Thiết kế cấu trúc crispra tăng cường biểu hiện gen osysl2 Ở lúa tbr225

Thiết kế cấu trúc crispra tăng cường biểu hiện gen osysl2 Ở lúa tbr225 Thiết kế cấu trúc crispra tăng cường biểu hiện gen osysl2 Ở lúa tbr225

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Lê Ngọc Diệp

THIẾT KẾ CẤU TRÚC CRISPRa TĂNG CƯỜNG BIỂU HIỆN

GEN OsYSL2 Ở LÚA TBR225

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – Năm 2023

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Lê Ngọc Diệp

THIẾT KẾ CẤU TRÚC CRISPRa TĂNG CƯỜNG BIỂU HIỆN

GEN OsYSL2 Ở LÚA TBR225

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 8420201.22

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS LÊ QUỲNH MAI

LỜI CẢM ƠNĐầu tiên, tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành đến TS Lê Quỳnh Mai đã

tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện tốt nhất để tôi có thể học tập và tham gia đề tài nghiên cứu Cô đã cho tôi những lời khuyên, những kiến thức và cách giải quyết vấn đề một cách khoa học, luôn khích lệ tôi phát triển bản thân theo hướng tích cực nhất trên con đường sự nghiệp

Tiếp đến, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy cô và các đồng nghiệp thuộc phòng Công nghệ mô tế bào Thực vật đã luôn chia sẻ, đồng hành và giúp đỡ tôi Sự hỗ trợ và khuyến khích từ các thành viên đã giúp tôi có thể hoàn thành nghiên cứu Luận văn Thạc sĩ này

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các quý thầy cô trong Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – ĐHQGHN đã luôn tâm huyết truyền đạt những kiến thức bổ ích trong suốt thời gian tôi tham gia học tập tại trường

Kinh phí thực hiện Luận văn được tài trợ từ dự án “Nghiên cứu cải tiến giống lúa về vi chất dinh dưỡng bằng công nghệ sinh học” (Mã số: NĐT/CN/21/24) của Bộ Khoa học và Công nghệ

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn đến toàn thể gia đình và bạn bè đã luôn động viên, giúp đỡ và cổ vũ tôi trong suốt thời gian thực hiện Luận văn này

Hà Nội, ngày 11 tháng 11 năm 2023

Học viên

1.3.2 Họ OsYSL ở lúa gạo 8

1.3.3 OsYSL2 ở lúa gạo 9

1.4 Công nghệ chỉnh sửa hệ gen CRISPR/Cas 10

1.4.1 Lược sử phát triển công nghệ CRISPR/Cas 10

1.4.2 Hệ thống CRISPR/Cas trong tăng cường biểu hiện gen 12

1.5 Giới thiệu về giống lúa TBR225 14

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 Vật liệu nghiên cứu 16

2.1.1 Mẫu thực vật 16

2.1.2 Chủng vi sinh vật 16

2.1.3 Vector và oligonucleotide 16

2.1.4 Hóa chất 17

2.1.5 Máy móc, trang thiết bị 18

2.2 Phương pháp nghiên cứu 18

2.2.1 Nghiên cứu in silico họ gen OsYSL 18

2.2.2 Phân lập và giải trình tự promoter OsYSL2 20

2.2.3 Thiết kế gRNA 22

2.2.4 Thiết kế cấu trúc vector tăng cường biểu hiện gen OsYSL2 23

2.2.5 Biến nạp vector đã ghép nối vào tế bào khả biến E coli 25

3.1.1 Xác định và phân tích cấu trúc họ YSL ở lúa 27

3.1.2 Xây dựng cây chủng loại phát sinh của họ OsYSL ở lúa 32

3.1.3 Dự đoán các yếu tố điều hòa cis trên vùng promoter của các gen OsYSL ở lúa 33

3.1.4 Phân tích dữ liệu về biểu hiện của họ gen OsYSL ở lúa 35

3.2 Kết quả nhân bản và phân tích vùng trình tự promoter gen OsYSL2 39

3.2.1 Thiết kế cặp mồi đặc hiệu nhân bản vùng trình tự promoter OsYSL2 39

3.2.2 Giải trình tự một vùng trên promoter OsYSL2 ở giống lúa TBR225 40

3.3 Kết quả thiết kế vector tăng cường biểu hiện gen OsYSL2 43

3.3.1 Kết quả thiết kế gRNA trên đoạn trình tự đã chọn 43

3.3.2 Thiết kế cấu trúc CRISPRa tăng cường biểu hiện gen OsYSL2 51

3.4 Kết quả tạo chủng E coli mang vector tăng cường biểu hiện gen OsYSL2 54

KẾT LUẬN 57

KIẾN NGHỊ 58

TÀI LIỆU THAM KHẢO 59

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1: Các trình tự mồi được sử dụng trong nghiên cứu 17

Bảng 2: Thành phần phản ứng PCR nhân bản trình tự promoter OsYSL2 21

Bảng 3: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR nhân bản trình tự promoter OsYSL2 21

Bảng 4: Thông tin cơ bản về các gen trong họ gen OsYSL 27

Bảng 5: Thông tin đặc tính lý hóa của họ protein OsYSL 29

Bảng 6: Thông tin vị trí của họ protein OsYSL trong tế bào 30

Bảng 7: Các yếu tố điều hòa cis trên vùng trình tự upstream 1,5 kb của các gen thuộc họ OsYSL 34

Bảng 8: Giá trị FPKM của các gen thuộc họ OsYSL ở hạt của hai giống Indica khác nhau về hàm lượng sắt trong hạt 37

Bảng 9: Giá trị FPKM của các gen thuộc họ OsYSL ở rễ của hai giống Indica khác nhau về hàm lượng sắt trong hạt 38

Bảng 10: Đánh giá độ tương đồng vùng trình tự promoter OsYSL2 ở các giống lúa Indica và Japonica 41

Bảng 11: Đánh giá độ tương đồng của vùng trình tự từ nucleotide 941 đến 1156 trên vùng upstream 1,5 kb gen OsYSL2 sử dụng để thiết kế gRNA ở các giống lúa Indica và Japonica 42

Bảng 12: Các gRNA đạt các tiêu chí về thành phần GC và cấu trúc bậc hai 44

Bảng 13: Kết quả đánh giá off-target ở các gRNA dài 20 nt 46

Bảng 14: Kết quả đánh giá off-target ở các gRNA dài 21 nt 48

DANH MỤC HÌNH

Hình 1: Sơ đồ các kênh liên quan đến hấp thu, vận chuyển và dự trữ sắt ở lúa gạo 6

Hình 2: Cây chủng loại phát sinh xây dựng từ 18 trình tự amino acid OsYSL 8

Hình 3: Cấu trúc dự đoán xuyên màng của OsYSL2 9

Hình 4: Sơ đồ cơ chế hoạt động của hệ thống CRISPR/Cas9 12

Hình 5: Hệ thống dCas9/VP64 14

Hình 6: Sơ đồ vector pBUN6A11 (Addgene) 16

Hình 7: Cấu trúc bậc hai điển hình của gRNA 23

Hình 8: Vị trí phân bố của các gen thuộc họ OsYSL trên NST 28

Hình 9: Cấu trúc gen và các motif protein bảo thủ của họ OsYSL 29

Hình 10: Cây chủng loại phát sinh của các protein YSL ở một số loài thực vật 33

Hình 11: Biểu đồ nhiệt thể hiện biểu hiện các gen OsYSL ở các mô khác nhau 35

Hình 12: Biểu đồ nhiệt thể hiện biểu hiện các gen OsYSL ở điều kiện dư thừa sắt 36Hình 13: Vị trí cặp mồi nhân bản đoạn trình tự trên promoter gen OsYSL2 vùng upstream 1,5 kb 39

Hình 14: Điện di sản phẩm PCR nhân bản đoạn trình tự trên promoter OsYSL2 ở lúa TBR225 40

Hình 15: Kết quả so sánh trình tự đoạn phân lập vùng promoter gen OsYSL2 với các trình tự đã công bố 41

Hình 16: Vị trí vùng trình tự lựa chọn để thiết kế gRNA (Seq_Design) hướng đích promoter OsYSL2 42

Hình 17: Vị trí các đoạn crRNA dài 20 nt trên trình tự promoter gen OsYSL2 43

Hình 18: Vị trí các đoạn crRNA dài 21 nt trên trình tự promoter gen OsYSL2 43

Hình 19: Sơ đồ vị trí các crRNA tiềm năng trên vùng trình tự upstream 1,5 kb của gen OsYSL2 50

