Thiết kế cấu trúc vector crispr cas9 chỉnh sửa gen sirzf1 và sibeh liên quân đến khả năng chịu hạn ở cây cà chua

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM - - TRƯƠNG THANH TÙNG THIẾT KẾ CẤU TRÚC VECTOR CRISPR/CAS9 CHỈNH SỬA GEN SlRZF1 VÀ SlBEH3 LIÊN QUAN ĐẾN KHẢ NĂNG CHỊU HẠN Ở CÂY CÀ CHUA Ngành: Công nghệ Sinh học Mã ngành: 42 02 01 LUẬN VĂN THẠC SĨ NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS LÃ VĂN HIỀN PGS.TS NGUYỄN TIẾN DŨNG Thái Nguyên - 2023 LỜI CAM ĐOAN Em xin cam đoan số liệu kết nghiên cứu đề tài “Thiết kế cấu trúc vector crispr/cas9 chỉnh sửa gen slrzf1 slbeh3 liên quan đến khả chịu hạn cà chua” trung thực, thực Khoa Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm – Trường Đại học Nông Lâm – Đại học Thái Nguyên Ngoài ra, báo cáo có sử dụng số nguồn tài liệu tham khảo trích dẫn rõ ràng phép cơng bố Em xin hồn tồn chịu trách nhiệm tính trung thực nội dung khác đề tài Học viên Trương Thanh Tùng i LỜI CẢM ƠN Trong q trình học tập hồn thành luận văn tốt nghiệp, em nhận giúp đỡ nhiều mặt cấp lãnh đạo nhà trường, tập thể cá nhân Trước tiên, em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến giáo viên hướng dẫn TS Lã Văn Hiền PGS.TS Nguyễn Tiến Dũng ln tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em suốt trình thực hoàn thành luận văn Em xin bày tỏ lời cảm ơn đến Khoa Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm thầy cô, quý đồng nghiệp tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành đề tài nghiên cứu Cuối em xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới gia đình, người thân bạn bè động viên, giúp đỡ em suốt trình học tập thực đề tài Em xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên, tháng 11 năm 2023 Học viên thực Trương Thanh Tùng ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH ẢNH vi MỞ ĐẦU 1.Tính cấp thiết đề tài Mục tiêu nghiên cứu Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn đề tài Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1.Tổng quan cà chua 1.1.1.Nghiên cứu cấu trúc di truyền quy định tính trạng 1.1.2 Một số nghiên cứu liên quan đến tính trạng chống chịu hạn cà chua .3 1.2 Giới thiệu chung kỹ thuật chỉnh sửa hệ gen CRISPR/Cas9 1.3.Một số nghiên cứu vai trò gen RZF1 BEH3 cải thiện khả chịu hạn trồng 10 1.3.1 Gen RING H2-Zinc Finger (RZF1) 10 1.3.2 Gen BRI1 EMS SUPPRESSOR (BES1)/BRASSINAZOLE RESISTANT (BEH3) .10 1.3.3 Nghiên cứu biểu gen SlRZF1 SlBEH3 để tạo trồng chịu hạn 11 1.4.Cơ sở lựa chọn vật liệu giống nghiên cứu 12 1.5.Tình hình nghiên cứu chỉnh sửa gen cà chua nước 13 iii 1.5.1.Tình hình nghiên cứu chỉnh sửa gen cà chua nước 13 1.5.2.Tình hình nghiên cứu chỉnh sửa gen cà chua giới 14 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1.Vật liệu, đối tượng nghiên cứu 16 2.1.1 Hóa chất .17 2.2.Nội dung nghiên cứu 17 2.3 Phương pháp nghiên cứu 17 2.3.1 Khai thác thông tin gen SlRZF1 SlBEH3 ngân hàng gen NCBI 17 2.3.2.Thiết kế cấu trúc vector CRISPR/Cas9 chỉnh sửa gen SlRZF1 SlBEH3 .18 2.3.2.1.Tách dòng gen SlRZF1 SlBEH3 từ cà chua 18 2.3.2.2.Thiết kế trình tự định hướng sgRNA chỉnh sửa gen SlZRF1 SlBEH3 .19 2.3.2.3 Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc chỉnh sửa gen SlRZF1 SlBEH3 .19 2.3.2.4.Tạo cà chua chỉnh sửa gen SlRZF1 SlBEH3 23 2.2.2.5.Chọn lọc dòng cà chua chỉnh sửa gen kĩ thuật PCR 25 2.4.Các phương pháp xử lý số liệu 26 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 27 3.1 Kết khai thác thơng tin trình tự gen SlRZF1 SlBEH3 cà chua 27 3.2 Kết xác định trình tự sgRNA định hướng gen SlRZF1 SlBEH3 28 3.2.1 Thiết kế cặp mồi trình tự đặc hiệu gen mục tiêu SlRZF1 SlBEH3 .28 3.2.2 Kết phân lập gen SlRZF1 SlBEH3 28 3.2.3 Kết xác định trình tự sgRNA định hướng 35 iv 3.3.Thiết kế cấu trúc vector chỉnh sửa đơn gen SlRZF1 SlBEH3 37 3.3.1 Cấu trúc vector pAGM4723::sgRNA-SlRZF1 37 3.3.2 Cấu trúc vector pAGM4723::sgRNA-SlBEH3 40 3.4 Kết chuyển tạo dòng cà chua chỉnh sửa gen SlRZF1 SlBEH3 43 3.5.Thảo luận 47 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 50 Kết luận 50 Kiến nghị 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO 51 PHỤ LỤC 58 PHỤ LỤC 63 v DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ TỪ VIẾT TẮT ADP Adenosine Diphotphat As Acetosyringone ACS Agrocinopine Synthase ATP Adenosin Triphosphat BAP Benzylaminopurine Bp Base pair BSA Bovine Serum Albumin CBF C-repeat Binding Factors CNSH Công Nghệ Sinh Học CTAB Cetyltrimethylammonium Bromide DREB Dehydration-Responsive Element-Binding DNA Deoxynucleic acid dNTPs Deoxy Nucleoside Triphosphate EDTA Ethylene Diamine Tetra Acetic acid Kb Kilo base kDa Kilo Dalton MCS Multi Cloning Site MS Murashige Skoog (1962) NAD Nicotinamide Adenine Dinucleotide PCR Polymerase Chain Reaction PMI Phosphomannose Isomerase QTL Quantitative Trait Loci RB Right Border RMOP Regeneration Medium for Organogenesis Plant RNA Ribonucleic Acid T-DNA Transfer - DNA TE Tris HCl - EDTA, pH = Ti - plasmid Tumor inducing plasmid iv DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Mồi sử dụng cho phản ứng PCR kiểm tra dòng cà chua chỉnh sửa gen 16 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng cắt nối sgRNA 21 Bảng 2.4 Quy trình phản ứng Golden Gate 21 Bảng 2.5 Thành phần phản ứng cắt nối 22 Bảng 2.6 Thành phần môi trường sử dụng chuyển gen 24 Bảng 2.7.Thành phần phản ứng PCR 26 Bảng 3.1 Thông tin gen SlRZF1 SlBEH3 cà chua (Solanum lycopersicum) 27 Bảng 3.2 Kết tạo vật liệu khởi đầu biến nạp vào giống cà chua CN3500F1 44 Bảng 3.3 Kết biến nạp gen vào cà chua CN3500F1 44 Bảng 3.4 Kết thử nghiệm chuyển cấu trúc chỉnh sửa gen vào cà chua 45 v DANH MỤC HÌNH ẢNH_Toc149636988 Hình 2.1 Sơ đồ cấu trúc vector pDONR/Zeo 19 Hình 2.2 Cấu trúc vector pAGM4723 vị trí gắn nối gRNA 20 Hình 3.1 Kết tách chiết RNA tổng số từ cà chua CN3500F1 .28 Hình 3.2 Kết nhân gen SlRZF1 SlBEH3 từ cDNA 29 Hình 3.3 Kết kiểm tra khuẩn lạc mang gen SlRZF1 SlBEH3 cắt enzym giới hạn 30 Hình 3.4 Nhận diện tương đồng xác định vùng axit amin mã hoá protein RING H2-type zince finger domain 32 Hình 3.5 Nhận diện tương đồng xác định vùng axit amin mã hoá protein BES1-N-terminal active domain 33 Hình 3.6 Cây phát sinh mơ tả mối quan hệ tương đồng thành viên RZF1 BEH3 cà chua 34 Hình 3.7 Xác định vị trí trình tự sgRNAs vùng nucleotide mã hoá (CDS) cho gen SlRZF1 36 Hình 3.8 Xác định vị trí trình tự sgRNAs vùng nucleotide mã hoá (CDS) cho gen SlBEH3 37 Hình 3.9 Khuếch đại sgRNA 38 Hình 3.10 Kết kiểm tra khuẩn lạc tái tổ hợp (Level 1) 38 Hình 3.11 Kết kiểm tra khuẩn lạc tái tổ hợp (Level 2) 39 Hình 3.12 Kết kiểm tra khuẩn lạc tái tổ hợp (Level 2) 40 Hình 3.13 Khuếch đại sgRNA 41 Hình 3.14 Kết kiểm tra khuẩn lạc tái tổ hợp (Level 1) 41 Hình 3.15 Kết kiểm tra khuẩn lạc tái tổ hợp (Level 2) 42 Hình 3.16 Kết kiểm tra khuẩn lạc tái tổ hợp (Level 2) 43 Hình 3.17.Tạo cà chua chuyển gen chiu hạn 45 Hình 3.18 Kết phân tích biểu gen sgRNA-SlBEH3 dòng chỉnh sửa gen PCR 46 vi TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả luận văn: Trương Thanh Tùng Tên luận văn: Thiết kế cấu trúc vector crispr/cas9 chỉnh sửa gen slrzf1 slbeh3 liên quan đến khả chịu hạn cà chua Ngành khoa học luận văn: Công nghệ Sinh học; Mã số: 42 02 01 Tên đơn vị đào tạo: Trường Đại học Nông Lâm, Đại học Thái Nguyên Mục đích nghiên cứu: Trong nghiên cứu với mục tiêu tạo dòng cà chua chống chịu hạn Việt Nam, tiến hành thiết kế cấu trúc vector chỉnh sửa đơn gen SlRZF1 SlBEH3 liên quan đến khả chịu hạn cà chua Việc nghiên cứu chuyển gen chịu hạn vào cà chua sàng lọc phân tích biểu đột biến nhằm góp phần phát triển giống cà chua chịu hạn, giải vấn đề nông nghiệp bị tác động hạn hán Việt Nam Phương pháp nghiên cứu: Trong nghiên cứu sử dụng vật liệu giống cà chua Microtom/CN3500F1 Vector: pDONR/Zeo,pAGM4723, vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens chủng: EHA105, LBA4404 số hóa chất liên quan Nghiên cứu gồm ba nội dung sau: Khai thác thơng tin gen SlRZF1 SlBEH3 ngân hàng genbank Xác định trình tự sgRNA định hướng gen SlRZF1 SlBEH3 Thiết kế cấu trúc vector chỉnh sửa đơn gen SlRZF1, SlBEH3 tạo dòng cà chua chỉnh sửa gen hệ T0 Nghiên cứu tiến hành: Khai thác thông tin gen SlRZF1 SlBEH3 ngân hàng gen NCBI Sau tiến hành thiết kế cấu trúc vector CRISPR/Cas9 chỉnh sửa gen SlRZF1 SlBEH3 theo phương pháp