Nghiên cứu tối Ưu quy trình phát hiện neisseria meningitidis bằng kỹ thuật lamp kết hợp crispr cas

Nghiên cứu tối Ưu quy trình phát hiện neisseria meningitidis bằng kỹ thuật lamp kết hợp crispr cas Nghiên cứu tối Ưu quy trình phát hiện neisseria meningitidis bằng kỹ thuật lamp kết hợp crispr cas

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

ĐÀO THỊ HUYỀN

NGHIÊN CỨU TỐI ƯU QUY TRÌNH PHÁT HIỆN NEISSERIA MENINGITIDIS

BẰNG KỸ THUẬT LAMP KẾT HỢP CRISPR-CAS

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2023

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

ĐÀO THỊ HUYỀN

NGHIÊN CỨU TỐI ƯU QUY TRÌNH PHÁT HIỆN NEISSERIA MENINGITIDIS

BẰNG KỸ THUẬT LAMP KẾT HỢP CRISPR-CAS

Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 8420101.21

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Người hướng dẫn khoa học:

TS Ngô Tất Trung - Bệnh viện Trung Ương Quân Đội 108 PGS.TS Đỗ Thị Phúc - Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên

Chữ ký CBHD

TS Ngô Tất Trung PGS TS Đỗ Thị Phúc

Hà Nội - 2023

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT vii

LỜI CẢM ƠN viii

LỜI CAM ĐOAN ix

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN 3

1.1 Bệnh viêm màng não do não mô cầu 3

1.1.1 Dịch tễ bệnh viêm màng não trên thế giớ 3

1.1.2 Dịch tễ học viêm màng não ở Việt Nam 5

1.2 Vai trò của chẩn đoán sớm mầm bệnh trong nhiễm khuẩn do Neisseria meningitidis 5

1.3 Các phương pháp chẩn đoán Neisseria meningitidis hiện nay 7

1.3.1 Nuôi cấy vi khuẩn 7

1.3.2 Phản ứng chuỗi trùng hợp thời gian thực (Realtime PCR) 7

1.4 Phát hiện Neisseria meningitidis bằng phương pháp LAMP kết hợp CRISPR-Cas 9

1.4.1 Khuếch đại đẳng nhiệt qua trung gian vòng lặp – LAMP 9

1.4.2 Clustered regularly interspaced short palindromic repeats – Cas 12

CRISPR-1.5 Biểu hiện, tinh sạch protein tái tổ hợp và ứng dụng trong phản ứng khuếch đại đẳng nhiệt qua trung gian vòng lặp LAMP 15

1.5.1 Protein tái tổ hợp và ứng dụng của chúng 15

1.5.2 Làm thế nào để sản xuất protein tái tổ hợp đạt chất lượng 16

1.5.3 Biểu hiện và tinh sạch protein tái tổ hợp Bst large fragment ứng trong phản ứng khuếch đại đẳng nhiệt qua trung gian vòng lặp 18

1.6 Tình hình nghiên cứu kết hợp LAMP và CRISPR-Cas trong phát hiện Neisseria meningitidis 23

ii

CHƯƠNG 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.1 Nguyên vật liệu, đối tượng nghiên cứu 25

2.1.1 Nguyên vật liệu 25

2.1.2 Đối tượng nghiên cứu 25

2.2 Phương pháp nghiên cứu 26

2.2.1 Phương pháp, thời gian, địa điểm thực hiện nghiên cứu 26

2.2.2 Các bước tiến hành nghiên cứu 26

2.2.3 Thiết kế mồi/probe/gRNA cho phản ứng LAMP/ CRISPR-Cas 27

2.2.4 Tách chiết DNA chứng dương và DNA mẫu bệnh phẩm 28

2.2.5 Thiết lập dải nồng độ chuẩn dương 28

2.2.6 Biểu hiện và tinh sạch enzyme Bst Large Fragment tái tổ hợp 29

2.2.7 Realtime PCR phát hiện N meningitidis 30

2.2.8 Tối ưu phản ứng LAMP kết hợp CRISPR-Cas phát hiện N meningitidis 31

2.2.9 Đánh giá ngưỡng phát hiện và độ đặc hiệu kỹ thuật của phương pháp LAMP kết hợp CRISPR-Cas 32

