Nghiên cứu phát triển kỹ thuật DNA macroarray nhằm phát hiện nhanh tính kháng rifampicin và isoniazid ở vi khuẩn lao

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO T G ĐẠI C BÁC O À ỘI … …… o0o… …… G G I D V C D ÁT T I C O T T ÁT Á G I I ICI VÀ I O I VI O Chuyên ngành: Công nghệ sinh học thực phẩm ã số: 62 54 02 05 g ih ng n ho học: G T Đ GT G T TÔ Hà Nội – 2011 T I T ID LỜI CẢM ƠN Trước hết, xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc tới GS.TS Đặng Thị Thu - Phịng Hóa sinh Sinh học phân tử - Viện Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm – Trường Đại học Bách khoa Hà Nội tận tình hướng dẫn dìu dắt tơi suốt q trình nghiên cứu Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc tới PGS.TS Tô Kim Anh TS Lê Quang Hịa – Phịng Hóa sinh Sinh học phân tử - Viện Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm – Trường Đại học Bách khoa Hà Nội tận tình hướng dẫn, dìu dắt cấp kinh phí cho tơi thực nghiên cứu Bên cạnh đó, tơi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Nguyễn Thị Xn Sâm – Trưởng mơn Hóa sinh Sinh học phân tử thày, cô giáo cán phịng Hóa sinh Sinh học phân tử tận tình giúp đỡ, dạy bảo động viên tơi q trình học tập nghiên cứu khoa học Tôi xin cảm ơn TS Trương Quốc Phong – Trưởng phịng thí nghiệm Cơng nghệ sinh học nghiên cứu sinh, học viên cao học bạn sinh viên – Viện Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm - trường Đại học Bách khoa Hà Nội động viên tạo điều kiện thuận lợi cho tơi q trình thực nghiên cứu Nhân dịp này, muốn gửi lời cảm ơn tới TS Nguyễn Văn Hưng tập thể cán bộ, bác sỹ Khoa Vi sinh - Bệnh viện phổi Trung Ương TS Lưu Thị Liên, ThS Phạm Hữu Thường cán bộ, bác sỹ Khoa Xét nghiệm – Bệnh viện Phổi Hà Nội nhiệt tình giúp đỡ tơi q trình làm luận án Cuối cùng, xin cảm ơn Ban giám hiệu Trường trung học phổ thông Lạng Giang số – Tỉnh Bắc Giang gia đình, bạn bè đồng nghiệp động viên, khích lệ tạo điều kiện tốt cho học tập nghiên cứu Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2011 Nguyễn Văn Duy LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi Những số liệu kết nghiên cứu luận án trung thực chưa tác giả khác công bố Hà Nội, ngày tháng năm 2011 Nguyễn Văn Duy v DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT TT Ký hiệu Nghĩa ký hiệu ACP NADH-dependent enol acyl carrier protein AFB Trực khuẩn bền axit (trực khuẩn lao) (Acid-fast bacilli) AIDS Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải (Acquired immunodeficiency syndrome ) BCG Trực khuẩn Calmette-Guérin (Bacillus Calmette-Guérin) BCIP 5-bromo-4chloro-3’-indolyphosphate (p-toluidine) bp Cặp bazơ (Base pair) cDNA ADN bổ sung (Complementary DNA) CIAA Hỗn hợp gồm 24 chloroform : isoamylalcohol