/RIF m u PID: 2306007199: LPA kh ng RMP, KS nh y RMP

Hình 3.30 Kết quả GTT m u PID: 2307005596: LPA kh ng RMP, KS nh y RMP Hình 3.31 Kết quả Xpert MTB/RIF m u PID: 2307005596: LPA kh ng RMP, KS nh y RMP

H nh PL2 1: L i sản phẩm PCR v i th nh STRIP Hình PL2.2 C ng t n hiệu trên thanh STRIP H nh PL3 1 C ƣ nh n ịnh kết quả giả tr nh t H nh PL3 2 Th ng tin kết quả giải tr nh t

Hình PL4.1 Mã code trên cartridge Hình PL4.2 t rtri ge v o kho ng mo ule Hình PL4.3 Hiển thị kết quả xét nghiệm Xpert MTB/RIFHình PL4.5 B o o kết quả xét nghiệm Xpert MTB/RIF Hình PL5.1 Ghi m ệnh nhân ph ên rtri ge

Hình PL5.2 H t m u ến v h hi trên pipet Hình PL5.3 Nhả m u v o rtri ge

Hình PL5.4 M n h nh t o xét nghiệm Xpert MTB/XDR Hình PL5.5 Gi o iện kết quả trên ph n mềm GeneXpert

MỞ ĐẦU

Theo tổ hứ y tế thế gi i bệnh l o (TB) l một ệnh truyền nhiễm nguy hiểm v l một trong những nguyên nhân h ng u gây tử vong o một t nhân truyền nhiễm trên to n thế gi i Từ khi xảy r i ị h Covi -19, t nh ến n m 2022 ệnh l o l ệnh truyền nhiễm ó tỷ lệ tử vong o thứ 2 hỉ xếp s u ovi v trư HIV/AIDS [67]

Ư t nh n m 2022 ó khoảng 10,6 triệu người mắ ệnh l o trên to n thế gi i, trong ó 5,8 triệu l n m gi i, 3,5 triệu l nữ gi i và 1,3 triệu triệu người l trẻ em Số người sống hung v i HIV hiếm 6,3% tổng số ệnh nhân l o, có 410.000 người mắ l o kh ng thuố ho l o kh ng Rif mpi in v tỉ lệ iều trị khỏi hỉ hiếm khoảng 63% trong số ệnh nhân l o kh ng ho kh ng Rif mi in Tỷ lệ mắ ệnh l o ( m i trên 100 000 ân/n m) t ng 3,9% giữ n m 2020 v 2022 N m 2022 trên thế gi i ó khoảng 1,3 triệu người hết v ệnh l o, trong ó ó 167.000 trường h p ng nhiễm HIV

Mỗi ng y, trên thế gi i ó khoảng 4 000 người tử vong v g n 30 000 người mắ ệnh n y Trong ó vấn ề l o kh ng thuố l mối e o nghiêm tr ng ối v i ngành Y tế ng ộng

Việt Nam là một trong 30 nư ó g nh n ng ệnh l o v l o kh ng thuố o nhất thế gi i Chỉ t nh riêng 2021 ó 169 000 người mắ ệnh l o v trên 12 000 người hết v ệnh l o [67].Việ xuất hiện hủng l o kh ng thuố l vấn ề ng qu n ng i v ng ư Chương tr nh Chống l o iệt qu n tâm Lao kh ng thuố ng ảnh hưởng l n ho ộng ng v to n ng nh y tế M ù nắm v i tr tiên phong trong việ p ụng tiếp n m i, phương ph p hẩn o n, iều trị ệnh nhân trong những n m qu , v n hỉ ó hư ến 60% số ệnh nhân l o kh ng thuố ư iều trị T ng ường m ng lư i hẩn o n, v n ng l quản lý ệnh nhân l o kh ng thuố ở tất ả ấp t i Việt N m l một vấn ề ưu tiên

T i Bệnh viện Phổi Trung ương hiện ng triển kh i nhiều xét nghiệm như: nu i ấy v kh ng sinh vi khuẩn l o trên m i trường lỏng BACTEC MGIT 960

(thời gi n th hiện khoảng 2-3 tu n ối v i m u ó hủng nu i ấy), KS trên m i trường LJ v xét nghiệm sinh h phân tử ó ộ nh y o như MTB

ịnh nh TRCReady, GeneXpert MTB/RIF, Xpert MTB/XDR, LPA MTBDRplus và LPA MTBDRsl (phương ph p LPA v i thời gi n trả kết quả từ 24-36 giờ v th

hiện ư trên m u ệnh phẩm v hủng s u nu i ấy )… xét nghiệm sinh h phân tử giúp x ịnh nhanh, chính xác t nh tr ng mắ l o v x ịnh t nh kh ng thuố ủ vi khuẩn l o góp ph n r t ngắn thời gi n trả kết quả v hỗ tr iều trị l o kh ng thuố

Việ kiểm so t t nh tr ng kh ng thuố , giảm khả n ng lây nhiễm v t ng ường hiệu quả iều trị l o ối v i ệnh nhân lao kh ng thuố MDR-RR TB, n l h n phương ph p xét nghiệm ó khả n ng ph t hiện ệnh nhân kh ng thuố MDR-RR TB ũng như x ịnh tính kháng Isoniazid – INH và kháng Rifampicin - RMP một h nh nh hóng v y phương ph p sinh h phân tử n ư ưu tiên th hiện th y thế phương ph p KS thông thường V v y h ng t i tiến h nh

nghiên ứu ề t i: “ Nghiên cứu tính đồng thuận của phương pháp Line Probe

Assay và BACTEC MGIT trong xác định tính kháng Isoniazid và Rifampicin tại bệnh viện Phổi Trung ương” v i h i mục tiêu:

1 X ịnh tỉ lệ ng thu n củ phương ph p Line Probe Assay (kỹ

thu t Genotype MTBDRplus) và BACTEC MGIT 960 trong x ịnh tính kháng Isoniazid và Rifampicin t i bệnh viện Phổi Trung ương 9 th ng u n m 2023

2 nh gi kết quả kh ng ng thu n giữa phương ph p Line Probe

Assay và BACTEC MGIT trong x ịnh tính kháng Isoniazid và Rifampicin

Chương 1-TỔNG QUAN 1.1 BỆNH LAO

1.1.1 Vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis

Bệnh l o ó từ rất lâu ời Từ thời Ai C p ổ i, ệnh l o ư ph t hiện nhờ t m thấy những ấu t h l o xương trên x ư p khi kh i qu t Dư i thời Hippo r tes, ệnh l o ư m tả l ệnh kéo i trở n ng v o mù ng, l m h o m n ơ thể n ến i hết ho người ệnh Trư thế kỷ XIV, ở Châu Âu ấu t h

về ệnh l o ũng ư t m thấy trên ộ xương người [22] Vi khuẩn l o - Mycobacterium tuberculosis l n nguyên gây ệnh l o, l n u tiên ư sỹ

người ứ - Ro ert Ko h phân l p v o o ng y 24/3/1882 [22], mở u ho uộ hiến hống l i n ệnh một thời gây nên i ị h ho nhân lo i trên to n u [22]

Mycobacterium tuberculosis thuộ gi i Bacteria, ngành Actinobacteria, ộ

Actinomycetales, h Mycobacteriaceae, giống Mycobacterium [6, 17]

Mycobacterium ư chia làm 2 nhóm: M tuberculosis complex g m mười loài ó khả n ng gây ệnh ở người [24], và nhóm Mycobacteria other than tuberculosis

(Non-tuberculous mycobacteria và Mycobacterium leprae) g m nhiều lo i kh ng gây ệnh ở người [45, 51]

Tr khuẩn l o M tuberculosis có kích thư c từ 2 4µm, rộng 0,3

-1,5µm Tế o ng mảnh ứng riêng lẻ ho xếp thành hình chữ N, Y, V,

th nh m ho thành dãy phân nhánh như cành cây M tuberculosis không di

ộng, kh ng sinh bào tử, khó ắt m u v i các thuố nhuộm th ng thường [6, 38, 12]