Hình 20: Cấu trúc bậc hai dựa đoán của gRNA (crRNA_6) 51

Hình 21: Vị trí cắt mở vòng vector pBUN6A11 của enzyme giới hạn BsaI 51

Hình 22: Vị trí của crRNA_6 trong hệ thống CRISPRa tăng cường biểu hiện gen

OsYSL2 52

Hình 23: Kết quả PCR kiểm tra sản phẩm ghép nối với cặp mồi vector (V) và cặp mồi đặc hiệu (S) 53Hình 24: Kết quả giải trình tự kiểm tra vị trí đoạn chèn trên vector tăng cường biểu

hiện gen OsYSL2 53Hình 25: Sơ đồ cấu trúc vector tăng cường biểu hiện gen OsYSL2 ở giống lúa TBR225

54

Hình 26: Kết quả biến nạp vector tăng cường biểu hiện gen OsYSL2 vào chủng vi khuẩn E coli DH5α 55

Hình 27: Kết quả kiểm tra PCR khuẩn lạc với cặp mồi vector và cặp mồi đặc hiệu 55

Hình 28: Kết quả giải trình tự kiểm tra vector tăng cường biểu hiện gen OsYSL2 trong

khuẩn lạc 2.5 56

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

CRISPR Clustered regularly interspaced

short palindromic repeats

nhóm các đoạn ngắn đối xứng lặp lại thường xuyên

CRISPRa CRISPR activation CRISPR hoạt hóa

DMA 2’-deoxymugineic acid 2’-deoxymugineic acid DMAS deoxymugineic acid synthase deoxymugineic acid synthase

FPKM Fragments per kilobase of

transcript per million fragments mapped

các đoạn trên mỗi kilobazơ phiên mã trên mỗi triệu lần đọc bản đồ

PAM Protospacer adjacent motif các motif liền kề protospacer PCR Polymerase chain reaction phản ứng chuỗi polymerase SAM S-adenosyl-L-methionine S-adenosyl-L-methionine

YSL yellow stripe 1-like yellow stripe 1-like

MỞ ĐẦU

Thiếu máu là một trong những căn bệnh phổ biến với hơn hai tỷ người mắc phải, trong đó phần lớn nguyên nhân là do thiếu sắt Sắt (Fe) là nguyên tố vi lượng đóng vai quan trọng trong nhiều quá trình sinh học, tuy nhiên khẩu phần ăn hàng ngày của con người lại không cung cấp đủ hàm lượng cần thiết Do đó, việc tăng cường lượng sắt hấp thu vào cơ thể qua các thực phẩm tiêu thụ sẽ giúp cải thiện vấn đề sức

khỏe này Thực vật chiếm phần lớn chế độ ăn của con người, trong đó, lúa gạo (Oryza

sativa L.) là lương thực chủ yếu của hơn một nửa dân số thế giới, được trồng phổ

biến ở hơn 100 quốc gia với 90% tổng sản lượng đến từ châu Á Ở Việt Nam, TBR225 là giống lúa chủ lực của quốc gia có tính thích ứng rộng, có khả năng chống chịu với điều kiện bất lợi và sâu bệnh, chất lượng gạo thơm, ngon, mềm dẻo Tuy vậy, giống lúa này có nhược điểm là hàm lượng sắt trong hạt tương đối thấp Do đó, việc tăng cường hàm lượng sắt tích lũy trong hạt gạo TBR225 là một trong những hướng nghiên cứu cần thiết để cải thiện tình trạng này

Mặc dù sắt chiếm một lượng lớn trong đất nhưng lại thường tồn tại ở dạng Fe(III) không hòa tan, do đó thực vật phải phát triển những chiến lược khác nhau (chiến lược I và chiến lược II) để hấp thu nguyên tố này Lúa gạo sử dụng chiến lược II thông qua việc tạo phức với phytosiderophore để chelate hóa Fe(III) Phức hợp Fe(III)-phytosiderophore được hấp thu và vận chuyển thông qua kênh vận chuyển Yellow Stripe1-Like (YSL) Ở lúa gạo có 18 gen mã hóa cho các protein YSL được

tìm ra, trong đó OsYSL2 có vai trò trong tích lũy sắt ở hạt Nhiều nghiên cứu đã cho thấy giảm biểu hiện của gen OsYSL2 có thể dẫn đến giảm hàm lượng sắt trong hạt

Trong khi đó, khi tăng cường biểu hiện gen này thì hàm lượng sắt được cải thiện đáng kể ở hạt gạo

Công nghệ chỉnh sửa hệ gen đang đóng vai trò hỗ trợ chủ lực trong cải thiện tính trạng ở cây trồng thông qua việc thay đổi biểu hiện của gen Để tăng cường biểu

hoạt tính cắt đã bị loại bỏ của dCas9 cùng với yếu tố hoạt hóa phiên mã giúp tăng cường biểu hiện chính xác gen đích mong muốn

Với mục tiêu cải thiện hàm lượng sắt tích lũy ở hạt gạo TBR225 thông qua

tăng cường biểu hiện gen OsYSL2 sử dụng công nghệ CRISPRa, chúng tôi đã thực

hiện đề tài nghiên cứu “Thiết kế cấu trúc CRISPRa tăng cường biểu hiện gen

OsYSL2 ở lúa TBR225” Đề tài luận văn được thực hiện với các mục tiêu sau: (1)

Nghiên cứu in silico họ gen OsYSL; (2) Phân lập và giải trình tự một vùng nằm trên promoter gen OsYSL2; (3) Thiết kế cấu trúc vector tăng cường biểu hiện với gRNA đặc hiệu cho promoter gen OsYSL2 và biến nạp vector thiết kế vào chủng vi khuẩn E

coli

TỔNG QUAN 1.1 Vai trò của sắt đối với sức khỏe con người

Sắt (Fe) là nguyên tố thiết yếu cho tất cả các sinh vật sống và đóng vai trò quan trọng trong nhiều quá trình sinh học Theo ước tính của Tổ chức Y tế Thế giới (World Health Organization – WHO, 2001), có khoảng hai tỷ người bị thiếu máu trên toàn thế giới và trong đó, 50% người bị thiếu máu là do thiếu sắt Ở Việt Nam, theo điều tra quốc gia về vi chất dinh dưỡng năm 2014 – 2015 của Viện Dinh dưỡng, tình trạng thiếu sắt phổ biến ở trẻ em dưới 5 tuổi (50,3%) và phụ nữ mang thai (47,3%) Thiếu máu do thiếu sắt có thể gây chậm phát triển nhận thức và thể chất, làm giảm khả năng miễn dịch, tăng nguy cơ tử vong mẹ và bé Nguyên nhân cơ bản của việc thiếu sắt được xác định là do hàm lượng sắt hấp thu qua khẩu phần ăn hàng ngày khá thấp [60] Khi lượng sắt không đủ để tạo ra hồng cầu, quá trình tổng hợp hemoglobin trong tiền hồng cầu sẽ suy giảm và gây ra các triệu chứng huyết học liên quan đến thiếu máu do sắt Chiến lược tối ưu để ngăn chặn tình trạng thiếu sắt chính là tăng cường lượng sắt hấp thu vào cơ thể qua khẩu phần ăn hàng ngày

Thực vật đóng vai trò là nguyên liệu sơ cấp, chiếm vị trí quan trọng trong sức khỏe dinh dưỡng của con người [35] Trong đó, lúa gạo là lương thực chủ yếu của một nửa dân số thế giới, được trồng phổ biến ở hơn 100 quốc gia với 90% tổng sản lượng toàn cầu đến từ châu Á [30] Tuy nhiên, so với các lương thực khác, gạo thường chứa hàm lượng sắt thấp và tính khả dụng kém, không cung cấp đủ lượng sắt cần thiết cho dinh dưỡng hàng ngày [97] Gạo nguyên cám chứa 12 mg Fe kg-1 [44], nhưng trong gạo đã xay xát thì lượng Fe lại giảm đi đáng kể Điều này xảy ra do hầu hết sắt được tích lũy ở lớp aleurone [98], do đó 90% hàm lượng sắt sẽ mất đi trong quá trình xay xát Thêm vào đó, hạt gạo chứa nhiều axit phytic (có vai trò trong tích lũy phospho) có thể chelate hóa Fe làm cho sắt trở nên không còn tính khả dụng sinh học [37] Do đó, việc tăng cường hàm lượng cũng như tính khả dụng sinh học của sắt