Codon Bộ ba mã hóa 10 Cy3 Cyanine 11 Cy5 Cyanine 12 DNA Deoxyribonucleic acid 13 dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate 14 DOTS Chế độ điều trị ngắn hạn có giám sát trực tiếp (Directly observed treatment shortcourse) 15 dUTP Deoxyuridine triphosphate 16 EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid 17 EMB Ethambutol vi 18 FDA Tổ chức Dược phẩm Lương thực Hoa Kỳ (Food and Drug Admintration) 19 HIV Virut gây suy giảm miễn dịch người (Human immunodeficiency virus) 20 INH Isoniazid 21 kb Kilo base 22 kDa Kilo Dalton 23 mRNA Messenger axit ribonucleic (ARN thông tin) 24 MDR Kháng đa thuốc (Multidrug resistance) 25 MGIT Ống thị sinh trưởng (Mycobacteria growth indicator tuber) 26 MIC Nồng độ ức chế tối thiểu (Minimum inhibiton concentration) 27 NALC N-acetyl-L-cystein 28 NBT Nitro-blue tetrazolium chloride 29 OD Mật độ quang (Optical density) 30 PCR Phản ứng tổng hợp chuỗi (Polymerase chain reaction) 31 PZA Pyrazinamide 32 RIF Rifampicin 33 SDS Sodium dodecyl sulfate 34 SSC Saline sodium citrate 35 SSPE Sodium saline phosphate, EDTA vii 36 TE Tris-EDTA 37 Tm Nhiệt độ tan chảy (Melting temperatures ) 38 UV Tia cực tím (Ultraviolet) 39 v/v Thể tích/thể tích 40 WHO Tổ chức Y tế giới (World health organization) 41 w/v Khối lượng/ thể tích 42 XDR Kháng thuốc phổ rộng (Extensively drug-resistance) viii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Tên hình Hình thái tế bào M tuberculosis kính hiển vi điện tử khuẩn lạc vi khuẩn lao mơi trường thạch 1.2 Mơ hình cắt ngang cấu trúc thành tế bào vi khuẩn lao cấu trúc axit α- mycolic 1.3 Trang Xu hướng thay đổi tỷ lệ mắc lao theo đầu người tỷ lệ nhiễm HIV toàn cầu 1.4 Cơ chế phát triển tính kháng thuốc vi khuẩn lao 14 1.5 Quy trình phân tích phân tử đích sử dụng DNA array 31 1.6 Phản ứng tạo kết tủa màu NBT BCIP tác dụng alkaline phosphatase 3.1 Quy trình thiết kế mẫu dị oligonucleotit phát vi khuẩn lao kháng rifampicin 3.2 35 57 Mơ hình minh họa vị trí mẫu dị thiết kế cho phát vi khuẩn lao kháng rifampicin mẫu dị Mtpol1 so với vị trí gen rpoB 3.3 59 Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR với cặp mồi katG315F-katG315R sử dụng DNA khuôn tách chiết phương pháp khác 3.4 65 Điện di sản phẩm PCR kiểm tra ảnh hưởng thời gian xử lý siêu âm tách chiết DNA từ mẫu đờm 68 ix 3.5 Điện di sản phẩm PCR so sánh hiệu tách chiết DNA phương pháp siêu âm phương pháp tiêu chuẩn sử dụng hóa chất 3.6a Ảnh hưởng thời gian cố định mẫu dị đến tín hiệu lai 3.6b Ảnh hưởng chiều dài oligo-dT vị trí gắn oligo-dT đến khả lai mẫu dò 3.7 69 71 72 Kết lai vùng trình tự gen rpoB từ chủng M tuberculosis H37Rv với mẫu dò kiểu dại sử dụng 75 dung dịch lai khác 3.8 Kết lai mẫu dò phát đột biến kháng rifampicin với trình tự gen từ chủng M tuberculosis H37Rv nhiệt độ lai khác 3.9 77 So sánh hiệu rửa lai dung dịch 1x SSC chứa 0,15 SDS dung dịch 4x SSPE chứa 0,5% SDS 79 3.10 Hiệu phủ màng hợp chất khác 80 3.11 Kết lai mẫu dị với trình tự gen đích khuếch đại từ chủng chủng M tuberculosis H37Rv sử dụng phản ứng PCR khác 3.12 Điện di kiểm tra sản phẩm PCR tìm hiểu nồng độ DNA khn tối thiểu phản ứng khuếch đại từ cặp mồi 3.13 82 84 Ảnh hưởng nhiệt độ gắn mồi hàm lượng MgCl lên khả khuếch đại từ cặp mồi phản ứng PCR đơn 86 x 3.14 Kết lai kiểm tra ảnh hưởng nồng độ mồi đến hiệu khuếch đại đánh dấu trình tự đích phản ứng PCR bất đối đa mục tiêu 3.15 87 Kết lai mẫu dò cố định màng với sản phẩm PCR bất đối đa mục tiêu sử dụng nồng độ DNA khn khác 3.16 Kiểm tra tính đặc hiệu mẫu dò thiết kế cho gen rpoB 3.17 Kiểm tra tính đặc hiệu mẫu dị thiết kế cho gen katG vùng khởi động gen inhA 3.18 92 95 Kiểm tra tính đặc hiệu mẫu dò thiết kế bổ sung cho gen katG vùng khởi động gen inhA 3.19 90 98 Kết thử nghiệm kỹ thuật DNA macroarray phát vi khuẩn lao kháng thuốc trực tiếp mẫu đờm 107 (1) (2) (3) (4) (5) (6) 71 HN298 Hà Vinh T R S Hà Nội 72 HN722 Lê Thị Vân A R S Hà Nội 73 HN302 Cao Anh T R S Hà Nội 74 HN305 Chu Tuấn Đ R R Hà Nội 75 HN306 Cao Bá Đ R S Hà Nội 76 HN318 Hoàng Nghĩa H R S Hà Nội 77 HN324 Đoàn Quốc V R S Hà Nội 78 HN326 Lã Thị L R S Hà Nội 79 HN329 Trần Thị H R S Hà Nội 80 HN336 Hồ Quang T R R Hà Nội 81 HN377 Vũ Thanh H R S Hà Nội 82 HN386 Nguyễn Việt T R S Hà Nội 83 HN390 Đào Thế T R R Hà Nội 84 HN391 Nguyễn Văn M R S Hà Nội 85 HN404 Bùi Trường S R S Hà Nội 86 HN406 Nguyễn Văn P R S Hà Nội 87 HN412 Lê Thị Vinh H R R Hà Nội 88 HN422 Phạm Văn N R R Hà Nội 89 HN423 Nguyễn Thị T R S Hà Nội 90 HN426 Hà Thị Thu H R S Hà Nội 91 HN435 Nguyễn Hùng D R S Hà Nội 92 HN439 Nguyễn Hữu T R R Hà Nội 93 HN446 Trịnh Xuân T R S Hà Nội 94 HN453 Trịnh Anh S R S Hà Nội 95 HN463 Nguyễn Tiến V R S Hà Nội (1) (2) (3) (4) (5) (6) 96 HN472 Bùi Văn N R S Hà Nội 97 HN473 Vũ Thị T R S Hà Nội 98 HN513 Phạm Năng L R R Hà Nội 99 HN529 Phan Đức H R S Hà Nội 100 HN531 Nguyễn Ngọc T R S Hà Nội 101 HN300 Nguyễn Thị A S S Hà Nội 102 HN301 Trần Đình B S S Hà Nội 103 HN307 Tô Văn T S S Hà Nội 104 HN319 Đỗ Văn C S S Hà Nội 105 HN330 Đặng Thị S S S Hà Nội 106 HN331 Lê Thị L S S Hà Nội 107 HN337 Vũ Thúy N S S Hà Nội 108 HN653 Kiều Minh Y S S Hà Nội 109 HN 299 Đỗ Thị Thanh T S S Hà Nội 110 HN 453 Trịnh Anh S S S Hà Nội Ghi chú: INH: isoniazid RIF: rifampicin R: kháng thuốc chống o S: nhạy cảm thuốc chống o Trung Ương: Bệnh viện Phổi Trung Ương Hà Nội: Bệnh viện Phổi Hà Nội Phụ lục Kết giải trình tự gen khảo sát đột biến liên quan đến tính kháng thuốc chủng vi khuẩn lao