M tuberculosis là vi khuẩn hiếu khí, phát triển tốt nhất ở nhiệt ộ 37oC và áp suất O2 100mmHg ỉnh phổi và vùng phổi dư i xương n thường ph t hiện lao nhiều nhất v có áp suất O2 từ 120 - 130 mmHg (khi ứng), kế ến là vùng thân xương và u xương v i áp suất O2 là 100mmHg Lách, gan, dày, th quản ít xuất hiện vi khuẩn lao hơn do p suất O2 thấp Thời gi n p h â n c h i a thế hệ ủ vi khuẩn l o từ 16 - 20 giờ, h m hơn rất nhiều so v i các vi khuẩn kh thời

gian hỉ tính ằng phút Tốc ộ phân chia ch m có thể o tính thẩm thấu ủ th nh tế bào h n chế s hấp thụ hất inh ư ng và liên quan ến tố ộ tổng h p ủ

ribosome Thành tế o củ M tuberculosis có chứ peptidoglycan nhưng chúng không ắ t m u t h u ố n h u ộ m Gram Ở vi khuẩn l o các phân tử lipit gắn v i

thành tế o chứ không phải ác protein hay polysacharide do ó chúng không giữ l i những tinh thể màu tím trong quá trình nhuộm Gram [6, 9, 18]

M tuberculosis ư xác ịnh ư i kính hiển vi khi nhuộm Ziehl –

Neelsen Vi khuẩn v n giữ màu nhuộm sau khi xử lí v i dung ị h axit, nên ư phân lo i là "tr c khuẩn kháng axit" AFB sẽ có m u ỏ tươi trên nền xanh

[7] (Hình 1.1) iểm này rất qu n tr ng ể phát hiện vi khuẩn l o trong các

m u ệnh phẩm Ngoài ra, vi khuẩn l o cũng có thể ư quan sát ư i kính hiển vi huỳnh quang nhuộm auramine [2, 37] AFB sẽ ắt m u v ng s ng trên nền en (Hình 1.2)

Hình 1.1 Vi khuẩn lao kháng axit - AFB được nhuộm bằng phương pháp Ziehl – Neelsen (được chụp tại khoa Vi sinh và Labo lao chuẩn Quốc gia- Bệnh viện

Phổi Trung ương 2023)

Hình 1.2 Vi khuẩn lao kháng axit - AFB được nhuộm huỳnh quang Auramine (được chụp tại khoa Vi sinh và Labo lao chuẩn Quốc gia- Bệnh viện Phổi

Trung ương 2023)

Hình 1.3 Cấu tạo thành tế bào của M tuberculosis [20]

M tuberculosis có cấu t o rất phứ t p nhưng hoàn hảo mà ít vi sinh v t nào có ư (Hình 1.3) Cấu t o M tuberculosis g m cá l p như s u:

- L p trong cùng l m ng sinh hất ó ản hất l phospholipid kép giữ v i tr iều hòa s p suất thẩm thấu Màng còn chứa các protein ấu tr v chức n ng khác th m gi v o ho t ộng sống ủ tế o như các protein truyền tín hiệu, các enzyme, các protein v n huyển… [30, 38]

- L p tiếp theo là peptidoglycan liên kết v i ường arabinose và các phân tử

mycolic acid t o hình th i ổn ịnh cho vi khuẩn Thành tế bào vi khuẩn l o là

cấu trúc phứ t p nhất ư iết ở Prokaryot do có một số thành ph n hóa h và

liên kết chéo ất thường, mứ ộ liên kết giữ peptidoglyc n ở thành tế o M tuberculosis là 70 - 80% trong khi ở vi khuẩn E coli là 20 - 30% [6, 66]

- L p ngoài l l p ư t o nên bởi s liên kết giữ các mycolic acid và các

hất lipid phứ t p ây là ấu tr t o nên ộ tính ủ M tuberculosis và có cấu

tr phứ t p làm t ng khả n ng chống thấm nư của thành tế o vi khuẩn, giúp tr c khuẩn t n t i lâu ở môi trường bên ngoài, hống l i i th o v tế bào miễn ị h [35]

Protein xuyên màng Axit

mycolic

Ph n Ar in n ủ LAM

Ph n lipom nn n ủ LAM Phứ h p

lipi t o

Cơ chế gây bệnh

M tuberculosis xâm nhiễm vào ơ thể phổ iến nhất l qua ường hô hấp,

tiếp ến l qua các ường tiêu hóa, da, kết m mắt Sau khi gây tổn thương tiên

phát, M tuberculosis có thể theo ường h huyết ho ường máu t i ơ qu n

khác gây tổn thương thứ phát Nhiều cơ quan: phổi, th n, màng não, xương, h h,

da ều có thể ị M tuberculosis xâm nh p, nhưng thường ị hơn ả l phổi và vị

trí g p nhiều nhất là ỉnh phổi [7]

1.1.2 Tình hình bệnh lao trên thế giới và tại Việt Nam

Tình hình bệnh lao trên thế giới

Theo o o ủ Tổ hứ Y tế Thế gi i WHO, ư t nh n m 2022 trên to n u ó khoảng 10,6 triệu trường h p mắ ệnh l o trong ó: khoảng 6,5 triệu trường h p l n m gi i, 4,1 triệu trường h p l nữ gi i v 1,3 triệu l trẻ em từ 0-14 tuổi Tỷ lệ mắ ệnh l o t ng 3,6% từ n m 2020 ến n m 2021 o ệnh ị h ovi v n m 2022 ắt u phụ h i như n m 2019 Trên to n u số lư ng người tử vong o l o t ng, khoảng 1,13 triệu trường h p, v i 167.000 ng nhiễm HIV Trong ó 2/3 số tử vong ến từ 8 quố gi : Ấn ộ, In onesi , Trung Quố , Philippin, P kist n, Nigeri , B ngl esh v Cộng h Dân hủ Congo Trên to n u, ư t nh số lư ng người mắ MDR/RR-TB mỗi n m tương ối ổn ịnh từ n m 2015 ến 2020 nhưng ắt u t ng v o 2021 Ư t nh ó 450.000 ca (95% UI: 399 000 – 501 000) MDR/RR-TB m i ư o o v o n m 2021 trên 215 quố gi v vùng l nh thổ, t ng 3 1% so v i n m 2020 Trong ó MDR/RR-TB hiếm 3,6% (95% UI: 2,7–4,4%) mắ m i v hiếm 18% trong số iều trị trư ó v i khoảng 119.000 tử vong o MDR/RR-TB v 20% trường h p tiền siêu kh ng Tỷ lệ mắ MDR/RR-TB khác nhau giữ khu v v quố gi 7 quố gi ó số lư ng MDR/RR-TB o nhất, hiếm 2/3 tổng số mắ trên to n u n m 2021 l : Ấn ộ, Liên B ng Ng , P kist n, Trung Quố , In onesi , Philippin, N m Phi Trong ó, 3 quố gi hiếm 42% MDR/RR-TB trên toàn u l Ấn ộ (26%), Liên Bang Nga (8,5%) và Pakistan (7,9%) Tỷ lệ o nhất (> 50% iều trị trư

ó v i MDR/RR-TB) ư t m thấy ở Liên B ng Ng v một v i nư ng Âu v Trung Á (WHO report 2023) [67]

Tình hình bệnh lao tại Việt Nam

Theo o o ủ tổ hứ Y tế thế gi i n m 2022, Việt N m ó 172 000 người mắ l o trong ó ó 9 200 người mắ l o kh ng thuố : tỉ lệ mắ l o kh ng thuố MDR/RR-TB l khoảng 4,5% trên ối tư ng ệnh nhân l o m i v khoảng 15% trên ệnh nhân iều trị , Chương tr nh hống l o quố gi hiện ph t hiện ư khoảng hơn 102 000 người mắ l o, khoảng 59% ệnh nhân l o ư iều trị v ó khoảng 8% hết o ệnh l o Tuy nhiên, ư s qu n tâm v ủng hộ ho nỗ l trong việ quản lý ệnh l o một h ó hiến lư , Việt n m t ng ường hệ thống hẩn o n v h m só ệnh l o

