Thiết kế vector mang cấu trúc gen liên quan đến khả năng chống chịu ở cây đậu xanh

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC - THIẾT KẾ ẬU XANH LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thái Nguyên – 2011 Số hóa Trung tâm Học liệu Tai ngay!!! Ban co the xoa dong chu nay!!! http://www.lrc-tnu.edu.vn/ LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết nghiên cứu luận văn trung thực chƣa có cơng bố cơng trình khác Tác giả Võ Thị Minh Hịa Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ LỜI CẢM ƠN Lời tơi xin đƣợc bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Vũ Thanh Thanh, Khoa Khoa học Sự sống, trƣờng Đại học Khoa học - Đại học Thái Ngun TS Lê Văn Sơn, Phịng Cơng nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học - Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam, ngƣời tận tình hƣớng dẫn, bảo, dìu dắt giúp đỡ suốt thời gian thực hồn thành luận văn Tơi xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới GS.TS Lê Trần Bình, PGS.TS Chu Hồng Hà, Phịng Cơng nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học, ngƣời tạo điều kiện đóng góp ý kiến quý báu cho suốt thời gian thự Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới CN Hồng Hà, Phịng Cơng nghệ tế bào thực vật, Viện Cơng nghệ Sinh học tận tình giúp đỡ tơi hoàn thành luận văn tốt nghiệp Trong thời gian thực tập nghiên cứu, nhận đƣợc hỗ trợ nhiệt tình ý kiến đóng góp bổ ích chú, anh chị bạn Phịng Cơng nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học Tôi xin chân thành cảm ơn giúp đỡ q báu Tơi xin cảm ơn chân thành thầy cô giáo khoa Khoa học sốngtrƣờng Đại học Khoa học-Đại học Thái Nguyên hƣớng dẫn, truyền đạt kiến thức cho suốt q trình học tập nghiên cứu Tơi vơ cảm ơn tình cảm tốt đẹp ngƣời thân gia đình, đồng nghiệp bạn bè ln giúp đỡ, động viên khích lệ suốt thời gian học tập, nghiên cứu , ngày 06 tháng 10 năm 2011 Học viên Võ Thị Minh Hịa Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ MỤC LỤC Trang i ii iii iv MỞ ĐẦU 1 Lý chọn đề tài Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Ý nghĩa khoa học đề tài Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 …………… 1.1.2.2 T 1.2 HẠN VÀ CƠ SỞ PHÂN TỬ CỦA TÍNH CHỊU HẠN 10 trồng ………………… 1.2.1 1.2.2 Cơ sở hóa sinh sinh học phân tử tính chịu hạn 10 11 1.3 GEN VÀ PROTEIN LTP (Lipid Transfer Protein) 15 1.3.1 Gen LTP ………………………………………………………… 15 (LTP) …………………………………… 17 1.3.2 Protein 1.4 KỸ THUẬT CHUYỂN GEN THÔNG QUA A.tumefaciens …… 18 1.4.1 Vi khuẩn A tumefaciens tƣợng biến nạp gen vào thực vật 18 1.4.2 19 …… 20 1.4.3 Các Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 1.4.4 Thành tựu chuyển gen thực vật ……………………………… 21 Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 ………………………………… 24 24 25 2.2 P …………………………………… 26 2.2.1 ……………………………………… 27 2.2.2 ……………………… 27 2.2.3 en LTP ……………………… 27 2.2.4 ………………………… 28 29 33 2.1 V A tumefaciens CV58C1 34 A tumefaciens CV58C1 35 36 37 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38 3.1 PHÂN LẬP GEN LTP …………………………………………… 38 3.1.1 Thiết kế mồi …………………………………………………… 38 tổng hợp cDNA … 38 LTP ………………………………… 