BAO CÁO KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI CẤP BỘ
NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ SINH KHẢ DỤNG CỦA
RIFAMPICIN TỪ HỖN HỢP 3 THUỐC CHỐNG LAO RHZ TRÊN NGƯỜI TÌNH NGUYỆN
Chủ nhiệm đẻ tài: PGS 7S Hoàng Thị Kim Huyền Co quan chủ trì để tài: Trường Đại học Dược Hà Nội
Trang 2BAO CÁO KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI CẤP BỘ
NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ SINH KHẢ DỤNG CỦA
RIFAMPICIN TU HON HOP 3 THUỐC CHỐNG LAO RHZ TRÊN NGƯỜI TÌNH NGUYỆN
Chủ nhiệm đẻ tài: PGS TS Hoang Thi Kim Huyén Cơ quan chủ trì để tài: Trường Đại học Được Hà Nội Cấp quản lý: Bộ Y tế
Thời gian thực hiện: từ tháng 12/2003 đến tháng 12/2005 Tổng kinh phí thực hiện đề tài: 300 triệu đồng
Trang 3BAO CAO KET QUA NGHIEN CUU DE TAI CAP BO 1 Tên để tài:
Nghiên cứu đánh giá sinh khả dung của rifampicin từ hỗn hợp 3 thuốc chống lao RHZ trên người tình nguyện 2 Chủ nhiệm để tài: PGS TS Hoang Thị Kừm Huyền
3 Đơn vị chủ trì để tài: _ Trường Đại học Dược Hà Nội 4 Cấp quản lý: Bộ Y tế
3 Danh sách những người thực hiện chính
- PGS.TS Hoàng Thị Kim Huyền, Bộ môn Dược lâm sàng, trường ĐHDHN - Th§ Lê Thị Luyếp
- ThS Nguyễn Thị Liên Hương - Th§ Bùi Đức Lập
- Th§ Phan Quỳnh Lao - ThS Pham Thi Thuy Vao 6 Dé tai nhánh: Không có
Trang 4AUC ATS CDC TUATLD R, RMP WHO Z,PZA NHỮNG CHỮ VIẾT TÁT
Diện tích dưới đường cong nỏng độ -thời gian
(Area Under the Curve of Concentration versus Time) Hội lồng ngực My (American Thoracic Society)
Trung tâm phòng chống bệnh tật Mỹ
(Center for Diseases Control and Prevention)
Nồng độ tối đa của thuốc trong huyết tương
Chương trình chống lao quốc gia
Hoá trị liệu ngắn ngày có giám sắt trực tiếp
(Directly Observed Therapy Short course)
Ethambutol
Co quan quản lý Thực phẩm — Dược phẩm Mỹ (Food And Drug Administration)
Thuốc viên hón hợp cố định liêu (Fixed Dose Combination)
Hoi bénh ohiém tring MY (Infectious Diseases Society of America)
Isoniazid
Sắc ký lông hiệu năng cao
(High Performance Liquid Chromatography)
Hiệp hội bài lao và bệnh phổi quốc tế
(International Union Against Tuberculosis and Lung Disease)
Rifampicia
Streptomycin
Thời gian bán thải của thuốc
Thời gian thuốc đạt nồng độ cực đại trong huyết tương kể từ khi đưa
thuốc
Tổ chức y tế thế giới
(World Heaith Organization)
Trang 5MUC LU
PHAN A- TOM TAT CAC KET QUA NOI BAT CUA DE TAI
1 Kết quả nổi bật
2 Áp dụng vào thực tiễn sản xuất và đời sống xã hội
3 Đánh giá thực biện để tài đối chiếu với đề cương nghiên cứu đã được phê duyệt 4 Các ý kiến để xuất PHẦN B- NỘI DUNG BÁO CÁO CHI TIẾT KẾT QUÁ NGHIÊN CỨU 1 Dat van dé 2 Téng quan
2.1 Thuốc chống lao hốn hợp cố định liều
2.2 Sinh khả dụng của RMP trong thuốc chống lao hóa hợp cố định liều 2.3 Phương pháp định lượng RMP trong huyết tương bằng HPLC
3 Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
3.1 Đối tượng nghiên cứu
3.2 Vật liệu và phương tiện nghiên cứu 3.3 Phương pháp nghiên cứu
4 Kết quả nghiên cứu
4.1 Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng R.MP trong huyết tương 4.1.1 Xây dựng phương pháp định lượng RMP trong huyết tương
4.L-2 Thẩm định phương pháp định lượng
4.2 Sinh khả dụng của RMP trên người tình nguyện 4.2.1 Đặc điểm của nhóm người tình nguyện
4.2.2 Nông độ RMP trong huyết tương và các thông số được động học của
RMP trên người tình nguyện
4.2.3 Đánh giá sinh kha dung cia RMP trong các chế phẩm bón hợp và đơn lẻ 5 Bàn luận
3.1 Phương pháp định lượng RMP trong huyết tương,
3.1.1 Phương pháp tùa protein huyết tương và chiét rifampicin
3.1.2 Chương trình sắc ký
3.2 Đánh giá sinh khả dụng của RMP
3.2.1 Một số thông số được động học của RMP khi uống RMP đơn độc
Trang 66 Kết luận và đề xuất Tài liệu (ham khảo Phụ lục
Phụ Lục 1 - Phiếu thu thập số liệu ogi
Phụ lục 2 - Phiếu theo dõi sức khoẻ người tình nguyện
Trang 7PHAN A TOM TAT CAC KET QUA NOIBAT CUA DE TAI
1 Kết quả nổi bật của đề tài
a/ Đóng góp mới của đề tài
- Xây dựng và hoàn chỉnh được quy trình định lượng rifampicin trong huyét tương người từ hỗn hợp 3 thuốc chéng lao RHZ, lam tiền dé cho việc kiểm tra chất
lượng thuốc có chứa rifampicin Điều này còn giúp cho việc theo dõi néng dé mot thuốc chống lao hàng đầu (rữampicin) trong điều trị khi cần thiết
Về mặt kỹ thuật, xây dựng quy trình định lượng nồng độ thuốc trong huyết
tương vốn đã khó khăn, cần có trạng thiết bị (máy HPLC) cùng với chuyên gia có kinh nghiệm vẻ kiểm nghiệm; nhưng định lượng nông độ riampicin trong huyết tương còn khó khăn hơn vì trong mẫu huyết tương đẻ định lượng rifampicin luôn có nhiều thuốc chống lao khác cùng được uống đồng thời Với nhiều khó khăn trên, ở thời điểm hiện nay tại Việt nam, người nghiên cứu phải có nhiều nỗ lực để vượt qua Xét về mặt lợi ích, những kết quả nghiên cứu sinh khả dụng của RMP nói riêng và
thuốc chống lao trong viên EDC nói chung sẽ giúp ích cho chương trình chống lao quốc gia trong lựa chọn chế phẩm thuốc chống lao FDC đảm bảo chất lượng Đồng thời giúp các nhà sản xuất thuốc trong nước trong việc sản xuất chống lao FDC đảm bảo sinh khả dụng của RMP cũng như các thành phần khác Ngoài ra, đốt với cong đồng, việc đảm bảo chất lượng thuốc chống lao góp phần điều trị bệnh lao thành công và giảm nguy cơ xuất hiện kháng thuốc, điều đó có ý nghĩa lớn trong thực tiễn
Viet nam hiện nay
- Đã đánh giá được tương đương sinh học (Bioequivalance) của rifampicin từ
viên EDC hiện chương trình chống lao Quốc gia đang sử dụng (Combikits) so với viên rifampicin khi ding don déc va rifampicin trong phối hợp 3 viên riêng rẽ RHZ Nhờ nghiên cứu này chúng tôi phát hiện được sự giảm sinh khả dụng của rifampicin trong chế phẩm thuốc chống lao dưới dạng viên hỗn hợp cố định liéu (Fixed dose combination - EDC) - dạng thuốc chứa nhiều thành phần thuốc chống lao trong cùng 1 chế phẩm, đúng như nhiều nghiên cứu của các tác giả trên thế giới, từ đó có được để xuất về việc đưa tiêu chuẩn đánh giá sinh khả dung in vivo rifampicin cita céc đạng viên EDC khi kiểm tra chất lượng thuốc điều trị lao
Những nghiên cứu trên thế giới cho thấy thuốc chống lao dạng EDC có độ hoà
tan của RMP tốt cũng không đảm bảo rằng RMP trong viên FDC sẽ đạt tiêu chuẩn
Trang 8Mặc dù việc tìm ra RMP đã trải qua 4 thập kỷ nhưng cho đến nay, những thông tia nghiên cứu về yếu tố ảnh hưởng đến sinh khả dụng của RMP và những thay đổi của quá trình sản xuất chế phẩm để đảm bảo sinh khả dụng của RMP được công bố rất ít Những thông tia đẩy đủ về việc sử dụng tá dược, thay đổi quy trình bào chế vẫn được giữ kín trong các tài liệu của các nhà sản xuất mà không công bố Chính những điều này làm chậm trễ cho việc hiểu biết và đưa ra giải pháp dảm bảo sinh khả dụng của RMP trong các chế phẩm EDC
