Nghiên cứu đột biến kháng rifampicin và isoniazid của mycobacterium tuberculosis bằng phương pháp genotype mtbdrplus

LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan, công trình nghiên cứu khoa học riêng tơi hướng dẫn Tiến sĩ Nguyễn Văn Hưng Các số liệu, kết luận văn trung thực chưa công bố bất lỳ công trình khác Học viên Nguyễn Thị Hồng Nhạn LỜI CẢM ƠN Tơi xin chân thành bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc đến T.S Nguyễn Văn Hưng Trưởng khoa Vi Sinh labo lao chuẩn Quốc Gia, Bệnh Viện Phổi Trung Ương, tận tình hướng dẫn, quan tâm giúp đỡ tơi suốt q trình thực đề tài hoàn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo Phòng đào tạo sau đại học, Labo Lao chuẩn Quốc gia Bệnh viện phổi Trung ưong, tạo điều kiện, giúp đỡ tơi q trình học tập nghiên cứu Tơi xin tỏ lịng biết ơn chân thành đến Ban giám hiệu, Ban chủ nhiệm Khoa Sau đại học, Trường Đại học Mở Hà Nội tạo điều kiện giúp đỡ tơi suốt q trình học tập nghiên cứu Cuối xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân bạn bè, đồng nghiệp động viên, khích lệ tơi nhiều để tơi có thêm nhiệt tình say mê nghiên cứu khoa học Hà Nội, ngày 16 tháng 12 năm 2015 Học viên Nguyễn Thị Hồng Nhạn MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tình hình bệnh lao Việt nam Thế Giới 1.1.1 Tình hình bệnh Lao Thế Giới 1.1.2 Tình hình bệnh Lao Việt Nam 1.1.3 Lịch sử bệnh lao lao kháng thuốc 1.2 MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS 1.2.1 Đặc điểm Mycobacterium tuberculosis 1.2.2 Cấu tạo Mycobacterium tuberculosis 1.2.3 Cơ chế gây bệnh 1.2.4 Cơ chế kháng thuốc Mycobacterium tuberculosis 10 1.3 Các phương pháp chẩn đoán lao kháng thuốc 11 1.3.1 Các phương pháp xác định kiểu hình 11 1.3.2 Các phương pháp xác định kiểu gen 12 1.4.Chẩn đoán vi khuẩn lao kháng Rifammycin 12 1.4.1.Kháng sinh Rifampicin 14 1.4.2.Cơ chế kháng Rifampicin 14 1.5 Chẩn đoán Mycobacterium tuberculosis kháng Isoniazid 16 1.5.1.Gen katG với chế kháng thuốc isoniazid Mycobacterium tuberculosis 18 1.5.2 Gen inhA với chế kháng thuốc isoniazid Mycobacterium tuberculosis 18 1.6.Nghiên cứu đột biến khang RMP INH Thế giới Việt Nam 20 1.6.1 Nghiên cứu Thế giới 20 1.6.2 Nghiên cứu Việt Nam 21 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 Đối tượng nghiên cứu: 22 2.2 Nội dung nghiên cứu: 22 2.3.Nguyên vật liệu 24 2.3.1 Thiết bị phịng thí nghiệm 24 2.3.2 Hóa chất nghiên cứu 24 2.3.3 Vật liệu nghiên cứu 25 2.3.4 Đệm dung dịch 25 2.4 Phương pháp nghiên cứu 26 2.4.1 Quy trình chẩn đốn Mycobacterium tuberculosis kháng thuốc kỹ thuật GENOTYPE MTBDRplus 26 2.4.1.1 Xử lí mẫu bệnh phẩm 26 2.4.1.2 Tách chiết ADN 27 2.4.1.3 Phản ứng khuếch đại 28 2.4.1.4.Lai tự động máy GT-blot 20 29 2.4.1.5 Phân tích kết 31 2.4.1.6 Kiểm tra chất lượng 32 2.4.2.Giải trình tự gen 35 2.4.2.1.Phương pháp tách chiết kiểm tra ADN 35 2.4.2.2.Cặp mồi dùng nghiên cứu 36 2.4.2.3.Các thao tác với ADN 38 2.4.2.4.Phương pháp dịng hố gen 43 2.4.2.5.Phương pháp kiểm tra gen dịng hố 44 2.4.2.6.Phương pháp giải trình tự gen 49 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 51 3.1 Kết thu thập mẫu phát lao đa kháng phương pháp Genotype MTBDRplus 51 3.1.1 Kết xác định MTB: 51 3.1.2 Kết xác định MTB kháng thuốc: 51 3.1.3 Vị trí tỷ lệ đột biến gene rpoB 54 3.1.4 Vị trí tỷ lệ đột biến gene katG 60 3.1.5 Vị trí tỷ lệ đột biến gene inhA 62 3.2 Kết thu thập mẫu giải trình tự gen 63 3.2.1.Kết tách chiết ADN tổng số 64 3.2.2.Kết biến nạp vecter tái tổ hợp 66 3.2.2.1.Kết tách chiết ADN Plasmid 67 3.2.2.2.Xử lý dòng plasmid tái tổ hợp với enzyme giới hạn 68 3.2.3.Kết đọc trình tự 70 