39 40 3.1.5 Kết xác định trình tự nucleotide 41 3.2 THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN 43 3.2.1 Ghép nối đoạn gen LTP vào vector chuyển tiếp pRTRA7/3 43 3.2.2 Thiết kế vector tái tổ hợp pCB301 mang gen LTP 43 3.2.3 Kết biến nạp pCB301-LTP vào vi khuẩn A tumefaciens 46 3.1.2 Tách RNA tổng số 3.1.3 Kết PCR 3.1.4 3.2.4 Kết kiểm tra có mặt vector tái tổ hợp dòng khuẩn lạc colony-PCR 3.3 CHUYỂN GEN VÀ KIỂM TRA SỰ CÓ MẶT CỦA GEN LTP Ở Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 46 CÂY THUỐC LÁ 48 3.3.1 Kết chuyển gen LTP vào thuốc 48 3.3.2 Kết kiểm tra thuốc chuyển gen kỹ thuật PCR 50 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 51 NHỮNG CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI 52 TRÌNH TỰ GEN ĐĂNG KÝ TRÊN NGÂN HÀNG GEN EMBL 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO 53 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT A.tumefaciens Agrobacterium tumefaciens BAP 6-Benzyl Amino Purine (Benzyladeninpurin) bp Base pair cDNA Complementary DNA cs Cộng DEPC Diethyl pyrocarbonat DNA Deoxyribonucleic Acid dNTP deoxynucleosit triphotphat (deoxynucleoside triphosphate) EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid EtBr Ethiium bromide E.coli Escherichia coli Gus β-glucuronidase IBA Indole-3-Butyric Acid Kb kilo base LB Luria and Bertani MS Murashige Skoog NAA Naphthalene Acetic Acid OD Optical density (Giá trị mật độ quang) PCR Polymerase Chaine Reaction RNA Ribonucleic Acid RNase Ribonuclease RT-PCR Reverse Transcriptase-PCR SDS Sodium dodecylsulfat TAE Tris-acetate-EDTA Taq Thermus aquaticus Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG ĐỀ TÀI Bảng Tên bảng Trang 2.1 25 2.2 Thành phần phản ứng PCR nhân gen LTP 29 2.3 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR nhân gen LTP 29 2.4 Thành phần phản ứng ghép nối gen LTP vào vector 31 2.5 Thành phần 34 2.6 34 3.1 Trình tự mồi nhân gen LTP 39 3.2 Kết chuyển gen LTP vào thuốc môi trƣờng chọn lọc 51 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ DANH MỤC CÁC HÌNH TRONG ĐỀ TÀI Hình Tên hình Trang 3.1 Hình ảnh điện di kết PCR nhân gen LTP 41 3.2 Hình ảnh điện di sản phẩm cắt plasmid pBT-LTP BamHI 42 3.3 So sánh trình tự nucleotide gen LTP giống đậu xanh HN2 trình tự cơng bố AY300807 3.4 44 So sánh trình tự amino acid protein LTP giống đậu xanh HN2 AY300807 44 3.5 điện di sản phẩm PCR colony pCB301-LTP 46 3.6 Hình ảnh điện di sản phẩm cắt pCB301-LTP NcoI NotI 47 3.7 Hình ảnh 48 khuẩn lạc sau biến nạp plasmid tái tổ hợp pCB301-LTP vào A tumefaciens chủng CV58C1 3.8 Hình ảnh điện di sản phẩm colony-PCR cặp mồi đặc hiệu 3.9 Quy trình chuyển gen-LTP vào thuốc K326 invitro từ mô thông qua vi khuẩn A tumefaciens 3.10 49 50 Hình ảnh điện di PCR nhân đoạn gen LTP thuốc cặp mồi đặc hiệu Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 52 Đậu xanh có tên khoa học Vigna radiata L.Wilczek, đậu đỗ Đậu xanh có nguồn gốc từ Ấn Độ Trung Á, phân bổ chủ yếu vùng nhiệt đới nhiệt đới, trồng quen thuộc Châu Á phổ biến nƣớc ta [11], [13] Trồng đậu xanh cung cấp nguồn thực phẩm giàu đạm, đáp ứng nhu cầu