Nam 1994, TUATLD và WHO đã ban hành khuyến cáo rằng chỉ những thuốc chống lao dạng EDC có chất lượng tốt và đảm bảo sinh khả dụng của RMPmới nên sử dụng để điều trị bệnh lao
Năm 1999 WHO đã ban hành quy định tất cả các chế phẩm thuốc chống lao đạng EDC bắt buộc phải được đánh giá sinh khả dụng của RMP trước khi sử dụng điều trị cho bệnh nhân, trong khi sinh khả dụng của INH, PZA, EMB trong các chế
phẩm này dường như ít phải quan tâm hơn do những hoạt chất nay dé tan trong
nước, [14-311
Chương trình chống lao quốc gia (CTCLQG) ở nước ta cũng đã sử dụng các thuốc chống lao dạng viên hón hợp trong điều trị bệnh lao từ nhiều năm nay và các chuyên gia đầu ngành lao cũng tất quan tâm đến chất lượng thuốc chống lao của những dạng bào chế này Tuy nhiên, cho đến nay ở Việt nam chưa có l nghiên cứu qào tiến hành đánh giá sinh khả dung cita rifampicin (RMP) trong các chế phẩm bốn hợp, vì vậy, nghiên cứu sinh khả dụng của RMP trong viên bón hợp là cần thiết
bí Kết quả cụ thể
1 Về phương pháp định lượng RMP trong huyết tương người bằng HPLC: Phương pháp định lượng RMP huyết tương bằng HPLC do chúng tôi xây dựng đơn giản, dễ tiến hành, có độ đúng, độ chính xác cao, có tính chọn lọc và khoảng
tuyến tính rộng
Phương pháp chiết RMP có hiệu suất xấp xỉ 100% với độ lệch chuẩn tương đối < 3,3% chứng tỏ phương pháp có độ đúng cao, có thể áp dụng trong thực nghiệm xác định nông độ rifampicin trong huyết tương Phương pháp có độ chính xác cao với R8D < 1% Pic riampicia ở nông độ 0,2 ðg/ml xác định, không trùng với pic khác, tái hiện, sai khác trung bình khi nghiên cứu độ chính xác là 7,71% (không quá
20% theo quy định của FDA) Kết quả thực nghiệm cho thấy trong huyết tương
người, rifampicin ổn định sau 3 tháng bảo quản tránh ánh sáng ở nhiệt độ - 40°C 2 Về nông độ RMP trong máu của các dạng chế phẩm nghiên cứu:
Trang 9Cmax của RMP đạt được trong huyết tương bị giảm đi 31,24% và AUC giảm
25,04% khi uống RMP-INH-PZA đồng thời so với uống RMP đơn độc
Nồng độ RMP cao nhất đạt được trong huyết tương người tình nguyện khi
uống viên hỗn hop Combikits la 6,52 + 1,84 g/ml, thấp hơn so với uống viên đơn lẻ doi chiéu (10,44 + 2,0 ug/ml) va thap hon pham vi diéu trị
Thời gian đạt nồng độ Cmax của rifampicia trong huyết tương khi uống viên hóa hợp Combikits lớn hơn so với viên đơa lẻ, ở phản lớn cá thể đạt Tmax ở 3h, trong khi ở viên đơu lễ là th
3 Sinh khả dụng tương đối của RMP trong viên hón hợp Combikits dang sir dụng hiện nay thấp, chi đạt 64,95% so với viên đơn lẻ (46% — 77% với khoảng tia
cậy 90%)
c/ Hiệu quả về đào tạo
- Đã đào tạo được L nghiên cứu sinh, 1 thac sĩ và 2 được sĩ đại học
- Đã nâng cao được năng lực nghiên cứu, đặc biệt trong lĩnh vực đánh giá sinh khả dụng và tương đương sinh học cho đội ngũ cán bộ giảng dạy của Bộ môn Dược
lâm sàng
- Đã tạo được sự hợp tác trong đào tạo và nghiên cứu khoa học với Viện Lao và Bệnh phổi Trung ương, Bệnh viện Lao Hà nội và gây được sự chú ý của các giáo sư đầu ngành Lao
d/ Hiệu quả về kinh tế
- Để xuất với Bộ Y tế đưa tiêu chuẩn về đánh giá sinh khả dụng của RMP trong các dạng chế phẩm FDC khi cho phép chế phẩm lưu hành hoặc đấu thầu, tránh tình trạng đấu thầu phải những sản phẩm kém chất lượng như biện nay gây lãng phí
ef Hiệu quả về Xã hội:
- Việc phát biện giảm sinh khả dụng RMP của thuốc Combikits từ để tài này đã đem lại lợi ích cho xã hội, tránh tình trạng điều trị kém hiệu quả Đặc biệt nếu sử dụng những dạng chế phẩm có nồng độ thấp sẽ dẫn đến tình trạng tạo ra các chủng vi khuẩn lao kháng thuốc, đặc biệt nguy hiểm là khang RMP
f/ Các hiệu quá khác
Trang 102 Áp dung vào thực tiến sân xuất và đồi sống xã hội
-Giúp cho các nhà bào chế trong nước tút kinh nghiệm nhằm cải tiến quy trình bào chế thuốc chống lao dạng viên EDC
- Giúp cho các nhà điều trị thấy tố vai trò của đánh giá sinh khả dụng của
thuốc
3 Đánh giá thực hiên để tài đối chiếu với để cương nghiên cứu đã được phê duyệt
a/ Ln hồn thành đúng tiến độ
b/ Đã đạt được rnục tiêu nghiên cứu để ra
+ Đánh giá tương đương sinh học của rifampicin trong vién hỗn hợp cố định liều (DO) biện được CTCLQG đang sử dụng
+ Rút ra kết luận về chất lượng của rifampicia trong viên FDC để đóng góp ý kiến cho CTCLQG trong lựa chọn thuốc điều trị
c/ Các sản phẩm tạo ra so với dự kiến:
- Phương pháp chiết xuất va định lượng RMP từ huyết tương người - Chất lượng của sản phẩm thử: Combikits
đ/ Đánh giá việc sử dụng kinh phí: - Sử dụng hợp lý, tiết kiệm
4 Các ý kiến đề xuất
Từ những kết quả nghiên cứu trên đây chúng tôi đưa ra những để xuất và kiếu nghị sau:
1 Cẩn chú ý tới tiêu chuẩn vẻ sinh khả dụng của rứampicin khi đấu thầu mua thuốc chống lao cũng như việc nghiên cứu bào chế thuốc chống lao dạng viên hỗn hợp để đảm bảo bệnh nhân được sử dụng thuốc chống lao đảm bảo chất lượng
2 Có thể sử dụng phương pháp định lượng RMP huyết tương để giám sát nỏng độ điều tị những trường hợp bệnh nhân lao tái trị do đặc điểm giao động giữa các cá
Trang 11PHAN B NOIDUNG BAO CAO CHI TIẾT KẾT QUA NGHIEN CUU
1 ĐẶT VẤN ĐỀ
Thuốc chống lao hỗn hợp cố định liều (Eixed dose combination - FDC) la dang thuốc chứa nhiều thành phần thuốc chống lao trong cùng l chế phẩm Sử dụng thuốc chống lao dạng EDC mang lại nhiều lợi ích cho bệnh nhân và cho thầy thuốc: đảm bảo vấn để tuân thủ điều trị của bệnh nhân dễ dang hơn, thày thuốc kê đơn đơn giản hơn, tránh nguy cơ bệnh nhân bỏ sót thuốc và điều trị đơn trị liệu dẫn tớt tình trạng kháng thuốc Vì những lợi ích trên WHO/TUATLD khuyến cáo sử dụng thuốc chống lao dạng FDC trong chương trình chống lao của tất cả các quốc gia Thuốc chống lao hỗn hợp RMP - INH và RMP - INH- PZA đã được sử dụng rộng rãi từ những năm 80 của thế kỷ XX ở hơn 40 quốc gia trên thế giới
Những nghiên cứu trên thế giới cho thấy thuốc chống lao dạng EDC có độ hoà
tancủa RMP tốt cũng không đảm bảo rằng RMP trong viên FDC sẽ đạt tiêu chuẩn
về sinh khả dụng *! có thể chế phẩm này đảm bảo sinh khả dụng nhưng chế phẩm khác thì sinh khả dụng kém Hậu quả của sử dụng thuốc chống lao dạng EDC có sinh khả dụng không đảm bảo dẫn tới kết quả điều trị kém, nguy cơ thất bại
điều trị và sẽ gia tăng các chủng vi khuẩn lao kháng RMP (không còn lợi ích ngăn
chặn tình trạng kháng thuốc) F®!