2.2.10 Phát hiện não mô cầu trên mẫu bệnh phẩm bằng phương pháp LAMP-CRISPR-Cas và so sánh với Realtime-PCR 32

CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34

3.1 Kết quả tối ưu quy trình phát hiện Neisseria meningitidis bằng kỹ thuật LAMP kết hợp CRISPR-Cas 34

3.1.1 Thiết kế mồi/probe/gRNA đặc hiệu 34

3.1.2 Kết quả tạo dải panel chứng dương 35

3.1.3 Tinh chế enzyme Bst Large Fragment (BstLF) tái tổ hợp và ứng dụng trong khuếch đại đẳng nhiệt phát hiện Neisseria meningitidis 37

3.1.4 Kết quả tối ưu phản ứng khuếch đại đẳng nhiệt LAMP 43

3.1.5 Kết quả tối ưu phản ứng cắt đặc hiệu bằng hệ thống CRISPR-Cas 48

3.1.6 Kết quả kết hợp LAMP và CRISPR-Cas đọc kết quả bằng que thử nhanh 51

3.2 Kết quả tách chiết DNA mẫu bệnh phẩm 53

iii 3.3 Đánh giá tính ngưỡng phát hiện và độ đặc hiệu kỹ thuật của phương pháp

Hình 1 6 Hoạt tính trans-cleavage của hệ thống CRISPR-Cas 14

Hình 1 7 Các ứng dụng chính của protein tái tổ hợp trong lĩnh vực y học thuốc và điều trị 16

Hình 1 8 Các bước sản xuất protein tái tổ hợp 17

Hình 1 9 Hệ thống T7 promoter biểu hiện protein từ plasmid pET [39] 20

Hình 1 10 Sơ đồ minh hoạ IMAC [42] 22

Hình 2 1 Sơ đồ nghiên cứu 26

Hình 3 1 Sơ đồ mapping trình tự mồi và gRNA trên gen ctrA của N.meningitidis serotype B 35

Hình 3 2 Tín hiệu huỳnh quang phản ứng Realtime PCR xác định panel chứng dương 36

Hình 3 3 (A) Sơ đồ cấu trúc plasmid pET15b_Bst-LF chứa trình tự mã hoá protein Bst Large Fragment (nguồn: Addgene) (B) Hình ảnh điện di SDS-PAGE sau tinh sạch protein bằng HisPur™ Ni-NTA Resin bằng các đệm rửa khác nhau 38

Hình 3 4 Hình ảnh điện di kết quả khảo sát hoạt tính enzyme BstLF tinh sạch được bằng phương pháp khuếch đại đẳng nhiệt LAMP 41

Hình 3 5 Hình ảnh điện di kết quả khảo sát nhiệt độ gắn mồi cho phản ứng LAMP 43

Hình 3 6 Hình ảnh điện di kết quả tối ưu thành phần phản ứng LAMP 44

Hình 3 7 Hình ảnh điện di kết quả tối ưu phản ứng LAMP 45

Hình 3 8 Hình ảnh điện di kết quả lặp lại điều kiện tối ưu phản ứng LAMP 46

Hình 3 9 Hình ảnh điện di sản phẩm khuếch đại gen ctrA đặc hiệu não mô cầu 47

v Hình 3 10 Kết quả tối ưu CRISPR-Cas cắt đặc hiệu gene ctrA não mô cầu 49 Hình 3 11 Hình ảnh tín hiệu huỳnh quang thu được khi khảo sát nhiệt độ từ 39oC đến 50oC cho phản ứng CRISPR-Cas 50 Hình 3 12 Tối ưu phản ứng CRISPR-Cas cắt đặc hiệu gene ctrA não mô cầu 50 Hình 3 13 Kết quả chẩn đoán nhanh tại chỗ DNA N meningitidis bằng công nghệ CRISPR-CAS kết hợp khuếch đại đẳng nhiệt LAMP trên dải panel chuẩn dương 52 Hình 3 14 Nồng độ DNA tách chiết từ mẫu bệnh phẩm thu thập được (ng/µl) 54 Hình 3 15 Kết quả đánh giá độ đặc hiệu kỹ thuật của phương pháp LAMP kết hợp CRISPR-Cas phát hiện não mô cầu 57 Hình 3 16 Biểu đồ Venn thể hiện sự tương đồng của hai kit chẩn đoán trên 139 mẫu bệnh phẩm 59