dinh dƣỡng ngƣời vật ni mà cịn có tác dụng cải tạo bồi dƣỡng đất rễ đậu xanh có nốt sần chứa vi sinh vật cố định đạm sống cộng sinh [4], [5] Những năm gần tình hình sản xuất, tiêu thụ chế biến đậu xanh nƣớc ta có chiều hƣớng gia tăng khai thác đƣợc số ƣu điểm quan trọng đậu xanh nhƣ: trồng có giá trị kinh tế cao nguồn thực phẩm có nhiều dinh dƣỡng, đa dạng đời sống, thích hợp với tiêu dùng nƣớc xuất Ngoài ra, đậu xanh loại trồng ngắn ngày, dễ luân canh, xen canh, gối vụ có khả cải tạo đất tốt [14] Hạn hán vấn đề gây ảnh hƣởng nghiêm trọng đến suất đậu xanh , giống đậu xanh trồng Việt Nam chủ yếu giống có khả chịu hạn Chính vậy, nghiên cứu đậu xanh có khả chịu hạn đòi hỏi thực tiễn Cho đến nay, nhà khoa học giới Việt Nam đạt đƣợc kết định việc tạo giống đậu xanh phƣơng pháp chọn giống truyền thống nhƣ chọn dòng tế bào hay sử dụng phƣơng pháp gây đột biến thực nghiệm Tuy nhiên, phƣơng pháp cịn có nhƣợc điểm nhƣ thời gian chọn tạo lâu, thí nghiệm địi hỏi lƣợng cá thể lớn… Vì vậy, áp dụng tiến sinh học Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Chọn ngẫu nhiên 10 dòng khuẩn lạc mọc đĩa thạch để tiến hành phản ứng PCR colony cặp mồi đặc hiệu Sản phẩm phản ứng đƣợc điện di kiểm tra gel agarose 0,8%, kết thể hình 3.8 1000 bp 350 bp -PCR cặp mồi đặc hiệu M: Thang marker DNA 1kb; Giếng - 10: Các dòng khuẩn lạc Qua kết thu đƣợc trên, cho thấy: có 10 dịng khuẩn lạc đƣợc lựa chọn cho kết dƣơng tính với phản ứng PCR với băng có kích thƣớc 350 bp (trừ dòng số 10 cho kết âm tính) Với tỷ lệ 80%, cho thấy biến nạp thành công vector pCB301 mang gen LTP vào vi khuẩn A.tumefaciens Nhƣ vậy, tạo đƣợc chủng A tumefaciens CV58C1 mang plasmid tái tổ hợp pCB301-LTP Đây nguồn nguyên liệu phục vụ cho mục đích chuyển gen vào thực vật nhằm tạo trồng có khả chịu hạn tốt Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 3.3 CHUYỂN GEN VÀ KIỂM TRA SỰ CÓ MẶT CỦA GEN LTP Ở CÂY THUỐC LÁ 3.3.1 Kết chuyển gen LTP vào thuốc Sau đƣa đƣợc vector pCB301-LTP vào vi khuẩn A tumefaciens, tiến hành biến nạp vào mảnh thuốc đƣợc cảm ứng môi trƣờng WPM trƣớc ngày Sau hai ngày đồng nuôi cấy, tiến hành cấy chuyển mảnh sang môi trƣờng GM có bổ sung Cefotaxim 500 mg/l, Kanamycin 50 mg/l BAP 1mg/l Cây Thuốc K326 Mảnh biến nạp cm2 in vitro môi trƣờng cảm ứng tái sinh từ mảnh môi Trƣờng GM tạo chồi Chọn lọc chuyển gen môi trƣờng RM Tạo hồn chỉnh Hình 3.9 Quy trình chuyển gen-LTP vào thuốc K326 in vitro từ mô thơng qua vi khuẩn A tumefaciens Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Sau 2-3 tuần xuất chồi nhỏ Từ mảnh lá, tiến hành tách chồi nhỏ cấy lên môi trƣờng MS có bổ sung Cefotaxim 500 mg/l, Kanamycin 50 mg/l để nhân nhanh chồi Sau 4-5 tuần, chồi nhỏ sống sót đƣợc đặt lên mơi trƣờng RM có bổ sung Cefotaxim 500 mg/l, Kanamycin 50 mg/l Các thuốc hồn chỉnh sau đƣợc đƣa mơi trƣờng trấu cát nhằm phát triển hệ rễ Sau 2-3 tuần thuốc đƣợc chuyển mơi trƣờng nhà kính Tỷ lệ chọn lọc sơ mảnh môi trƣờng chọn lọc đƣợc thể qua bảng 3.2 Bảng 3.2 Kết LTP vào thuốc môi trƣờng chọn lọc Thời gian Tổng số Số mô Số mô Số mô Số mô biến nạp Mô sống sót sống sót sống sót cảm ứng