Theo thống kê t i B o o sơ kết ho t ộng Chương tr nh hống l o Quố gi n m 2023, số ệnh nhân l o ph t hiện n m 2022 l 103.804 trường h p, giảm 38 6% so v i n m 2021 Trong 6 th ng u n m 2023, số mắ m i ư ph t hiện l 51.254 người, trong ó ó 31.705 mắ m i Số lư ng v tỷ lệ tử vong o l o ư t nh l 8.304 (95% UI: 5.190 – 13.494) người, giảm 30,8% so v i n m 2021 Việt N m nằm trong 30 quố gi ó tỷ lệ l o kh ng và kháng Rifampicin o nhất thế gi i v i ư t nh ó 9.200 (95% UI: 5.800 – 13.000) ệnh nhân v o n m 2022, trong ó ó 4,5% nằm trong nhóm số mắ m i v 15% trong nhóm iều trị l i ng thời, Việt N m ũng nằm trong 10 quố gi ó khoảng h giữ số mắ v số ư iều trị l n nhất trên thế gi i ( iều trị hỉ hiếm khoảng 59% trong tổng số mắ ) Do ó, việ t ng tỷ lệ ph t hiện số mắ m i nhằm ư r ph iều trị phù h p, kịp thời l một trong những mụ tiêu hiến lư trong n m 2023 ủ hệ thống y tế nư t [1, 2]

L o kh ng thuố l ệnh l o o M tuberculosis omplex gây r ó khả n ng

kh ng v i ất kỳ một lo i thuố hống l o n o [64, 66] Hiện tư ng kháng thuố ủ vi khuẩn l o xảy ra trư c ho sau khi xâm nh p vào ơ thể người bệnh

Trường h p kháng thuố xảy ra trư khi xâm nh p vào ơ thể người bệnh g i là

kháng thuốc tiên phát (kh ng thuố ở ệnh nhân m i) là hiện tư ng ị lây nhiễm

ởi một hủng kh ng thuố Còn hiện tư ng kháng thuố xảy ra sau khi xâm

nh p vào ơ thể còn g i là kháng thuốc thứ phát (kháng thuốc ở bệnh nhân đã điều trị), thường xảy ra ở trường h p bệnh nhân dùng thuốc hống lao không ng

quy ịnh, kh ng ng liều lư ng và thời gian sử dụng thuốc [49, 27]

Các cơ chế gây ra kháng thuốc bao gồm:

+ Th nh tế o: Th nh tế o ủ M tuberculosis hứ phân tử lipi

phứ t p ho t ộng như một h ng r o ng n h n thuố xâm nh p v o tế o

+ Enzym iến ổi và ất ho t thuố : Bộ gen ủ M tuberculosis mã hóa các

enzym (protein) l m ất ho t phân tử thuố C enzym n y thường l h p hất thuố phosphoryl t, etyl t ho enyl t

+ Hệ thống ẩy thuố r ngo i: Tế o l o hứ hệ thống phân tử hủ ộng ơm phân tử thuố r khỏi tế o

+ ột iến: ột iến tiên ph t trong ộ gen ủ TB ó thể l m th y ổi protein l "mụ tiêu" ủ thuố , l m ho vi khuẩn kh ng thuố

Phân loại lao kháng thuốc [66]

+ Bệnh l o kh ng (MDR) l ệnh l o kh ng v i 2 lo i thuố hống l o Rifampicin và Isoniazid

+ Bệnh l o kh ng Rifampi in l ệnh l o kh ng v i Rifampicin + Bệnh l o kh ng Isoni zi (Hr-TB): l ệnh l o kh ng v i Isoni zi nhưng nh y ảm v i Rifampicin

+ Siêu kh ng thuố (XDR): l những trường h p l o kh ng thuố ho kháng Rifampicin ó kh ng thêm v i ất ứ thuố nào trong nhóm Quinolon và kh ng v i t nhất một lo i thuố hống l o nhóm A (WHO th ng o ịnh nghĩ m i 27 January 2021) [64, 67]

Khoảng 60 n m trư , loài người m i tìm ra thuố hữ lao Giờ ây các hủng lao kháng thuốc xuất hiện và có 3.3 % số ca mắ l o m i và 17% các ca trên thế gi i là các kháng (MDR/RR - TB) [1] N m 2006, ệnh lao siêu

kháng (XDR- TB) ắt u xuất hiện Chủng lao siêu kháng này không hỉ kháng những thuố ở hàng 1 mà n kh ng v i ất ứ thuố n o thuộ nhóm Fluoroquinolone (Ofloxaxin và Moxifloxacin), v kh ng 1 trong 3 lo i thuố tiêm hàng 2 (Amikacin, Capreomycin và Kanamycin) vốn gây ộ h i nhiều hơn cho ệnh nhân cùng v i thời gian iều trị và chi phí ắt ỏ S lây lan ủ lao kháng thuố m nh ƣ tiếp sứ bởi i ị h HIV, hệ thống h m só sứ khỏe ộng ng yếu kém, và s sao lãng iện pháp kiểm so t lây nhiễm [9]

N m 1998, WHO công ố kết quả khảo sát tình hình lao kháng thuốc ở 35 nƣ c và khu v trên thế gi i Theo công ố này tỷ lệ kháng thuố tiên phát trung bình v i riêng từng lo i thuố có khác nhau, ụ thể là: kháng Isoniazid 3,2%, Rifampicin 0,2%, Ethambutol 0,3%, Streptomycin 2,5% Tỷ lệ kháng thuố tiên phát trung bình là 9,9% trong ó kháng 1 thuố chiếm 6,6%, kháng 2 thuố chiếm 2,5%, kháng 3 thuố hiếm 0.6%, 4 thuố là 0,2% kháng thuố trung ình là 1,4% [10]

Tình hình kháng thuốc mắ phải v i từng lo i thuố cũng khác nhau: Kháng Isoniazid trung bình là 6,3%, Rifampicin 0,7%, Ethambutol 0,4%, Streptomycin 2,6% Tỷ lệ kháng thuố trung bình trên thế gi i là 36%, trong ó kh ng 1 lo i thuố 12,2%, 2 lo i thuố là 9,7%, 3 lo i thuố là 5,4%, 4 lo i thuốc là 4,4% Lao kháng thuố mắ phải có tỷ lệ trung bình là 13% [10] Trong nghiên ứu n y, h ng t i t p hung v o l o kh ng thuố v kh ng 2 lo i kh ng sinh phổ iến trong ph iệu trị l o t i Việt N m l Rif mpi in v Isoni zi

1.2.1 Lao kháng Rifampicin

1.2.1.1 Đặc điểm kháng sinh Rifampicin

Rifampicin tên kho h l 3 –[[[4 – methyl – 1 – pipeainyl] imino] methyl], là d n xuất n tổng h p từ rif mpi in B, một lo i kháng sinh do

Streptomyces mediterranei sinh ra [58]

- Rifampicin l thuố ó ho t t nh iệt khuẩn m nh th ng qu ứ hế ho t ộng ủ enzyme RNA polymerase Rif mpi in kh ng ó hiện tƣ ng kh ng thuố héo v i

lo i thuố hữ l o kh N ng ộ ứ hế tối thiểu (MIC) là 0,005– 0,2 µg/ml (invitro)

Hình 1.4 Công thức cấu tạo của rifampicin [28]

RMP l một n xuất ủ rif my in ƣ sử ụng v o n m 1972 nhƣ một hất hống l o ây l một trong thuố kh ng sinh hiệu quả nhất, ƣ sử ụng ùng v i INH trong ph iều trị l o kh ng

Khi xảy r ột iến g n vùng lõi ủ gen rpoB sẽ l m th y ổi ấu tr tiểu

ph n β-su unit ủ RNA polymer se m nó m hó nên l m ho khả n ng kết h p ủ RMP v i tiểu ph n n y giảm i Kết quả l t ụng ủ RMP ối v i

M tuberculosis giảm ho mất i M tuberculosis trở nên kh ng thuố v i Rifampicin [57] Có 90 – 95 % hủng M tuberculosis kh ng RMP ƣ x ịnh l o ột iến trên vùng tr nh t 81 p n y ủ rpoB Nhƣ v y n 5 – 10