1.2 Vận chuyển sắt ở thực vật

Sắt đóng vai trò quan trọng trong nhiều quá trình sinh học ở thực vật như là hô hấp, tổng hợp diệp lục hay tham gia trong chuỗi truyền điện tử [38] Mặc dù sắt chiếm một lượng lớn trong đất, tuy nhiên ở đất có tính kiềm (chiếm khoảng 30% diện tích đất trồng trọt trên thế giới) thì hàm lượng sắt lại hạn chế bởi phần lớn sắt tồn tại ở dạng Fe(III) không hòa tan [33] Trong khi đó, phần lớn Fe sinh khả dụng có nhiều trong đất có tính axit gây độc cho thực vật vì lượng sắt dư thừa có thể hình thành các loại phản ứng oxy thông qua phản ứng Fenton [33, 100] Do đó, thực vật có cơ chế để tiếp nhận và hấp thu sắt ở rễ, ngăn chặn tình trạng thiếu sắt hoặc ngộ độc sắt và duy trì cân bằng nội môi sắt [33] Để hấp thu được Fe(III) tồn tại trong đất, thực vật đã phát triển hai chiến lược: chiến lược I và chiến lược II [104] Sự khác biệt lớn nhất giữa hai chiến lược này là ở giai đoạn oxi hóa sắt khi hấp thu vào thực vật: chiến lược I sử dụng Fe(II) và chiến lược II sử dụng Fe(III) [18]

Thực vật sử dụng chiến lược I bao gồm tất cả thực vật hai lá mầm và thực vật một lá mầm không thuộc họ cỏ [18] Phần lớn các gen thiết yếu trong hấp thu sắt ở

chiến lược I được xác định ở Arabidopsis là ferric-chelate reductase oxidase 2 (FRO2)

[85], Fe-regulated transporter 1 (IRT1) [28] và H+-ATPase chịu trách nhiệm tiết proton và hợp chất phenolic vào rễ để tăng cường khả năng hòa tan các ion sắt [55] Cụ thể, Fe(III) được khử thành sắt Fe(II) nhờ FRO2 gần màng tế bào sau đó được vận chuyển từ đất vào tế bào rễ thông qua kênh vận chuyển IRT1

Các thực vật sử dụng chiến lược II như lúa gạo, lúa mì, lúa mạch và ngô tiết lượng lớn phân tử hữu cơ có ái lực cao với Fe là phytosiderophore (PS) thuộc họ mugineic acid (MA) [11, 14, 56, 91] Việc tổng hợp MA là một con đường bảo thủ xuất phát từ S-adenosyl-L-methionine và bao gồm các phản ứng của nicotianamine synthase (NAS), nicotianamine aminotransferase (NAAT) và deoxymugineic acid synthase (DMAS) [10, 55, 92] Cụ thể, ba phân tử S-adenosyl-methionine được sử dụng để tổng hợp nicotiamine (NA) bằng enzyme NAS Ở thực vật một lá mầm, NA được chuyển hóa thành 2’-deoxymugineic acid (DMA) nhờ enzyme NAAT và

DMAS DMA là thành viên thuộc họ MA Ở lúa gạo, việc biểu hiện của các gen mã hóa cho các enzyme phụ thuộc vào hàm lượng Fe trong đất và hầu hết các gen được xác định là có vai trò trong đáp ứng thiếu Fe NAS nằm trên màng của bóng bào ở tế bào rễ, trong khi đó NAAT nằm trong các bóng bào này cho thấy vị trí sinh tổng hợp MA Việc tiết MA vào trong rễ thông qua sự biểu hiện của kênh vận chuyển PS là TOM1 TOM1 được phát hiện ở lúa gạo và lúa mạch và thuộc siêu họ điều hành chính (MFS - major facilitator superfamily), là một trong những nhóm kênh vận chuyển xuyên màng lớn nhất giúp thúc đẩy quá trình vận chuyển cơ chất thông qua màng tế bào và phản ứng với gradient ion hóa thẩm [79] Sau đó, phức hợp Fe–MA được hình thành và hấp thu qua kênh YELLOW STRIPE 1 (YS1) và YELLOW STRIPE 1-like (YSL) ở tế bào rễ [21, 46] Phức hợp Fe(III)–DMA được hấp thu vào tế bào chất tế bào rễ có thể bị khử bởi ascorbate và chuyển thành Fe(II)–NA Fe(II)–NA tế bào chất sau đó được tiết vào xylem và tạo ra các phức hợp chủ yếu là với citrate hoặc DMA (Fe–DMA) và tiếp tục được vận chuyển [106] Sơ đồ các gen mã cho protein liên quan đến vận chuyển và cân bằng nội môi Fe ở lúa gạo là mô hình đại diện được

thể hiện ở Hình 1 [73] Quá trình hấp thu và vận chuyển ở lúa mì cũng tương tự với

lúa gạo và đã được nghiên cứu trước đó [14, 18]

Hình 1: Sơ đồ các kênh liên quan đến hấp thu, vận chuyển và dự trữ sắt ở lúa gạo [73]

Các kênh đó bao gồm: TOM1 (transporter of mugineic acid family phytosiderophores 1), YS1 (yellow strip1), YSL15 (yellow stripe 1-like), IRT1 (iron-regulated transporter), OsNRAMP1 (natural resistance-associated macrophage protein 1), OsFRDL1 (ferric reductase defective like1), ENA (efflux transporter of nicotianamine), OsVIT (vacuolar iron transporter), OsFER (ferritin)

1.3 Tổng quan về họ YSL 1.3.1 Họ protein YSL ở thực vật

Họ YSL là thành viên thuộc họ oligopeptide transporter (OPT) có các thành viên liên quan đến kênh vận chuyển tri-, tetra-, penta- và hexapeptide và các dẫn xuất của amino acid [105] giúp thực vật sinh trưởng và phát triển [72] Họ OPT là một

nhóm các kênh vận chuyển proton kết hợp có nhiều vai trò trong cân bằng nội môi kim loại, vận chuyển nitơ, và phân bố lưu huỳnh [71, 90] Các protein OPT được dự đoán có chứa hai motif bảo thủ cao (NPG và KIPPR) và có 12-14 domain xuyên

màng với đầu N và đầu C hướng ra ngoài màng tế bào [57, 99] Ở Arabidopsis, có 17

thành viên thuộc họ OPT được xác định và chia ra thành hai nhóm: Oligopeptide Transporter (PT) và Yellow Stripe-Like (YSL) [57] Các thành viên nhóm YSL được tìm thấy ở vi khuẩn cổ, vi khuẩn, nấm và thực vật nhưng không có ở động vật, trong khi đó PT chỉ được tìm thấy ở thực vật và nấm [71, 90] Protein YSL không có cấu trúc nhất quán Nghiên cứu của Murata và cộng sự [76] chỉ ra ZmYS1 và HvYS1 có 12 domain xuyên màng, trong khi nghiên cứu của DiDonato và cộng sự [25]dự đoán rằng protein YSL có 15 domain xuyên màng

Thành viên họ YSL có thể được chia ra thành bốn phân nhóm [20] và hầu hết đã được nghiên cứu các đặc tính chức năng ZmYS1 được phân lập lần đầu ở hệ gen của ngô, có chức năng vận chuyển phức hợp Fe(III)-PS từ đất vào rễ [21] Đột biến

ys1 ở ngô đã gây ra tình trạng thiếu sắt ở thể đột biến do mất khả năng vận chuyển

phức hợp Fe(III)-PS Trong điều kiện thiếu sắt, sự biểu hiện gen ZmYS1 tăng lên ở rễ và thân [20, 84] Ở Arabidopsis thaliana, các protein YSL có vai trò vận chuyển phức

hợp Fe-NA và Fe-citrate AtYSL1 góp phần trong vận chuyển đường dài phức hợp Fe(II)–NA qua mạch xylem và vận chuyển đến hạt [49] AtYSL1, AtYSL2 và AtYSL3 cần thiết cho việc vận chuyển Fe, Zn, và Cu từ lá đến hạt [17, 96] AtYSL4 và AtYSL6 nằm trên màng bào quan, chẳng hạn như màng lục lạp, màng không bào và mạng lưới nội chất, đóng vai trò là trung gian vận chuyển nội bào phức hợp kim

loại – NA trong tế bào [19, 27] Ở Brachypodium distachyon đã xác định được 19

thành viên thuộc họ YSL [107] Trong đó, BdYSL3 đã được chứng minh vai trò trong

việc vận chuyển Cu [89] Dòng đột biến ysl3 ở Brachypodium cho thấy việc chậm

phát triển hoa, thay đổi cấu trúc cụm hoa, giảm khả năng sinh sản của hoa, kích thước hạt và trọng lượng hạt Ở lúa mạch, HvYS1 là chất vận chuyển phức hợp kim loại-

bì, được chứng minh đóng vai trò vận chuyển phức hợp PS với các kim loại Fe(III), Zn(II), Ni(II), Cu(II), Mn(II) hay Co(II) [8]