Golden Gate Sau thiết kế thành công tiến hành chuyển vector mang gen chỉnh sửa vào chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens LBA4404 kiểm tra khuẩn lạc phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu sgRNA-SlRZF1/SlBEH3 Bước cuối tạo cà chua chỉnh sửa gen SlRZF1 SlBEH3 theo phương pháp Sun cộng (2015), sau có chỉnh sửa gen T0 tiến hành chọn lọc kĩ thuật PCR thông qua đánh giá biểu gen chọn lọc kháng kháng sinh kanamycin, sgRNA-SlRZF1, sgRNA-SlBEH3 vii developmental stage-specific molecular responses to drought and salinity stresses in chickpea Sci Rep 2016, 6, 19228 30 Goel D, Singh AK, Yadav V, Babbar SB, Bansal KC (2010) Overexpression of osmotin gene confers tolerance to salt and drought stresses in transgenic tomato (Solanum lycopersicum L.) Protoplasma 245(1–4):133–141 31 Gong P, Zhang J, Li H, Yang C, Zhang C, Zhang X, Khurram Z, Zhang Y, Wang T, Fei Z, Ye Z (2010) Transcriptional profiles of drought-responsive genes in modulating transcription signal transduction, and biochemical pathways in tomato J Exp Bot 61(13):3563–3575 32 Grützner R., Martin P., Horn C., Mortensen S., Cram E.J., Lee-Parsons C.W.T., Stuttmann J., and Marillonnet S (2021) High-efficiency genome editing in plants mediated by a Cas9 gene containing multiple introns Plant Comm 2, 100135 33 Guo Y, Huang C, Xie Y, Song F, Zhou X (2010) A tomato glutaredoxin gene SlGRX1 regulates plant responses to oxidative, drought and salt stresses Planta 232(6):1499–1509 34 Hu H, Xiong L, 2014 Gentic engineering and breeding of drought resistant crops Annual Review Plant Biology65: 715–741 35 Jae-Hoon Lee1, and Woo Taek Kim, 2011 Regulation of Abiotic Stress Signal Transduction by E3 Ubiquitin Ligases in Arabidopsis Mol Cells 31, 201-208, March 31, 2011 36 Jensen CR, Battilani A, Plauborg F, Psarras G, Chartzoulakis, K, Janowiak F, Stikic R, Jovanovic Z, Li G, Qi X, Liu F, Jacobsen S, Andersen MN, 2010 Defcit irrigation based on drought tolerance and root signaling in potatoes and tomatoes Agricultural Water Management 98: 403–413 37 Jiang W, Zhou H, Bi H, Fromm M, Yang B, Weeks DP, 2013 Demonstration of CRISPR/Cas9/sgRNA-mediated targeted gen modification in Arabidopsis, tobacco, sorghum and rice Nucleic Acids Research 41: e188 54 38 Jinek M, Chylinski K, Fonfara I, Hauer M, Doudna JA, Charpentier E, 2012 A programmable dual-RNA–guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity Science 337: 816–821 39 Ju HW, Min JH, Chung MS, Kim CS, 2013 The atrzf1 mutation of the novel RING-type E3 ubiquitin ligase increases proline contents and enhances drought tolerance in Arabidopsis Plant Science 203–204: 1–7 40 Jung C, Capistrano-Gossmann G, Braatz J, Sashidhar N, Melzer S, 2018 Recent developments in genome editing and applications in plant breeding Plant Breed 137: 1–9 41 Kader AA, 2008 Flavor quality of fruits and vegetables Journal of the Science of Food and Agriculture 88: 1863–1868 42 Karlberg L, Rockström J, Annandale JG, Steyn JM, 2007 Low-cost drip irrigation: a suitable technology for southern Africa? Agricultural Water Management 89: 59–70 43 Khan S-A, Li M-Z, Wang S-M, Yin H-J (2018) Revisiting the role of plant transcription factors in the battle against abiotic stress Int J Mol Sci 19(6):1634 44 Kim AR, Min JH, Lee KW, Kim CS, 2017 PCA22 acts as a suppressor of atrzf1to mediate proline accumulation in response to abiotic stress in Arabidopsis Journal of Experimental Botany 68 (7): 1797–1809 45 Kim CS, Ju HW, Min JH, 2012 Gen implicated in drought stress tolerance and transformed plants with the same United States Patent application publication US 20140026254A1 46 Kim H, Kim ST, Ryu J, Choi MK, Kweon J, Kang BC, Ahn HM, Bae S, Kim J, Kim JS, Kim SG, 2016 A simple, flexible and high-throughput cloning system for plant genome editing via CRISPR-Cas system Journal of Integrative Plant Biology 58(8):705–12 47 Kimura S, Sinha N, 2008 Tomato (Solanum lycopersicum): A model fruit‐ bearing crop Cold Spring Harbor Protocols 2008 55 48 Kong F, Wang J, Cheng L, Liu S, Wu J, Peng Z, Lu G, 2012 Genome-wide analysis of the mitogen-activated