nghiên cứu Ký hiệu chủng rpoB katG inhA INH RIF (2) (3) (4) (5) (6) (7) BK1 KD KD -15C→T R S BK2 KD KD -15C→T R S BK3 531TCG→TTG 315AGC→ACC KD R R BK4 516GAC→GTC 315AGC→ACC KD R R BK5 531TCG→TTG KD KD S R BK6 KD 315AGC→ACC KD R S BK7 KD 315AGC→ACC KD R S BK9 KD 315AGC→ACC KD R S BK13 516GAC→GTC KD KD S R 10 BK15 526CAC→TAC 315AGC→ACC KD R R 11 BK16 516GAC→GTC KD KD S R 12 BK19 KD KD -15C→T R S 13 BK20 526CAC→TAC KD KD S R 14 BK21 526CAC→TAC 315AGC→ACC KD R R 15 BK22 315AGC→ACC KD R R 16 BK23 315AGC→ACC KD R R 17 BK25 KD 315AGC→ACC KD R S 18 BK26 526CAC→GAC 315AGC→ACC KD R R 19 BK27 531TCG→TTG 315AGC→ACC KD R R 20 BK28 531TCG→TTG 315AGC→ACC KD R R 21 BK29 531TCG→TTG 315AGC→ACC KD R R STT (1) Kết giải trình tự gen 531TCG→TTG 526CAC→TAC 516GAC→GTC 526CAC→TAC Kiểu hình (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) 531TCG→TTG KD KD R R KD KD R R 22 BK30 23 BK31 24 BK32 KD KD KD S R 25 BK33 516GAC→GTC KD KD S R 26 BK37 531TCG→TTG 315AGC→AAC R R 27 BK38 531TCG→TTG KD KD R R 28 BK39 531TCG→TTG KD -15C→T R R 29 BK40 KD KD KD R S 30 BK41 531TCG→TTG 315AGC→ACC KD R R 31 BK42 KD 315AGC→ACC KD R S 32 BK44 516GAC→GTC KD KD R R 33 BK45 KD KD S R 34 BK46 526CAC→TAC KD KD S R 35 BK48 526CAC→TAC KD KD S R 36 BK49 516GAC→GTC KD KD S R 37 BK50 516GAC→GTC KD KD S R 38 HN1 531TCG→TTG 315AGC→ACC KD R R 39 HN2 531TCG→TTG 315AGC→ACC KD R R 40 HN3 KD 315AGC→ACC KD R S 41 HN4 KD 315AGC→ACC KD R S 42 HN5 516GAC→GTC KD -15C→T R R 43 HN6 531TCG→TTG 315AGC→ACC KD R R 44 HN7 531TCG→TTG 315AGC→ACC KD R R 45 HN8 KD 315AGC→ACC KD R S 46 HN9 315AGC→ACC KD R R 531TCG→TTG 516GAC→GTC 531TCG→TTG 516GAC→GTC 511CTG→CCG 531TCG→TTG (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) 47 HN10 KD 315AGC→ACC KD R R 48 HN50 531TCG→TTG KD KD R R 49 HN60 KD 315AGC→AAC KD R S 50 HN64 KD 315AGC→ACC KD R S 51 HN73 KD 315AGC→ACC KD R S 52 HN77 KD 315AGC→ACC KD R S 53 HN83 KD 315AGC→ACC KD R S 54 HN88 KD KD KD R S 55 HN90 KD 315AGC→ACC KD R S 56 HN94 KD 315AGC→ACC KD R S 57 HN297 526CAC→TAC 315AGC→ACC KD R R 58 HN298 KD 315AGC→ACC KD R S 59 HN722 KD KD -15C→T R S 60 HN302 KD 315AGC→ACC KD R S 61 HN305 531TCG→TTG 315AGC→ACC KD R R 62 HN306 KD KD KD R S 63 HN318 KD 315AGC→ACC KD R S 64 HN324 KD KD KD R S 65 HN326 KD 315AGC→ACC KD R S 66 HN329 KD 315AGC→ACC KD R S 67 HN336 531TCG→TTG 315AGC→ACC KD R R 68 HN377 KD 315AGC→ACC KD R S 69 HN386 KD 315AGC→ACC KD R S 70 HN390 516GAC→GTC 315AGC→ACC KD R R 71 HN391 KD 315AGC→ACC KD R S 72 HN404 KD KD KD R S 73 HN406 KD 315AGC→AAC KD R S 74 HN412 526CAC→GAC KD KD R R (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) 75 HN422 526CAC→TAC 315AGC→ACC KD R R 76 HN423 KD 315AGC→ACC KD R S 77 HN426 KD 315AGC→ACC KD R S HN435 KD 315AGC→ACC KD R