1.3.2 Họ OsYSL ở lúa gạo

Ở lúa gạo, họ YSL có 18 thành viên đã được tìm ra tương đồng từ 36% đến

76% với ZmYS1, trong đó OsYSL15 là thành viên gần gũi nhất (Hình 2) [58]

Hình 2: Cây chủng loại phát sinh xây dựng từ 18 trình tự amino acid OsYSL [58] Trong nghiên cứu của Koike và cộng sự ở điều kiện đủ sắt hoặc thiếu sắt, chỉ

có 6 gen tìm thấy được sản phẩm phiên mã trong rễ hoặc lá của cây lúa [58] OsYSL6,

OsYSL14 và OsYSL16 biểu hiện ở cả rễ và lá của cả hai nhóm cây, trong khi đó OsYSL13 ưu tiên biểu hiện ở chồi và có sự giảm biểu hiện ở cây thiếu sắt OsYSL15

chỉ biểu hiện ở rễ và biểu hiện nhiều hơn khi thiếu sắt OsYSL2 không biểu hiện ở rễ

tuy nhiên lại biểu hiện mạnh ở lá của cây thiếu sắt

Chức năng của các thành viên thuộc họ OsYSL cũng đã được nghiên cứu OsYSL2 là một kênh vận chuyển Fe-NA thiết yếu cần cho vận chuyển đường dài Fe(II)-NA và Mn(II)-NA qua mạch phloem [47, 58] OsYSL6 là kênh vận chuyển Mn-NA chịu trách nhiệm giải độc khi dư thừa Mn [86] OsYSL9 và OsYSL13 liên quan đến vận chuyển sắt từ nội nhũ đến phôi trong giai đoạn phát triển của hạt [87, 109] OsYSL15 là kênh vận chuyển phức hợp Fe(III)-DMA có chức năng hấp thu Fe(III)-DMA ở rễ và vận chuyển sắt ở mạch phloem [46, 63] OsYSL16 chịu trách nhiệm phân bổ Fe(III)-DMA [52, 62] và Cu(II)-NA [108, 110] qua các bó mạch OsYSL18 liên quan đến phân bố Fe(III)-DMA ở các cơ quan sinh sản, khớp lamina và tế bào phloem ở gốc bẹ lá [6]

1.3.3 OsYSL2 ở lúa gạo

OsYSL2 là thành viên thuộc họ OsYSL nhận được nhiều sự chú ý bởi protein này đã được chứng minh có vai trò trong tích lũy sắt ở hạt gạo [58]

Hình 3: Cấu trúc dự đoán xuyên màng của OsYSL2 [58]

OsYSL2 được mã hóa bởi gen OsYSL2, Gen này nằm trên cánh ngắn của NST số 2, chứa 7 exon OsYSL2 mã hóa cho chuỗi polypeptide dài 674 amino acid với 14

domain xuyên màng (Hình 3) Protein này đóng vai trò trong vận chuyển phức hợp

kim loại – NA ở lúa gạo, vận chuyển sắt và mangan ở mạch phloem và vận chuyển

OsYSL2i dòng 3 và 5 cho thấy hàm lượng sắt trong hạt suy giảm Kết quả này đề xuất

vai trò của OsYSL2 trong việc tích lũy sắt ở hạt gạo Nghiên cứu về tương quan giữa

hàm lượng sắt ở hạt với sự biểu hiện OsYSL2 của nhóm tác giả đã đưa ra kết quả hàm

lượng sắt ở dòng đột biến giảm 20% ở gạo nguyên cám và 40% ở gạo đã xay xát khi

so với dòng kiểu dại Nhóm nghiên cứu cũng tăng cường biểu hiện gen OsYSL2 thông qua promoter sucrose transporter OsSUT1 cho kết quả hàm lượng sắt cao hơn ở dòng chuyển gen Ở dòng OsSUT1-promoter OsYSL2 thứ 18, hàm lượng Fe trong gạo xay

xát cao gấp 4,4 lần so với dòng gạo kiểu dại Do đó, việc tăng cường biểu hiện gen

OsYSL2 có thể định hướng tăng cường hàm lượng Fe tích lũy trong hạt gạo

Promoter là vùng trình tự thường nằm ngược dòng gen (upstream) hoặc ở đầu 5’ của vị trí khởi đầu, đóng vai trò là nơi mà RNA polymerase sẽ bám vào để khởi đầu quá trình phiên mã [68] Promoter liên quan chặt chẽ đến điều hòa biểu hiện của gen và thường được ứng dụng nhiều trong kỹ thuật di truyền [66] Cho đến hiện tại, người ta đã phát triển nhiều hệ thống promoter dùng phổ biến để điều khiển sự biểu hiện của gen như là CaMV35S promoter [29], RuBisCo promoter [74] và NOS

promoter [5] Các yếu tố điều hòa cis nằm trên vùng promoter là một trong những

yếu tố quan trọng quyết định đến biểu hiện gen, bởi đây là vị trí bám của các protein

liên quan đến khởi đầu và điều hòa quá trình phiên mã [41] Các yếu tố điều hòa cis

ở thực vật có chức năng đáp ứng với các bất lợi, điều hòa biểu hiện gen đặc hiệu với các mô khác nhau và và điều hòa biểu hiện gen quy định tính trạng hình thái trong những giai đoạn sinh trưởng phát triển khác nhau [45] Để tăng cường biểu hiện của các gen quan tâm, các nghiên cứu chèn trình tự promoter có khả năng hoạt động mạnh hoặc các promoter đáp ứng có điều kiện đã được nghiên cứu và cho thấy có hiệu quả cao [15, 50, 101] Việc đưa các yếu tố có khả năng hoạt hóa vào kích thích promoter để tăng cường biểu hiện các gen đích cũng đang là hướng nghiên cứu được phát triển cùng công cụ chỉnh sửa gen CRISPR [24, 70, 103]

1.4 Công nghệ chỉnh sửa hệ gen CRISPR/Cas 1.4.1 Lược sử phát triển công nghệ CRISPR/Cas

Hệ thống chỉnh sửa gen CRISPR/Cas được phát triển dựa trên cơ chế miễn dịch tự nhiên ở vi khuẩn Nhiều vi khuẩn và hầu hết các vi khuẩn cổ đã phát triển các hệ thống miễn dịch đáp ứng chống lại sự lây nhiễm của thực khuẩn thể thông qua các

locus CRISPR (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats) và các gen

liên quan tới CRISPR (cas) [4, 40] Trong quá trình sinh miễn dịch, sau khi tiếp xúc

với các yếu tố di truyền xâm nhập từ thực khuẩn thể, các DNA ngoại lai ngắn được tích hợp vào vùng đệm (spacer) của CRISPR trong bộ gen vật chủ để ghi nhớ cho các lần xâm nhiễm sau này [4] Sau đó, CRISPR được phiên mã tạo thành tiền RNA và cắt thành các đơn vị nhỏ hơn là CRISPR RNA (crRNA) Mỗi crRNA chứa một trình tự spacer và theo sau bởi trình tự lặp lại Những crRNA này sẽ liên kết với một hoặc nhiều protein Cas để tạo thành phức hệ Cas-crRNA Trong giai đoạn xâm nhiễm, hệ thống Cas-crRNA sẽ tìm kiếm tế bào chứa nucleic acid ngoại lai mục tiêu thông qua sự nhận diện và bắt cặp bổ sung với trình tự crRNA Sau khi nhận biết, trình tự nucleic acid ngoại lai sẽ bị cắt đứt bởi các protein Cas

Kể từ lần đầu được ứng dụng vào chỉnh sửa gen [51], hệ thống CRISPR/Cas9 đã nhanh chóng phát triển và trở thành công cụ tiềm năng trong thao tác gen ở các loài bởi dễ dàng trong thiết kế, đơn giản trong sử dụng và có tính hiệu quả cao [43] Hệ thống chỉnh sửa gen này bao gồm có hai thành phần chính: protein Cas9 và guide

RNA (gRNA) (Hình 4) gRNA có chứa một trình tự RNA nhỏ dài khoảng 20

nucleotide bổ sung với trình tự đích giúp Cas9 nhận biết và cắt chính xác trình tự đích đó Thêm nữa, trình tự nhận biết để cắt của Cas9 có liên kết với trình tự protospacer adjacent motif (PAM) là một đoạn nucleotide ngắn nằm ở đầu 3’ của trình tự đích Ở

Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9), là Cas9 được sử dụng phổ biến trong chỉnh

sửa thì trình từ PAM là 5’-NGG-3’ Đứt gãy sợi đôi (DNA double-strand break – DSB) được tế bào sửa chữa theo hai con đường chính dựa trên việc có sử dụng hay không sử dụng trình tự DNA tương đồng làm khuôn [95] Sửa chữa không tương đồng (non-homologous end joining – NHEJ) là phương thức gọt sửa và nối trực tiếp hai đầu đứt gãy với nhau mà không cần trình tự tương đồng Con đường NHEJ thường tạo ra các đột biến indels hay đột biến dịch khung làm gián đoạn gen [54] Trong khi đó, sửa chữa tương đồng (homologous recombination – HR) yêu cầu đoạn trình tự DNA tương đồng làm khuôn để sửa chữa đứt gãy DNA [95] Sửa chữa theo con đường HR có độ chính xác cao thông qua việc sử dụng trình tự DNA tương đồng chủ yếu từ NST chị em để làm khuôn

Hình 4: Sơ đồ cơ chế hoạt động của hệ thống CRISPR/Cas9 [48]

1.4.2 Hệ thống CRISPR/Cas trong tăng cường biểu hiện gen

Dựa trên cơ chế của hệ thống CRISPR/Cas, người ta đã tạo ra nhiều cải biến mới giúp tăng khả năng ứng dụng của hệ thống này trong điều khiển biểu hiện gen Vào năm 2013, nhóm tác giả Qi và cộng sự [81] đã tạo ra đột biến trên hai miền endonuclease bảo thủ của Cas9 cụ thể là Aspartic acid ở vị trí 10 của miền RuvC biến đổi thành alanine (D10A) và histidine ở vị trí 840 của miền HNH biến đổi thành alanine (H840A) Cas9 chứa hai đột biến này sẽ bị mất đi hoạt tính endonuclease tạo thành dCas9 (dead Cas9) Hệ thống CRISPR/dCas9 không còn khả năng cắt DNA nhưng vẫn có hoạt tính bám đặc hiệu với trình tự DNA mục tiêu thông qua trình tự gRNA

Nhiều hệ thống điều hòa biểu hiện gen được phát triển dựa trên khả năng bám đặc hiệu của hệ thống CRISPR/dCas9 Trong điều hòa biểu hiện các gen nội sinh,

việc cải biến các yếu tố phiên mã (transcription factors – TFs) để nhắm đến vùng điều hòa của gen đích giúp hoạt hóa hay ức chế biểu hiện gen là một trong những chiến lược được nhiều nghiên cứu chú ý đến [24, 61, 70] Hệ thống điều hòa biểu hiện gen được phát triển theo hai hướng: điều hòa ức chế biểu hiện gen (CRISPRi) và điều hòa tăng cường biểu hiện gen (CRISPRa) CRISPRi ứng dụng khả năng bám của phức hợp CRISPR/dCas9 vào các yếu tố DNA thông qua sợi gRNA làm ức chế quá trình kéo dài của RNA polymerase để làm giảm biểu hiện gen [61] Trong khi đó, hệ thống CRISPRa có thể tăng cường biểu hiện gen mục tiêu qua việc protein dCas9 dung hợp với các yếu tố phiên mã giúp thu hút và ổn định các phức hợp liên kết với promoter Có một số các yếu tố phiên mã được sử dụng trong CRISPRa hiện nay như là p65, Rta, HSF1, VP16 và một số biến thể của chúng VP16 có nguồn gốc từ herpes simplex virus (HSV), giúp hoạt hóa phiên mã gen sớm của virus qua việc gắn gốc amino acid ở trình tự cuối với một hoặc nhiều protein vật chủ có thể nhận biết trình tự DNA ở vùng promoter của chúng Dựa trên đặc tính này của VP16, nghiên cứu của R R Beerli và cộng sự [13] đã kết hợp bốn VP16 để tạo thành VP64 giúp tăng cường biểu hiện gen hiệu quả hơn Hệ thống CRISPRa với các yếu tố phiên mã khác nhau được lựa chọn không những cần hiệu quả trong tăng cường biểu hiện gen mà còn cần đảm bảo tính an toàn, tránh tác dụng phụ gây độc cho tế bào [94] Các thí nghiệm sử dụng hệ thống sử dụng p65 hay Rta cho mức độ biểu hiện cao tuy nhiên lại gây ra độc tính

cho chuột trong khi đó dCas9/VP64 không gây độc (đã được đánh giá in vivo) [94]

Sử dụng hệ thống CRISPRa với thành phần hoạt hóa phiên mã VP64 có thể thay thế cho phương pháp truyền thống để tăng cường biểu hiện gen như là sử dụng CaMV

35S bởi có thể giúp tăng tính đặc hiệu vào vị trí yếu tố cis trên promoter của gen

thông qua gRNA giúp tránh hiệu ứng pleiotropy và làm im lặng gen sau phiên mã [24]

Hình 5: Hệ thống dCas9/VP64 [80] Sử dụng hệ thống CRISPRa dung hợp giữa dCas9 với VP64 đã cho thấy hiệu quả trong việc tăng cường biểu hiện gen Cụ thể, trong nghiên cứu ở nho, Chong Ren và cộng sự đã sử dụng hệ thống dCas9-VP64 và dCas9-TV để tăng cường biểu hiện gen UDP-glucose flavonoid glycosyltransferases (UFGT) đóng vai trò quan trọng trong sinh tổng hợp anthocyanin [82] Việc sử dụng hệ thống dCas9-VP64 đã làm tăng mức độ hoạt động của UFGT lên 1,6 – 5,6 lần; trong khi sử dụng dCas9-TV làm tăng hoạt động của gen này lên 5,7 – 7,2 lần Hệ thống dCas9-TV là sự kết hợp của 6 motif yếu tố phiên mã TALE và VP128 giúp tăng cường phiên mã Trong một nghiên cứu khác liên quan đến khả năng chịu hạn, sử dụng hệ thống CRISPRa đã giúp làm tăng cường biểu hiện gen AREB1 [24] Tăng cường biểu hiện gen này giúp thúc đẩy cải thiện hiệu suất sinh lý của cây trong điều kiện hạn hán, liên quan đến việc tăng cường hàm lượng diệp lục, hoạt động của các enzyme chống oxy hóa và tích lũy đường tan Một nghiên cứu mới nhất vào năm 2023 đã chỉ ra rằng tăng cường biểu hiện gen SlPR-1 sử dụng hệ thống CRISPRa cũng làm tăng khả năng kháng lại

sự xâm nhiễm của Clavibacter michiganensis [31] Những kết quả trên cho thấy tiềm

năng ứng dụng của hệ thống CRISPRa trong tăng cường biểu hiện gen liên quan các tính trạng tốt ở cây trồng

1.5 Giới thiệu về giống lúa TBR225

TBR225 được lai tạo từ tổ hợp lai K2/TBR27 vụ mùa 2006 thực hiện bởi Trần Mạnh Báo và các cộng sự, thuộc bản quyền của Công ty cổ phần Tập đoàn ThaiBinh

Seed, được công nhận giống Quốc gia năm 2015 [1] K2 có đặc điểm đẻ nhánh khỏe, bông to và nhiều hạt TBR27 chống được bệnh đạo ôn vụ xuân, bệnh bạc lá vụ mùa và có chất lượng gạo ngon, thơm TBR225 giữ được các đặc tính tốt của hai giống lúa gốc và cho năng suất cao

Về đặc điểm hình thái, TBR225 có chiều cao cây từ 110 đến 115 cm, đẻ nhánh khỏe, cứng cây, trỗ bông tập trung Bông của TBR225 to, dài 28 – 30 cm và nhiều hạt, hạt có hình dạng thon dài với khối lượng 1000 hạt từ 24-25 gram Hạt có chiều dài 7,0 – 7,1 mm, tỷ lệ dài/rộng 3,0

Về đặc điểm nông học, TBR225 là giống cảm ôn có tính thích ứng rộng, chịu thâm canh và chống chịu sâu bệnh khá tốt, nhiễm nhẹ bệnh đạo ôn và bạc lá Giống có thời gian sinh trưởng trung bình Ở miền Bắc, vụ xuân 125 – 135 ngày, vụ mùa 100 – 105 ngày Ở các tỉnh từ Đà Nẵng trở vào, vụ đông xuân 105 – 110 ngày, vụ hè thu 100 – 105 ngày

Giống lúa TBR225 có tính thích ứng cao, trồng được ở nhiều miền trên cả nước bao gồm đồng bằng sông Hồng, các tỉnh Trung bộ và một số tỉnh Nam bộ như Tiền Giang, Kiên Giang, năng suất tốt Năng suất vụ xuân của TBR225 đạt từ 60-75 tạ/ha, vụ mùa đạt 58 - 64 tạ/ha Năng suất của TBR225 có thể lên đến 80 - 90 tạ/ha trong điều kiện thâm canh cao Hạt gạo TBR225 trắng, trong Cơm gạo TBR225 mềm, vị đậm và thơm