protein kinase gen family in Solanum lycopersicum Gen 499: 108–120 49 Lee J, Shim D, Moon S, Kim H, Bae W, Kim K, Kim Y-H, Rhee S-K, Hong CP, Hong S-Y Genome-wide transcriptomic analysis of BR-deficient Micro-Tom reveals correlations between drought stress tolerance and brassinosteroid signaling in tomato Plant Physiol Biochem 2018;127:553–560 50 Li R, Liu C, Ruirui Zhao R, Wang L, Chen L, Yu W, Zhang S, Sheng J,Shen L, 2019 CRISPR/Cas9-mediated SlNPR1mutagenesisreduces tomato plant drought tolerance BMC Plant Biology 19:38 51 Liu L, Song Y, Li J Mapping of QTLs for drought tolerance during seedling stage using introgression line populations in tomato Acta HorticSin 2011;38(10):1921–1928 52.Manivannan P, Jaleel CA, Sankar B, Kishorekumar A, Somasundaram R, Alagu Lakshmanan GM, Panneerselvam R, 2007 Growth, biochemical modifications and proline metabolism in Helianthus annuus L as induced by drought stress Colloids and Surfaces B: Biointerfaces59: 141-149 53 Muhammad T, Zhang J, Ma Y, Li Y, Zhang F, Zhang Y, Liang Y (2019) Overexpression of a mitogen-activated protein kinase SlMAPK3 positively regulates tomato tolerance to cadmium and drought stress Molecules 24(3):556 54 Patanè C, Tringali S, Sortino O, 2011 Effects of defcit irrigation on biomass, yield, water productivity and fruit quality of processing tomato under semi-arid Mediterranean climate conditions Scientia Horticulturae 129: 590–596 55 Rai AC, Singh M, Shah K (2013a) Engineering drought tolerant tomato plants over-expressing BcZAT12 gene encoding a C2H2 zinc finger transcription factor Phytochemistry 56.Shan Q, Wang Y, Li J, Zhang Y, Chen K, Liang Z, Zhang K, Liu J, Xi JJ, Qiu JL, Gao C (2013) Targeted genome modification of crop plants using a CRISPR-Cas system Nat Biotechnol 31: 686–688 56 57 Thirumalaikumar VP, Devkar V, Mehterov N, Ali S, Ozgur R, Turkan I, Mueller-Roeber B, Balazadeh S (2018) NAC transcription factor JUNGBRUNNEN enhances drought tolerance in tomato Plant Biotechnol J 16(2):354–366 58 Tinh NV, Park CR, Lee KH, Lee S, Kim CS, 2020 BES1/BZR1 Homolog cooperates with E3 ligase AtRZF1 to regulate osmotic stress and brassinosteroid responses in Arabidopsis Journal of Experimental Botany, 72(2): 636–653 59 Wang G Agricultural drought in a future climate: Results from 15 global climate models participating in the IPCC 4th assessment Clim Dyn 2005;25:739–753 60 Weber E, Engler C, Gruetzner R, Werner S, Marillonnet S A modular cloning system for standardized assembly of multigene constructs PLoS One 2011; 6: e16765 61 Wudiri, B.B., and Henderson, D.W 1985 Effects of water stress on flowering and fruit set in processing tomatoes Sci Hortic 27: 189–198 62 Zhang C, Quan R, Wang J Development and application of CRISPR/Cas9 technologies in genomic editing Hum Mol Genet 2018 Aug 1;27(R2):R79-R88 63 Zhu M, Chen G, Zhang J, Zhang Y, Xie Q, Zhao Z, Pan Y, Hu Z, 2014 The abiotic stress-responsive NAC-type transcription factor SlNAC4 regulates salt and drought tolerance and stress-related genes Lycopersicum) Plant Cell Report 33(11): 1851–1863 57 in tomato (Solanum PHỤ LỤC Kết giải trình tự vector pAGM4723 mang sgRNA1/sgRNA2 chỉnh sửa gen SlRZF1 VECTOR (pAGM4723 (NPTII+CAS9+sgRNA1+sgRNA2+Linker SLRZF1 (sgRNA1+sgRNA2) >CONSTRUCT SEQUENCE (SGRNA1+SGRNA2) TGGCAGGATATATTGTGGTGTAAACAAATTGACGCTTAGACAACTTAATAACAC ATTGCGGACGTTTTTAATGTACTGGGGTTGAACACTCTGTGCCGAATTCGGATC CGGAGCGGAGAATTAAGGGAGTCACGTTATGACCCCCGCCGATGACGCGGGAC AAGCCGTTTTACGTTTGGAACTGACAGAACCGCAACGTTGAAGGAGCCACTGA GCCGCGGGTTTCTGGAGTTTAATGAGCTAAGCACATACGTCAGAAACCATTATT GCGCGTTCAAAAGTCGCCTAAGGTCACTATCAGCTAGCAAATATTTCTTGTCAA AAATGCTCCACTGACGTTCCATAAATTCCCCTCGGTATCCAATTAGAGTCTCATA TTCACTCTCCTATTTTTACAACAATTACCAACAACAACAAACAACAAACAACAT TACAATTACATTTACAATTACCATGGTTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTC TCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAAT CGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCT TTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAGGACGAGGCAGC GCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAGCTGTGCTCGACGT TGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGG ATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGGCTGATGC AATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGC GAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATC AGGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCC AGGCTCAAGGCGCGCATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACTCATGGCGA TGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGA CTGTGGCCGGCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCG TGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTA CGGTATCGCCGCTCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAG TTCTTCTGAGCGGGACTCTGGGGTTCGCTAGAGTCCTGCTTTAATGAGATATGC GAGACGCCTATGATCGCATGATATTTGCTTTCAATTCTGTTGTGCACGTTGTAAA 58 AAACCTGAGCATGTGTAGCTCAGATCCTTACCGCCGGTTTCGGTTCATTCTAATG AATATATCACCCGTTACTATCGTATTTTTATGAATAATATTCTCCGTTCAATTTA CTGATTGTACCCTACTACTTATATGTACAATATTAAAATGAAAACAATATATTGT GCTGAATAGGTTTATAGCGACATCTATGATAGAGCGCCACAATAACAAACAATT GCGTTTTATTATTACAAATCCAATTTTAAAAAAAGCGGCAGAACCGGTCAAACC TAAAAGACTGATTACATAAATCTTATTCAAATTTCAAAAGTGCCCCAGGGGCTA GTATCTACGACACACCGAGCGGCGAACTAATAACGCTCACTGAAGGGAACTCC GGTTCCCCGCCGGCGCGCATGGGTGAGATTCCTTGAAGTTGAGTATTGGCCGTC CGCTCTACCGAAAGTTACGGGCACCATTCAACCCGGTCCAGCACGGCGGCCGG GTAACCGACTTGCTGCCCCGAGAATTATGCAGCATTTTTTTGGTGTATGTGGGCC CCAAATGAAGTGCAGGTCAAACCTTGACAGTGACGACAAATCGTTGGGCGGGT CCAGGGCGAATTTTGCGACAACATGTCGAGGCTCAGCCGCTGCAAGAATTCAA GCTTGGAGGTCAACATGGTGGAGCACGACACTCTGGTCTACTCCAAAAATGTCA AAGATACAGTCTCAGAAGATCAAAGGGCTATTGAGACTTTTCAACAAAGGATA ATTTCGGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCTGTCACTTCATCGAAA GGACAGTAGAAAAGGAAGGTGGCTCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGA AAGGCTATCATTCAAGATCTCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCA CCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGAGGTTCCAACCACGTCTACAAAGCA AGTGGATTGATGTGATAACATGGTGGAGCACGACACTCTGGTCTACTCCAAAAA TGTCAAAGATACAGTCTCAGAAGATCAAAGGGCTATTGAGACTTTTCAACAAAG GATAATTTCGGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCTGTCACTTCATC GAAAGGACAGTAGAAAAGGAAGGTGGCTCCTACAAATGCCATCATTGCGATAA AGGAAAGGCTATCATTCAAGATCTCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACC CCCACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGAGGTTCCAACCACGTCTACAA AGCAAGTGGATTGATGTGACATCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCACAATCCC ACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAG GACACGCTCGAGTATAAGAGCTCATTTTTACAACAATTACCAACAACAACAAAC AACAAACAACATTACAATTACATTTACAATTATCGATACAATGGACAAGAAGTA CTCCATTGGGCTCGATATCGGCACAAACAGCGTCGGCTGGGCCGTCATTACGGA CGAGTACAAGGTGCCGAGCAAAAAATTCAAAGTTCTGGGCAATACCGATCGCC ACAGCATAAAGAAGAACCTCATTGGCGCCCTCCTGTTCGACTCCGGGGAGACG GCCGAAGCCACGCGGCTCAAAAGAACAGCACGGCGCAGATATACCCGCAGAAA GAATCGGATCTGCTACCTGCAGGAGATCTTTAGTAATGAGATGGCTAAGGTGGA 59 TGACTCTTTCTTCCATAGGCTGGAGGAGTCCTTTTTGGTGGAGGAGGATAAAAA GCACGAGCGCCACCCAATCTTTGGCAATATCGTGGACGAGGTGGCGTACCATGA AAAGTACCCAACCATATATCATCTGAGGAAGAAGCTTGTAGACAGTACTGATA AGGCTGACTTGCGGTTGATCTATCTCGCGCTGGCGCATATGATCAAATTTCGGG GACACTTCCTCATCGAGGGGGACCTGAACCCAGACAACAGCGATGTCGACAAA CTCTTTATCCAACTGGTTCAGACTTACAATCAGCTTTTCGAAGAGAACCCGATC AACGCATCCGGAGTTGACGCCAAAGCAATCCTGAGCGCTAGGCTGTCCAAATCC CGGCGGCTCGAAAACCTCATCGCACAGCTCCCTGGGGAGAAGAAGAACGGCCT GTTTGGTAATCTTATCGCCCTGTCACTCGGGCTGACCCCCAACTTTAAATCTAAC TTCGACCTGGCCGAAGATGCCAAGCTTCAACTGAGCAAAGACACCTACGATGAT GATCTCGACAATCTGCTGGCCCAGATCGGCGACCAGTACGCAGACCTTTTTTTG GCGGCAAAGAACCTGTCAGACGCCATTCTGCTGAGTGATATTCTGCGAGTGAAC ACGGAGATCACCAAAGCTCCGCTGAGCGCTAGTATGATCAAGCGCTATGATGA GCACCACCAAGACTTGACTTTGCTGAAGGCCCTTGTCAGACAGCAACTGCCTGA GAAGTACAAGGAAATTTTCTTCGATCAGTCTAAAAATGGCTACGCCGGATACAT TGACGGCGGAGCAAGCCAGGAGGAATTTTACAAATTTATTAAGCCCATCTTGGA AAAAATGGACGGCACCGAGGAGCTGCTGGTAAAGCTTAACAGAGAAGATCTGT TGCGCAAACAGCGCACTTTCGACAATGGAAGCATCCCCCACCAGATTCACCTGG GCGAACTGCACGCTATCCTCAGGCGGCAAGAGGATTTCTACCCCTTTTTGAAAG ATAACAGGGAAAAGATTGAGAAAATCCTCACATTTCGGATACCCTACTATGTAG GCCCCCTCGCCCGGGGAAATTCCAGATTCGCGTGGATGACTCGCAAATCAGAAG AGACTATCACTCCCTGGAACTTCGAGGAAGTCGTGGATAAGGGGGCCTCTGCCC AGTCCTTCATCGAAAGGATGACTAACTTTGATAAAAATCTGCCTAACGAAAAGG TGCTTCCTAAACACTCTCTGCTGTACGAGTACTTCACAGTTTATAACGAGCTCAC CAAGGTCAAATACGTCACAGAAGGGATGAGAAAGCCAGCATTCCTGTCTGGAG