Nam 1994, TUATLD và WHO đã ban hành khuyến cáo rằng chỉ những thuốc
chống lao dạng EDC có chất lượng tốt và đảm bảo sinh khả dụng của RMP mới nên sử dụng để điều trị bệnh lao
Năm 1999 WHO đã ban hành quy định tất cả các chế phẩm thuốc chống lao đạng EDC bắt buộc phải được đánh giá sinh khả dụng của RMP trước khi sử dụng điều trị cho bệnh nhân, trong khi sinh khả dụng của INH, PZA, EMB trong các chế
phẩm này dường như ít phải quan tâm hơn do những hoạt chất này dé tan trong
nước, '221 S1
Trang 12Mục tiêu nghiên cứu:
1 Đánh giá tương đương sinh học của riampicia trong viên hóa hợp cố định liêu ŒDC) biện đang được CTCLQG sử dụng
Trang 132 TONG QUAN
2.1 THUỐC CHỐNG LAO HỖN HỢP CỐ ĐỊNH LIỀU
2.1.1 Sự ra đời của thuốc chống lao hỗn hợp cố định liều
Thuốc chống lao hóa hợp cố định liêu (Eixed Dose Combioatioa - FDC) là dạng thuốc chứa nhiều thành phần thuốc chống lao trong cùng ! chế phẩm Những chế phẩm hốn hợp đầu tiên gồm 2 thành phản (2-EDC) trong đồ cé isoniazid (INH) là: TNH-PAS, INH- thiacetazon, ra đời ngay sau khi cé isoniazid (aim 1952) Khi có sự ta đời của cthambutol (EM) và tifampicia (RMP) thi có dạng hóa hợp TNH -
EMB, INH - RMP, trong céc chế phẩm phối hợp 2 thuốc (2-FDC) được sử dụng
rong tai nhất từ khi ra đời đến nay là hốn hợp RMP-INH Hãng Hoechs Marion Rousel đã đưa ra thị trường chế phẩm hón hợp có chứa 3 thuốc RMP- INH- PZA (3-
FDC) đầu tiên năm 1988, dạng viên hồn hợp 4 thuốc RMP - INH- PZA- EMB (4-
FDC) đầu tiên vào năm 1997, cùng thời điểm đó Novatis đưa ra viên hóa hợp 3 thuốc RMP -INH- PZA dành cho trễ em, t1
Thuốc chống lao hón hợp RMP - INH và RMP -INH- PZA đã được sử dụng tộng rãi từ những năm 80 của thế kỷ XX ở hơn 40 quốc gia trên thế giới Đến nay, các chế phẩm bốn hợp chứa 2, 3, hoặc 4 thành phản được sử dụng rộng rãi ở nhiều quốc gia trên thế giới
2.1.2 Lợi ích của việc sử dụng thuốc chống lao dạng FDC
Sử dụng thuốc chống lao dạng FDC mang lại nhiều lợi ích cho bệnh nhân và cho thầy thuốc: đảm bảo vấn để tuân thù điều tị của bệnh nhân dễ đàng hơn, thay thuốc kê don don giản hơn, tránh nguy cơ bệnh nhân bỏ sót thuốc và điều trị don trị liệu đão tới tình trạng kháng thuốc, ngoài ra còn có những lợi ích khác trong thực tiễn Đối với thầy thuốc, phác đỏ điều trị lao cũng trở nên don giản hơn, việc kế đơn thuốc để đầng hơn, giảm những sai sót về tính liều thuốc và tên thuốc khi kẽ đơa, việc hướng dẫn bệnh nhân dùng thuốc cũng thuận tiện hơn
Bệnh nhân dễ tuân thủ điều trị hơn vì số viên thuốc cản phải uống cho một ngày giảm đi Chính điều này đã dẫu tới WHO/TUATLD khuyến cáo sử dụng thuốc chống lao đạng FDC trong chương trình chống lao của tất cả các quốc gia
2.1.3 Chất lượng của thuốc chéng lao dang FDC
Trang 14đặc biệt là đù độ hoà tan của RMP trong viên EDC tốt cũng không đảm bảo rằng MP trong viên FDC sẽ đạt tiêu chuẩn về sinh khả dụng.2U: 5! Những nghiên cứu
trên thế giới cho thấy rằng trong thuốc chống lao dang FDC, cé thể chế phẩm này
dim bảo sinh khả dụng tốt nhưng chế phẩm khác lại có sinh khả dụng kém.” Những yếu tố ảnh hưởng đế sinh khả dụng của RMP cho đến nay đã được biết đến nhưng cũng chưa thật đẩy đủ Hậu quả của sử dụng thuốc chống lao dạng FDC có chất lượng không đảm bảo dẫn tới kết quả điều trị kém và sẽ tạo ra tình trạng kháng thuốc (không còn lợi ích ngăn chặn tình trạng kháng thuốc) 5!
2.2 SINH KHẢ DỤNG CỦA RMP TRONG THUỐC CHỐNG LAO HỖN
HỢP CỐ ĐỊNH LIỀU
2.2.1 Lý do cắn nghiên cứu sinh khả dụng của RMP trong viên FDC
Ngay từ thời kỳ đầu mới ra đời của các chế phẩm hén hop RMP - INH, Acocella và cộng sự đã nghiên cứu so sánh nông độ các thuốc chống lao đạt được trong huyết tương người tình nguyện sau khi uống viên hỗn hợp và riêng lẻ, Năm 1988, trong hội thảo của IUATLD tại Dubrovnik, tiến sĩ Acocella Œ (Trường Đại học Pavia, Italy) đã báo cáo kết quả nghiên cứu sinh khả dụng của RMP trong viên FDC cho thấy sinh khả dụng của RMP đặc biệt là dạng 3-EDC rất kém Những
nghiên cứu khác cũng cho thấy rằng cùng là dạng thuốc chống lao FDC nhưng một số chế phẩm đạt tiêu chuẩn về sinh khả dụng còn chế phẩm khác thì không E1
Năm 1989, Acocella đã công bố trên tạp chí của Hiệp hội bài lao và bệnh phổi quốc tế về kết quả nghiên cứu vẻ sinh khả dụng của RMP trong một số chế phẩm thuốc chống lao (4 chế phẩm RMP đơn lẻ, 4 chế phẩm hón hgp RMP - INH, 4 chế phẩm hóa hợp RMP - INH- PZA) so sánh với các chế phẩm chuẩn đơn lẻ RMP, INH, PZA Chỉ có I chế phẩm RMP đơn lẻ được sản xuất ở châu Âu, còn lại các chế phẩm thử nghiệm trong nghiên cứu này được sản xuất và sử dụng ở các nước châu Á Kết quả nghiên cứu đã cho thấy: 4 chế phẩm RMP đơn lẻ đều đạt tiêu chuẩn vẻ sinh khả dụng, trong khi đó 3 chế phẩm hón hợp RMP - INH cé I chế phẩm nỏng độ RMP trong huyết tương đạt được sau khi uống là rất thấp (giảm 50% so với chế
phẩm chuẩn), 4 chế phẩm FDC 3 thành phản RMP - INH - PZA đều có sinh khả
duog thap
Nam 1994, IUATLD va WHO di ban haoh khuyến cáo rằng chỉ những thuốc chống lao dạng EDC có chất lượng tốt và đảm bảo sinh khả dụng của RMPmới nên sử dụng để điều trị bệnh lao Sau khuyến cáo trên 5 năm, Pillai và cộng sự (1999) đã
trình bày kết quả nghiên cứu cho thấy sinh khả dụng của RMP trong thuốc chống
Trang 15phẩm hồn hợp thuốc chống lao EDC lưu hành trên thị trường thế giới có 7 chế phẩm EDC có sinh khả dụng của RMP kém so với chế phẩm RMP chuẩn đơn lẻ E5!