KẾT LUẬN 73 TÀI LIỆU THAM KHẢO 74 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT AFB : Trực khuẩn kháng axit (Acid-fast bacilli) AND : Deoxyribo nucleic Acid BACTEC-MGIT: Môi trường lỏng hệ thống BACTEC CTCLQG : Chương trình chống lao Quốc Gia DOTS : Hóa trị liệu ngắn ngày có kiểm sốt trực tiếp INH : Isoniazid KSĐ : Kháng sinh đồ LJ : Môi trường đặc cấy Mycobacterium tuberculosis Lowenstein-Jeelsen LPA : lai đầu dò (Line Probe Assay) MDR-TB : Bệnh lao đa kháng thuốc (Multidrugs Resistance - Tuberculosis) MTB : Mycobacterium tuberculosis SOP : Quy trình thực hành chuẩn(Standard Operating Proceduce) PCR : Kỹ thuật nhân gen (Polymerase Chain Reaction) TCYTTG : Tổ chức y tế Thế giới (World Health Organization) RMP : Rifampicin XDR-TB : Bệnh lao siêu kháng thuốc (Extremely Drug-Resistant Tuberculosis) DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1: Cách pha dung dịch khử tạp 27 Bảng Chu trình nhiệt cho phản ứng khuếch đại: 28 Bảng Khởi động máy GT-BOT 20 29 Bảng Lượng dung dịch pha chi tiết cho mẫu 30 Bảng 5: Thành phần dùng cho phản ứng PCR 37 Bảng 6: Chương trình thực phản ứng PCR 38 Bảng : Thành phần hỗn hợp phản ứng gắn vector 43 Bảng 8: Phạm vi phân tích ADN gel Agarose 46 Bảng 9: Thành phần hỗn hợp phản ứng gắn 48 Bảng 10: Thành phần phản ứng PCR cho xác định trình tự 49 Bảng 11: Kết xác định MTB 51 Bảng 12: Kết xác định chủng MTB 51 Bảng 13 Kết xác định chủng MTB kháng thuốc 52 Bảng 14: Kết xác định chủng MTB kháng thuốc RMP 52 Bảng 15: Kết xác định chủng MTB kháng thuốc INH 53 Bảng 16: Vị trí đột biến gen rpoB liên quan đến tính kháng RMP [56] 54 Bảng 17: Vị trí đột biến gen katG liên quan đến tính kháng INH 60 Bảng 18: Vị trí đột biến gen inhA liên quan đến tính kháng INH 62 Bảng 19: Vị trí đột biến gen kat G + inhA liên quan đến tính kháng INH 63 Bảng 20 : Kết kiểm tra độ tinh ADN phương pháp đo OD 65 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Mycobacterium tuberculosis kính hiển vi mọc thành cuộn thừng (cord forming) ảnh chụp khoa vi sinh labo lao chuẩn Quốc Gia, năm 2014 Hình Cấu tạo thành tế bào M tuberculosis Hình Cơng thức cấu tạo rifampicin [53] 14 Hình Cấu trúc tinh thể kết kết rifampicin ARN polymerase 15 Hình Trình tự nucleotide đoạn “hot – spot” gen rpoB 16 Hình Cơng thức cấu tạo isoniazid [35] 17 Hình Cơ chế kháng thuốc isoniazid gen inhA [31] 19 Hình 8.Các băng tín hiệu STRIP 31 Hình 9.Các điểm mẫu dò hoang dại đột biến gen rpoB 34 Hình 10.Các điểm mẫu dị hoang dại đột biến gen katG 34 Hình 11 Các điểm mẫu dị hoang dại đột biến gen inhA 34 Hình 12: Sơ đồ nguyên lý phản ứng PCR 39 Hình 13: Số nhân lên sau 30 chu kỳ PCR 40 Hình 14 pCR®-TOPO® vectors 41 Hình 15: Nguyên lý hoạt động TOPO TA Cloning® kit 42 Hình 16: Quy trình thực phản ứng gắn vector 42 Hình 17: Đột biến WT8,M3 gen rpoB liên quan đến tính kháng Rifampicin 55 Hình 18: Đột biến WT7,M2A gen rpoB liên quan đến tính kháng Rifampicin 56 Hình 19: Đột biến WT7,M2B gen rpoB liên quan đến tính kháng Rifampicin 56 Hình 20: Đột biến WT3,WT4,M1 gen rpoB liên quan đến tính kháng Rifampicin 57 Hình 21: Kết kiểm tra điện di ADN tổng số gel agarose 1% 64 Hình 22: Kết kiểm tra PCR điện di gel agarose 1% 65 Hình 23 : kết biến nạp vector tái tổ hợp tế bào khả biến E.coli DH5α 66 Hình 24: Kết điện di kiểm tra plasmid biến nạp vào vector tách dòng 68 Hình 25: Kết xử lý ADN plasmid tái tổ hợp enzyme giới hạn EcoR I 69 Hình 26 Phân tích, so sánh trình tự nucleotide phát đột biến phân đoạn 81 bp gen rpoB mẫu nghiên cứu TB-03 70 Hình 27 Kết xác định trình tự phát đột biến mẫu nghiên cứu TB-03 71 ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh lao bệnh truyền nhiễm vi trùng lao gây ra, lây nhiễm từ người bệnh sang người lành Bệnh gặp tất phận thể, lao phổi thể lao phổ biến (chiếm 80 -85%) nguồn lây cho người xung quanh Bệnh chữa khỏi mà không để lại di chứng phát sớm, điều trị kịp thời Tuy nhiên, người bệnh điều trị không cách (bỏ dở điều trị dùng thuốc không theo dẫn thầy thuốc) gây hậu nghiêm trọng như: Bệnh không khỏi, dễ để lại di chứng gây tử vong; gây tượng kháng thuốc, nguy hiểm lao đa kháng thuốc làm cho việc điều trị khó khăn tốn hơn; tiếp tục nguồn lây nhiễm chủng kháng thuốc cộng đồng Việc điều trị lao đa kháng thuốc phức tạp khó khăn Chi phí điều trị cao, thời gian điều trị kéo dài Tỷ lệ khỏi bệnh thấp, tỷ lệ bỏ trị tử vong bệnh nhân cao Đột biến chủng Mycobacterium tuberculosis gây kháng thuốc hàng xuất điển hình với tần suất 3x10-9 đến 3x10-7 tế bào hệ, nghĩa người nhiễm bệnh tồn lượng nhỏ vi khuẩn đột biến kháng thuốc [11] Chẩn đoán Mycobacterium tuberculosis đa kháng thuốc sở y tế nước phải dựa vào phương pháp nuôi cấy Mycobacterium tuberculosis làm kháng sinh đồ kéo dài - tuần gặp khó khăn việc điều trị Sinh học phân tử tạo đột phá chẩn đoán Mycobacterium tuberculosis đa kháng thuốc khắc phục nhược điểm Thời gian chẩn đốn rút ngắn xuống vài ngày vài với độ nhạy độ đặc hiệu cao Kháng thuốc xảy đột biến khu vực hệ gen MTB, như: katG, inhA, ahpC, kasA ndh liên quan đến tính kháng Isoniazid (INH), rpoB kháng Rifampicin (RIF), embB kháng Ethambutol (EMB), pncA kháng Pyzamid (PZA) rpsL, rrs liên quan đến tính kháng Streptomycin (STR) H37RV Đường chạy mẫu âm tính Kết điện di hình 23 cho thấy gel sản phẩm PCR có dạng băng ADN nhất, đậm rõ nét, có kích thước 571bp phù hợp với kích thước đoạn ADN cần nhân Điều chứng tỏ cặp mồi chúng tơi thiết kế có độ đặc hiệu cao chương trình thành phần phản ứng PCR phù hợp Với sản phẩm PCR tiếp tục tiến hành gắn vào vector tách dòng 3.2.2.Kết biến nạp vecter tái tổ hợp Biến nạp Vector pCR®-TOPO® sau gắn đoạn ADN cần tách dịng vào tế bào vi khuẩn E coli chủng DH5α theo phương pháp Sambrook Nhờ máy sinh tổng hợp tế bào vi khuẩn, plasmid tạo với số lượng lớn Quá trình biến nạp vector tái tổ hợp thực phương pháp sốc nhiệt, trình tự tiến hành nêu phần phương pháp nghiên cứu Sau biến nạp, dịch tế bào đem cấy môi trường LB đặc, bổ sung kháng sinh Ampicillin, X- gal Trong môi trường chọn lọc này, khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp có màu trắng khuẩn lạc mang vector pCR®-TOPO® khơng mang đoạn ADN nhân lên nhờ phản ứng PCR có màu xanh Kết biến nạp thể hình sau: Hình 23 : kết biến nạp vector tái tổ hợp tế bào khả biến E.coli DH5α 66 Vector pCR®-TOPO® chứa vùng promoter lac đoạn gene mã hố cho lacZα dùng cho trình chọn lọc khuẩn lạc xanh trắng, ngồi mang hai gene kháng kháng sinh kanamycine ampicilline giúp chọn lọc tế bào E.coli mang vector Toàn khuẩn lạc phát triển mơi trường có ampicilline kanamycine vi khuẩn mang plasmid Vì có mặt gen kháng Amp Ka plasmid mang đến cho vi khuẩn đặc tính kháng Amp Ka Những khuẩn lạc có màu xanh xuất vector pCR®-TOPO® có mang operon Lac hoạt động bình thường, có chất cảm ứng IPTG tổng hợp nên βgalactosidase, enzyme thuỷ phân chất X- gal có mặt mơi trường để tạo nên sản phẩm có màu xanh Trong đó, khuẩn lạc có màu trắng hình thành từ tế bào mang plasmid có operon Lac khơng hoạt động Chính vậy, có chất cảm ứng IPTG enzyme khơng tổng hợp nên β- galactosidase khơng chuyển hố X-gal, operon Lac bị bất hoạt bị thay đổi cấu trúc, bị đứt đoạn hay bị thay đổi trình tự đoạn ADN ngoại lai xen vào promoter lac gene cấu trúc LacZ Trong trường hợp này, promoter lac điều khiển gene cấu trúc phiên mã nên khơng có dịch mã thành enzyme Trên đĩa petri, khuẩn lạc xanh trắng xuất riêng rẽ Như vậy, việc lựa chọn khuẩn lạc trắng để tách plasmid loại bỏ phần lớn trường hợp không mong muốn tất khuẩn lạc trắng mang vector plasmid tái tổ hợp chứa đoạn ADN cần thiết Để khẳng định cách chắn hơn, cần thực bước kiểm tra Đó : kiểm tra ADN plasmid tách chiết enzyme giới hạn so sánh kích thước đoạn cắt với sản phẩm phản ứng PCR 3.2.2.1.Kết tách chiết ADN Plasmid Chúng sử dụng đĩa biến nạp cho mẫu Sau biến nạp plasmid vào chủng tế bào khả biến DH5α nuôi cấy môi trường LB thạch chứa tác nhân chọn lọc Chúng chọn ngẫu nhiên 24 khuẩn lạc, có 21 khuẩn lạc trắng (Mỗi đĩa biến nạp chọn ngẫu nhiên khuẩn lạc trắng) khuẩn lạc xanh để nuôi cấy môi trường LB lỏng có bổ sung Ampicilline Các khuẩn 67 lạc đánh số thứ tự từ đến 21 khuẩn lạc trắng X khuẩn lạc xanh Các lọ môi trường cấy vi khuẩn từ khuẩn lạc nhặt đem nuôi lắc điều kiện nhiệt độ 37oC, tốc độ 200 vòng/phút Sau nuôi qua đêm, hỗn dịch tế bào chuyển vào ống Eppendorf 1,5 Sau tách chiết plasmid theo qui trình trên, chúng tơi lấy 5µl dịch plasmid tách từ khuẩn lạc hoà TE buffer để điện di kiểm tra gel agarose 1% Kết điện di kiểm tra thể hình 25 10 11 12 X X X 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Hình 24: Kết điện di kiểm tra plasmid biến nạp vào vector tách dịng Theo lý thuyết, phân tử ADN có kích thước lớn điện di gel agarose chúng di chuyển chậm Qua ảnh điện di plasmid thu được, ta thấy số plasmid tách từ khuẩn lạc trắng chạy chậm plasmid tách từ khuẩn lạc xanh Plasmid từ khuẩn lạc xanh vector pCR®TOPO® chuẩn tự đóng vịng Như vậy, plasmid tách từ khuẩn lạc trắng mang ADN ngoại lai Có thể nói rằng, q trình thực từ gắn sản phẩm PCR mang gene mong muốn vào vector tách dòng biến nạp chọn khuẩn lạc xanh trắng thực tương đối tốt 3.2.2.2.Xử lý dòng plasmid tái tổ hợp với enzyme giới hạn Để khẳng định cách chắn việc gắn đoạn gene mong muốn vào vector tách dịng pCR®-TOPO®, chúng tơi sử dụng enzyme giới hạn EcoR I 68 Trên vector tách dịng pCR®-TOPO®, có hai vị trí nhận biết enzyme EcoRI (GAATTC) hai đầu vector chúng dạng mạch thẳng Và vector gắn sản phẩm PCR hai vị trí nằm hai đầu ADN ngoại lai Do đó, vector plasmid pCR®-TOPO® dạng tái tổ hợp xử lý enzyme giới hạn EcoR I, enzyme cắt rời đoạn ADN ngoại lai kích thước thay đổi khơng đáng kể Điều cho phép so sánh đoạn ADN cắt sau gắn vào vector tách dòng với sản phẩm PCR ban đầu Qua kết hình 25, mẫu nghiên cứu chọn plasmid đủ tiêu chuẩn tiến hành phản ứng cắt kiểm tra enzyme giới hạn EcoRI Các plasmid chọn mẫu plasmid mang ký hiệu 3, 4, 9, 10, 15 Sản phẩm kiểm tra chạy điện di gel agarose 1% Kết xử lý ADN plasmid tái tổ hợp enzyme giới hạn EcoR I thể hình 26 Phương pháp xử lý ADN với enzyme giới hạn Phản ứng cắt enzyme giới hạn có thành phần sau: Đệm enzyme (10X) Plasmid tái tổ hợp (~300 ng) Enzyme (10 unit/µl) H2O 1,5 µl x µl 0,2 µl y µl Tổng thể tích 15 µl Hỗn hợp ủ 37 C 30 phút Chạy điện di kiểm tra gel agarose % Hình 25: Kết xử lý ADN plasmid tái tổ hợp enzyme giới hạn EcoR I 69 Đường chạy 1: Sản phẩm PCR chuẩn, đường chạy - 5: plasmid 3, 4, 9, 10, 15 xử lý enzyme EcoRI Trên ảnh điện di ta thấy plasmid tách chiết từ khuẩn lạc trắng chọn để xử lý enzyme giới hạn EcoR I xuất băng ADN với kích thước tương ứng với kích thước sản phẩm PCR Như vậy, từ kết dòng ADN plasmid tái tổ hợp, chúng tơi thấy dịng ADN plasmid tái tổ hợp gắn vào vector tách dịng pCR®-TOPO®, nói cách khác kết tách dịng gene rpo B thực thành công Tuy nhiên, để khẳng định cần