vi

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Bảng panel chứng dương 28 Bảng 2.2 Bảng so sánh kết quả chẩn đoán giữa LAMP-CRISPR/Cas và Realtime PCR 32 Bảng 3.1 Bảng phân tích trình tự mồi ctrA đặc hiệu cho não mô cầu 34 Bảng 3.2 Bảng kết quả đo nồng độ protein BstLF theo phương pháp Bradford 40 Bảng 3.3 Kết quả phát hiện dương tính N meningitidis bằng phản ứng LAMP sử dụng BstLF in-house sau 20 lần lặp lại tại mỗi nồng độ 42 Bảng 3.4 Kết quả đánh giá ngưỡng phát hiện N meningitidis của phương pháp LAMP kết hợp CRISPR-Cas 55 Bảng 3.5 Bảng phân tích độ nhạy và độ đặc hiệu thực tế của phương pháp LAMP kết hợp CRISPR-Cas phát hiện N meningitidis so với phương pháp Realtime PCR 58 Bảng 3.6 Bảng phân tích Kappa đánh giá sự đồng thuận của hai bộ sinh phẩm chẩn đoán 59

vii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

CDC Center for Disease Control: Trung tâm kiểm soát bệnh tật Hoa

Kỳ

KIA Kliger’s Iron Agar: Môi trường thạch nghiêng LAMP Loop-mediated isothermal amplification: Phản ứng khuếch đại

đẳng nhiệt qua trung gian vòng CRISPR Clustered Regularly Interspaved Short Palindromic Repeats-

Đoạn lặp xen kẽ các trình tự lặp lại ngắn PCR Polymerase chain reaction: phản ứng sinh học phân tử kéo dài

chuỗi Realtime-PCR Realtime-polymerase chain reaction: phản ứng sinh học phân tử

kéo dài chuỗi trong thời gian thực

WHO World Health Organization: Tổ chức Y tế thế giới Ct Cycle Threshold: Chu kỳ tại đó tín hiệu nhân lên vượt qua tín

hiệu nền PC Positive control (Chứng dương) NC Negative control (Chứng âm)

viii

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn thạc sĩ này, đầu tiên tôi xin gửi lòng kính trọng và sự biết ơn chân thành nhất đến thầy hướng dẫn TS Ngô Tất Trung và cô PCG TS Đỗ Thị Phúc đã trực tiếp hướng dẫn, không những chỉ dạy tôi kiến thức mà còn dạy tôi cách làm việc, cách tư duy, luôn đem đến cho tôi những cơ hội và động lực để tôi có thể phấn đấu đạt được Điều đó giúp tôi trở nên trưởng thành hơn từng ngày và có thể chọn được con đường đi đúng đắn Tôi xin trân trọng cảm ơn PGS TS Lê Hữu Song, PGS.TS Phan Quốc Hoàn đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi có thể tham gia nghiên cứu và thực hiện luận văn tại Bệnh viện Trung ương Quân đội 108; cảm ơn các anh chị làm việc tại Trung tâm Nghiên cứu Y học Việt Đức và Khoa Sinh học phân tử – Bệnh viện Trung ương Quân đội 108 đã quan tâm, hướng dẫn tận tình, giúp tôi có thêm kinh nghiệm và hoàn thiện các kĩ năng trong phòng thí nghiệm Tôi cảm thấy rất hạnh phúc và biết ơn khi gia đình, người thân, bạn bè đã

luôn bên cạnh và hỗ trợ tôi mọi lúc

Xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Bộ Quốc phòng Việt Nam đã tài trợ kinh phí cho nghiên cứu này theo hợp đồng số 364/2020/HD-NCKHCN Các cơ quan tài trợ không có vai trò gì trong việc thiết kế nghiên cứu, thu thập và phân tích dữ liệu, quyết định xuất bản và/hoặc chuẩn bị bản thảo

ix

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là của tôi và công bố một cách trung thực Kết quả trong luận văn là một phần của công trình nghiên cứu thuộc đề tài cấp Bộ Quốc Phòng, mã số 20208940 Kết quả này sử dụng trong luận văn được sự chấp thuận của các thành viên nghiên cứu đề tài