Năm 1999, trong Hội thảo của WHO tổ chức tại Geneva, G Ellard va B
#ourie đã trình bày những thông tỉa nghiên cứu vẻ chất lượng của thuốc chống lao đạng EDC của nhiều tác giả khác và cũng cho thấy sinh khả dụng của RMP ở những chế phẩm khác nhau có mặt trên thị trường thể giới trong nhiều năm qua có những chế phẩm đạt sinh khả dụng, những chế phẩm khác lại rất kém.EU
Đứng trước thực trạng trên, năm 1999, WHO đã quy định sinh khả dụng của MP trong tất cả các chế phẩm thuốc chống lao dạng EDC bắt buộc phải được đánh giá, trong khi sinh khả dụng của INH, PZA, EMB trong các chế phẩm này dường
như ít phải quan tâm hơn do những hoạt chất này dễ tan trong nước f2!:431
Mặc dù việc tìm ra RMP đã trải qua 4 thập kỷ nhưng cho đến nay, những thông tia nghiên cứu về yếu tố ảnh hưởng đến sinh khả dụng của RMP và những thay đổi của quá trình sản xuất chế phẩm để đảm bảo sinh khả dụng của RMP được công bố rất ít Những thông tia đẩy đủ về việc sử dụng tá dược, thay đổi quy trình bào chế vẫn được giữ kín trong các tài liệu của các nhà sản xuất mà không công bố Chính những điều này làm chậm trễ cho việc hiểu biết và đưa ra giải pháp dảm bảo sinh khả dụng của RMP trong các chế phẩm FDC
2.2.2 Vấn đề đánh giá sinh khả dụng của RMP trong viên EDC tại Việt Nam Thực hiện quy trình đánh giá sinh khả dụng và tương đương sinh học của một chế phẩm thuốc nói chung, đặc biệt là thuốc chống lao dạng EDC ở Việt Nam hiện nay cũng gặp khó khăn ở nhiều khía cạnh Vẻ mặt tài chính, cản có kinh phí không nhỏ chỉ phí cho người tình nguyện khoẻ mạnh tham gia thử nghiệm và cho quy trình
định lượng nỏng độ thuốc trong huyết tương Về mặt kỹ thuật, xây dựng quy trình
định lượng nồng độ thuốc trong huyết tương vốn đã khó khăn, cần có trạng thiết bị (máy HPLC) cùng với chuyên gia có kinh nghiệm vẻ kiểm nghiệm; nhưng định lượng nông độ rifampicin trong huyết tương còn khó khăn hơn vì trong mẫu huyết tương để định lượng rifampicin luôn có nhiều thuốc chống lao khác cùng được uống
đồng thời Về mặt thù tục: do tiến hành nghiên cứu thừ nghiệm trên người tình
nguyện khoẻ mạnh nên phải được Hội đồng đạo đức trong nghiên cứu y sinh học thông qua và cho phép thực hiện
'Với nhiều khó khăn trên, ở thời điểm hiện nay tại Việt nam, người nghiên cứu phải có nhiều nó lực để vượt qua Xét về mặt lợi ích, những kết quả nghiên cứu sinh khả dụng của RMP nói riêng và thuốc chống lao trong viên EDC nói chung sẽ giúp ích cho chương trình chống lao quốc gia trong lựa chọn chế phẩm thuốc chống lao FDC dim bảo chất lượng Đồng thời giúp các nhà sản xuất thuốc trong nước trong
Trang 16việc sản xuất chống lao FDC đảm bảo sinh khả dụng của RMP cũng như các thành phản khác Ngoài ra, đối với cộng đồng, việc đảm bảo chất lượng thuốc chống lao
góp phần điều trị bệnh lao thành công và giảm nguy cơ xuất biện kháng thuốc, điều đó có ý nghĩa lớn trong thực tiển Việt nam hiện nay
2.3 PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG RIFAMPICIN TRONG HUYẾT
TƯƠNG BẰNG HPLC
Để đánh giá sinh khả dụng của RMP, cần xây dựng được phương pháp định lượng RMP huyết tương Có nhiều phương pháp định lượng rifampicin trong huyết tương như phương pháp đo quang, phương pháp sinh học, phương pháp sắc ký, trong đó, phương pháp sắc ký lòng hiệu năng cao (HPLC) là phương pháp phỏ biến hơn cả do có độ chính xác cao, khoảng thời gian phân tích hợp lý và chỉ phí chấp nhận được
2.3.1 Phương pháp chiết rifampicin từ huyết tương
Để chiết hoạt chất từ huyết tương phục vụ cho định lượng thuốc trong huyết tương bằng HPCL thường sử dụng các phương pháp sau:
-_ Phương pháp chiết lỏng - lỏng: bằng dung môi hoặc hỗn hợp dung môi Một số hốn hợp dung môi đã được nghiên cứu để chiết riampicin bao gồm
dichloromethan - diethylether, ti lệ 2:3 (v/v) 1, diethylether: diclomethane, tỉ lệ
2:1 (v#+) 1, hốn hợp butanol - chloroform, ti le 3:7 (v:v) U7
- Phương pháp chiết lòng - rắn: dùng cột chiết xuất pha rắn để chiết hoạt chất Miu được bơm vào cột chiết xuất pha rắn sau đó được rửa giải bằng hệ dung môi
thích hợp để tách hoạt c hất 5°
-_ Tủa protein Phương pháp tùa protein huyết tương là phương pháp đơn giản hơn cả Một số dung môi để tủa protein huyết tương đã được nghiên cứu bao gồm
acetonitril t! 41 (tỉ lệ huyết tương: acetonitril= 1:1,5 hoặc 1:1); methanol °°! 2.3.2 Chương trình sắc ký
Tại Việt Nam, đã có những nghiên cứu vẻ phương pháp định lượng rifampicin trong chế phẩm bào chế 11 Trong chế phẩm bào chế, qui trình chiết và phương pháp định lượng thường đơn giản hơa định lượng trong huyết tương do tạp (các tá dược) thường có bản chất là chất vô cơ và hầm lượng trong thuốc thường đã được dự đoán
trước
Trên thế giới, có nhiều chương trình sắc ký được sử dụng để tách tiiampicin ra khỏi huyết tương
Trang 17Bang 2.1: Mét s6 chuong trinh HPLC dink Luong rifampicin trong huyét tuong Luu lượng dòng (ml/phút) Cột sắc ký Pha động liChosobRP8 |A:Đẹmphosphat |0-5 phút: Btăng (230x4,6mmID., | nồng độ 10 mMM (pH | từ 10% - 80% 5 jum, Merck) 3,5) Từ 5 phút : Tiên cột: C8 (30 um, | B: Acetonitdl / đệm |- A:20% 30 mmx 4,6 mm phosphat (2:3) - B:80% 1D.) Tốc độ: 1,5 1mÍ/phút Spherisorb C 8 (250 | A: AcetonirdL 0-5 phút: À tăng x 4,6 mm 1D.„ 5 B:Demphosphat | từ6-90% jum, Phase Sep, nông độ 5 mM (pH | 5-12 phút: USA) 3,5) = A:90% Tiên cột: C8 (30 tim, - 10% 50 mmx 4,6 mm Tốc độ: 2 ml/phút 1D.) BondapakC 18 (30 | Methanol - 0,05 M emx3,9mm, 10 | ammoniumfommate um) (65:35) Spherisorb C 8 (250 | Acetonirrile- 0,1% x 4,6 mm 1D.„ 5 acid trifluoroacetic jum, Supeleo, (80:20) Bellafonte, PA, USA) Tiên cột: C8 ‘Nova Pack C18 250 | Methanol- dung địch mmx 4mm,4 ym) | 0/01 MNatd pho sphat pH 5,2 65:35)
2.3.3 Độ ổn định của rifampicin trong huyết tương
Rifampicia dễ bị phân huỷ ở nhiệt độ thường Le Guellec va cong sur! tại phòng thí nghiệm dược lý và độc tính lâm sàng, CHU Brctonneau, Tour, Pháp tiến hành nghiên cứu độ ổu định của rifampicin trong mẫu huyết tương kết quả cho thấy: tifampicia bị phân huỷ nhanh chóng ở nhiệt độ thường (25°C) tới 54% trong vòng 8 giờ, thêm acid ascorbic có thể kéo đài độ én định của rifampicin 16i 12 giờ Rifampicia ở nông độ thấp bị phân huỷ nhanh hơn Tuy nhiên, ở nhiệt độ -20°C, rifampicia én dioh hon Rifampicia trong huyết tương bệnh nhân uống riampicia thé hiện độ ổa định cao hơn, có thé do ở điều kiện in vivo, các phân từ tifampicin đa định hơn
Trang 18Mot s6 oghiéa ctu vé do da diah cia rifampicin huyét tương được tóm tắt ở bảng 2.2
Bảng 2.2: Kết quả các nghiên cứu độ ổn định của rjfampicir
Mẫu báo quần Điều kiện bao quan bao quan Nhiệt độ Thời gian ổn định Mẫu huyết tương Thêm acid ascorbic -20°C 6 thang Mau sau khi chiết -20°C 1 đêm
Mẫu riampicin tự tạo
trong huyết tương,
Đảo quản bằng acid
ascorbic -20°C 6 thang
Mẫu huyết tương bệnh