xác định trình tự nucleotid sản phẩm PCR Các plasmid chọn cắt enzyme EcoRI thành công đem tinh kit tinh Invitrogen trước mix phản ứng đọc trình tự 3.2.3.Kết đọc trình tự Để xác định trình tự gen rpoB chủng Mycobacterium tuberculosis nghiên cứu, plasmid tái tổ hợp pBT/rpoB sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR đọc trình tự Trình tự gen chủng đọc cặp mồi đặc hiệu M13 – F M13 – R vector tách dòng Kết đọc trình tự: Clone TB05-03 codon 531: C  T Hình 26 Phân tích, so sánh trình tự nucleotide phát đột biến phân đoạn 81 bp gen rpoB mẫu nghiên cứu TB-03 70 Hình 27 Kết xác định trình tự phát đột biến mẫu nghiên cứu TB-03 Phần chữ đỏ: Vùng siêu đột biến liên quan đến tính kháng RMP gen rpoB Phần chữ xanh: Đột biến ba 531 (Ser  Leu) Trình tự phân đoạn 571 nucleotide gen rpoB trình tự amino acid suy diễn thu nhận chương trình BioEdit Phân tích chương trình BLAST so sánh trình tự nucleotide chủng nghiên cứu với chủng chuẩn H37Rv cho thấy chủng TB05-03 xuất đột biến thay nucleotide ba 531 (TCG  TTG) làm thay đổi acid amine Ser  Leu (Hình 27 28) Theo kết mà tác giả nước công bố, khoảng 96% chủng lao kháng RMP có đột biến vùng siêu biến gen rpoB Tần suất đột biến chủng lao kháng thuốc chủ yếu xảy ba, chủ yếu đột biến sai nghĩa thay nucleotide (Cavusoglu, 2002; Ramaswamy, 1998) Theo MatsiotaBeARNrd cộng (1998), Pozzi cộng (1999) nghiên cứu chủng lao kháng RMP phân lập từ Hy lạp chủng lao kháng đa thuốc từ Italy cho thấy, tỷ lệ đột biến gen rpoB có liên quan kháng RMP chiếm tần số cao ba 531 (TCG  TTG) nghiên cứu 56% 59% Elif cộng (2005) nghiên cứu đặc tính phân tử 21 chủng lao kháng RMP phân lập từ Malatya, Thổ Nhĩ Kỳ cho kết phát đột biến gen rpoB codon 531, 516, 526, 513 với tỷ lệ tương ứng 47.6%, 23.8%, 14.3%, and 14.3%, đột biến ba 531 (TCG  TTG) thường thấy (47.6%) Tác giả Elif so sánh tỷ lệ với nghiên cứu khác giới 71 3000 chủng lao kháng thuốc phân lập từ 44 nước khác nhận thấy tỷ lệ đột biến ba 516, 526 531 chủng phân lập từ Châu Á, Châu Úc Nga thường cao vùng khác, đột biến codon 531 có tần số cao Do kết phù hợp với đặc điểm chung thường thấy nghiên cứu giới 72 KẾT LUẬN Vùng đột biến mẫu Mycobacterium tuberculosis phân tích nằm vùng 81bp gen rpoB liên quan đến tính kháng RMP chủ yếu xảy vị trí codon 513 – 517 516 - 519,526,531 xuất mutation D516V, ,H526Y, H526D, S531L chiếm tỷ lệ 78,9% Một phần tỷ lệ xảy vị trí codon 513 – 517 516 - 519,526,531 mà không xuất mutation chiếm tỷ lệ 17,5% Còn phần tỷ lệ nhỏ xảy đột biến codon 510 - 513, 518-523 521 - 525 chiếm tỷ lệ 3,6% Tỷ lệ đột biến thường gặp xảy codon 531 chúng tơi khẳng định kết giải trình tự gen vùng rpoB Ngoài dạng đột biến hay gặp codon 516,526,531 Việt Nam phát đột biến đồng thời condon 513 – 517 516 - 519 điểm khác biệt so với cơng bố tác giả nước ngồi Và tỷ lệ xuất đột biến đột biến đa kháng đột biến RMP đơn có khác biệt dễ nhận thấy đột biến xảy vị trí codon 513 – 517 516 – 519 xuất xuất mutation D516V xảy bệnh nhân có kết đa kháng tỷ lệ xuất đột biến codon 510 – 513(WT2), 526(WT7) bênh nhân có kết kháng RMP đơn cao hẳn với bệnh nhân có kết đa kháng(5,3% - 1,5% 15,8% - 6%) Vùng đột biến gen katG inhA chủng lao phân tích xảy codon S315T gen katG chiếm tỷ lệ 92% đột biến codon C15T gen inhA chiếm tỷ lệ 5,4% Đột biến đồng thời gen katG inhA chủng chiếm tỷ lệ 2,6% Vùng đôt biến gen katG WT xuất đột biến M2 (codon S315T2) xuất với tỷ lệ cao hẳn mẫu bệnh phẩm có kết kháng Inh đơn thuần(17,86%) so với mẫu bệnh phẩm có kết kháng kết hợp INH RMP 73 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Đặng Đức Anh (2001), Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch số thể bệnh lao, Luận án Tiến sĩ sinh học Bộ Y tế / Chương trình chống lao Quốc Gia(2015) “ Tổng kết hoạt động CTCL năm 2014“, Báo cáo tổng kết hoạt động CTCL năm 2014 phương hướng hoạt động tháng đầu năm 2015 Bộ Y tế, Viện thông tin Thư viện Y học Trung Ương(2013), tình hình bệnh lao (http://www.hoilhpn.org.vn/) Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyên, Phạm Văn Ty (2003), Vi sinh vật Y học, Nhà xuất giáo dục Hồ Thị Thùy Dương (2004), sinh học phân tử, Nhà xuất giáo dục Phan Thượng Đạt (2008) Tình hình bệnh lao kháng thuốc cách phòng ngừa Phan Trọng Hồng, Ngơ Văn Trường, Lê Văn Sơn, Lê Trần Bình, Chu Hồng Hà (2007), "Tách dịng gen biểu mã gen mã hóa tiểu đơn vị p66 enzyme phiên mã ngược virus HIV-1" Tạp chí Cơng nghệ sinh học tập 5, số 4, tr 463-470 Nguyễn Văn Hưng (2001), Nghiên cứu số đặc điểm sinh học MycrobacteriumTuberculosis phân lập Bệnh viện Phổi Trung Ương Lê Thị Luyến (2007), Bộ Y tế , Tình hình dịch tễ , điều trị, dự phịng nghiên cứu Lao Việt Nam, Hội thảo sinh học phân tử bệnh lao ,Đại học quốc gia Hà Nội, tháng 8/2007 10 Trần Văn Sáng (1999), Vi khuẩn kháng thuốc cách phòng điều trị, Nhà xuất giáo dục 11 Thơng cáo báo chí (2010), Hoa Kỳ kỷ niệm Ngày Thế giới phòng, chống Lao 2010 (http://vietnamese.vietnam.usembassy.gov/pr240310.html) 74 12 Thuốc – sức - khỏe (2009), Thuốc chống lao (http://www.thuocsuckhoe.com/khainiem/baiviet/phanloai062.htm) 13 Lê Huyền Ái Thúy, Hồ Thi Thanh Thủy, Nguyễn Văn Hưng, Nguyễn Bảo Toàn, '' Phát nhanh Mycobacterium tuberculosis Mycobacterium tuberculosis kháng thuốc Isoniazid, Rifampin Ethambutol Realtime PCR'' , Hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc 2009, NXB Đại học Thái Nguyên, tr 881-884 14 Phùng Công Thưởng (2007), nghiên cứu chẩn đoán lao kháng rifampicin phương pháp xác định đột biến gen rpoB, Luận văn thạc sĩ y học 15 Quyên Đinh Thi (2005), Công nghệ sinh hoc, Nhà xuất khoa học kỹ thuật 16 Nguyễn Xuân Triều (2006), "Chẩn đoán lao", Bài giảng lao bệnh phổi Khoa Sau đai hoc, Học viện quân y 17 Phạm Hùng Vân (2007), Các quy trình kỹ thuật sinh học phân tử thường sử dụng chẩn đoán nghiên cứu y sinh học Nhà xuất Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh 18 Nghiêm Ngọc Minh, Nguyễn Văn Bắc, Vũ Thị Mai, Cung Thị Ngọc Mai, Xác định đột biến gen rpoB liên quan đến tính khánh Rifampicin số chủng Mycobacterium tuberculosis thu thập miền bắc Việt Nam, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ 19 Đinh Ngọc Sỹ, Nguyễn Văn Hưng cộng sự, hướng dẫn quy trình thực hành chuẩn xét nghiệm Mycobacterium tuberculosis, tr 76 Tiếng Anh 20 Ahmad S, Fares E, Araj GF, Chugh TD, Mustafa AS (2002), Prevalence of S315T mutation within the katG gene in isoniazid-resistant clinical Mycobacterium tuberculosis isolates from Dubai and Beirut Inter J Tuber and lung dis 6(10), pp 920-926 75 21 Amina A (2009), Genotypic detection of rifampicin and isoniazid resistant Mycobacterium tuberculosis strains by ADN sequencing: a randomized trial Annals of Clinical Microbiology and Antimicrobials, 8,pp 22 Aslan, G., Tezcan, S., Serin, M.S., Emekdas, G (2008), ”Genotypic analysis of isoniazid and rifampicin resistance in drug-resistant clinical Mycobacterium tuberculosis complex isolates in southern Tukey”, Jpn J Infect Dis., 61(4), pp 255-60 23 Marttila HJ, Soini H, Huovinen P, Viljanen MK (2009), “katG mutations in isoniazid- resistant Mycobacterium tuberculosis isolates recovered from Finnish patients”, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8878604?ordinalpos 24 