Giống lúa TBR225 với những ưu thế vượt trội đã được đưa vào cơ cấu giống chủ lực ở Hà Nội [3] Hà Nội cũng là tỉnh thành ở Việt Nam tiêu thụ lúa giống TBR225 cao nhất (481,5 tấn) trong năm 2021 Tuy giống lúa TBR225 có nhiều đặc điểm tốt nhưng lại có hàm lượng sắt trong hạt tương đối thấp (34.3778 µg/g) khi so sánh với 50 giống lúa khác ở Việt Nam [2] Do đó, việc nghiên cứu tăng cường hàm lượng sắt tích lũy trong hạt lúa TBR225 là hướng nghiên cứu tiềm năng có thể tạo ra giống gạo vừa có đặc tính sinh học tốt vừa có giá trị dinh dưỡng cao cho con người

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Mẫu thực vật

Giống lúa TBR225 được cung cấp bởi Công ty cổ phần Tập đoàn ThaiBinh Seed [1]

2.1.2 Chủng vi sinh vật

Vi khuẩn E coli DH5α (Thermo Fisher Scientific, US) được sử dụng để nhân

dòng vector mong muốn

2.1.3 Vector và oligonucleotide

Vector pBUN6A11 do nhóm nghiên cứu Hui-Li Xing và cộng sự [102] phát

triển cung cấp bởi hãng Addgene

Hình 6: Sơ đồ vector pBUN6A11 (Addgene)

Các trình tự oligonucleotide sử dụng được liệt kê ở Bảng 1

Bảng 1: Các trình tự mồi được sử dụng trong nghiên cứu

Tên mồi Trình tự (5’ – 3’) Tm

(°C)

Kích thước sản phẩm dự kiến

crRNA_6 short-Fw GCCTCCTAGGTCT

414 bp pBUN6A11-Rv TGCACTGCAGGAA

2.1.4 Hóa chất

Hóa chất sử dụng trong tách chiết DNA bao gồm: CTAB (USBio), Chloroform:isoamyl alcohol (24:1) (Bio Basic), Isopropanol (Merck), Ethanol (Merck)

Hóa chất sử dụng trong phản ứng PCR và điện di bao gồm: MyTaq™ Mix (Meridian Bioscience), Agarose (Meridian Bioscience), HyperLadder™ 50bp (Meridian Bioscience), RedSafe™ Nucleic Acid Staining Solution (iNtRON Biotechnology), TAE 50X (ABT)

Hoá chất dùng trong phản ứng cắt – nối: BsaI-HF®v2 (New England Biolabs), Universal Ligation Mix (Vazyme Biotech), FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit (Vazyme Biotech)

Các hóa chất khác cũng được cung cấp từ các hãng uy tín

2.1.5 Máy móc, trang thiết bị

Máy móc, trang thiết bị chính sử dụng trong nghiên cứu bao gồm: máy PCR (Mastercycler nexus GSX1, Eppendorf), máy đo OD (BioSpectrometer, Eppendorf), máy chụp ảnh gel điện di (UVP BioDoc- It2, Analytik Jena), bể điện di (Mupid®-Exu, Takara Bio), máy ly tâm (Centrifuge 5424 R, Eppendorf), thiết bị ổn nhiệt (HB120-S, DLAB) Các thiết bị sử dụng thuộc Trung tâm Khoa học Sự sống và các phòng Thí nghiệm thuộc Khoa Sinh học, Trường ĐH Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Nghiên cứu in silico họ gen OsYSL 2.2.1.1 Thu thập thông tin và phân tích cấu trúc họ YSL ở lúa gạo

Trình tự protein ZmYS1 được thu thập từ cơ sở dữ liệu UniProt [7, 121] được sử dụng làm đầu vào để tìm kiếm các trình tự tương đồng trên lúa gạo Trình tự này

được đối chiếu với cơ sở dữ liệu O sativa v7.0 trên Phytozome v13 [34, 116] sử dụng

công cụ BlastP Tất cả các trình tự có E-value ≤ 1E-10 được thu thập trình tự protein, trình tự gen, trình tự mã hóa và trình tự promoter (1.5 kb upstream tính từ vị trí codon mở đầu) làm dữ liệu phân tích Thông tin về khối lượng phân tử, pI, chỉ số kỵ nước (aliphatic index) và GRAVY (Grand average of hydropathicity) được xác định sử dụng công cụ ExPASY [32, 113] Vị trí của các protein này trong tế bào cũng được dự đoán nhờ công cụ WoLF PSORT [42, 122] Các motif bảo thủ của họ protein OsYSL tìm ra bởi công cụ MEME [9, 115] Thông số cài đặt trong MEME bao gồm: số motif tối đa, 15; chiều dài tối thiểu của motif, 6; chiều dài tối đa của motif, 50 Vị

trí của các gen OsYSL trên nhiễm sắc thể cũng được xác định sử dụng tệp giff3 từ cơ

sở dữ liệu Phytozome v13 và biểu diễn bằng công cụ TBtool [16] TBtool [16] cũng được sử dụng để thể hiện cấu trúc exon/intron và các motif protein của họ OsYSL

2.2.1.2 Phân tích các yếu tố điều hòa cis trên vùng trình tự promoter của các gen YSL ở lúa gạo

Vùng trình tự promoter của các gen OsYSL được sử dụng để tìm kiếm các yếu tố điều hòa cis sử dụng công cụ PlantCARE [64, 118] Chỉ các trình tự nằm trên sợi

dương mới được thu thập phục vụ cho việc phân tích Tất cả dữ liệu sau đó được phân loại dựa trên vai trò của chúng bao gồm đáp ứng với điều kiện bất lợi, đáp ứng với căng thẳng sinh học, liên quan đến quá trình phát triển, đáp ứng với phytohormone, đáp ứng với ánh sáng, liên quan đến vùng promoter

2.2.1.3 Xây dựng cây chủng loại phát sinh họ protein YSL ở lúa gạo

Tất cả trình tự protein YSL của các thành viên thuộc họ O sativa, A thaliana

và một số trình tự YSL thuộc các loài thực vật bậc cao khác đã nghiên cứu trước đó được sử dụng để xây dựng cây chủng loại phát sinh Những trình tự này được so sánh sử dụng phần mềm Clustal X2 [59] Cây chủng loại phát sinh của các họ YSL ở các loài được dựng bằng phần mềm MEGA11 [93] sử dụng phương pháp Neighbor-Joining với bootstrap 1000 và số thread là 3 Cây sau đó được biểu diễn và chú thích bằng phần mềm iTOL v6 [65, 114]

2.2.1.4 Phân tích dữ liệu biểu hiện của họ gen YSL ở lúa gạo

Để đánh giá biểu hiện họ gen YSL ở lúa gạo, dữ liệu biểu hiện của 18 gen

OsYSL ở các giai đoạn phát triển được phân tích thông qua dữ liệu microarray

(GSE6893) [53] Việc so sánh sự biểu hiện của các gen này dưới điều kiện thông thường và điều kiện dư thừa Fe cũng được phân tích qua dữ liệu giải trình tự thông lượng cao (high throughput sequencing) (GSE150103) [12] Cuối cùng, các gen thuộc

họ OsYSL ở hai giống Indica khác nhau về hàm lượng sắt tích lũy trong hạt cũng

được đánh giá (GSE70093) [23] Biểu đồ nhiệt (heatmap) được dựng dựa trên giá trị

2.2.2 Phân lập và giải trình tự promoter OsYSL2 2.2.2.1 Tách chiết DNA tổng số từ lúa TBR225

Tách chiết DNA tổng số từ lá của lúa TBR225 được thực hiện dựa trên phương pháp tách chiết sử dụng đệm CTAB [78] Cụ thể, 500 mg mẫu lá được nghiền trong nitơ lỏng sau đó bổ sung 1 mL đệm CTAB 2% và trộn đều Hỗn hợp này được ủ ở 65°C trong 20 phút và ly tâm ở 12.000 rpm trong 5 phút ở 4°C Dịch nổi được thu vào ống mới và thêm một lượng dung dịch chloroform: isoamyl alcohol (24:1) tương ứng, trộn đều và ly tâm ở 10.000 rpm trong 10 phút ở 4°C Sau khi thu lấy dịch nổi, thêm một lượng isopropanol tương đương với thể tích thu được Hỗn hợp được ủ 5-7 phút rồi ly tâm ở 13.000 rpm trong 15 phút Sau đó, phần dịch nổi được loại bỏ, phần tủa được rửa với ethanol 70%, ly tâm ở 12.000 rpm trong 10 phút, lặp lại hai lần Tủa được ủ khô ở nhiệt độ phòng và hòa với nước Mẫu DNA được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1,5% và bảo quản ở -20°C