sau sau sau tạo chồi tuần tuần tuần 185 173 157 (phút) 30 200 155 Qua bảng 3.2, chúng tơi nhận thấy số lƣợng mơ sống sót môi trƣờng chọn lọc giảm dần theo thời gian, điều cho thấy khả mô tồn phát triển đƣợc mô mang tế bào đƣợc chuyển gen Sau - tuần, có 155/200 mơ sống sót mơi trƣờng chọn lọc tạo đƣợc chồi sau 6-8 tuần thuốc chuyển gen hoàn chỉnh đƣợc tạo thành Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 3.3.2 Kết kiểm tra thuốc chuyển gen kỹ thuật PCR Để kiểm tra có mặt gen chuyển thuốc chuyển gen, bƣớc đầu tách chiết DNA tổng số từ thuốc chuyển gen nhân gen LTP cặp mồi đặc hiệu Kết điện di sản phẩm PCR cho thấy, mẫu đƣợc kiểm tra xuất băng có kích thƣớc 350 bp tƣơng ứng với gen LTP M - 500 bp 350 bp 250 bp ạn gen LTP thuốc cặp mồi đặc hiệu (M: Thang marker DNA 1kb; – 6: Sản phẩm PCR; ( - ): Đối chứng âm) Nhƣ vậy, bƣớc đầu thu đƣợc thuốc chuyển gen mang gen LTP có khả chống chịu với điều kiện ngoại cảnh khô hạn Đây kết để tiếp tục việc chuyển gen LTP vào đậu xanh nhằm tạo đậu xanh có khả chịu hạn tốt Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ I Kết luận Từ kết thu đƣợc q trình nghiên cứu nhƣ chúng tơi rút đƣợc kết luận sau: Phân lập đƣợc gen LTP có kích thƣớc 351 bp từ giống đậu xanh - (HN2), Thiết kế đƣợc vector chuyển gen pCB301-LTP biến nạp thành công vào chủng vi khuẩn A.tumefaciens CV58C1 Chuyển đƣợc gen LTP kiểm tra có mặt gen LTP thuốc phƣơng pháp PCR II Đề nghị Tiếp tục sàng lọc, đánh giá khả chuyển gen mức độ biểu protein LTP thuốc chuyển gen, Sử dụng vector chuyển gen pCB301-LTP thiết kế thành công để chuyển vào đậu xanh nhằm tạo đậu xanh chuyển gen có khả chống chịu tốt điều kiện khơ hạn Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ NHỮNG CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI Nguyễn Vũ Thanh Thanh, Võ Thị Minh Hịa, Hồng Hà, Lê Văn Sơn, Chu Hồng Mậu (2011), Phân lập gen mã hóa protein vận chuyển lipit (LTP2) từ mRNA phục vụ chuyển gen đậu xanh, Tạp chí Khoa học cơng nghệĐại học Thái Nguyên, 85(09), pp 127-132 Nguyễn Vũ Thanh Thanh, Võ Thị Minh Hịa, Hồng Hà, Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Mậu (2012), Thiết kế vector chuyển gen mang gen mã hóa lipid transfer protein (LTP) phân lập từ đậu xanh (Vigna radiata L, Wilczek), gửi đăng tạp chí Cơng nghệ sinh học TRÌNH TỰ GEN ĐĂNG KÝ TRÊN NGÂN HÀNG GEN EMBL Vo M.H., Hoang H., Nguyen Vu T.T., Le V.S (2011), Isolation of lipid transfer protein from Vigna radiata Myduc-Hanoi-Vietnam, ACCESSION HE589494 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ TÀI LIỆU THAM KHẢO I Tài liệu tiếng Việt Lê Trần Bình (2008), Phát triển trồng chuyển gen Việt Nam, Bộ sách chuyên khảo, NXB Khoa học Công nghệ Lê Trần Bình (2003), Tài liệu thực hành cơng nghệ tế bào thực vật, Phịng Cơng nghệ tế bào thực vật, Viện Cơng nghệ Sinh học Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội (1997), Công nghệ sinh học thực vật cải tiến giống trồng, NXB Nông nghiệp, Hà Nội, Nguyễn Mạnh Chính, Nguyễn Mạnh Cƣờng (2008), Trồng đậu xanh, NXB Nông nghiệp, Hà Nội, tr 3-9 Đƣờng Hồng Dật (2006), Cây đậu xanh, Kỹ thuật thâm canh biện pháp tăng