nhân uống rifampicin -20°C 6 thang
Mau huyết tương bệnh
nhân uống rifampicin
- 80°C 12 tháng
Như vậy, các tác giả đưa ra các kết quả nghiên cứu khác nhau, do đó việc tiến hành nghiên cứu độ ổn định của rifampicia trong mẫu giả và trong mẫu huyết tương bệnh nhân uống thuốc là cần thiết
2.3.4 Các chỉ tiêu thầm định phương pháp định lượng
Thẩm định phương pháp phân tích là xác nhận độ tin cậy của phép do hoạt chất
trong môi trường đã cho bằng thực nghiệm
Các chỉ tiêu thẩm định bao gồm tính đặc hiệu, độ đúng, độ chính xác, hàm đáp ứng, giới hạn định lượng và độ ổn định của mẫu Thẩm định phương pháp theo hướng dẫn của ASEAN, FDA-US vẻ xây dựng các phương pháp phân tích sinh học
8111.1121.189]
Trang 193 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
Người tình nguyện khoẻ mạnh (12 người), lựa chọntheo các tiêu chuẩn sau:
3.1.1.Tiêu chuẩn lựa chọn
Tuổi L8 - 35, không phân biệt giới
Cân nặng 45 - 55 kg
Được xác định là khoẻ mạnh dựa trên các dữ liệu lâm sàng và cận lâm sàng Chức năng gao, thận, huyết học bình thường; biểu hiện bằng các chỉ số xét
aghiệm sinh hoá mầu (ASAT, ALAT, bilirubia toàn phản, ure, creatinia), các chỉ số huyết học (số lượng hỏng cầu, số lượng bạch cầu, công thức bạch cầu, hemoglobin), xét nghiệm nước tiểu (protein, glucose, hỏng cẩu, bạch cầu) trong giới hạn bình thường
Có cam kết tình nguyện tham gia nghiên cứu
3.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ:
Phụ nữ có thai hoặc đang cho con bú Tiên sử dị ứng với các thuốc thử nghiệm Tiên sử bị động kinh Suy gan-thận Nghiện rượu, ma tuý, thuốc lá HBsAg (+) HIV(+)
3.2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 3.2.1 Thuốc nghiên cứu
- Thuốc viên bốn hợp đang sử dụng trong CTCLQG: biệt duge Combikit bao gồm L viên 2-EDC (rfampicin-isoniazid) + 1 viên pytazioamid trong cùng 1 vỈ
(RH+2), hạn sử dụng 01/ 06 của hãng Lyka labs /Ấn độ
- Thuốc chuẩn đối chiếu: rifampicin (R), isoniazid (H), pyrazinamid (Z) déu & dạng viên nén Hầm lượng, tên thương mại, nguồn gốc, bạn sử dụng, số viên uống cho mỗi liêu đơn như trong bảng 3.1
Trang 20Bang 3.1 Thuốc sử dụng trong nghiên cứu
Tên hoạt chát/ Biệt dược Hãng SX/ Số Bí Hàm lượng Nước SX Hạn sử dụng Rifampiein L50 mg (RH)179G/2774A Isoniazid 100 mg Lyka labs /An dg |_ (Z)L79G/2423A Pyrazinamid 500 mg Exp 01/2006 Fatol Acneimittel/ OOL051
Rifampicin 150 TẠP kho Eremfat 150 Đức Exp 05/2005 Lafal C12 Tsganizid 100 me: labocatoices/Phép | Exp 04/2008 Novatis/ 344M040L Pycazinamid 500 mg Bangladesh Exp 04/2006
* Đặc điểm của chế phẩm chúa RIMP nghiên cứu
Các thuốc sử dụng trong nghiên cứu này không phải là những chế phẩm mới, đây là những thuốc đang sử dụng điều trị cho bệnh nhân Đặc điểm vẻ hàm lượng và độ hoà tan của chế phẩm chứa RMP đơn lẻ và hốn hợp đã được thu thập trước khi tiến hành thừ nghiệm Dựa trên phiếu kiểm nghiệm lô hàng khi nhập khẩu của Trung tam kiểm định quốc gia (VINACONTROL) cho thấy chế phẩm hón hợp chứa
RMP trong thừ nghiệm đạt các tiêu chuẩn về hàm lượng (99,7% so với trên nhãn),
độ hoà tan đã được đánh giá đạt Riêng chế phẩm đối chiếu (RMP đơn lẻ) được đặt mua từ nước ngoài và đã được nhà sản xuất kiểm nghiệm lô hàng (hàm lượng RMP
trong chế phẩm L01,7% so với trên nhãn)
Sự khác biệt về hầm lượng RMP của các chế phẩm chứa RMP là không đáng kế (2%) so với hàm lượng thực ghỉ trên nhãn
Những chế phẩm chúa RMP trong nghiên cứu này đạt tiêu chuẩn về hàm
lượng và độ hoà tan
3.2.2 Máy móc thiết bị
- Hệ thống máy sắc ký lòng hiệu năng cao Spectra System Thermo Finigan -_ Máy li tâm: Hermle Z200A (Đức)
-_ Máy lắc siêu âm
- Can phântích: Presia XB220A (Thuy Sỹ) với độ chính xác 0,lmg ~_ Tủ lạnh sâu - 40%
- Máy dopH
Trang 21- Máy lọc
-_ Các dụng cụ thí nghiệm khác: pipet tự động, pipet thuỷ tỉnh chính xác, các dụng cụ thủy tỉnh thí nghiệm
3.2.3 Hoá chất thí nghiêm
- _ Riampicin, Isoniazid, Pyrazinamid chuẩn quốc tế - Methanol diag cho HPLC
- Acetonittil dùng cho HPLC
- Kali dihydrophos phat: loai tinh khiét phan tich 3.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3.1 Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng rifampicin trong huyết tương
3.3.1.1 Xây dựng phương pháp định lượng rifampicin trong huyết tương
Có nhiều phương pháp định lượng rifampicin trong huyết tương, chúng tôi chọn phương pháp sác ký lòng hiệu năng cao (HPLC) do phương pháp này có độ chính xác cao, thời gian phân tích hợp lý và chỉ phí chấp nhận được Phương pháp chiết rifampicin và chương trình sắc ký được nghiên cứu như sau:
"Phương pháp chiết: Mẫu tifampicia chuẩn trong huyết tương được nghiên cứu chiết với các loại dung môi khác nhau để tìm ra dung môi có hiệu suất chiết cao
"_ Chương trình sắc ký Cột sắc ký:
Khảo sát khả năng tách và định lượng rứampicia trong huyết tương trên cột
phù hợp, có khả năng tách rifampicin ra khỏi mẫu phân tích Pha động
Tiến hành khảo sát nhiều hệ pha động khác nhau dựa vào các nghiên cứu trước và độ tan của rifampicin trong dung môi với các tỉ lệ khác nhau để tìm ra hệ pha động có khả năng tách rifampicia ra khỏi mẫu phân tích và có thời gian lưu hợp lý
Bước sống
Tiến hành quét phổ rifampicin, tìm bước sóng hấp thụ để xác định bước sóng phân tích
Tiêu lượng đồng
Thay đổi lưu lượng đòng từ 0,7 đến 1,5 ml/phút để tìm lưu lượng dòng thích hợp, có thể tách riêng pic của rifampicin ra khỏi pic tạp và thời gian phân tích hợp lý
Trang 22Thể tích tiêm
Thử với một số thể tích tiêm tir20 - 50 yl dé tim thể tíc h tiêm cho diện tích pic
phù hợp
3.3.1.2 Thâm định phương pháp định lượng
Sau khi xác định được phương pháp định lượng rifampicin chúng tôi tiến hành thẩm định phương pháp theo các chỉ tiêu sau:
"_ Tính đặc hiệ
Chuẩn bị các mẫu huyết tương trắng (huyết tương không có rifampicia), mẫu chuẩn (huyết tương tring + rifampicin adug 46 10 pg/ml), mẫu chuẩn (mẫu huyết tương có chứa rifampicia, isoaiazid, pytazioamid) và mẫu thử (mẫu huyết tương bệnh nhân 2 giờ sau khi uống hốn hợp rifampicia, isoniazid, py razinammid)
Các mẫu được xử lý, chạy sắc ký, so sánh sắc đỏ của mẫu huyết tương trắng, mẫu chuẩn riampicia trong huyết tương và mẫu huyết tương bệnh nhân uống hốn
hợp R-H-Z để xác định tính đặc hiệu của phương pháp =_ Độ đúng: Xác định bằng phương pháp thêm
Pha 10 mẫu rifampicia trong huyết tương với nồng độ 8 ug/ml, 5 mẫu đầu thêm chính xác vào mỗi miu 4 jig, 3 mẫu sau thêm vào mỗi mẫu 8 yg Tiến hành xử tý, chạy sắc ký, tính tỉ lệ tìm lại rifampicia từ điện tích pic theo công thức sau:
Tổng lượng RMP - Lượng RMP ban đầu
% tifampicin tim lai = ——————————_ x 100%
Lượng RMP thêm vào
=_ Độ chính xác
Pha mẫu chuẩn với nông độ 8 ¡g/ml, tiến hành xử lý mẫu, chạy sắc ký mẫu 5 lầu Đánh giá độ chính xác qua kết quả đo được
"_ Hàm đáp ứng