2.2.2.2 Thiết kế mồi nhân đoạn vùng trình tự đích

Trình tự OsYSL2 lấy từ cơ sở dữ liệu GenBank được sử dụng làm trình tự để

thiết kế mồi trên công cụ BLAST Primer [119] Mồi cần đạt được các tiêu chí: thành phần GC nằm trong khoảng 40-60%, chiều dài mồi nằm trong khoảng 18-28 nucleotide, nhiệt độ nóng chảy (Tm) của mồi nằm trong khoảng 57-63°C, mồi xuôi và mồi ngược có Tm không chênh nhau quá 3°C, đầu 3’ kết thúc bằng G hoặc C để tăng cường khả năng bám Ngoài ra các thông số liên quan đến khả năng tự bắt cặp hay cấu trúc bậc hai của mồi cũng được xét đến để tối ưu độ đặc hiệu cũng như khả năng bắt cặp của mồi

2.2.2.3 Nhân bản đoạn trình tự promoter OsYSL2

Đoạn trình tự đích trên vùng promoter của gen OsYSL2 được khuếch đại bằng

phương pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu đã thiết kế ở trên với khuôn là mẫu DNA tổng số lá lúa TBR225 tách chiết được Thành phần phản ứng và chu trình nhiệt được thể hiện theo các bảng dưới đây:

Bảng 2: Thành phần phản ứng PCR nhân bản trình tự promoter OsYSL2

Nồng độ gốc

Nồng độ phản ứng

Thể tích 1 phản ứng

Kí hiệu

TBR225

Bảng 3: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR nhân bản trình tự promoter OsYSL2

Các bước Nhiệt độ Thời gian Đơn vị

Khuếch đại (n chu kỳ: 35)

2.2.2.4 Giải trình tự đoạn trình tự đích

Sản phẩm PCR nhân bản trình tự trên promoter OsYSL2 sau khi được kiểm tra

trên bản điện di được dùng làm mẫu giải trình tự Phương pháp giải trình tự được sử dụng ở đây là phương pháp giải trình tự Sanger Kết quả giải trình tự sau đó được phân tích sử dụng phần mềm BioEdit và so sánh với các giống lúa trên cơ sở dữ liệu

2.2.2.5 Phân tích các yếu tố điều hòa cis trên vùng trình tự promoter OsYSL2

Dự đoán các yếu tố điều hòa cis trên vùng trình tự promoter OsYSL2 được

thực hiện bằng công cụ PlantCARE [118] Các yếu tố điều hòa nằm trên sợi dương được thu thập và phân loại theo dựa theo chức năng Trong đó, các yếu tố điều hòa liên quan đến promoter được sử dụng để phân tích và thiết kế gRNA nhắm đích giúp

tăng cường biểu hiện gen OsYSL2

2.2.3 Thiết kế gRNA

Trình tự gRNA được thiết kế trên trình tự promoter gen OsYSL2 đã phân tích

trước đó Công cụ sử dụng để thiết kế là CRISPR-P v2.0 [69, 112] Các thông số của trình tự gRNA được phân tích bao gồm thành phần GC, TBP (total base pairs – cặp base tổng số), CBP (consecutive base pairs – cặp base liên tiếp) và IBP (internal base pairs – cặp base nội phân tử) Các gRNA được lựa chọn tiếp đó được xác định các trình tự tương đồng trên hệ gen lúa sử dụng phần mềm CCTop [111] Các trình tự genome của lúa được lấy từ cơ sở dữ liệu Ensembl Plants [117] Cuối cùng, các gRNA được đánh giá cấu trúc bậc hai sử dụng phần mềm RNAfold WebServer [120] Các gRNA cần có đầy đủ các cấu trúc RAR (repeat and anti-repeat) và các stem loop [67]

(Hình 7) Những cấu trúc này cần thiết để giúp hệ thống chỉnh sửa tồn tại ổn định và

thực hiện chức năng

Hình 7: Cấu trúc bậc hai điển hình của gRNA [67]

2.2.4 Thiết kế cấu trúc vector tăng cường biểu hiện gen OsYSL2 2.2.4.1 Tách chiết vector pBUN6A11

Vector pBUN6A11 được tách chiết sử dụng bộ kit TopPURE Plasmid DNA

Extraction Kit (ABT) từ chủng khuẩn E coli chứa vector được cung cấp Khuẩn mang

vector pBUN6A11 được nuôi lắc qua đêm trong môi trường LB lỏng cho đến OD600

đạt 1,5 – 5,0 4 mL dịch nuôi cấy được ly tâm ở tốc độ 13.000 rpm trong 2 phút, loại bỏ dịch nổi Ống chứa cặn khuẩn được bổ sung 225 µL PS Buffer và 25 µL RNase A rồi trộn đều 250 µL PL Buffer được bổ sung và đảo 3 – 6 lần rồi ủ ở nhiệt độ phòng 5 phút Ống tiếp tục được thêm 350 µL PP Buffer đã làm lạnh, đảo ống 3 – 6 lần, ủ lạnh 5 phút và ly tâm ở 13.000 rpm trong 10 phút Sau khi ly tâm, dịch nổi của ống được chuyển sang cột silica và ly tâm ở tốc độ 13.000 rpm trong 1 phút Cột được rửa hai lần với 500 µL WB1 Buffer, ly tâm 13.000 rpm trong 1 phút Và được làm khô bằng ly tâm 13.000 rpm trong 1 phút Cuối cùng, cột được chuyển sang ống thu

đồng thời cũng được kiểm tra thông qua điện di tổng số và PCR với cặp mồi vector Vector sau tách được bảo quản ở -20°C

2.2.4.2 Thực hiện phản ứng ghép nối gRNA và vector pBUN6A11

Vector pBUN6A11 được cắt mở vòng sử dụng enzyme BsaI-HF®v2 (NEB) với thể tích phản ứng là 50 µL Sau khi cắt mở vòng, sản phẩm cắt được tinh sạch sử dụng bộ kit FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit của Vazyme 50µL sản phẩm cắt mở vòng vector pBUN6A11 được điện di trên bản gel 1,5% ở 80V trong 30 phút thu băng sản phẩm chính Một lượng thể tích buffer GDP tương ứng với khối lượng của gel (100 mg gel tương ứng với 100 μl GDP) được cho vào ống chứa gel đã cắt và ủ ở 55°C trong vòng 10 phút để hòa tan gel Dung dịch được chuyển lên cột FastPure DNA Mini Columns-G có lắp ống thu 2 mL rồi ly tâm ở 12.000 rpm trong 1 phút và loại bỏ dịch lọc Cột tiếp tục được thêm 300 μl Buffer GDP và ly tâm ở 12.000 rpm trong 1 phút, loại bỏ dịch lọc Cột được rửa hai lần với 700 μL Buffer GW, ly tâm 12.000 rpm trong 1 phút Cuối cùng, cột được thêm 30 µL Elution Buffer vào chính giữa màng lọc, ủ 2 phút và ly tâm ở 12.000 rpm trong 1 phút, thu lấy dịch chứa DNA, bảo quản ở -20°C

Phản ứng bắt cặp của gRNA được thực hiện bằng cách trộn 10 µL mồi xuôi nồng độ 10 µM (crRNA_6 Fw) và 10 µL mồi ngược nồng độ 10 µM (crRNA_6 Fw) trong 30 µL H2O Cặp oligonucleotide này được xác định là kết quả thiết kế gRNA (mục 2.2.3.) Theo đó, trình tự cho crRNA_6-Fw và crRNA_6-Rv lần lượt là: 5’-

5’-[AAAC]TTGCGCAGACCTAGGAGGCTG-3’ Phản ứng này được ủ ở 95°C trong 5 phút và ngay lập tức làm lạnh nhanh trên đá trong 20 phút Sản phẩm phản ứng sau đó được dùng trong phản ứng ghép nối gRNA vào vector

Phản ứng ghép nối gRNA vào vector được thực hiện nhờ enzyme T4 DNA ligase trong bộ kit Universal Ligation Mix của Vazyme Biotech Cụ thể, 9 µL vector pBUN6A11 đã cắt mở vòng và tinh sạch được trộn với 1 µL phản ứng gRNA đã bắt cặp trong 10 µL 2 × Universal Ligation Mix Hỗn hợp này được ủ ở 25°C trong 5

phút sau đó được giữ lạnh trên đá, ủ qua đêm ở 4°C Sản phẩm ghép nối được kiểm tra bằng phản ứng PCR với mồi vector và PCR với mồi đặc hiệu gRNA Sản phẩm ghép nối có thể được bảo quản ở -20°C trong 1 tuần