Balganesh, T.S., Alzari, P.M., Cole, S.T (2008), “Rising standards for tuberculosis drug development” Trends Pharmacol Sci., 29(11), pp 576-581 25 Basso LA, Santos DS, de Souza ON (2005) “Molecular dynamics simulation studies of the wild-type, I21V, and I16T mutants of isoniazid-resistant Mycobacterium tuberculosis enoyl reductase (InhA) in complex with NADH: toward the understanding of NADH-InhA different affinities” Biophys J 89(2), pp 876884 26 Chomezynski and Sacchi (1987), ''A rapid ADN isolation procedure for the identification of Campylobacter jejuni by the polymerase chain reaction'' http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1046/j.1365-2672.2000.00841.x/pdf 27 Dale, JW, No RM., Ramayah S, Tang TH., Zainuddin ZF (1999), “Molecular epidemiology of tuberculosis in Malaysia”, J Clin Microbiol., 37(5), pp 1265-1268.and “inhA genes and in vitro susceptibility in Mycobacterium tuberculosis clinical strains segregated by spoligotype families from tuberculosis prevalent countries in South America” Dalla Costa and et al (2009), Correlations of mutations in katG, oxyR-ahpC 28 Department of Biological Sciences 1000 Hilltop Circle Baltimore (2007), Preparation of ADN Genomic (http://www.research.umbc.edu/~jwolf/genomic) 76 from Bacteria 29 Leung ET, Ho PL, Yuen KY, Woo WL, Lam TH, Kao RY, Seto WH, Yam WC (2006) “Molecular characterization of isoniazid resistance in Mycobacterium tuberculosis: identification of a novel mutation in inhA” Antimicrob Agents Chemother 50(3), pp 1075-8 30 J Med Res 2014 Oct; Detection of multi-drug resistance & characterization of mutations inMycobacterium tuberculosis isolates from North- Eastern States of India using GenoType MTBDRplus assay Indian 140(4): 501–506 31 Dalla Costa and et al (2009), Correlations of mutations in katG, oxyR-ahpC and inhA genes and in vitro susceptibility in Mycobacterium tuberculosis clinical strains segregated by spoligotype families from tuberculosis prevalent countries in South America 32 Aslan, G., Tezcan, S., Serin, M.S., Emekdas, G (2008), ”Genotypic analysis of isoniazid and rifampicin resistance in drug-resistant clinical Mycobacterium tuberculosis complex isolates in southern Tukey”, Jpn J Infect Dis., 61(4), pp 255-60 33 Argekar, A P., Kunjir, S S And Purandare, K S., Simltaneuos, “Dertermination of rifamoicin, isoniazid and pyramizinamid by high performance thin layer chromatography”, J Pharm Biomed Anal., 14, 1645 – 1650 (1996) 34 Ashok Rattan, Awdhesh kalia, and Ahmad (1998), “Multidrug – Resistant Mycobacterium tuberculosis”, Emerging infectious diseases, Vol 4, No 35 Campbell Elizabeth A., et al (2001), “Structure Mechanism for Rifampicin Inhibition of bacteria ARN polymerase”, J Cell 104: 901-902 36 Cole S T et al (1998), “Deciphering the biology of Mycobacterium tuberculosis from the complete genom sequence”, Nature, 393, 537-544 37 Espitia C.et al (1999), “The PE-PGRS glycine-rich proteins of Mycobacterium tuberculosis: a new family of fibronectin-binding protein”, Microbiology 145, 3487-3495 77 38 G T Noordhoek, J A Kaan, S Mulder, et al (1995), “Routine application of the polymerase chain reaction for detect of Mycobacterium tuberculosis in clinal samples”, J Clin Pathol, 48: 810-814 39 James M Musser (1995), “Antimicrobial egent resistance in Mycobacteria: Molerculer Genetic Insights”, Clinical Mrobiology Reviews, Vol 8, No 4,p 496-514 40 Jeremy W Dale et al (1999), “Molercular Epidemiology of Tuberculosis in Malaysia”, JouARNl of Clinical microbiology, Vol 37, No 5, p 1265-1268 41 Juan Carlos Palomino, Sylvia CArdoso