suất, chất lượng sản phẩm, NXB Lao động - Xã Hội, tr 5-31 Điêu Thị Mai Hoa (2006), Nghiên cứu số đặc điểm nông học, sinh lý sinh học phân tử liên quan đến tính trạng chín tập trung đậu xanh, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam, tr 51-63 Trần Thị Cúc Hịa, Lê Trần Bình, Bùi Bá Bổng (2004), Chuyển nạp gen kháng sâu cryIAb cryIAc vào giống lúa phương pháp Agrobacterium chọn lọc Mannose, Nông nghiệp-Nông thônMôi trƣờng, 6, tr 21-26 Nguyễn Ánh Hồng (2000), Cơ sở Khoa học Công nghệ chuyển gen thực vật, NXB Nông nghiệp Hà Nội Kết nghiên cứu khoa học đậu đỗ 1991 - 1995 (1996), Viện Khoa học kỹ thuật Nông nghiệp, Việt Nam, tr 4-188 10 Kết nghiên cứu khoa học nông nghiệp 2000 (2001), NXB Nơng Nghiệp Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 11 Nguyễn Đăng Khôi (1997), “Các đậu ăn hạt Việt Nam”, Tạp chí Sinh học, 2, tr 5-6 12 Trần Thị Phƣơng Liên (1999), Nghiên cứu đặc tính hóa sinh sinh học phân tử số giống đậu tương có khả chịu nóng, chịu hạn Việt Nam, Luận án tiến sĩ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Hà Nội 13 Trần Đình Long, Lê Khả Tƣờng (1998), Cây đậu xanh, NXB Nơng Nghiệp 14 Trần Đình Long, Lê Khả Tƣờng (1991), Những nghiên cứu chọn tạo giống đậu đỗ, NXB Nông nghiệp, Hà Nội, tr 2-20 15 Chu Văn Mẫn (2003), Ứng dụng tin học sinh học, NXB Đại học Quốc Gia, Hà Nội 16 Chu Hoàng Mậu (2001), Sử dụng phương pháp đột biến thực nghiệm để tạo dòng đậu tương đậu xanh thích hợp cho miền núi Đơng Bắc Việt Nam, Luận án tiến sĩ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Hà Nội 17 Đỗ Tiến Phát, Đinh Thị Phòng, Chu Hoàng Hà (2008), Đánh giá ảnh hưởng thời gian nhiễm khuẩn tới hiệu chuyển gene vào (Gossypium hirsutum L) thơng qua Agrobacterium tumefaciens, Tạp chí Cơng nghệ sinh học, 6(4A), tr 689-695 18 Nguyễn Đức Thành (2003), Chuyển gen thực vật, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội 19 Nguyễn Đức Thành (2000), Nuôi cấy mô tế bào thực vật - Nghiên cứu ứng dụng, NXB Nông nghiệp, Hà Nội 20 Lê Duy Thành (2001), Cơ sở di truyền chọn giống thực vật, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội 21 Khuất Hữu Thanh (2006), Kỹ thuật gen nguyên lý ứng dụng, NXB KH & KT Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 22 Nguyễn Vũ Thanh Thanh (2006), Nghiên cứu đặc điểm sinh học phân tử số giống đậu xanh chịu hạn, Báo cáo tổng kết đề tài nghiên cứu khoa học công nghệ cấp Bộ 23 Nguyễn Vũ Thanh Thanh (2008), Nghiên cứu tính đa dạng di truyền phân lập số gen liên quan đến tính chịu hạn đậu xanh (Vigna radiata (L,) Wilczeck), Luận án tiến sĩ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Hà Nội 24 Phạm văn Thiều (1997), Cây đậu xanh kỹ thuật trồng chế biến sản phẩm, NXB Nông nghiệp 25 Mai Trƣờng, Nguyễn Hữu Hổ, Lê Tấn Đức, Nguyễn Văn Uyển (2001), “Hệ thống tái sinh đậu xanh từ cuống tử điệp nuôi cấy in vitro”, Tạp chí sinh học, 23, tr 33-35 26 Đỗ Năng Vịnh, (2002), Công nghệ sinh học trồng, NXB Nông nghiệp 27 Vũ Văn Vụ (1999) Sinh lí thực vật ứng dụng Nxb Giáo dục II Tài liệu tiếng Anh 28 Arondel V., Vergnolle C., Cantrel C., Kader J.C (2000), “Lipid transfer protein are