C u nối

Vòng napthol

% hủng M tuberculosis kh ng ó ột iến trên vùng gen n y ủ rpoB iều

n y ho thấy n phải x ịnh thêm những ột iến kh trên gen n y ho những gen kh ó liên qu n ể x ịnh h nh x v to n ộ ơ hế kh ng RMP ủ vi khuẩn l o

Theo ng ố ủ WHO trên hơn 38.215 hủng lao phân l p từ m u lâm

s ng th tất ả hủng kh ng RMP ều m ng ột iến gen rpoB [62] H u hết ột

iến xảy r t i vùng quyết ịnh kh ng RMP (RRDR- RIF resistance-determining

region) l một o n tr nh t dài 81- p nằm trên gen rpoB [62] Trên 38.215 hủng

phân l p ph t hiện thấy 24 ột iến liên qu n ến t nh kh ng trong ó o g m 6 ột iến ở vùng r l L430P, D435Y, H445L, H445N, H445S v L452P v 2 ột iến ở ên ngo i vùng RRDR l V170F v , 16 ột iến liên qu n t nh kháng nằm trong vùng RRDR Ngo i r n ph t hiện ư 117 ột iến ư oi l ó liên qu n t i tính kháng RMP theo phân lo i ủ WHO [62]

Hình 1.5 Cấu trúc kết hợp giữa rifampicin và RNA polymerase [28]

1.2.1.3.Gen rpoB với cơ chế kháng thuốc RMP ở M tuberculosis

Gen rpoB l một o n ADN ó k h thư 3519 p, hịu tr h nhiệm m hó

ho tiểu ph n β-su unit ủ ARN polym r se Những ột iến kh ng kh ng sinh rif mpi in thường xảy r trên o n gen n y, trong ó o n thường xảy r ột iến

nhất l o n nằm g n trung tâm ủ gen rpoB, o n n y hỉ ngắn khoảng 81 p

ư gi i h n từ ộ 507 ến 533 – người t g i ây l vùng siêu iến – “hot - spot region” C ột iến xuất hiện trên o n n y o g m: ột iến ở ộ thứ 526, 516, 531 ho kết quả ề kh ng tốt v i rif mpi in; ột iến ở ộ 510, 515,

Tiểu phần β

512 th ho khả n ng kh ng rif mpi in ở mứ ộ thấp hơn Tr nh t nu leoti e trên o n “hot spot” như s u:

507 GGC ACC AGC CAG CTG AGC CAA TTC ATG GAC CAG AAC AAC CCG CTG TCG GGC TTG ACC CAC AAG CGC CGA CTG TCG CGC CTG 533 Mỗi nu leoti e trên o n n y ó thể ị th y thế, ho n ổi vị tr , mất i, thêm v o ể t o r ột iến[38, 58, 50]

Hình 1.6 Trình tự nucleotide trên đoạn “hot – spot” của gen rpoB [44]

Chẩn o n phân tử t nh kh ng Rifampicin l phù h p nhất vì nghiên ứu

hỉ r rằng t nh kh ng thuố l o ột iến ở vùng lõi ủ gen rpoB C phương

ph p phân tử ư sử ụng o g m: tr nh t t ộng tr tiếp vùng h

ư khuế h i ủ gen rpoB Khuế h i vùng h ằng PCR tiếp ó phân t h

t nh h nh s i ơn (SSCP) v khuế h i vùng h ằng PCR s u ó l i m u thẳng v i u oligonu leoti e (INNO-LiPA Rif TB 17 kit, Innogenetics, Zwijnaarde, Belgium) [44]

Một số nghiên ứu hỉ r rằng khoảng 95% hủng M tuberculosis lâm sàng

kháng Rif mpi in m ng ột iến iểm ho ột iến thêm, mất o n trong

vùng lõi 81 p ủ rpoB (mã hoá cho 27 acid amin) ây l mối tương qu n h t

hẽ ủ s th y thế i min iệt v n ng ộ ứ hế tối thiểu (MIC) củ thuố C ột iến ở o on 516/ 526/531 ho kết quả kh ng rif mpi in ở mứ o trong khi ó những s th y ổi i min ở vị tr 514/533 thường ho kết quả kh ng Rif mpi in ở mứ thấp C nghiên ứu trư ó hỉ r rằng 45% hủng ó ột iến ở codon 531 (S531) trong khi 35% hủng kh ng thuố ó s th y ổi

codon 526 (H526) n ến th y thế i min C ột iến n y kh ng ó trong hủng m n ảm [26, 44, 47]

T n số ủ ột iến iệt th y ổi ng kể giữ ộng ng ân tộ v vùng ị lý Tuy nhiên, ơ hế kh ng thuố hư ư x ịnh ở g n 5% hủng lâm s ng kh ng Rif mpi in khi kh ng ó ột iến n o ư ph t hiện ở

vùng lõi 81 p ho các vùng khác trên gen rpoB iều n y ho thấy một ph n nhỏ

ủ hủng kh ng Rif mpi in sẽ kh ng ư ph t hiện ởi phương ph p phân tử so v i thử nghiệm t nh m n ảm thuố kiểu h nh th ng thường [47]

1.2.2 Lao kháng Isoniazid

1.2.2.1 Đặc điểm kháng sinh INH

Isonaizid có tên khoa h c là Isonicotinic acid hydrazide, công thức hóa h c là C8H7N3O và là một trong các lo i thuốc kháng lao m nh nhất, d ng ột màu trắng dễ hòa tan trong nư c N ng ộ ức chế tối thiểu (MIC) 0,02 - 0,2 mg/L

Hình 1.7 Công thức cấu tạo Isoniazid [60]

12.2.2 Cơ chế kháng Isoniazid

INH ư gi i thiệu v o n m 1952 như một hất hống l o ùng v i RMP u tiên, INH i v o tế o ư i ng tiền thuố v ư ho t hó ởi enzyme

catalase peroxidase do gen katG mã hóa [69] S u ó thuố sẽ ứ hế qu tr nh tổng

h p xit my oli th ng qu hất m ng l protein (ACP)-reductase enoyl- yl phụ

thuộ NADH ư m hó ởi gen inhA [55] Việ kh ng thuố n y ó liên qu n ến ột iến ở một số gen như katG, inhA, ahpC, kasA và NDH H i ơ hế phân tử h nh ủ kh ng thuố INH ó liên qu n ến ột iến ở gen katG và inhA ho vùng promoter ủ gen n y ối v i gen inhA, ốn ột iến promoter ủ operon f G1-inhA v ột iến g154 về ph u ủ gen inhA (tứ l g609 trong o on 203 ủ

gen fabG1) ó khả n ng t o r t nh kh ng ở mứ ộ thấp do t o r một promoter th y thế ho inhA [25] ột iến phổ iến nhất ƣ t m thấy ở vị tr −15C/T liên qu n ến khả n ng yếu v i INH ột iến ở gen inhA kh ng hỉ gây kh ng INH m

n kh ng thuố ETO v ó ùng h [27] ột iến phổ iến thứ h i xảy r trong

vùng promoter củ inhA gây t ng ƣờng ho giảm iểu hiện gen n y, ho một ột

iến t i trung tâm ho t ộng l m giảm i l ối v i isoni zi -NAD [23] Một ột

iến trong vùng iều h v một ột iến trong vùng m hó gen inhA ó thể t o r hủng kh ng INH m nh [29] Trên gen katG, ó ột iến S315T, S315N v

W328L liên qu n h t hẽ v i t nh kh ng INH, trong ó ột iến hiếm tỷ lệ o nhất l S315T, hủ yếu l ột iến th y thế nu leoti e ở codon 315 (AGC → ACC ho c AGC → ACA) [69, 25] Ngo i r t nh kh ng ủ INH ũng liên qu n t i ột

iến gen fabG1 và ahpC ột iến ở fabG1, L203L (CTG203CTA) t o r một

promoter m nh gây r s iểu hiện qu mứ ủ gen n y ƣ hứng minh l

gây kháng INH [16] Thêm v o ó, ột iến trên gen ahpC l m t ng iểu hiện ủ

gen này ũng liên qu n t i t nh kh ng INH [59]