AGCAGAAGAAAGCTATCGTGGACCTCCTCTTCAAGACGAACCGGAAAGTTACC GTGAAACAGCTCAAAGAAGATTATTTCAAAAAGATTGAATGTTTCGACTCTGTT GAAATCAGCGGAGTGGAGGATCGCTTCAACGCATCCCTGGGAACGTATCACGA TCTCCTGAAAATCATTAAAGACAAGGACTTCCTGGACAATGAGGAGAACGAGG ACATTCTTGAGGACATTGTCCTCACCCTTACGTTGTTTGAAGATAGGGAGATGA TTGAAGAACGCTTGAAAACTTACGCTCATCTCTTCGACGACAAAGTCATGAAAC AGCTCAAGAGGCGCCGATATACAGGATGGGGGCGGCTGTCAAGAAAACTGATC AATGGGATCCGAGACAAGCAGAGTGGAAAGACAATCCTGGATTTTCTTAAGTC 60 CGATGGATTTGCCAACCGGAACTTCATGCAGTTGATCCATGATGACTCTCTCAC CTTTAAGGAGGACATCCAGAAAGCACAAGTTTCTGGCCAGGGGGACAGTCTCC ACGAGCACATCGCTAATCTTGCAGGTAGCCCAGCTATCAAAAAGGGAATACTG CAGACCGTTAAGGTCGTGGATGAACTCGTCAAAGTAATGGGAAGGCATAAGCC CGAGAATATCGTTATCGAGATGGCCCGAGAGAACCAAACTACCCAGAAGGGAC AGAAGAACAGTAGGGAAAGGATGAAGAGGATTGAAGAGGGTATAAAAGAACT GGGGTCCCAAATCCTTAAGGAACACCCAGTTGAAAACACCCAGCTTCAGAATG AGAAGCTCTACCTGTACTACCTGCAGAACGGCAGGGACATGTACGTGGATCAG GAACTGGACATCAATCGGCTCTCCGACTACGACGTGGATCATATCGTGCCCCAG TCTTTTCTCAAAGATGATTCTATTGATAATAAAGTGTTGACAAGATCCGATAAA AATAGAGGGAAGAGTGATAACGTCCCCTCAGAAGAAGTTGTCAAGAAAATGAA AAATTATTGGCGGCAGCTGCTGAACGCCAAACTGATCACACAACGGAAGTTCG ATAATCTGACTAAGGCTGAACGAGGTGGCCTGTCTGAGTTGGATAAAGCCGGCT TCATCAAAAGGCAGCTTGTTGAGACACGCCAGATCACCAAGCACGTGGCCCAA ATTCTCGATTCACGCATGAACACCAAGTACGATGAAAATGACAAACTGATTCGA GAGGTGAAAGTTATTACTCTGAAGTCTAAGCTGGTTTCAGATTTCAGAAAGGAC TTTCAGTTTTATAAGGTGAGAGAGATCAACAATTACCACCATGCGCATGATGCC TACCTGAATGCAGTGGTAGGCACTGCACTTATCAAAAAATATCCCAAGCTTGAA TCTGAATTTGTTTACGGAGACTATAAAGTGTACGATGTTAGGAAAATGATCGCA AAGTCTGAGCAGGAAATAGGCAAGGCCACCGCTAAGTACTTCTTTTACAGCAAT ATTATGAATTTTTTCAAGACCGAGATTACACTGGCCAATGGAGAGATTCGGAAG CGACCACTTATCGAAACAAACGGAGAAACAGGAGAAATCGTGTGGGACAAGGG TAGGGATTTCGCGACAGTCCGGAAGGTCCTGTCCATGCCGCAGGTGAACATCGT TAAAAAGACCGAAGTACAGACCGGAGGCTTCTCCAAGGAAAGTATCCTCCCGA AAAGGAACAGCGACAAGCTGATCGCACGCAAAAAAGATTGGGACCCCAAGAA ATACGGCGGATTCGATTCTCCTACAGTCGCTTACAGTGTACTGGTTGTGGCCAA AGTGGAGAAAGGGAAGTCTAAAAAACTCAAAAGCGTCAAGGAACTGCTGGGCA TCACAATCATGGAGCGATCAAGCTTCGAAAAAAACCCCATCGACTTTCTCGAGG CGAAAGGATATAAAGAGGTCAAAAAAGACCTCATCATTAAGCTTCCCAAGTAC TCTCTCTTTGAGCTTGAAAACGGCCGGAAACGAATGCTCGCTAGTGCGGGCGAG CTGCAGAAAGGTAACGAGCTGGCACTGCCCTCTAAATACGTTAATTTCTTGTAT CTGGCCAGCCACTATGAAAAGCTCAAAGGATCTCCCGAAGATAATGAGCAGAA GCAGCTGTTCGTGGAACAACACAAACACTACCTTGATGAGATCATCGAGCAAAT 61 AAGCGAATTCTCCAAAAGAGTGATCCTCGCCGACGCTAACCTCGATAAGGTGCT TTCTGCTTACAATAAGCACAGGGATAAGCCCATCAGGGAGCAGGCAGAAAACA TTATCCACTTGTTTACTCTGACCAACTTGGGCGCGCCTGCAGCCTTCAAGTACTT CGACACCACCATAGACAGAAAGCGGTACACCTCTACAAAGGAGGTCCTGGACG CCACACTGATTCATCAGTCAATTACGGGGCTCTATGAAACAAGAATCGACCTCT CTCAGCTCGGTGGAGACAGCAGGGCTGACCCCAAGAAGAAGAGGAAGGTGTGA GCTTGTCAAGCAGATCGTTCAAACATTTGGCAATAAAGTTTCTTAAGATTGAAT CCTGTTGCCGGTCTTGCGATGATTATCATATAATTTCTGTTGAATTACGTTAAGC ATGTAATAATTAACATGTAATGCATGACGTTATTTATGAGATGGGTTTTTATGAT TAGAGTCCCGCAATTATACATTTAATACGCGATAGAAAACAAAATATAGCGCGC AAACTAGGATAAATTATCGCGCGCGGTGTCATCTATGTTACTAGATCGACGCTA CTAGAATTCGAGCTCGGAGTGATCAAAAGTCCCACATCGATCAGGTGATATATA GCAGCTTAGTTTATATAATGATAGAGTCGACATAGCGATTGTTGTCTTTGTCCA AATTGTGGCGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGT TATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTCTAGACCCAGCTTTC TTGTACAAAGTTGGCATTACGCTTTACGAATTCCCATGGGGAGTGATCAAAAGT CCCACATCGATCAGGTGATATATAGCAGCTTAGTTTATATAATGATAGAGTCGA CATAGCGATTGTGCATTCATGAGGCAGAGAATGGTTTTAGAGCTAGAAATAG CAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCG GTGCTTTTTTTCTAGACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTTGGCATTACGCTCAGAGA GGATGCACATGTGACCGAGGGACACGAAGTGATCCGTTTAAACTATCAGTGTTT GACAGGATATATTGGCGGGTAAACCTAAGAGAAAAGAGCGTTTATTAGAATAA TCGGATATTTAAAAGGGCGTGAAAAGGTTTATCCG 62 PHỤ LỤC Vector pAGM4723 mang sgRNA1/sgRNA2 chỉnh sửa gen SlBEH3 VECTOR (pAGM4723 (NPTII+CAS9+sgRNA1+sgRNA2+Linker SLBEH3 (sgRNA1+sgRNA2) >CONSTRUCT SEQUENCE (SGRNA1+SGRNA2) TGGCAGGATATATTGTGGTGTAAACAAATTGACGCTTAGACAACTTAATAAC ACATTGCGGACGTTTTTAATGTACTGGGGTTGAACACTCTGTGCCGAATT CGGATCCGGAGCGGAGAATTAAGGGAGTCACGTTATGACCCCCGCCGAT GACGCGGGACAAGCCGTTTTACGTTTGGAACTGACAGAACCGCAACGTT GAAGGAGCCACTGAGCCGCGGGTTTCTGGAGTTTAATGAGCTAAGCACA TACGTCAGAAACCATTATTGCGCGTTCAAAAGTCGCCTAAGGTCACTATC AGCTAGCAAATATTTCTTGTCAAAAATGCTCCACTGACGTTCCATAAATT