encoded by a small multigen family in Arabidopsis thaniana” Plant Science, 157, pp 1-12 29 Blilou I., Ocampo J.A., Garcia - Garrido J.M (2005), „„ Induction of LTP and Pal gene expression in rice roots clonized by the arbuscular mycorrhizal fungus Glomus mosseae‟‟, www.ncbi.nlm.nih.gov 30 Britton M.T., M.A Escobar, A.M Dandekar (2008), The oncogenes of Agrobacterium tumefaciens and Agrobacterium rhizogenes in Agrobacterium: From Biology to Biotechnology, T, Tzfira and V, Citovsky, Editors, Springer: New York, pp 524-65 31 Carvalho A.O., Souza-Filho G.A., Ferreira B.S., Branco A.T., Araujo I.S., Fernandes K.V., Retamal C.A., Gomes V.M., (2006), „„Cloning Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ and characterization of a cowpea seed lipid transfer protein cDNA: expression analysis during seed development and under fungal and cold stresses in seedling tissues‟‟, Plant Physiol Biochem, 44 (11-12), pp 732-742 32 Chen Y.J., Wu M.F., Yu Y.H., Tam M.F., Lin T.Y., (2004), “Developmental expression of the three mung bean Hsc70s and substrate-binding specificity of the encoded protein”, Plant and Cell Physiology, 45(110), pp 1603-1614 33 Dure L.III, Crouch M., Harada J., T-H Ho, Mundy J., Quatrano R.S., Thomas T., Sung Z.R., (1989), “Common amino acid sequene domains among the LEA proteins of higher plans” Plant Mol Biol, 12, pp 475486 34 Goyal K., Walton L.J., Tunnacliffe A (2005), “LEA proteins prevent protein aggrevation due to water stress”, Biochem, 388, pp 151-157 35 Guerbette F., Grosbois M., Jolliot C.A., Kader J.C., Zachowski A., (1999), “Lipid-transfer proteins from plants: Structure and binding properties”, Molecular and Cellular Biochemistry, 192, pp 157-161 36 Kader J.C., (1996), “Lipid-transfer proteins in plants”, Annual Review of Plant Physiology Plant Molecular Biology, 47, pp 627-654 37 Karen S., and John M., (1990), “Gene expression in respone to abscisic acid and osmotic stress”, The plant cell, 2, pp 503-512 38 Kim Y.J., Kim J.E., Lee J.H., Lee M.H., Jung H.W., Bahk Y.Y., Hwang B.K., Hwang I., Kim W.T., (2003), “The Vr - PLC3 gene ancodes a pultative plasma membrane – localized phosphoinoside – specific phospholipase C whose expression is induces by abiotic stress in mungbean (Vigna radiata L,)”, Federation of European Biochemical Societies Letters, 556, pp 127-136 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 39 Liu K.H., Lin T.Y., (2003), “ Cloning and characterization of two novel lipid transfer protein I genes in Vigna radiata”, DNA sequence – The Journal of sequencing and mapping, 14(6), pp 420-426 40 Malgorzata G., Barbara Z., (2004), “Multifunctional role of plant cysteine proteinases”, Acta Biochimica Polonica, 51(3), pp 609-624 41 Molina A., Diaz I., Vasil I.K., Carbonero P,, Gracisa O.F., (1996), “Two cold-inducible genes encoding lipid transfer protein LTP4 from barley show differential responses to bacterial pathogens”, Molercular and General Genetics, 252, pp 162-168 42 Ouvrard O., Cellier F., Ferrare K., Tousch D., Lamaze T., Dupuis J.M., Casse D.F., (1996), “Identification and