Leao, Viviana Ritacco (2007), “Tuberculosis 2007 – from basic science to patient care”, www Tubercuosis Textbook.com 42 Kapur V, Li L L, et al (1994), “characterization by automated ADN sequence of mitations in the gence (rpoB) encoding the ARN polymerase β subunit in rifampin-resistant Mycobacterium tuberculosis strain from New York City and Texas”, J Clin Microbiol 32: 1095-1098 43 Kristin Kremer, Margreta van Zetten et al (1997), “PCR and Reverse Line Blot Hybridization (PHL) to detect rifampicin Resistant”, Laboratory manual, Mycobacterium Department, National Institute of Public Health and the Environment, Bilthoven, The Netherlands 44 L Heifet, T Sanchez, et al (1999), “Development of Rifapentine Susceptibility Test for Mycobacterium tuberculosis”, JouARNl of Amtimicrobial Chemotherrapy, Vol 43, No 1,p 25-28 45 Mami, C., Selvakumar, et al (2001), “Mutations in the rpoB gene of Multidrug-Resistant Mycobacterium tuberculosis Clinical Isolate from India”, J Clin Microbiol 39: 2987-2990 46 Musser J M (1995), “Antimicrobial agent resistance in Mycobacteria: Molecular genetic insights”, Clinical microbiology, 496-514 47 Palomino J.C., S.C Leao, V Ritacco (2007), “Tuberculosis 2007 from basic science to patient care”, www.Tuberculosistextbook.com 78 48 Scholossberg D (2006), Tuberculosis and nontuberculus Mycobacteria infections Fifth edition McGraw-Hill, Medical Publishing Division 49 Sechi L A et al, (1997), “Detect of Mycobacterium tuberculosis by PCR analys of urine and other clinical samples from AIDS and non-HIV-infected patients”, Molercular and cellular Probes 11, 281-285 50 Saeed Zaker bostnabal, Mohammad Noghanian3, A Edward Graviss2, Ahmad reza (2008), “Multiple mutationsin the rpoB gene of mycobacterium tuberculosis isolates correlate with level of resistance to rifampicin in patients with active pulmonary tuberculosis in Afganistan border of Iran”, Bahrmand 1, P Leonid Titov3 and Seyed Ali Nojoumi 51 Telenti, A., P Imboden, et al (1993), “Detection of rifampicin-resistance mutations in Mycobacterium tuberculosis”, Lancet 341: 647-650 52 Veena Balakriskman, Saaketvarma and Dipankar Chatterji, “Piperine augments transcription inhibitory activity of rifampicin by severalfold in Mycobacterium smagmatis”, Molercular Biophysics Unit, Indian Institute of Science, Bangalore 560 012, India 53 WHO (2014), Anti – tuberculosis drug resistant in the world, Report No.2, http://www.who.int/tb/piblication/who_htm_tb_2004_343/en/ 54 WHO (2014) Global Tuberculosis Control Surveillance, Planning, Financing, WHO Report 2014 55 Younghee Hahn and Sunmi Shin (2001), “Electrochemical behavior and diffenrential pulse polarographic determination of rifampicin in pharmaceutical preparations”, Archives of pharmacal research, Vol 24, No 2, p 100 – 104 56 Ahmad Reza Bahrmand,”High-Level Rifampin Resistance Correlates with Multiple Mutations in the rpoBGene of Pulmonary Tuberculosis Isolates from the Afghanistan Border of Iran “J Clin Microbiol 2009 Sep; 47(9): 2744–2750 57 N.Shubladze, N.Tadumadze,and N.Bablishvili “Molecular patterns of multidrug resistance of Mycobacterium tuberculosis in Mycobacteriol Author manuscript; available in PMC 2014 Jun 79 Georgia” Int J 58 “Rapid screening of MDR-TB using molecular Line Probe Assay is feasible in Uganda” http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2841659 59 “Performance Assessment of the GenoType MTBDRplus Test and ADN Sequencing in Detection of Multidrug-Resistant Mycobacterium tuberculosis” http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19494067 80