1.2.2.3.Gen katG vơ i cơ chế kháng thuốc Isoniazid ở M tuberculosis

Gen katG có kích thƣ c 2223 bp, nằm trên nhiễm sắc thể, mã hóa cho

enzyme catalase – peroxidase (Hình 1.8) Có khoảng 95% các hủng lao kháng Isoniazid mang ột iến trên gen này [13] Enzyme catalase - peroxidase này ho t hóa Isoniazid bằng cách kết h p axyl isonicotinic v i NADH ể t o thành phứ hệ axyl isonicotinic - NADH Phứ hệ này liên kết ch t hẽ v i enzyme

katoenoylreductese (mã hó ởi gen inhA), theo ó làm ng n cản ơ hất enoyl -

AcpM Quá trình này làm ứ hế s tổng h p acid mycolic [15] Cơ chế phân tử của tính kháng Isoniazid chủ yếu có liên qu n ến ột biến thêm/mất o n ho các ột biến nh m nghĩ /vô nghĩ , trong ó chủ yếu diễn ra t i codon 315 và 463 củ gen

katG Nếu ột iến ở se thứ 2 trên codon 315 ủ gen katG (AGC iến thành

ACC hay ACA) sẽ n ến làm giảm ho mất hoàn toàn ho t tính ủ enzyme

catalase – peroxidase, M tuberculosis sẽ trở thành kháng thuốc isoniazid [33] Do

ó ph t hiện s thay ổi di truyền này trong gen katG có thể cung cấp một phương pháp sàng l nhanh và chính xác các chủng M tuberculosis kháng Isoniazid

Hình 1.8 Trình tự nucleotide gen KatG [70]

1.2.2.4 Gen inh với cơ chế kháng thuốc Isoniazid ở M tuberculosis

Gen inhA có kích thư 810 bp [21, 27] m ã h ó a enzyme enoyl - acyl

reductase Enzyme này ho t hóa isoniazid gây ảnh hưởng ến phứ INH – NAD làm ứ hế quá trình sinh tổng h p mycolic acid thành tế bào Isoniazid ư

ho t hóa ởi các peroxidase catalase katG t o thành phứ INH - NAD v phứ n y ị ứ chế ởi enzyme anoyl - acyl reductase inhA Quá trình ứ chế này làm tích

lũy acid béo huỗi dài, ứ hế quá trình tổng h p acid mycolic, và cuối cùng gây tế o hết [27]

Hình 1.9 Trình tự nucleotide gen InhA [70]

N m 2006, Leung v ộng s ph t hiện một ột biến m i có liên quan t i

cơ hế kháng Isoniazid t i vị trí 581 bp trên gen inhA làm thay ổi acid amin

Ile194Thr (ATC > ACC) d n ến enzyme enoyl – acyl reductase ị mất ho t tính

ho làm giảm liên kết ái l ủ gen inhA và NADH, do ó vi khuẩn l o sẽ kháng thuốc Isoniazid (Hình 4) V v y, việ phát hiện s thay ổi di truyền trên gen inhA

có thể cung cấp một phương pháp sàng l nhanh và chính xác cho việ phát hiện

các chủng M tuberculosis kháng Isoniazid [45]

Hình 1.10 Cơ chế kháng thuốc Isoniazid của gen inhA [30]

1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU LAO KHÁNG THUỐC

1.3.1 Nghiên cứu trên Thế giới

T i Ấn ộ th hiện nghiên ứu trên 553 m u ờm từ ối tƣ ng nghi ngờ

MDR ằng kỹ thu t GenoType MTBDRplus assay Kết quả có 181 hủng ( hiếm

32,7%) là kh ng thuố Thiếu WT8 ùng v i ột iến ở o on S531L l ng phổ iến nhất gây ra kháng Rifampicin (65,1%) v mất WT ùng v i ột iến ở

o on S315T1 ủ gen katG l m h nh phổ iến nhất kh ng thuố Isoni zi

(86,2%) [69]

Một nghiên ứu kh t i Ấn ộ nghiên ứu trên tổng số 125 hủng MTB ằng kỹ thu t GenoType® ho thấy ó 120 hủng (96%) l l o kh ng thuố Chỉ có 45 chủng MDR-TB ƣ phân t h về hiệu suất, t n số v m u ột iến ởi

GenoType MTBDRplus ộ nh y ủ xét nghiệm GenoType MDRTBplus phát

Acid mycolic

hiện kh ng ơn Rif mpi in, ơn Isoni zi (N m 2008, Aslan INH) v kh ng thuố tương ứng là 95,8%, 96,3% và 97,7% (P <0,05) [51]

N m 2009, Dalla Costa và cộng s tiến hành xác ịnh các ột iến liên

quan ến tính kháng thuố trên các gen katG, oxyR-ahpC và inhA V i gen katG,

tác giả tiến hành thu th p 160 m u t i 3 nư c thuộ Nam Mỹ có số ệnh nhân mắ lao kháng thuố cao là Brazil, Peru và Argentina T i Br zil tác giả thu ư 4 ng ột biến, bao g m: S315T, S315N, S315I, G258D Trong ó ột iến S315T hiếm tỷ lệ cao nhất, g n 94% T i Peru có 2 ng ột iến l S315T và S315N, trong ó S315T chiếm tỷ lệ l n nhất, g n 91% T i Argentin hỉ g p ng ột iến S315T [30]

N m 2008, Aslan và cộng s tiến hành thu th p 30 m u bệnh phẩm t i nhiều vùng khác nhau t i châu Á ể x ịnh các ột iến liên quan ến tính kháng

thuố trên các gen katG, inhA, rpoB Trong ó 25 m u có liên quan ến tính kháng Isoniazid Tiến hành trình t tác giả thu ư 4 iểm ột iến trên gen katG

T i codon 315 có các ng ột biến: S315T, S315N, S315I, trong ó ng ột iến S315T chiếm tỷ lệ l n, hiếm 72% [ 1 9 ]

N m 2017 Abyot Meaza v ộng s tiến h nh thu th p 274 m u nghi MDR t i Ethiopian Public Health Institute.Th hiện so s nh kết quả phương ph p LPA v KS BACTEC MGIT ho kết quả ộ nh y, ộ hiệu, giá trị o

ương t nh-PPV và giá trị o âm t nh -NPV ủ Genotype MTBDRplus VER

2.0 LPA từ m u ờm soi ương t nh là 96,4%, 100%, 100% v 96,9% ộ nh y,

ộ hiệu, PPV v NPV ủ Genotype MTBDRplus VER 2 0 LPA l n lư t l

77,8%, 97,2%, 82,4% v 97,2% trong ph t hiện MTB từ m u ờm ó kết quả soi âm tính C ột iến phổ iến nhất liên qu n ến kh ng RMP v INH l n lư t l S531L v S315TL Một iều hiếm hoi ph t hiện ột iến (C15T/A16G) kháng INH [48]

N m 2020 Vimal Kumar v ộng s tiến h nh nghiên ứu trên 193 m u ằng

phương ph p Xpert MTB/RIF và LPA, GenoType MTBDRplus v i KS lỏng

BACTEC MGIT 960 cho kết quả tương ứng như s u: ộ nh y v ộ hiệu ủ

GeneXpert trong ph t hiện kh ng thuố Rifampicin là 100% (95%, CI: 88,8–100%) và 99,4% (95% CI: 96,6–99,9%) Trong khi ó ộ nh y v ộ hiệu ủ LPA tương ứng là 94,3% (95% CI: 80,8–99,3%) và 100% (95% CI: 97,7–100%) [42]