CCCCTCGGTATCCAATTAGAGTCTCATATTCACTCTCCTATTTTTACAACA ATTACCAACAACAACAAACAACAAACAACATTACAATTACATTTACAATT ACCATGGTTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGT GGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCT GATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGT CAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAGGACGAGGCAGCG CGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAGCTGTGCTCGA CGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCG GGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCAT CATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCTACCTGCC CATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGAT GGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGGGG CTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGCGCATGCCCGACG GCGAGGATCTCGTCGTGACTCATGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATG GTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGGCTGGGTGT GGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAAG AGCTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGCC 63 GCTCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTC TGAGCGGGACTCTGGGGTTCGCTAGAGTCCTGCTTTAATGAGATATGCGA GACGCCTATGATCGCATGATATTTGCTTTCAATTCTGTTGTGCACGTTGTA AAAAACCTGAGCATGTGTAGCTCAGATCCTTACCGCCGGTTTCGGTTCAT TCTAATGAATATATCACCCGTTACTATCGTATTTTTATGAATAATATTCTC CGTTCAATTTACTGATTGTACCCTACTACTTATATGTACAATATTAAAATG AAAACAATATATTGTGCTGAATAGGTTTATAGCGACATCTATGATAGAGC GCCACAATAACAAACAATTGCGTTTTATTATTACAAATCCAATTTTAAAA AAAGCGGCAGAACCGGTCAAACCTAAAAGACTGATTACATAAATCTTAT TCAAATTTCAAAAGTGCCCCAGGGGCTAGTATCTACGACACACCGAGCG GCGAACTAATAACGCTCACTGAAGGGAACTCCGGTTCCCCGCCGGCGCG CATGGGTGAGATTCCTTGAAGTTGAGTATTGGCCGTCCGCTCTACCGAAA GTTACGGGCACCATTCAACCCGGTCCAGCACGGCGGCCGGGTAACCGAC TTGCTGCCCCGAGAATTATGCAGCATTTTTTTGGTGTATGTGGGCCCCAA ATGAAGTGCAGGTCAAACCTTGACAGTGACGACAAATCGTTGGGCGGGT CCAGGGCGAATTTTGCGACAACATGTCGAGGCTCAGCCGCTGCAAGAAT TCAAGCTTGGAGGTCAACATGGTGGAGCACGACACTCTGGTCTACTCCAA AAATGTCAAAGATACAGTCTCAGAAGATCAAAGGGCTATTGAGACTTTTC AACAAAGGATAATTTCGGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATC TGTCACTTCATCGAAAGGACAGTAGAAAAGGAAGGTGGCTCCTACAAAT GCCATCATTGCGATAAAGGAAAGGCTATCATTCAAGATCTCTCTGCCGAC AGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAG AAGAGGTTCCAACCACGTCTACAAAGCAAGTGGATTGATGTGATAACAT GGTGGAGCACGACACTCTGGTCTACTCCAAAAATGTCAAAGATACAGTCT CAGAAGATCAAAGGGCTATTGAGACTTTTCAACAAAGGATAATTTCGGG AAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCTGTCACTTCATCGAAAGGA CAGTAGAAAAGGAAGGTGGCTCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGG AAAGGCTATCATTCAAGATCTCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGAC CCCCACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGAGGTTCCAACCACGTC TACAAAGCAAGTGGATTGATGTGACATCTCCACTGACGTAAGGGATGAC 64 GCACAATCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTC ATTTCATTTGGAGAGGACACGCTCGAGTATAAGAGCTCATTTTTACAACA ATTACCAACAACAACAAACAACAAACAACATTACAATTACATTTACAATT ATCGATACAATGGACAAGAAGTACTCCATTGGGCTCGATATCGGCACAA ACAGCGTCGGCTGGGCCGTCATTACGGACGAGTACAAGGTGCCGAGCAA AAAATTCAAAGTTCTGGGCAATACCGATCGCCACAGCATAAAGAAGAAC CTCATTGGCGCCCTCCTGTTCGACTCCGGGGAGACGGCCGAAGCCACGCG GCTCAAAAGAACAGCACGGCGCAGATATACCCGCAGAAAGAATCGGATC TGCTACCTGCAGGAGATCTTTAGTAATGAGATGGCTAAGGTGGATGACTC TTTCTTCCATAGGCTGGAGGAGTCCTTTTTGGTGGAGGAGGATAAAAAGC ACGAGCGCCACCCAATCTTTGGCAATATCGTGGACGAGGTGGCGTACCAT GAAAAGTACCCAACCATATATCATCTGAGGAAGAAGCTTGTAGACAGTA CTGATAAGGCTGACTTGCGGTTGATCTATCTCGCGCTGGCGCATATGATC AAATTTCGGGGACACTTCCTCATCGAGGGGGACCTGAACCCAGACAACA GCGATGTCGACAAACTCTTTATCCAACTGGTTCAGACTTACAATCAGCTT TTCGAAGAGAACCCGATCAACGCATCCGGAGTTGACGCCAAAGCAATCC TGAGCGCTAGGCTGTCCAAATCCCGGCGGCTCGAAAACCTCATCGCACA GCTCCCTGGGGAGAAGAAGAACGGCCTGTTTGGTAATCTTATCGCCCTGT CACTCGGGCTGACCCCCAACTTTAAATCTAACTTCGACCTGGCCGAAGAT GCCAAGCTTCAACTGAGCAAAGACACCTACGATGATGATCTCGACAATCT GCTGGCCCAGATCGGCGACCAGTACGCAGACCTTTTTTTGGCGGCAAAGA ACCTGTCAGACGCCATTCTGCTGAGTGATATTCTGCGAGTGAACACGGAG ATCACCAAAGCTCCGCTGAGCGCTAGTATGATCAAGCGCTATGATGAGC ACCACCAAGACTTGACTTTGCTGAAGGCCCTTGTCAGACAGCAACTGCCT GAGAAGTACAAGGAAATTTTCTTCGATCAGTCTAAAAATGGCTACGCCG GATACATTGACGGCGGAGCAAGCCAGGAGGAATTTTACAAATTTATTAA