S 315AGC→ACC KD R R 78 513CAA→AAA 79 HN439 80 HN446 KD 315AGC→ACC KD R S 81 HN453 KD 315AGC→ACC KD R S 82 HN463 KD 315AGC→ACC KD R S 83 HN472 KD 315AGC→ACC KD R S 84 HN473 KD 315AGC→ACC KD R S 85 HN513 516GAC→GTC 315AGC→ACC KD R R 86 HN529 KD 315AGC→ACC KD R S 87 HN531 KD 315AGC→ACC KD R S 526CAC→GAC Ghi chú: KD: trình tự gen kiểu dại R: Kháng thuốc chống S: Mẫn cảm thuốc chống INH: isoniazid RIF: rifampicin o o Phụ lục Kết phân tích trình tự vùng mã hóa gen inhA 11 chủng vi khuẩn lao kháng INH có trình tự gen katG vùng khởi động gen inhA kiểu dại sử dụng phần mềm ClustalW2 CLUSTAL 2.0.12 Multiple Sequence Alignments Sequence format is Pearson Sequence 1: inhA94_BK30 247 bp Sequence 2: inhA94_BK31 247 bp Sequence 3: inhA94_BK38 247 bp Sequence 4: inhA94_BK40 247 bp Sequence 5: inhA94_BK44 247 bp Sequence 6: inhA94_HN50 247 bp Sequence 7: inhA94_HN88 247 bp Sequence 8: inhA94_HN306 247 bp Sequence 9: inhA94_HN324 247 bp Sequence 10: inhA94_404 247 bp Sequence 11: inhA94_BK412 247 bp Sequence 12: H37Rv 247 bp comparing paramArg[setSeqNoRange]= off comparing Start of Pairwise alignments Aligning Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences (1:2) Aligned Score: (1:3) Aligned Score: (1:4) Aligned Score: (1:5) Aligned Score: (1:6) Aligned Score: (1:7) Aligned Score: (1:8) Aligned Score: (1:9) Aligned Score: (1:10) Aligned Score: (1:11) Aligned Score: (1:12) Aligned Score: (2:3) Aligned Score: (2:4) Aligned Score: (2:5) Aligned Score: (2:6) Aligned Score: (2:7) Aligned Score: (2:8) Aligned Score: (2:9) Aligned Score: (2:10) Aligned Score: (2:11) Aligned Score: (2:12) Aligned Score: (3:4) Aligned Score: (3:5) Aligned Score: (3:6) Aligned Score: (3:7) Aligned Score: (3:8) Aligned Score: (3:9) Aligned Score: (3:10) Aligned Score: (3:11) Aligned Score: (3:12) Aligned Score: (4:5) Aligned Score: (4:6) Aligned Score: 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences (4:7) Aligned Score: 100 (4:8) Aligned Score: 100 (4:9) Aligned Score: 100 (4:10) Aligned Score: 100 (4:11) Aligned Score: 100 (4:12) Aligned Score: 100 (5:6) Aligned Score: 100 (5:7) Aligned Score: 100 (5:8) Aligned Score: 100 (5:9) Aligned Score: 100 (5:10) Aligned Score: 100 (5:11) Aligned Score: 100 (5:12) Aligned Score: 100 (6:7) Aligned Score: 100 (6:8) Aligned Score: 100 (6:9) Aligned Score: 100 (6:10) Aligned Score: 100 (6:11) Aligned Score: 100 (6:12) Aligned Score: 100 (7:8) Aligned Score: 100 (7:9) Aligned Score: 100 (7:10) Aligned Score: 100 (7:11) Aligned Score: 100 (7:12) Aligned Score: 100 (8:9) Aligned Score: 100 (8:10) Aligned Score: 100 (8:11) Aligned Score: 100 (8:12) Aligned Score: 100 (9:10) Aligned Score: 100 (9:11) Aligned Score: 100 (9:12) Aligned