1.3.2 Nghiên cứu tại Việt Nam

T i Việt N m, ó kh t nghiên ứu ơ ản về ơ hế phân tử v gen

kh ng thuố ở M tuberculosis ư th hiện, v h u hết ều t p trung v o các

thuố kh ng l o như RMP, INH

- N m 2011 v i ề t i nghiên ứu "Nghiên cứu chẩn đoán lao kháng thuốc isoniazid bằng phương pháp xác định đột biến trên gen katG và gen inhA từ các chủng Mycobacterium tuberculosis phân lập tại Miền Trung - Việt Nam " [8] ư th hiện t i H c viện Quân Y 17 chủng M tuberculosis thu th p từ các ệnh

nhân nhiễm lao ở bệnh viện Trung ương Huế ư tách dòng và giải trình t Kết quả nghiên cứu có 13/17 m u m ng ột biến v i nhiều d ng khác nhau Tỷ lệ ột

iến trên gen katG là g n 77%, tỷ lệ ột iến trên gen inhA g n 40% T i các m u ệnh phẩm ó ột iến th ột biến S315T trên gen katG chiếm tỷ lệ 76% Có 5 m u ệnh phẩm kháng thuố không có ột iến Ile194Thr trên gen inhA liên quan

(88,9%) hủng ó ột iến ở vùng x ịnh kh ng RMP 81-bp (RRDR) trên gen

rpoB Kh ng INH hủ yếu liên qu n ến ột iến S315T ở gen katG (15/17;

88,2%), phù h p v i số liệu ng ố ởi WHO [25]

N m 2018 Trương Thiên Ph v ộng s th hiện nghiên ứu t i ệnh viện

Ch R y so s nh kết quả MTBDRplus v i kết quả kh ng sinh lỏng BACTEC

MGIT Kết quả hỉ r ộ nh y v ộ hiệu trong x ịnh t nh kh ng RMP tương ứng l 96,6% v 99,1%, trong khi ó ộ nh y v ộ hiệu ủ thuố INH tương ứng l 92,1% v 98,2% [13]

G n ây, v o n m 2022, Dương Thị Lo n v ộng s ũng tiến h nh nghiên ứu x ịnh tỷ lệ kh ng thuố ở ệnh nhân l o phổi t i ph t v ph t

hiện ột iến kh ng RMP trong gen rpoB ở C n Thơ, Việt Nam [27, 32] sử ụng kỹ

thu t giải tr nh t to n ộ hệ gen Kết quả hỉ r tỷ lệ kh ng thuố l o phổi l 63,8%

v l o kh ng thuố hiếm 23,2% C ột iến trên gen rpoB hủ yếu l ở o on

531 (27,5%) và 523 (17,5%), ngo i r ó xuất hiện 2 ột iến hiếm g p l S522A (2,5%) và A532P (2,5%) ng h ý ph t hiện ư ột iến th y thế ở o on

532 v hủng l o ột iến ở 7 o on trong gen rpoB [30]

Nghiên ứu m i nhất ủ Nguyễn Thị Lệ Hằng ng v o th ng 7/2023 trên t p h Frontiers in Mi ro iology ph t hiện ư h i ột iến phổ iến nhất trên

gen rpoB l S450L v H445Y v i tỷ lệ tương ứng l 32/87 (36,8%) và 15/87 (17,2

%) trên 295 ệnh nhân l o phổi ư iều trị t i H Nội, Việt N m [43]

C nghiên ứu ư th hiện trư ó ho thấy kh ng thuố ó mối liên qu n m t thiết v i những ột iến gen Nhưng trong nhiều trường h p, ơ hế v v i tr ủ gen liên qu n ến kh ng thuố hư ho n to n ư hiểu iết S phứ t p ủ qu tr nh n y ùng ph t v phổ iến l o kh ng thuố , gây khó kh n trong kiểm so t v ấu tr nh hống l i ệnh truyền nhiễm

1.4 CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN LAO KHÁNG THUỐC

Chẩn o n M tuberculosis kháng thuố trong các phòng thí nghiệm trên thế

gi i hiện nay g m ó 2 phương pháp ó là phương pháp xác ịnh kiểu hình và phương pháp x ịnh ột iến gen kh ng thuố (kiểu gen) Th h thứ l n trong hẩn o n l o kh ng thuố l s khó kh n trong việ x ịnh s m v h nh x

t nh nh y ảm v i thuố kh ng sinh ủ vi khuẩn M tuberculosis nhằm hư ng n

iều trị hiệu quả Một trong những phương ph p truyền thống ư sử ụng ể x ịnh l o kh ng thuố l xét nghiệm ộ nh y ảm ủ vi khuẩn v i thuố kh ng sinh (drug susceptibility testing - DST)

1.4.1 Các phương pháp xác định kiểu hi nh

Các phương pháp xác ịnh kiểu hình thông thường có thể là: Phương pháp xác ịnh tương quan, phương ph p xác ịnh tỷ lệ kháng, phương pháp n ng ộ tuyệt ối

T i Việt N m hiện ng sử ụng phương ph p x ịnh theo tỷ lệ kh ng trên m i trường lỏng BACTEC MGIT v trên m i trường LJ [1,2]

Phương ph p kh ng sinh kiểu h nh ó ộ nh y, mối liên qu n v i lâm s ng tốt v ho phép x ịnh n ng ộ hất ứ hế tối thiểu Tuy nhiên, thường ị h n hế do phụ thuộ v o tố ộ sinh trưởng ủ vi khuẩn l o trong m i trường nu i ấy nên thời gi n ho kết quả lâu (khoảng 1-2 tháng) [2]

Hiện n y, nu i ấy v kh ng sinh kiểu h nh sử ụng hệ thống m y BACTEC MGIT 960 ư sử ụng rộng r i trong ệnh viện, trở th nh tiêu huẩn v ng trong hẩn o n l o kh ng thuố , KS kiểu h nh l xét nghiệm tiên quyết ể ư r ph iều trị ho người ệnh Như c iểm của phương pháp này là thời gian nuôi ấy ể chẩn oán quá dài, ít nhất mất 2 - 4 tu n s u ó th hiện KS mất 2-3 tu n nâng thời gi n hẩn o n kh ng thuố lên t i 4-7 tu n [2] iều này làm cho công tác iều trị và kiểm soát tình hình bệnh lao kháng thuốc còn g p nhiều khó kh n

1.4.2 Các phương pháp xác định đột biến gen liên quan đến tính kháng thuốc

Bên nh phương ph p truyền thống l xét nghiệm phân tử ph t hiện gen liên qu n t i kh ng thuố C xét nghiệm phân tử ph t hiện gen liên qu n t i tính kh ng thuố thông qua ột iến i truyền trên vùng gen hiệu thường ho kết quả nh nh hơn xét nghiệm kh ng sinh kiểu h nh o g m phương ph p như: phân t h trên l i m u (probe-based assays) và phân tích trên tr nh t (sequence-based assays) C phân t h trên l i o g m: LPA (line probe assay) [2, 35] và GeneXpert (Cephei , Mỹ) [2]

Phương ph p LPA ó thể p ụng hệ thống phân tích xét nghiệm kiểu gen

n t ộng MTBDRplus o g m ư : t h hiết ADN, khuế h i PCR m i v l i ngư Phương ph p n y ó thể ph t hiện ột iến trên gen rpoB liên

qu n t i t nh kh ng RMP, trên gen katG và vùng promoter gen inhA liên qu n ến

tính kháng INH [40] Phương ph p LPA ó thể th hiện tr tiếp trên m u ệnh phẩm kh ng n nu i ấy, thời gi n th hiện xét nghiệm hỉ từ 24-36 giờ, kết quả xét nghiệm x ịnh ư ng thời tính kháng INH và RMP

Giải tr nh t gen h sử ụng Deeplex®-MycTB [26] ư WHO hư ng n kỹ thu t sử ụng trong ph t hiện ột iến liên qu n ến kh ng thuố ở vi khuẩn lao từ n m 2018 Phương ph p n y ó thể ph t hiện 18 ột iến liên qu n ến tính kh ng thuố và x ịnh khả n ng kh ng ủ vi khuẩn l o ối v i 13 lo i thuố hống l o o g m (Bảng 1 1): Rifampicin, Isoniazid, Ethionamide, Pyrazinamide,

Fluoroquinolones, Linezolid, Bedaquiline, Clofazimine [31]

Bảng 1.1 Các đột biến gen liên quan tính kháng thuốc và các thuốc chống lao xác định bằng phương pháp Giải trình tự Deeplex Myc-TB [31]