expression of water stressand abscisic acid-regulated genes in a drought-tolerant sunflower genotype”, Plant Molecular Biology, Volume 31, Number 4, pp 819829 43 Pe M.E., (1993), “Mapping quantitative trait loci (QLPs) for resistance to gibberella zeae infection in maize”, Molercular Gene Geneet , 241(1-2), pp 11-16 44 Raesh S., Manickam A., (2006), “Prediction of functions for two LEA proteins from mungbean”, Bioinformation, 1(4), pp 133-138 45 Ren-Gao X., Hong-Feng assisted transformation X., Zhang B, (2006), “A multi-needleof soybean cotyledonary node cells”, Biotechnol Lett, 28, pp 1551-1557 46 Terres S.S., Godoy J.A., Pintor-Toro J.A., (1992), “Analysis of two novel classes of plant antifungal proteins from radish (Raphanus sativus L,) seeds” The Journal of Biological Chemistry, 267, pp 15301-15309 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 47 Wise (2003), “Leaping to conclusions a computational reanalysis of latte ambryogenesis abundant proteins and their possible roles” BMC Bioinformatics, 4, pp 52-57 48 Xiao B., Huang Y., Tang N., Xiong L., (2007), “Over-expression of a LEA gene in rice improves drought resistance under the field conditions”, TAG, 115, pp 35-46 49 Sevon N.K.M., Oksman-Caldentey (2002), Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation: root cultures as a source of alkaloids, Planta Med, 68(10), pp 59-68 50 Sonia R Saini R.P., Singh, Jaiwal P.K., (2007), “Agrobacterium tumefaciens mediated transfer of Phaseolusvulgaris -amylase inhibitor1 gene into mungbean (Vigna radiata (L,)Wilczek) using bar as selectable marker”, Plant Cell Rep, 26, pp 187–198 51 http://www.ncbi.nlm.ni.,gov/AY800307 - Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ PHỤ LỤC Phụ lục 1: Thành phần loại môi trƣờng Môi Thành phần trƣờng LB đặc g/l Yeast extract + 10 g/l Bacto tryptone + 10 g/l NaCl + 15 g/l bacto agar, pH = LB lỏng g/l Yeast extract + 10 g/l Bacto tryptone + 10 g/l NaCl, pH = MS đặc MS lỏng ½ MS GM RM WPM đặc WPM lỏng 20ml/L MS I + 10ml/L MS II + 10 ml/L MS III + 10 ml/L MS IV + 10 ml/L MS V + 30 g đƣờng + g thạch, pH = 5,8 20ml/L MS I + 10ml/L MS II + 10 ml/L MS III + 10 ml/L MS IV + 10 ml/L MS V + 30 g đƣờng, pH = 5,8 10 ml/L MS I + ml/L MS II + ml/L MS III + ml/L MS IV + ml/L MS V, pH = 5,8 20ml/L MS I + 10ml/L MS II + 10 ml/L MS III + 10 ml/L MS IV + 10 ml/L MS V + mg/l BAP+ 30 g đƣờng + g thạch, pH = 5,8 20ml/L MS I + 10ml/L MS II + 10 ml/L MS III + 10 ml/L MS IV + 10 ml/L MS V + 0,1 mg/l IBA + 30 g đƣờng + g thạch, pH = 5,8 WPM I (20ml/L) + WPM II (10ml/L) + WPM III (10ml/L) + WPM IV (10ml/L) + WPM V (10ml/L) + 30 g đƣờng + g thạch, pH = 5,8 WPM I (20ml/L) + WPM II (10ml/L) + WPM III (10ml/L) + WPM IV (10ml/L) + WPM V Số hóa Trung tâm Học liệu (10ml/L) + 30 g đƣờng, pH = 5,8 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Phụ lục 2: Sơ đồ vector chuyển gen dùng thí nghiệm - Cấu trúc vector pRTRA7/3 CaMV35S: 544 bp Cmyc+KDEL+polyA: 300 bp - Cấu trúc vector pBT Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ - Cấu trúc vector pCB301 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/