GCCCATCTTGGAAAAAATGGACGGCACCGAGGAGCTGCTGGTAAAGCTT AACAGAGAAGATCTGTTGCGCAAACAGCGCACTTTCGACAATGGAAGCA TCCCCCACCAGATTCACCTGGGCGAACTGCACGCTATCCTCAGGCGGCAA GAGGATTTCTACCCCTTTTTGAAAGATAACAGGGAAAAGATTGAGAAAA 65 TCCTCACATTTCGGATACCCTACTATGTAGGCCCCCTCGCCCGGGGAAAT TCCAGATTCGCGTGGATGACTCGCAAATCAGAAGAGACTATCACTCCCTG GAACTTCGAGGAAGTCGTGGATAAGGGGGCCTCTGCCCAGTCCTTCATCG AAAGGATGACTAACTTTGATAAAAATCTGCCTAACGAAAAGGTGCTTCCT AAACACTCTCTGCTGTACGAGTACTTCACAGTTTATAACGAGCTCACCAA GGTCAAATACGTCACAGAAGGGATGAGAAAGCCAGCATTCCTGTCTGGA GAGCAGAAGAAAGCTATCGTGGACCTCCTCTTCAAGACGAACCGGAAAG TTACCGTGAAACAGCTCAAAGAAGATTATTTCAAAAAGATTGAATGTTTC GACTCTGTTGAAATCAGCGGAGTGGAGGATCGCTTCAACGCATCCCTGGG AACGTATCACGATCTCCTGAAAATCATTAAAGACAAGGACTTCCTGGACA ATGAGGAGAACGAGGACATTCTTGAGGACATTGTCCTCACCCTTACGTTG TTTGAAGATAGGGAGATGATTGAAGAACGCTTGAAAACTTACGCTCATCT CTTCGACGACAAAGTCATGAAACAGCTCAAGAGGCGCCGATATACAGGA TGGGGGCGGCTGTCAAGAAAACTGATCAATGGGATCCGAGACAAGCAGA GTGGAAAGACAATCCTGGATTTTCTTAAGTCCGATGGATTTGCCAACCGG AACTTCATGCAGTTGATCCATGATGACTCTCTCACCTTTAAGGAGGACAT CCAGAAAGCACAAGTTTCTGGCCAGGGGGACAGTCTCCACGAGCACATC GCTAATCTTGCAGGTAGCCCAGCTATCAAAAAGGGAATACTGCAGACCG TTAAGGTCGTGGATGAACTCGTCAAAGTAATGGGAAGGCATAAGCCCGA GAATATCGTTATCGAGATGGCCCGAGAGAACCAAACTACCCAGAAGGGA CAGAAGAACAGTAGGGAAAGGATGAAGAGGATTGAAGAGGGTATAAAA GAACTGGGGTCCCAAATCCTTAAGGAACACCCAGTTGAAAACACCCAGC TTCAGAATGAGAAGCTCTACCTGTACTACCTGCAGAACGGCAGGGACAT GTACGTGGATCAGGAACTGGACATCAATCGGCTCTCCGACTACGACGTG GATCATATCGTGCCCCAGTCTTTTCTCAAAGATGATTCTATTGATAATAA AGTGTTGACAAGATCCGATAAAAATAGAGGGAAGAGTGATAACGTCCCC TCAGAAGAAGTTGTCAAGAAAATGAAAAATTATTGGCGGCAGCTGCTGA ACGCCAAACTGATCACACAACGGAAGTTCGATAATCTGACTAAGGCTGA ACGAGGTGGCCTGTCTGAGTTGGATAAAGCCGGCTTCATCAAAAGGCAG CTTGTTGAGACACGCCAGATCACCAAGCACGTGGCCCAAATTCTCGATTC 66 ACGCATGAACACCAAGTACGATGAAAATGACAAACTGATTCGAGAGGTG AAAGTTATTACTCTGAAGTCTAAGCTGGTTTCAGATTTCAGAAAGGACTT TCAGTTTTATAAGGTGAGAGAGATCAACAATTACCACCATGCGCATGATG CCTACCTGAATGCAGTGGTAGGCACTGCACTTATCAAAAAATATCCCAAG CTTGAATCTGAATTTGTTTACGGAGACTATAAAGTGTACGATGTTAGGAA AATGATCGCAAAGTCTGAGCAGGAAATAGGCAAGGCCACCGCTAAGTAC TTCTTTTACAGCAATATTATGAATTTTTTCAAGACCGAGATTACACTGGCC AATGGAGAGATTCGGAAGCGACCACTTATCGAAACAAACGGAGAAACAG GAGAAATCGTGTGGGACAAGGGTAGGGATTTCGCGACAGTCCGGAAGGT CCTGTCCATGCCGCAGGTGAACATCGTTAAAAAGACCGAAGTACAGACC GGAGGCTTCTCCAAGGAAAGTATCCTCCCGAAAAGGAACAGCGACAAGC TGATCGCACGCAAAAAAGATTGGGACCCCAAGAAATACGGCGGATTCGA TTCTCCTACAGTCGCTTACAGTGTACTGGTTGTGGCCAAAGTGGAGAAAG GGAAGTCTAAAAAACTCAAAAGCGTCAAGGAACTGCTGGGCATCACAAT CATGGAGCGATCAAGCTTCGAAAAAAACCCCATCGACTTTCTCGAGGCG AAAGGATATAAAGAGGTCAAAAAAGACCTCATCATTAAGCTTCCCAAGT ACTCTCTCTTTGAGCTTGAAAACGGCCGGAAACGAATGCTCGCTAGTGCG GGCGAGCTGCAGAAAGGTAACGAGCTGGCACTGCCCTCTAAATACGTTA ATTTCTTGTATCTGGCCAGCCACTATGAAAAGCTCAAAGGATCTCCCGAA GATAATGAGCAGAAGCAGCTGTTCGTGGAACAACACAAACACTACCTTG ATGAGATCATCGAGCAAATAAGCGAATTCTCCAAAAGAGTGATCCTCGC CGACGCTAACCTCGATAAGGTGCTTTCTGCTTACAATAAGCACAGGGATA AGCCCATCAGGGAGCAGGCAGAAAACATTATCCACTTGTTTACTCTGACC AACTTGGGCGCGCCTGCAGCCTTCAAGTACTTCGACACCACCATAGACAG AAAGCGGTACACCTCTACAAAGGAGGTCCTGGACGCCACACTGATTCAT CAGTCAATTACGGGGCTCTATGAAACAAGAATCGACCTCTCTCAGCTCGG TGGAGACAGCAGGGCTGACCCCAAGAAGAAGAGGAAGGTGTGAGCTTGT CAAGCAGATCGTTCAAACATTTGGCAATAAAGTTTCTTAAGATTGAATCC TGTTGCCGGTCTTGCGATGATTATCATATAATTTCTGTTGAATTACGTTAA GCATGTAATAATTAACATGTAATGCATGACGTTATTTATGAGATGGGTTT 67 TTATGATTAGAGTCCCGCAATTATACATTTAATACGCGATAGAAAACAAA ATATAGCGCGCAAACTAGGATAAATTATCGCGCGCGGTGTCATCTATGTT ACTAGATCGACGCTACTAGAATTCGAGCTCGGAGTGATCAAAAGTCCCA CATCGATCAGGTGATATATAGCAGCTTAGTTTATATAATGATAGAGTCGA CATAGCGATTGAGGAAAGAGAGAACAATAACGGTTTAGAGCTAGAAAT AGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACC GAGTCGGTGCTTTTTTTCTAGACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTTGGCATTA CGCTTTACGAATTCCCATGGGGAGTGATCAAAAGTCCCACATCGATCAGG TGATATATAGCAGCTTAGTTTATATAATGATAGAGTCGACATAGCGATTG TTCGCCGGACTTAGAATGTACGGTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAA AATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCT TTTTTTCTAGACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTTGGCATTACGCTCAGAGAG GATGCACATGTGACCGAGGGACACGAAGTGATCCGTTTAAACTATCAGT GTTTGACAGGATATATTGGCGGGTAAACCTAAGAGAAAAGAGCGTTTAT TAGAATAATCGGATATTTAAAAGGGCGTGAAAAGGTTTATCCG 68