Score: 100 (10:11) Aligned Score: 100 (10:12) Aligned Score: 100 (11:12) Aligned Score: 100 There are 11 groups Start of Multiple Alignment Aligning Group 1: Sequences: Group 2: Sequences: Group 3: Sequences: Group 4: Sequences: Group 5: Sequences: Group 6: Sequences: Group 7: Sequences: Group 8: Sequences: Group 9: Sequences: 10 Group 10: Sequences: 11 Group 11: Sequences: 12 Alignment Score 126324 Score:4693 Score:4693 Score:4693 Score:4693 Score:4693 Score:4693 Score:4693 Score:4693 Score:4693 Score:4693 Score:4693 Phụ lục Kết phân tích trình tự gen ndh 11 chủng vi khuẩn lao kháng INH có trình tự gen katG vùng khởi động gen inhA kiểu dại sử dụng phần mềm ClustalW2 CLUSTAL 2.0.12 Multiple Sequence Alignments Sequence format is Pearson Sequence 1: ndh_BK30 252 bp Sequence 2: ndh_BK31 252 bp Sequence 3: ndh_BK38 252 bp Sequence 4: ndh_BK40 252 bp Sequence 5: ndh_BK44 252 bp Sequence 6: ndh_HN50 252 bp Sequence 7: ndh_HN88 252 bp Sequence 8: ndh_HN306 252 bp Sequence 9: ndh_HN324 252 bp Sequence 10: ndh_HN404 252 bp Sequence 11: ndh_HN412 252 bp Sequence 12: H37Rv 252 bp comparing paramArg[setSeqNoRange]= off comparing Start of Pairwise alignments Aligning Sequences (1:2) Aligned Score: Sequences (1:3) Aligned Score: Sequences (1:4) Aligned Score: Sequences (1:5) Aligned Score: Sequences (1:6) Aligned Score: Sequences (1:7) Aligned Score: Sequences (1:8) Aligned Score: Sequences (1:9) Aligned Score: Sequences (1:10) Aligned Score: Sequences (1:11) Aligned Score: Sequences (1:12) Aligned Score: Sequences (2:3) Aligned Score: Sequences (2:4) Aligned Score: Sequences (2:5) Aligned Score: Sequences (2:6) Aligned Score: Sequences (2:7) Aligned Score: Sequences (2:8) Aligned Score: Sequences (2:9) Aligned Score: Sequences (2:10) Aligned Score: Sequences (2:11) Aligned Score: Sequences (2:12) Aligned Score: Sequences (3:4) Aligned Score: Sequences (3:5) Aligned Score: Sequences (3:6) Aligned Score: Sequences (3:7) Aligned Score: Sequences (3:8) Aligned Score: Sequences (3:9) Aligned Score: Sequences (3:10) Aligned Score: Sequences (3:11) Aligned Score: Sequences (3:12) Aligned Score: Sequences (4:5) Aligned Score: Sequences (4:6) Aligned Score: Sequences (4:7) Aligned Score: 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences (4:8) Aligned Score: 100 (4:9) Aligned Score: 100 (4:10) Aligned Score: 100 (4:11) Aligned Score: 100 (4:12) Aligned Score: 100 (5:6) Aligned Score: 100 (5:7) Aligned Score: 100 (5:8) Aligned Score: 100 (5:9) Aligned Score: 100 (5:10) Aligned Score: 100 (5:11) Aligned Score: 100 (5:12) Aligned Score: 100 (6:7) Aligned Score: 100 (6:8) Aligned Score: 100 (6:9) Aligned Score: 100 (6:10) Aligned Score: 100 (6:11) Aligned Score: 100 (6:12) Aligned Score: 100 (7:8) Aligned Score: 100 (7:9) Aligned Score: 100 (7:10) Aligned Score: 100 (7:11) Aligned Score: 100 (7:12) Aligned Score: 100 (8:9) Aligned Score: 100 (8:10) Aligned Score: 100 (8:11) Aligned Score: 100 (8:12) Aligned Score: 100 (9:10) Aligned Score: 100 (9:11) Aligned Score: 100 (9:12) Aligned Score: 100 (10:11) Aligned Score: 100 (10:12) Aligned Score: 100 (11:12) Aligned Score: 100 There are 11 groups Start of Multiple Alignment Aligning Group 1: Sequences: Group 2: Sequences: Group 3: Sequences: Group 4: Sequences: Group 5: Sequences: Group 6: Sequences: Group 7: Sequences: Group 8: Sequences: Group 9: Sequences: 10 Group 10: Sequences: 11 Group 11: Sequences: 12 Alignment Score 132000 Score:4788 Score:4788 Score:4788 Score:4788 Score:4788 Score:4788 Score:4788 Score:4788 Score:4788 Score:4788 Score:4788 Phụ lục Kết phân tích trình tự vùng khởi động gen ahpC 11 chủng vi khuẩn lao kháng INH có trình tự gen katG vùng khởi động gen inhA kiểu dại sử dụng phần mềm ClustalW2 CLUSTAL 2.0.12 Multiple Sequence Alignments Sequence format is Pearson Sequence 1: ahpC_BK30 204 bp Sequence 2: ahpC_BK31 204 bp Sequence 3: ahpC_BK38 204 bp Sequence 4: ahpC_BK40 204 bp Sequence 5: ahpC_BK44 204 bp Sequence 6: ahpC_HN50 204 bp Sequence 7: ahpC_HN88 204 bp Sequence 8: ahpC_HN306 204 bp Sequence 9: ahpC_HN324 204 bp Sequence 10: ahpC_HN404 204 bp Sequence 11: ahpC_HN412 204 bp Sequence 12: H37Rv 204 bp comparing paramArg[setSeqNoRange]= off comparing Start of Pairwise alignments Aligning Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences (1:2) Aligned Score: (1:3) Aligned Score: (1:4) Aligned Score: (1:5) Aligned Score: (1:6) Aligned Score: (1:7) Aligned Score: (1:8) Aligned Score: (1:9) Aligned Score: (1:10) Aligned Score: (1:11) Aligned Score: (1:12) Aligned Score: (2:3) Aligned Score: (2:4) Aligned Score: (2:5) Aligned Score: (2:6) Aligned Score: (2:7) Aligned Score: (2:8) Aligned Score: (2:9) Aligned Score: (2:10) Aligned Score: (2:11) Aligned Score: (2:12) Aligned Score: (3:4) Aligned Score: (3:5) Aligned Score: (3:6) Aligned Score: (3:7) Aligned Score: (3:8) Aligned Score: (3:9) Aligned Score: (3:10) Aligned Score: (3:11) Aligned Score: (3:12) Aligned Score: (4:5) Aligned Score: (4:6) Aligned Score: 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences Sequences (4:7) Aligned Score: 100 (4:8) Aligned Score: 100 (4:9) Aligned Score: 100 (4:10) Aligned Score: 100 (4:11) Aligned Score: 100 (4:12) Aligned Score: 100 (5:6) Aligned Score: 100 (5:7) Aligned Score: 100 (5:8) Aligned Score: 100 (5:9) Aligned Score: 100 (5:10) Aligned Score: 100 (5:11) Aligned Score: 100 (5:12) Aligned Score: 100 (6:7) Aligned Score: 100 (6:8) Aligned Score: 100 (6:9) Aligned Score: 100 (6:10) Aligned Score: 100 (6:11) Aligned Score: 100 (6:12) Aligned Score: 100 (7:8) Aligned Score: 100 (7:9) Aligned Score: 100 (7:10) Aligned Score: 100 (7:11) Aligned Score: 100 (7:12) Aligned Score: 100 (8:9) Aligned Score: 100 (8:10) Aligned Score: 100 (8:11) Aligned Score: 100 (8:12) Aligned Score: 100 (9:10) Aligned Score: 100 (9:11) Aligned Score: 100 (9:12) Aligned Score: 100 (10:11) Aligned Score: 100 (10:12) Aligned Score: 100 (11:12) Aligned Score: 100 There are 11 groups Start of Multiple Alignment Aligning Group 1: Sequences: Group 2: Sequences: Group 3: Sequences: Group 4: Sequences: Group 5: Sequences: Group 6: Sequences: Group 7: Sequences: Group 8: Sequences: Group 9: Sequences: 10 Group 10: Sequences: 11 Group 11: Sequences: 12 Alignment Score 100584 Score:3876 Score:3876 Score:3876 Score:3876 Score:3876 Score:3876 Score:3876 Score:3876 Score:3876 Score:3876 Score:3876 Phụ lục Thành phần dung dịch sử dụng nghiên cứu  Dung dịch đệm 1x SSC chứa 0,1% SDS: - NaCl: 150 mM - Na3citrate: 15 mM - pH: 7,0 - SDS: 0,1% (w/v)  Dung dịch đệm 5x SSPE chứa 0,5% SDS: - NaCl: 0,9 M - Na2HPO4: 50 mM - EDTA: mM - pH: 7,7 - SDS: 0,5 % (w/v)  Dung dịch đệm AP pH7,5: - Tris: 100 mM - NaCl: 100 mM - MgCl 2: mM - pH: 7,5 - Tween20: 0,05 % (v/v)  Dung dịch đệm AP pH9,5: - Tris: 100 mM - NaCl: 100 mM - MgCl 2: mM - pH: 9,5  Dung dịch đệm 1x TE: - Tris –HCl: 10 mM - EDTA: mM - pH: 8,5  Dung dịch 50x NBT: 16,5 mg NBT/ml dimetthylformamide 100%  Dung dịch 50x BCIP: 8,25 mg NBT/ml dimetthylformamide 100%  Dung dịch CIAA: chloroform : isomaylalcohol = 24 : Phụ lục Bảng ký hiệu viết tắt tên axit amin STT Tên axit amin Ký hiệu Dạng chữ Dạng chữ Alanine A Ala Arginine R Arg Asparagine N Asn Aspartic acid D Asp Cysteine C Cys Glutamic acid E Glu Glutamine Q Gln Glycine G Gly Histidine H His 10 Isoleucine I Ile 11 Leucine L Leu 12 Lysine K Lys 13 Methionine M Met 14 Phenylalanine F Phe 15 Proline P Pro 16 Serine S Ser 17 Threonine T Thr 18 Tryptophan W Trp 19 Tyrosine Y Tyr 20 Valine V Val ... hành nghiên cứu đề tài ? ?Nghiên cứu phát triển kỹ thuật DNA macroarray nhằm phát nhanh tính kháng rifampicin isoniazid vi khuẩn lao? ??  Mục tiêu nghiên cứu - Khảo sát đột biến liên quan đến tính kháng. .. nâng cao độ nhạy phát vi khuẩn lao kháng INH 1.3 KỸ THUẬT DNA ARRAY VÀ ỨNG DỤNG TRONG CHẨN ĐOÁN VI KHUẨN LAO KHÁNG THUỐC 1.3.1 Nguyên tắc kỹ thuật DNA array Nguyên tắc kỹ thuật DNA array trình... dung nghiên cứu - Giải trình tự vùng gen chứa đột biến liên quan đến tính kháng isoniazid rifampicin chủng vi khuẩn lao thu thập - Xây dựng quy trình kỹ thuật DNA macroarray phát nhanh vi khuẩn lao