Pha đấy nông độ tifampicia chuẩn trong huyết tương từ Í đến 30 jg/ml, tiến hành xử lý mẫu, chạy sắc ký Nghiên cứu sự phụ thuộc của điệu tich pic thu được với nồng độ rifampicia Sự phụ thuộc là tuyến tính chặt khi hệ số tuyến tính r gần I
"Giới hạn định lượng
Từ mẫu huyết tương có nồng độ Lug/aml, pha loãng nhiều lần để được các nồng độ nhỏ hơn (0,5 géml, 0,2 g/ml; 0,1 ugúm|), mỗi nông độ 5 mẫu Tiến hành xử lý miu va chạy sắc ký Xác định nỏng độ là giới bạn định lượng thấp nhất khi:
Trang 23- Đáp ứng pic tại giới hạn định lượng thấp nhất > 5 lần so với đấp ứng pic
tương ứng ở mẫu trắng (nếu có)
- Pie của chất phân tích tại giới hạn định lượng thấp nhất có tính xác định, phân biệt, tái hiện với độ chính xác có hệ số biến thiên không quá 20%
"_ Độ ổn định của mẫu phân tích
"Mẫu huyết tương bệnh nhân uống rifampicin được bảo quản trong ống nghiệm nhựa, nút kín, ở nhiệt độ - 40°C trong khoảng thời gian 3 tháng Tại thời điểm một tháng, hai tháng, ba tháng, mẫu được lấy ra phân tích tìm hàm lượng còn lại sau thời gian bảo quản để xác định độ ổn định của rifampicin trong mau huyét tung
3.3.2 Nghiên cứu sinh khá dụng của RMP
3.3.2.1 Thiết kế nghiên cứu
Nghiên cứu ngẫu nhiên, liêu đơn, so sánh chéo ba, ba giai đoạn trên người tình
nguyện
Thiết kế nghiên cứu ngẫu nhiên:
Người tình nguyện được bố trí ngẫu nhiên thành 3 nhóm thử nghiệm như
sau:
- 12 người tình nguyện được mã hoá từ Á đến M
- Chuẩn bị 12 phiếu bốc thăm: 4 phiếu để “nhóm 1”, 4 phiếu để “nhóm 2”, 4 phiếu để “nhóm 3° - Cho người tình nguyện bốc thăm để phân ngẫu nhiên 12 người thành 3 nhóm - Kết quả: Nhóm I: gồm 4 người tình nguyện có mã A, D, E, E Nhóm 2: gồm 4 người tình nguyện có mã B, C, K, L Nhóm 3: gồm 4 người tình nguyện có mã G, H, I, M
Thiết kế nghiên cứu chéo ba, ba giai đoạn:
Mối người tình nguyện đều trải qua 3 giai đoạn, mối giai đoạn uống một trong các thuốc sau:
- Rifampicia doa doc (R)
- Rifampicia- isoniazid- pytazinarnid 3 loại riêng tế (R-H-Z) - Viên Combikit (RH4Z)
Trang 24Trình tự các giai đoạn thử nghiệm của các nhóm như sau:
Bảng 3.2 Bố trí các giai đoạn thử nghiệm theo từng nhóm Giai đoạn Giai đoạn I Giai đoạnH | GiaiđoạaHI Nhóm L R RH+Z RHZ Nhóm 2 RHrZ REZ R Nhóm 3 REZ R RH+Z Mối giai đoạn thừ nghiệm các h nhau một tuần Số viên thuốc cho mới liêu đơn như trong bảng 3.3
Bang 3.3 Số viên thuốc cho mỗi liều
Tên thương mại Thành phần Combikit® RH-Z Eremfat® 150 Rimifon® PZA-CIBA®
3.3.2.2 Mô tả phương pháp tiến hành
Trước khi tiến hành nghiên cứu, đề cương chỉ tiết đã được thông qua tại Hội đồng Đạo đức trong nghiên cứu Y sinh học của Trường Đại học Dược Hà Nội xem xét, chấp thuận và cho phép tiến hành (Phụ lục 7)
Các dữ liệu thu được trên người tình nguyện được ghỉ vào L phiếu theo mẫu
(Phụ lục 1)
Tựa chọn người
ình nguyện:
- _ Người khoẻ mạnh tình nguyện tham gia thử nghiệm được thăm khám lâm sàng,
làm xét nghiệm cản thiết (sinh hoá, huyết học, nước tiểu, HIV, HBV) để lựa
chọn đối tượng đủ tiêu chuẩn nghiên cứu Những đối tượng đù tiêu chuẩn có ký cam kết tình nguyện mới thu nhận vào nghiên cứu
Địa điền khám lâm sàng, uống thuốc và lấy mẫu mâu:
-_ Địa điểm khẩm lâm sàng, làm xét nghiệm, uống thuốc, lấy máu và theo dõi
trong quá trình thử nghiệm tại Bệnh viện Việt Nam - Cuba
-_ Theo đối, lấy máu và xử trí cấp cứu các tình huống bất thường trong quá trình thử nghiệm do bác sĩ và y tá dầm nhận
Trang 25
Cho người tình nguyện uống thuốc:
= Cho uống thuốc là người của nhóm nghiên cứu
-_ Ngày trước khi uống thuốc, ăn tối muộn nhất vào lúc 18h Sáng hôm sau nhịn ăn sáng Thuốc được uống lúc 7h với 200 mÍ nước (nước tỉnh khiết đóng chai)
Được ăn nhẹ lúc 9h Ăn trưa vào lúc l1h sau khi lấy mẫu máu giờ thứ4
Tiến hành lấy mẫu mầu:
—_ Mẫu được lấy như sau: 0h (trước khi uống thuốc), 30', 45”, 60', 90", 2h, 2h30, 3h,
4h, 8h, 12h, 24h
-_ Số lượng máu của mỗi mẫu là 5 mÍ, máu tính mạch, chống đông bing heparin;
trong vòng L3 phút sau khi lấy máu, ly tâm để tách huyết tương Mỗi mẫu máu
tách thành 2 mẫu huyết tương (Imlánẫu), ! mẫu để phân tích nỏng độ tiiampicia, mẫu còn lại để dự trữ sau khi phân tích số liệu, nếu nghỉ ngờ có thể phân tích lại
-_ Huyết tương tách ra cho vào ống nghiệm bằng nhựa, nút kín, dán nhãn có mã hoá mẫu, bảo quản trong tù lạnh sâu - 40% cho đến khi định lượng Thời gian bảo quản mẫu tối đa l tháng
Phân tích định lượng nông độ RMP bằng phương pháp HPLC
Sử dụng phương pháp định lượng RMP huyết tương đã được xây dựng và thẩm định phương pháp để định lượng RMP trong các mẫu huyết tương
Đánh giá tương đương sinh học của RMP từ viên Combikit:
Từ nỏng độ đo được, xây dựng đường cong nỏng độ - thời gian của mỗi dạng
chế phẩm
Tính các thông số dược động học của mỗi dạng chế phẩm (AUC, AUC,„.,
Cmax, Tmax, Ty, )-
So séoh AUC, AUC «, Cmax, Tmax, T,; của RMP từ viên Combikit với
đạng uống đơn lẻ và uống 3 viên phối hợp R-H-Z
3.3.3 Phương pháp thống kẻ, xử lý số liệu 3.3.3.1 Tính các thông số được động học
Sử dụng phần mềm chuyên dụng WINNOLIN 2.L để tính toán các thông số được động học RMP dựa trên các số liệu đo được từ thực nghiệm Các thông số dược động học chính cần xác định là:
~C„„„ - Nông độ tối đa của RMP/ huyết tương
Trang 26~Tz„„ - Thời gian đạt C„.„
Hai thông số C, T,„ lấy trực tiếp từ số liệu của thực nghiệm
- AUC, - điện tích dưới đường cong nỏng độ thời gian từ thời điểm 0 đến t giờ, theo qui tắc hình thang G+ Cus) Goa = 6) 2 - AUC sạ: diện tích dưới đường cong nồng độ thời gian từ thời điểm 0 đến vô cực, tính theo công thức: AUC = Sey C+C abn 4) 4S A, - Thời gian bầu thải Tụ; = a (A,: hằng số tốc độ thải trừ)
3.3.3.2 Đánh giá sinh khả dụng của RMP trong chế phẩm:
Một số thong sé due dong hoc chiah céa so séah fa AUC, AUC) 00, Cas tans Tye Sir dung phurong phép Avo one-side tests bay goi là phương pháp khoảng tia cay 90% Các thông số trên được chuyển logarith tự nhiên và phân tích phương sai Khoảng tin cậy 90% của tỷ lệ giá trị trung bình thông số dược động học giữa RMP đơn độc và R-H-Z (viên đơn lẻ); giữa viên hỗn hợp RH+Z và R-H-Z đơn lẻ theo công thức sau: Cone moơ~Amqaux| 29/0) Clep-a-zt amp = 100xe * : Appa > “hạ g~z #ÍQ a3: "4 CÍ(z/z-„-z) = 100% € PS
Với: sla gid trị trung bình của thông số đã chuyển logarith
toa, — tra từ bảng Student t-fest với
Trang 274 KẾT QUÁ NGHIÊN CỨU
4.1 XAY DUNG VA THAM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG RIFAMPICIN TRONG HUYẾT TƯƠNG
4.1.1 Xây dựng phương pháp định lượng rifampicin trong huyét tương
Phương pháp chủ
- Lựa chọn xử lý mẫu bằng phương pháp tủa protein huyết tương Các dung môi được nghiên cứu để tùa protein bao gồm:
+ Methanol tinh khiết, tiêu chuẩn HPLC + Acid trichloroacetic 5%
+ Acetonitril tình khiết, tiêu chuẩn HPLC
Nghiên cứu trên các dung môi thay, acetonitril có khả năng kết tủa protein
dưới dạng tùa bông, khi li tâm dễ dàng tách được dịch chiết