DEEPLEX® MYC-TB, ư ph t triển ởi GenoS reen l một giải ph p t h h p

v s ng t o kh ng n nu i ấy, ó thể ư r hẩn o n về khả n ng kh ng ho t nh nh y ảm ủ một hủng vi khuẩn l o v i 13 lo i thuố hống l o trong v ng hư y 48 giờ Bộ sinh phẩm trên nguyên lý sử ụng ng nghệ Giải tr nh t thế hệ m i [NGS] Tr nh t gene thu ư sẽ ư so s nh v i tr nh t gene th m

khảo ể t m r iến thể iết ó trong ơ sở ữ liệu, từ ó x ịnh ột iến liên qu n ến kh ng ho nh y ảm v i thuố l o

Deeplex® Myc-TB là thiết bị chẩn o n in vitro a trên giải trình t gene h (tNGS), có thể áp dụng tr c tiếp trên các m u bệnh phẩm lâm sàng Việc xét nghiệm d a vào giải trình t của hỗn h p khuế h i 24 plex ể x ịnh ng thời các loài vi khuẩn, kiểu gen và d o n khả n ng kh ng thuốc của các chủng MTBC (Hình 1.10)

Hình 1.11 Các bước thực hiện giải trình tự gen bằng sinh phẩm Deeplex

Myc-TB [31]

Các m u có thể ư c gộp l i và phân tích trong một l n ch y GTT (Bảng 1.3)

Bảng 1.3 Các nền tảng chạy giải trình tự thế hệ mới [31]

Trình t gen h ủa vi khuẩn mycobacteria có thể ư c ở các giếng gắn hsp65 gene Kết quả là mỗi vị trí trình t có thể ư c bao phủ bởi nhiều l n c, cho phép th c hiện các lệnh g i ột biến ó ộ tin c y cao Bao g m cả cho các qu n thể ột biến, biến dị, lo i chiếm tỷ lệ thấp t i 3% (th m chí 1%) của vi khuẩn

Nền tảng Kỹ thuật Thời gian

chạy

Số lượng mẫu

Số lượng mẫu bao gồm chứng

trong m u mà không thể tiếp c n ư c v i các xét nghiệm sinh h c phân tử nhanh khác N ng ộ DNA ư c chiết xuất thấp, chỉ c n 100-1000 bộ gen tr c khuẩn Mycobacteria là ủ ể x ịnh ư c ột biến Tòa bộ dữ liệu thu ư c sẽ ư c c p nh t, phân t h trên ơ sở dữ liệu của Deeplex®

Hiện nay có nhiều phương pháp xác ịnh kiểu gen ư c ứng ụng ể hẩn oán

M tuberculosis kháng thuốc, bao g m: [63]

- Giải tr nh t gen (Sequencing) [10, 26, 66, 61, 68] - Lai trên pha rắn (Solid-phase hybridization techniques) g m: tets LiPa, kỹ thu t PLH (PCR - reverse lineblot hybridization) hay kỹ thu t Spoligotyping [51]

- Real-time PCR [10] D nh s h xét nghiệm hẩn o n l o kh ng thuố ư WHO khuyến o: [35, 63]

Xpert MTB/RIF và Xpert MTB/RIF Ultra, Cepheid, Mỹ [35, 63]

GenoType® MTBDRplus, Hain Lifescience/Bruker, ứ [35, 44, 63, 65]

Genos hol r™ NTM+MDRTB II; Nipro, J p n [63]

GenoType® MTBDRsl, Hain Lifescience/Bruker, ứ [63, 65]

Truenat MTB, MTB Plus và MTB-RIF Dx assays, Molbio Diagnostics, Ấn ộ [56] FluoroType MTB and MTBDR, Hain Lifescience, ứ [35]

Abbott RealTime MTB và MTB RIF/INH trên hệ thống m2000sp và m2000rt s,

Abbott, Mỹ [35] BD Max MDR-TB, Becton Dickinson, Mỹ [35] Roche cobas® MTB and MTB-RIF/INH trên hệ thống Cobas 6800/880, Roche Diagnostics, Thụy Sỹ [27]

Genoscholar PZA TB II, Nipro, Nh t Bản [35, 63] Xpert MTB/XDR cartridge, Cepheid, Mỹ [4, 32]

Các phương pháp chẩn oán kiểu gen ều trên ơ sở x ịnh ột iến ở các gen có liên quan ến kháng thuốc tương ứng sử ụng cá kỹ thu t ao thường i hỏi trang thiết ị máy móc hiện i, tốn kém và c n nhân l có trình ộ chuyên sâu, nhưng thời gian chẩn oán bằng các phương pháp kiểu gen nhanh hơn, ó ộ

nh y và ộ hiệu cao vì v y có ý nghĩ rất l n, t o ư ột phá cho công tác iều trị và kiểm soát ệnh lao (Bảng 1 4)

Bảng 1.3 So sánh các phương pháp trong chẩn đoán lao kháng thuốc từ mẫu

bệnh phẩm Kháng sinh đồ

kiểu hình

LPA

Thời gian

4-6 tu n trên môi trường c 2- 3 tu n trên môi trường lỏng

Nuôi cấy

C n nuôi cấy (2-3 tu n)

nuôi cấy

Không c n nuôi cấy

tNGS: Không c n nuôi cấy WGS: C n nuôi cấy

Thuốc chống lao

15 thuốc lao g m: RIF, INH, PZA, STM, AMK, KAN, EMB, CAP, CLO, BDQ, LZD, FQ

MTB/XDR:

KAN, CAP, FQ, ETH

13 thuốc lao hàng 1 và hàng 2, g m: RIF,

n ng phơi nhiễm

Yêu c u phòng thí nghiệm an toàn sinh h c cấp 2+

Yêu c u phòng thí nghiệm an toàn sinh h c cấp 2+

Thấp (Do tất cả ư c từ m u ến kết quả ư c th c hiện t ộng trong 1 rtri ge Do ó

tNGS: thấp WGS: Yêu c u

nghiệm an toàn sinh h c cấp 2+ (m u nuôi cấy)

h n chế tối sai sót do yếu tố on người và

chéo giữa các m u)

ộ chính xác

ộ chính xác 98% [19]

ộ nh y: 96 % v ộ c hiệu 93,3% [ 34]

ộ nh y v ộ c hiệu cao

M u nuôi cấy: ộ nh y: 95,3% ộ c hiệu: 97,4%

phân: ộ nh y v ộ c hiệu tương t như m u nuôi cấy

Chương 2- VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

Bệnh nhân nghi lao ến kh m t i Bệnh viện Phổi Trung ương từ 1/1/2023 ến hết 30/9/2023 ó hỉ ịnh xét nghiệm t nh nh y ảm thuố l o h ng 1 trong sổ xét nghiệm t i khoa Vi sinh v L o l o huẩn Quố gi , Bệnh viện Phổi Trung ương

2.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn

Bệnh nhân ó hỉ ịnh ng thời v i 2 lo i xét nghiệm: MTB kh ng LPA v MTB kh ng thuố h ng 1 trên m i trường lỏng (BACTEC MGIT)

Kết quả LPA x ịnh t nh kh ng INH, ho RMP Kết quả KS x ịnh t nh kh ng INH, RMP

2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ

C kết quả xét nghiệm không xá ịnh v i ng thời ả h i thuố INH và

RMP ằng phương ph p LPA Genotype MTBDRplus

C ó kết quả xét nghiệm kh ng x ịnh ằng phương ph p KS BACTEC MGIT

2.2 Địa điểm, thời gian nghiên cứu

ị iểm: Bệnh viện Phổi Trung ương Thời gi n nghiên ứu: từ 1/1/2023 ến hết 30/9/2023

2.3 Vật liệu – Thiết bị và hóa chất nghiên cứu

2.3.1 Vật liệu nghiên cứu

-Que tre vô trùng; Bi thủy tinh v trùng; Gi ng tuýp; Kh y t m i trường; Giá AST lo i; Pipet nh v trùng hi v h; P nh, kẹp ; Pipet thủy tinh 20ml; Các u n ó l lo i 10, 20, 100, 200, 1000μl; Giấy thấm/kh n; G ng t y s h kh ng ột; Tuýp li tâm nh v trùng, hi v h, nắp xo y lo i 50ml, y hữ V; Ống eppendorf 0,5 ml; Ống 1,5 ml (Eppendorf DNA LoBind tubes); Tuýp PCR 200μl