Phản ứng kiểm tra vector ghép nối với mồi vector pBUN6A11-Fw/Rv và mồi đặc hiệu crRNA_6 short-Fw/pBUN6A11-Rv được thực hiện để đánh giá kết quả ghép nối Cặp mồi vector pBUN6A11-Fw/Rv được thiết kế dựa trên trình tự vector pBUN6A11 của Addgene cung cấp Cặp mồi pBUN6A11-Fw/Rv khuếch đại vùng

chứa điểm cắt của enzyme giới hạn BsaI, toàn bộ RNA scaffold và một phần vùng

trình tự OsU3 promoter (Bảng 1) Cặp mồi đặc hiệu cho vector tăng cường biểu hiện

mong muốn được thiết kế sử dụng trình tự gRNA chèn vào (crRNA_6

short-Fw/pBUN6A11-Rv) (Bảng 1) Phản ứng PCR kiểm tra sản phẩm ghép nối được thực

hiện với mồi vector pBUN6A11-Fw/Rv và mồi đặc hiệu crRNA_6 Fw/pBUN6A11-Rv, điện di trên gel agarose 1,5%

short-Phản ứng PCR kiểm tra vector tăng cường biểu hiện gồm các thành phần chính: PCR Buffer MyTaq™ Mix (1X), mồi xuôi pBUN6A11-Fw/crRNA_6 short-Fw (0.4 µM), mồi ngược pBUN6A11-Rv (0.4 µM), nước cất khử trùng và mẫu Chu trình nhiệt của phản ứng PCR diễn ra như sau: Biến tính 94°C trong 4 phút, 35 chu kỳ luân nhiệt gồm ba giai đoạn: (1) biến tính ở 94°C trong 1 phút, (2) gắn mồi 56°C trong 45 giây, (3) kéo dài 72°C trong 1 phút và sau đó là bước kéo dài cuối ở 72°C trong 10 phút

Sản phẩm PCR với mồi vector cũng được giải trình tự (theo phương pháp Sanger) để kiểm tra sự có mặt của trình tự gRNA và vị trí đoạn chèn trong sản phẩm ghép nối

2.2.5 Biến nạp vector đã ghép nối vào tế bào khả biến E coli

Chủng E coli DH5α được sử dụng để làm tế bào khả biến Cụ thể, E coli DH5α được nuôi lắc trong 10 mL LB qua đêm ở 37°C Sau đó, 200 µL E coli được

rpm 4°C trong 10 phút và loại bỏ dịch nổi 10 mL CaCl2 0,1M được bổ sung vào ống, ống được ủ trên đá 15 phút, ly tâm lạnh 3.000 rpm 4°C trong 10 phút để loại bỏ dịch nổi Bước này được thực hiện hai lần Biến nạp sử dụng phương pháp sốc nhiệt 5 µL sản phẩm ghép nối được ủ với 100 µL dịch tế bào khả biến 20 phút trên đá Ống phản ứng biến nạp được sốc nhiệt ở 42°C trong 45 giây rồi ngay được chuyển sang đá lạnh trong 5 phút 500 µL dung dịch LB được bổ sung vào ống biến nạp Khuẩn được nuôi lắc ở 37°C, 160 rpm trong 1,5 giờ và trải lên đĩa LB đặc có chứa kháng sinh Kanamycin 50 μg/mL

Các khuẩn lạc mang vector được kiểm tra bằng phương pháp PCR khuẩn lạc Cụ thể, một lượng nhỏ khuẩn lạc được lấy hòa tan trong 20 μL H2O, ủ ở 97°C trong 7 phút và sử dụng trực tiếp làm khuôn cho phản ứng PCR với cặp mồi vector pBUN6A11-Fw/Rv và cặp mồi đặc hiệu crRNA_6 short-Fw/pBUN6A11-Rv Sản phẩm PCR với cặp mồi vector pBUN6A11-Fw/Rv sau đó sẽ được gửi giải trình tự để kiểm tra sự có mặt của vector thiết kế có trong khuẩn lạc

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Kết quả nghiên cứu in silico họ gen OsYSL

3.1.1 Xác định và phân tích cấu trúc họ YSL ở lúa

Dựa trên trình tự của protein ZmYS1 trên cơ sở dữ liệu UniProt, 18 trình tự tương đồng ở lúa gạo đã được tìm thấy Thông tin về 18 trình tự thuộc họ OsYSL được thể

hiện ở Bảng 4, sự phân bố exon/intron của các gen này được thể hiện ở Hình 9 Chiều các gen được tìm thấy nằm trong khoảng 2794 đến 6690 nucleotide (Bảng 4) Vị trí

của các thành viên họ OsYSL trên nhiễm sắc thể được chỉ ra ở Hình 8 18 gen OsYSL

phân bố ngẫu nhiên trên các nhiễm sắc thể 1, 2, 4, 5 và 8 Trong đó, phần lớn các gen thuộc họ này nằm trên nhiễm sắc thể số 4 (8 trong 18 gen) Theo sau đó là nhiễm sắc

thể số 2 chứa 5 gen, các nhiễm sắc thể còn lại chứa 1 đến 2 gen OsYSL

Bảng 4: Thông tin cơ bản về các gen trong họ gen OsYSL

Vị trí khởi đầu (bp)

Vị trí kết thúc (bp)

STT Tên gen LOC ID NST

Vị trí khởi đầu (bp)

Vị trí kết thúc (bp)

Hình 9: Cấu trúc gen và các motif protein bảo thủ của họ OsYSL

A Các motif bảo thủ của họ OsYSL Mỗi motif được biểu diễn bằng một màu khác nhau Đường kẻ đen thể hiện vùng trình tự không bảo thủ B Phân bố exon/intron của họ gen OsYSL Hộp màu vàng đại diện cho exon, đường kẻ đen nối các exon đại diện cho intron, hộp màu xanh lá cây đại diện cho vùng trình tự không dịch mã

Các đặc tính lý hóa của họ protein OsYSL chỉ ra bao gồm số lượng amino acid, trọng lượng phân tử (mW), pI tính toán, chỉ số kỵ nước, chỉ số GRAVY cũng được

thể hiện ở Bảng 5 Chiều dài dự đoán của các protein OsYSL nằm trong khoảng 423

đến 727 amino acid và khối lượng phân tử dao động trong khoảng 46353,56 đến 78767,31 Da Giá trị pI của protein OsYSL từ 4,99 (tính acid) và 10,06 (tính bazơ) Thêm vào đó, giá trị GRAVY của tất cả các thành viên của họ OsYSL đều lớn hơn 0 cho thấy các protein này đều phân cực

Bảng 5: Thông tin đặc tính lý hóa của họ protein OsYSL

STT Tên protein Số lượng aa mW (Da) pI AI GRAVY

STT Tên protein Số lượng aa mW (Da) pI AI GRAVY

Bảng 6: Thông tin vị trí của họ protein OsYSL trong tế bào

STT Tên protein Vị trí trong tế bào

1 OsYSL1 plas: 10, vacu: 2, E.R.: 2

2 OsYSL2 plas: 11, E.R.: 2, vacu: 1

STT Tên protein Vị trí trong tế bào

3 OsYSL3 plas: 12, vacu: 1, E.R.: 1

4 OsYSL4 plas: 8, vacu: 3, golg: 2, E.R.: 1

5 OsYSL5 plas: 10, E.R.: 3, vacu: 1

6 OsYSL6 plas: 8, vacu: 3, E.R.: 3

7 OsYSL7 plas: 11, E.R.: 2, vacu: 1

8 OsYSL8 plas: 12, vacu: 1, E.R.: 1

9 OsYSL9 plas: 9, vacu: 2, golg: 2, cyto: 1

10 OsYSL10 plas: 8, E.R.: 4, golg: 2

11 OsYSL11 plas: 9, vacu: 2, golg: 2, E.R.: 1

12 OsYSL12 plas: 10, golg: 2, vacu: 1, E.R.: 1

13 OsYSL13 plas: 9, vacu: 2, golg: 2, E.R.: 1

14 OsYSL14 plas: 6, vacu: 5, golg: 2, cyto: 1

16 OsYSL16 plas: 12, vacu: 1, E.R.: 1

17 OsYSL17 plas: 10, E.R.: 2, vacu: 1, golg: 1

Chú thích: plas: màng tế bào, vacu: màng không bào, E.R.: mạng lưới nội chất,

golg: thể Golgi, cyto: tế bào chất

Dựa trên kết quả đánh giá vị trí, có thể thấy hầu hết các protein OsYSL đều

nằm trên màng tế bào (Bảng 6)