- Lay 1 ml huyét tương, thêm 1,5 ml acetonitril, lắc bằng máy lắc trong l phút Tiếp tục li tâm trong 25 phút, tốc độ 3500 vòng/phút Dịch li tâm được lọc qua giấy lọc
có kích thước lỗ 0,45 km và được tiêm vào cột sắc ký Chương trình sắc ký
"Xúc định côi sắc ký:
Dựa vào kết quả nghiên cứu của các tác giả và dựa vào điều kiện thực tế, chúng tôi đã lựa chọn cột pha đảo Alltech Apollo C18 (250 mm x 4,6mm, kích
thước hạt 5 im)
»_ ác định pha động:
Có nhiều hệ pha động được nghiên cứu:
- Đệm pho sphat pH 4,5: Methanol
Acetonitril: 0.1% trifluoroacetic
Các hệ pha động trên được nghiên cứu với tỉ lệ khác nhau, chúng tôi xác định hệ dung môi đệm phosphat pH 4,5: Methanol với tỉ lệ 35: 65 là hệ dung môi phù hợp, đảm bảo tách tốt rifampicin có thời gian lưu hợp lý (8,5 phút)
= Xác định bước sóng phát hiện
Rifampicin hấp thụ ở một số bước sóng, chúng tôi chọn bước sóng 254 am làm bước sóng nghiên cứu
»_ Xác định lu lượng dòng:
Khảo sát sự thay đổi lưu lượng dòng từ 0,7 - 1,5 ml/phút, chọn lưu lượng đồng 1 ml/phút cho pic tach tot và thời gian lưu hợp Lý (8,5 phút)
Trang 28Từ các kết quả nghiên cứu trên, chúng tôi đã lựa chọn được các điều kiện sắc ký như sau:
- Pha tĩnh: Cột Alltech Appolo C18 (230 mm x 4,6mm, kích thước hạt 5 jum)
- Bảo vệ cột: Alltech Appolo (7,5 x 4,6 kim)
- Dung dịch đệm: Dung dịch kali dihydtophosphat 0,02M, điều chỉnh pH về 4,5 bang dung dichacid phosphoric 1%
- Pha động: methanol: dung dịch đệm = 65%:35% - Bước sóng định lượng: 234 am
- Thé tich tiém: 30 pl
-_ Thời gian phân tích cho l mẫu là 12 phút
4.1.2 Thẩm định phương pháp định lượng
Phương pháp định lượng rifampicin trong huyết tương bằng HPLC như trên được thẩm định các chỉ tiêu sau: độ chọn lọc, độ đúng, độ chính xác, hàm đáp ứng, giới hạn định lượng và độ ổn định của mẫu trong huyết tương
4.1.2.1 Độ chọn lọc của phương pháp
Chuẩn bị các mẫu sau:
- Mẫu I: Mẫu huyết tương trắng
- Mẫu?2: Mẫu rifampicin trong huyết tương với nồng độ 10 ug/ml
- Mẫu 3: Mẫu rifampicia trong huyết tương với nông độ 10 hgímL với sự có
mặt của TNH (nồng độ 10 g/ml) va PZA (ndag do 30 pg/ml)
Ba mẫu trên được xử lý và tiến hành định lượng như mục 3.3.1 Sắc đỏ được
thể hiện trong phụ lục
Qua sắc dé ta thấy:
-_ Thời gian lưu của tampicin là 8,5 phút
- Trên sắc đổ của huyết tương trắng không có pic tại vị trí pic cita rifampicia Trên sắc đỏ của mẫu có thêm rifarnpicin có pic của rifampicin, gọn, rõ, câu
đối
- — Trên sắc đổ của mẫu có thêm riampicia, INH và PZA, tại vị trí pic của riarnpicia không có pic của các chất khác, chứng tỏ phương pháp có khả năng tách tốt rifampicin khdi INH va PZA
4.1.2.2 Xây dụng đường chuẩn
Đường chuẩn của rifampicia trong huyết tương được xây dựng trong khoảng nồng độ từ 0,2 - 30 _ig/ml, tiến hành xử lý mẫu và chạy sắc ký như phần 4.L.1 Kết quả được thể hiện ở bảng 4.1 và hình 4.1
Trang 29Bảng 4.1: Sự phụ thuộc của điện tích pic vào nồng độ Nẵng đệ rifampicin Digntich pic (ugml) 5000000 02 30012 4500000 4 05 T 60470 87900 ` soooooo ạ 3500000 ee ] 4 581200 2s00000 | 5 1182484 § 2000000 + 2 1762440, © 1500000 + Tổ 2302502 ¬ 500000 20 2900616 3 30 436074 o 4 8 12 16 20 24 28 Phương trình hồi quy "Năng 48 (gin) y = 145 165x+ 12609 và hệ số tướng quan r=0/ occas Hinh 4.1 Tương quan nẵng độ — diện tích pic ee
Kết quả thực nghiệm cho thấy có sự tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa diện
tích píc và nồng độ rifampicin trong khoảng khảo sát ( R= 0,999)
4.1.2.3 Độ đứng của phương pháp
Độ đúng của phương pháp được xác định bằng phương pháp thêm
Pha I0 mẫu rifampicin trong huyết tương với nông độ 8 pg/ml, 5 miu đầu thêm vào mỗi mẫu 4 ig, 5 miu sau thém vào mỗi mẫu 8 g, tiến hành xử lý mẫu và
định lượng ta được kết quả như bảng 4.2
Qua kết quả bảng 4.2 cho thấy, phương pháp có hiệu suất xap xi 100% và độ lệch chuẩn tương đối < 3,5% chứng tỏ phương pháp có độ đúng cao, có thể áp dụng
trong thực nghiệm xác định nỏng độ rifampicia trong huyết tương
Bang 4.2: Xác định độ đúng của phương pháp
Trang 304.1.2.4 Độ chính xác
Tiến hành pha mẫu tifampicia trong huyết tương có nỏng độ khoảng 8,0 pg/ml, Tiga hành xử lý mẫu và đo như mục 4.1.1 Kết quả thu được thể biện ở bảng 4.3: Bảng 4.3: Xác định độ chính xác của phương pháp Mau Lan 1 Tần 2 Tần 3 Nông độ do được (ug/ml) 8,32 848 832 TB +SD : 8,37 ‡ 0,0656 CV% : 0,78 % Qua kết quả ở bảng 4.3 ta thấy, phương pháp có độ chính xác cao với R8D < 19% 4.1.2.5 Giới hạn định lượng
Xác định giới han dich lượng dựa trên khảo sắt các mẫu huyết tương có nông 46 0,5pg/ml, 0,2ugiml, 0,Lugiml Ở cả 3 nông độ này vẫn phát hiện được pic của tifampicia trên sắc đỏ, trong khi ở các mẫu huyết tương trắng không có pic Tuy nhiên, dựa vào tiêu chuẩn xác định giới hạa định lượng (trình bày trong phản phương pháp nghiên cứu-3.3.1.2), chúng tôi xác định nông độ 0,2 g/ml là giới hạn định lượng thấp nhất (Kết quả trình bày trong bảng 4.4.)
Bảng 4.4: Độ chính xác của phương pháp định lượng ở nông độ 0,2pgiml Nôngđộ | Nong dodo Tra Sai khác thực ( pm) | được (gi) | Si Khác CẾ) | trụng bình 0205 0,225 9,76 0205 0,200 244 0205 0,235 14,63 7,71% 0205 0,189 7,80 0205 0,213 3,90
Pic rifampicin 6 odag do 0,2 ¡g/eml xác định, không trùng với pic khác, tái biện, sai khác trung bình khi nghiên cứu độ chính xác là 7,71% (không quá 20% theo quy định của FDA)
4.1.2.6 Độ ổn định của mẫu trong điều kiện bảo quản
Nghiên cứu độ ổn định của rifampicin trong mẫu huyết tương tự tạo và trong,
mẫu huyết tương người tình nguyện trong thời gian 3 tháng ¥ Mau tự tạo của RMP trong huyết tương
Trang 31Rifampicio chuẩn được pha trong huyết tương trắng với nỏng độ từ 0,6 g/ml
đến 19,2 jig/ml Mẫu huyết tương được bảo quảo trong ống nghiệm ptopylen có nắp, bọc giấy bạc và bảo quản ở nhiệt độ - 40ĐC trong tù lạnh sâu trong 3 tháng Tại thời
điểm ngay sau khi chuẩn bị mẫu, sau | tháng, 2 tháng, 3 tháng, mẫu huyết tương
được xử lý và định lượng
Bảng 4.5: Độ ổn định của mẫu rifampicin trong huyết trương trắng
Sau 1 thang Sau 2 tháng Sau 3 tháng Nông độ | % còn | Nóng độ | % còn | Nông độ | % còn (tg/ml) lại (pgiml) Bỉ (pgíiml) lại 0,62 103,3 0,60 1000 0,58 96,7 1/23 10,5 113 94,2 1,18 983 4,57 952 4,54 %6 4,35 90,6 S48 98,8 955 99,5 9,6 100,2 13,48 100,6 13,03 972 13,15 981 18,96 98.8 19,16 99,8 19,0 99,5 99,9 TB 97,5 TB 972 2,96 SD 2,65 SD 3.46 2,96% 2,72% 3,56 %
Kết quả thực nghiệm cho thấy rifampicin trong huyết tương ổn định trong 3
tháng với điều kiện bảo quản ở nhiệt độ - 40°C, tránh ánh sáng
* Mẫu huyết tương người tình nguyện
Mẫu huyết tương người tình nguyện uống hón hợp thuốc chống lao rifampicin-isoniazid-pyrazinamid được lấy, phân tích ngay để xác định nông độ tifampicin và các mẫu còn lại được bảo quản trong ống nghiệm propylen, nip kin, bọc giấy bạc và bảo quản trong tù lạnh sâu nhiệt độ - 40°C trong 3 tháng Tại thời