(kh ng hứ ADNse/Rnase);Thermowell® GOLD 0.5 mL Polypropylene PCR; Tubes with Flat Cap, Clear; Khẩu tr ng; Bô can; Thùng r thải v t liệu sinh h ó nắp y

2.3.2 Thiết bị dùng trong nghiên cứu

-Tủ ATSH lo i IIA; N i hấp; ng h ph t; Máy BACTEC MGIT; Tủ th o t PCR ó n t m; Máy ly tâm an toàn ( ó nắp y từng ối) cho tuýp 50ml); Máy ly tâm l nh ho tuýp 1 5ml; Máy ly tâm mini (Spin down); M y ủ nhiệt kh /ư t;Pipette t ộng lo i 10, 20, 100, 200, 1000μl; Lò vi sóng; Máy lai Twincubator; Tủ l nh 2-8 oC; Tủ âm -20oC ; Tủ âm sâu -70oC; N i hấp khử trùng; Tủ sấy; Máy vortex; Hệ thống khuế h i PCR; M y o Qu it™ 4 (Thermo Fisher™, Q33216)

-M y giải tr nh t Miseq ủ Illumin -Hệ thống GeneXpert ( ối v i kit Ultr , ph n mềm GeneXpert Dx n ver 4 7 trở lên) g m: Máy t nh iều kiển ph n mềm, m y s n m v h 2D

-Hệ thống GeneXpert g m: Máy GeneXpert 10 màu kèm: m y t nh iều kiển ph n mềm, m y s n m v h 2D; UPS 1500 VA; Bộ lưu iện

2.3.3 Hóa chất/Sinh phẩm

-Tuýp 7ml MGIT, L BACTEC MGIT 960 SIRE Supplement -L Streptomy in: 332 µg,L Isoni zi : 33 2 µg,L Isoni zi : 66.4µg,L Rifampicin: 332 µg,L Eth m utol: 1660 µg

- ộ ụ huẩn 0 5 M F rl n , ộ ụ huẩn 1 0 M F rl n -Nư ất, Dung ị h s t khuẩn, n 70%

-Chủng huẩn H37 Rv ATCC™ 27294 -GenoLyse® (hó hất t h hiết) 1/1,Hộp sinh phẩm 1/2; Membrane strips coated

with specific probes (MTBDRplus VER 2.0 STRIPS); Denaturation Solution

(DEN) contains <2% NaOH, dye, Hybridization Buffer (HYB) contains,Stringent Wash Solution (STR)contains >25% of a quaternary ammonium compound, <1% anionic tenside, dye; Rinse Solution (RIN) contains buffer, <1% NaCl, <1% nonionic tenside;Conjugate Concentrate (CON-C) contains streptavidin-conjugated

alkaline phosphatase, dye;Conjugate Buffer (CON-D) contains buffer, 1% blocking reagent, <1% NaCl;Substrate Concentrate (SUB-C) contains <70% dimethyl sulfoxide, <10% 4-nitro blue tetrazolium chloride, <10% 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate;Substrate Buffer (SUB-D) contains buffer, <1% MgCl2, <1% NaCl, Tray, evaluation sheet

-Hộp sinh phẩm 2/2; Amplification Mix A (AM-A GT MTBDRplus VER 2.0)

contains buffer, nucleotides, Taq polymerase;Amplification Mix B (AM-B GT

MTBDRplus VER 2.0) contains salts, specific primers, dye; ệm photph te pH 6 8

-Dung ị h My oprep v (N-acetyl-L-cystein) -Kit t h hiết QIA mp DNA Mini Kit; Nư ất PCR; Ethanol 100% -A uGreen™ High Sensitivity sDNA Qu ntit tion Kit; AMPure XP® Beads; NaOH 10 N; Tween20; NaClO; Bộ khuế h i PCR Deeplex® My -TB ủ GenoGreen

-Chuẩn ị thư viện Nextera® XT DNA Library Preparation kit và Nextera® XT Index Kits v2; Bộ h y m y MiniSeq Mi Output ho MiSeq® Reagent Kit V2 300 cycles; PhiX Control Kit v3;

-Cartridge Xpert MTB/RIF; Dung ị h xử lý ệnh phẩm S mple Re gent (dung ị h SR); Nư ất tiệt trùng ho ung ị h ệm phosph te pH 6 8; NALC ột -Bộ sinh phẩm Xpert MTB/XDR o g m: C rtri ge; Dung ị h xử lý SR, pipet hi v h ùng 1 l n

2.4 Cỡ mẫu

-Toàn bộ kết quả xét nghiệm của bệnh nhân ến kh m v iều trị t i Bệnh viện Phổi Trung ương từ 1/1/2023 ến hết 30/9/2023 có th c hiện ng thời xét nghiệm MTB ịnh nh kh ng LPA và xét nghiệm MTB kháng thuố h ng 1 trên m i trường lỏng (KS BACTEC MGIT) th c hiện trên hệ thống BACTEC MGIT 960 t i khoa Vi sinh và Labo lao chuẩn Quốc gia, Bệnh viện Phổi Trung ương ư c thu th p kết

quả xét nghiệm và không thuộ trường h p bị lo i trừ

2.5 Phương pháp nghiên cứu

Nghiên ứu ắt ng ng m tả h i ứu (mụ tiêu 1) v tiến ứu (mụ tiêu 2) Th hiện thu th p v so s nh số liệu trên m u ệnh nhân ó th hiện xác ịnh t nh kh ng INH v RMP ằng phương ph p LPA v phương ph p KS lỏng BACTEC MGIT

So s nh tỉ lệ ng thu n giữ 2 phương ph p xét nghiệm, kết quả kh ng ng thu n sẽ ư th hiện ổ sung v i phương ph p giải tr nh t gen h ằng ộ sinh phẩm Deeplex Myc-TB v xét nghiệm XpertTB/XDR ối v i trường h p kh ng ng thu n INH v kỹ thu t Xpert MTB/RIF ối v i trường h p kh ng ng thu n RMP

5 kỹ thu t xét nghiệm ư sử ụng trong nghiên ứu: - Kỹ thu t MTB kh ng thuố h ng 1 trên m i trường lỏng (BACTEC MGIT 960) là kỹ thu t th hiện kh ng sinh m i trường lỏng BACTEC MGIT v i 4 lo i thuố hống l o: Streptomy in, Isoniazid, Rifampicin và Ethambuton [2]

- Kỹ thu t MTB kh ng LPA (LPA): kỹ thu t x ịnh t nh kh ng thuố Isoni zi , Rif mpi in trên ng nghệ l i u dò [2, 34]

- Kỹ thu t M tuberculosis kh ng thuố giải tr nh t gen h (Deeplex): kỹ thu t

x ịnh t nh kh ng 13 lo i thuố hống l o trong ó ó thuố Isoni zi , Rif mpi in [31]

- Kỹ thu t MTB ịnh nh v kh ng Rif mpi in Xpert (Xpert MTB/RIF): kỹ thu t x ịnh ư t nh kh ng Rifampicin [2]

- Kỹ thu t MTB ịnh danh và siêu kháng Xpert (Xpert MTB/XDR) giúp phát hiện

các vi khuẩn lao siêu kháng thuốc, kháng v i INH, ETH, các FLQ và các thuốc tiêm hàng 2 [4]

2.5.1 Kỹ thuật MTB kháng thuốc hàng 1 trên môi trường lỏng BACTEC MGIT [2]

- Nguyên lý của kỹ thu t: M i trường MGIT cung cấp inh ư ng cho s phát

triển của Mycobacteria H p chất huỳnh quang gắn ư i y tuýp nh y cảm v i

oxy h t n trong m i trường, khi có vi khuẩn m c tiêu thụ oxy, h p chất sẽ phát