điểm ngay sau khi chuẩn bị mẫu, sau | tháng, 2 tháng, 3 tháng, mẫu huyết tương
này được xử lý và định lượng rifampicin Kết quả được thể hiện ở bảng 4.6
Trang 32Bang 4.6: Dé on dink cia mau rifampicin huyét tuong ngubdi tinh nguyén
Sau 1 thang Sau 2 thang Sau 3 tháng
% tim lại Nong độ
Trang 334.2 SINH KHA DUNG CUA RMP TREN NGUOI TINH NGUYEN 4.2.1 Đặc điểm của nhóm người tình nguyện Bảng 4.7 Một số chỉ số nhóm người tình nguyên Trung bình Cân nặng (kg) 46-55 Chiều cao (m) 1,53- 1/71 Tuổi 19-28 BMI 18-215
Người tình nguyện tham gia vào thử nghiệm bao gồm cả 2 giới (trong đó nam 8, aif 4), các chỉ số huyết học, sinh hoá và lâm sàng đều trong giới hạn bình thường Cân
nặng trung bình 51,21 + 3,19 kg, chiều cao trung bình 1,63 + 0,06 m; chi sé BMI 18 - 2133
4.2.2 Nông độ RMP trong huyết tương và các thông số dược động học của RMP trên người tình nguyện
Tiến hành định lượng nồng độ RMP trong huyết tương và xác định các thông số được động bọc của RMP trên 12 người tình nguyện khi uống RMP đơn độc, RMP - TNH - PZA đơn lẻ và viên hỗn hợp RH+PZA Tại thời điểm 24 giờ sau khi uống thuốc, với phương pháp định lượng vừa xây dựng được có giới bạn định lượng là 0,2pg/enl, da số các mẫu không xác định được nỏng độ RMP Do đó dể xác định AUC, chúng tôi không sử dụng thông số AUC¿.„, mà tính A ỨC, ;
Các kết quả nồng độ RMP huyết tương khi uống từng chế phẩm và các thông số được động bọc thể hiện trong các bảng từ 4.8 đến 4.13
Bang 4.8: Néng dé Rifampicin trong huyét tường (ugÌml) người tình nguyện Khi udng rifampicin don déc(RMP)
Trang 34Bang 4.9 Thong s6 duoc dong hoc cia rifampicin 6 12 ngubdi tinh nguyén khi uéng RMP don độc THONG $6 DDH Trink ty thir thuốc AUCsu | AUCs„ dư]; RRR AE TH R1 RHZRH7:R TiRH12 RE EEIDZLSIE2 TRE, RAZ: R RAZ RH: R RAZ RAZ RRA TH RE TH R HE RAZ RRA
Mẫu ở thời điểm 0,75h của người tình nguyện A,D, E, F bị hỏng trong quá trình lấy máu, vì vậy không có mẫu để xác định nảng độ ở các thời điểm trên
Bảng 4.10 Nông độ RMP huyết tương ( ugin) của 12 người tình nguyên khi uống viên hỗn hợp rfampicin ~isoniazdd đông thời với pyrazinamid (RH+Z)
Trang 35Bang 4.11 Thong số được động học của rifampicin ở 12 người tình nguyên khí uống viên hỗn hợp rƒfampicin — isoniadd + pyradnamid(RH+Z) "THONG SO DDH Trình tự th thuốc AUC, | AUCs (ugh) R.RH+2.R.H.Z RH+Z; R.H-Z;R RH+Z; RHZ;R RGRH+Z;R-H-Z R;RH+Z;R-H-Z R;RH+Z:R-H-Z R.H-2;R; RH+Z R:H-Z; R; RH+Z, R.H-Z;R; RH+Z RH+Z, RAZR RH+Z; RHZ;R RH-Z; Ry RHGZ
Có 4 cá thể không đo được nồng độ RMP ở thời điểm 0,5b, 1 cá thể đến 3b sau khi uống mới đo được nồng độ RMP huyết tương và ở thời điểm 8h sau khi uống nồng
độ đã rất thấp Sự giao động nông độ RMP trong cùng 1 thời điểm giữa các cá thể tất lớn,CV% từ39,7 - 125,49
Trang 36Bảng 4.13 Thông số được déng hoc cia rifampicin 6 12 ngudi tình nguyện khử uống đồn g thời 3 loại vién rifampicin, isoniazid, pyrazinamid don lé (R-H-Z) THONG SO DDH Coase Tước ALCpa, | ALCg (ugim) | (Œh) | (uehim) | (wg.h/mÐ Trình tự thứ thuốc RARE REZ RAR REZ RADE TH HZ RRZERAZ RRRAZ RAZ RRA RAZ: Ri RZ RHE: Ri RAZ TH HT REZ RAR RAZ: Ri RZ 10,44 2,01 193
Khi uống RMP có sự dao động lớn giữa các cá thể ở cùng thời điểm thể hiện bằng CV%, Thời điểm đạt nồng độ RMP cao nhất trong huyết tương không quá 1,3h 4.2.3 Đánh giá sinh khả dụng của RMP trong các chế phẩm hỗn hợp và đơn lề
4.2.3.1 So sánh nông độ RMP huyết tương trung bình ở 13 thời điểm
Sự khác biệt nông độ RMP trung bình ở mối thời điểm thể hiện trong hình 4.2 20 18 16 — ng ——nH+z B12 ¬ ——n-H-Z 3” > + S 6 a 2 a a 5 10 18 20 thời gian (giờ), 25
Hình 4.2 Nông độ RMP khi uống RMP đơn độc, R-H-Z và viên hôn hợp RH+Z
Để so sánh sinh khả dụng giữa các dạng chế phẩm, các thông số C„ AUC; và AUC,„ được chuyển logarith tự nhiên để phân tích phương sai và tính khoảng tin
cậy 90% cho tỷ lệ các thông số trên
Trang 37Bảng 4.14 Số liệu chuyển Logarit tự nhiên của AUC, „ị AUC,„; C„„ A B c D E F G H I K 1 M | 4] Se] 9 < a 4.2.3.2 So sánh chỉ số ADC,¡;
AUC là chỉ số biểu thị tượng trưng cho lượng thuốc vào được vòng tuần hoàn ở đạng cò boạt tính, được sử dụng để đánh giá lượng thuốc hấp thu được Kết quả so sánh AUC; ¡› ở bảng 4.15
Bảng 4.15 : So sánh AUC, „ giữa viên đơn lẻ (R-H-Z) va Rifampicin don déc (R), giữa vién hén hop (RH+Z) va viên đơn lễ
Trang 38Chi sé AUC, ,, truag bình khi uống R-H-Z thấp hơa so với uống RMP đơn độc, sinh khả dụng tương đối được tính bằng tỷ lệ AUC;„; của RMP khi uống R-H-Z so với
RMP don déc là 74,1 5%
Đối với viên bốn hợp, AUCC,„; trung bình là 36,07 jig.b/ml thap hon so với uống viên đơa lẻ R-H-Z (55,51 ng.h/ml) Sinh khả dụng tương đối của viên bốn hợp so với viên đơn lẻ là 65,89%
Dựa trên số liệu AUC,„; đã chuyển logarith, sau khi phâ tích phương sai với biến phụ thuộc là laAUC,,.; (Bảng 4.14.) khoảng tỉa cậy 90% của tỷ lệ A UC, ; giữa R~
H-Z va RMP là 54% - 97%; của tỷ lệ AUC,.; giữa RH+Z và R-H-Z là 45 - 80% (Bảng 4.16) Bảng 4.16 Phân tích phương sai với biển phụ thuộc là In AUC, 2 Tổng bình | Trung bình bình phương (SS) | phương (MS) Trình tự thử: 0,85152 Người tình nguyện 003882 Giai đoạn 045185 Chế phẩm 000002 Sai số: Tổng Nguồn biến thiên
Bảng 4.17 Khoảng tin cây 90% của tỷ lệ AUC,; giữa viên đơn lẻ (R-H-Z) va (RMP) don déc, giữa viên hỗn hợp (RH+2) và đơn lẻ (R-H-Z)
Khoảng tin cậy 906
Trang 394.2.3.2 So sánh ADUC,„
Bảng 4.18 So sánh AUCu giữa viên đơn lẻ (R-H-2) và rifampicin don déc (R), giữa viên hỗn hợp (RH+2) và viên đơn lễ A B G D E T G H T E4 L M
Tương tự như AUC,„, chỉ số AUC;„ cũng cho thấy khi uống R-H-Z đơn lẻ (67.39 uug.b/ml) thấp hơn so với uống RMP đơn độc (93,38 ug.húnD, viên hốn hợp (44,54 ng.h/mD thấp hơn so với viên don lẻ
Sinh khả dụng tương đối tính theo AUC¿„; của viên đơa lễ so với RMP đơn độc là 74,06%, viên bón hợp so với viên đơn lẻ là 64,95%
Trang 40Bang 4.20 Khoảng tin cây 90% của tỷ lệ AUC,„ giữa viên đơn lẻ (R-H-Z) và (RMP) đơn độc, giữa viên hỗn hợp (RH+2) và đơn lẻ (R-H-Z)
Tỷ lệ AUC,ø Khoảng tin cậy 90%
Giới hạn dưới Giới bạn trên R-H-Z/R 56% 95% RH+Z/R-H-Z 4.2.3.3, So sdnh chi s6 Cmax 46% 77%
C„„„ là nổng độ tiampicia cao nhất đạt được trong huyết tương, đối với rifampicia đây là chỉ số quan trọng liên qua tới nông độ điều trị và nỏng độ độc Sự khác biệt giữa các cá thể về nồng độ C„„„ và thời gian đạt được C„ đã thể biện trong
các bảng 4.8 đến 4.13 và các kết quả so sánh thể biện trong bảng 4.21
Bảng 4.21 So sánh C„u„ viên đơn lẻ (R-H-2) và Rifamppicin đơn độc (R), giữa viên hỗn hợp (RH+7) và viên đơn lễ Người TN Bl nỈ đ| ¬| mỊ a| mỊ mị ØỈ ¬| ø| >|
Khi uống R-H-Z viên đơn lẻ, chỉ số C„„ RMP đạt được thấp hơn so với uống
RMP don doc, đạt tỷ lệ 68,76% Như vậy, C„„ khi uống RMP cùng INH - PZA đơn lẻ bị giảm 31,24%