Người thực hiện

Đào Thị Huyền

1

MỞ ĐẦU

Viêm màng não là một căn bệnh nhiễm khuẩn nguy hiểm với tỷ lệ tử vong cao (13%), có khả năng bùng phát thành dịch, và để lại nhiều di chứng

nặng nề [1-3] Trong đó, não mô cầu (Neisseria meningitidis) là một trong những

nguyên nhân phổ biến gây ra bệnh viêm màng não do vi khuẩn và việc chẩn đoán nhanh, chính xác là hết sức cần thiết trong phòng dịch và điều trị bệnh [4] Hướng dẫn của Trung tâm kiểm soát bệnh tật Hoa Kỳ (Center for Disease Control – CDC) và Tổ chức Y tế thế giới khuyến cáo sử dụng phương pháp nuôi cấy và sinh học phân tử dựa trên phản ứng chuỗi - PCR để chẩn đoán xác định não mô cầu [5,

6] Tuy nhiên, nuôi cấy Neisseria meningitidis thường cho kết quả sau 24 giờ và có

tỷ lệ âm tính giả cao, do đó làm chậm trễ quá trình điều trị bệnh Phương pháp sinh học phân tử kéo dài chuỗi như PCR hay realtime PCR đã có những cải thiện hơn như thời gian chẩn đoán nhanh, chỉ sau vài giờ Tuy nhiên, cả hai phương pháp này đều yêu cầu thực hiện trong các phòng thí nghiệm tiêu chuẩn với quy trình nghiêm ngặt Điều này là một cản trở lớn khi đặt ra vấn đề tầm soát diện rộng trong vùng dịch hoặc chẩn đoán ở những nơi điều kiện cơ sở thiếu thốn Vì vậy, ứng dụng các phướng pháp chẩn đoán mới thân thiện với người dùng hơn, hạn chế sử dụng các thiết bị đắt tiền, phù hợp với thực tế lâm sàng, dễ dàng triển khai sàng lọc trong cộng đồng hoặc chẩn đoán tại các khu căn cứ quân sự với trang thiết bị đơn giản là rất cần thiết, và có tính thực tiễn cao

Xuất phát từ những đặc điểm dịch tễ và diễn biến lâm sàng của bệnh do

Neisseria meningitidis, các kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt ngày càng được quan tâm,

tiêu biểu là kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt qua trung gian vòng lặp (Loop-mediate isothermal amplification - LAMP) để phục vụ chẩn đoán sớm, ngay tại chỗ, chính xác mầm bệnh [7] Phương pháp này có nhiều ưu điểm như giá thành rẻ, độ nhạy cao, thời gian khuếch đại nhanh (chỉ trong vòng 60 phút), có thể khuếch đại và kéo dài chuỗi trong một điều kiện nhiệt độ và chỉ yêu cầu thiết bị ủ nhiệt đơn giản Hơn nữa, nhằm tăng tính đặc hiệu của phương pháp chẩn đoán, kết hợp CRISPR-Cas với LAMP vào một xét nghiệm, qua đó xây dựng một phương pháp sàng lọc với độ nhạy và độ đặc hiệu cao, có thể triển khai tại các cơ sở y tế với trang thiết bị hạn chế

2 Nhiều nghiên cứu công bố trên các tạp chí khoa học uy tín đã chỉ ra LAMP và CRISPR-Cas có thể kết hợp với nhau để phát hiện các tác nhân gây bệnh do vi khuẩn Tuy nhiên, cả trên thế giới và Việt Nam đều chưa có nghiên cứu nào ứng dụng kỹ thuật

này trong phát hiện Neisseria meningitidis Cùng với yêu cầu cấp thiết một phương pháp có thể triển khai sàng lọc, phát hiện nhanh Neisseria meningitidis ngay tại thực

địa, đề tài “Nghiên cứu tối ưu quy trình phát hiện Neisseria meningitidis bằng

kỹ thuật LAMP kết hợp CRISPR-Cas” được tiến hành với hai mục tiêu:

1 Tối ưu quy trình phát hiện Neisseria meningitidis bằng kỹ thuật LAMP kết

hợp CRISPR-Cas 2 Đánh giá ngưỡng phát hiện, độ đặc hiệu kỹ thuật của quy trình xét nghiệm

vừa xây dựng và đánh giá sự tương đồng với phương pháp Realtime PCR

trong chẩn đoán Neisseria meningitidis

3

1 CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN 1.1 Bệnh viêm màng não do não mô cầu

1.1.1 Dịch tễ bệnh viêm màng não trên thế giớ

Viêm màng não là tình trạng viêm (sưng) các màng bảo vệ bao phủ não và tuỷ sống Nguyên nhân thường do nhiễm vi khuẩn hoặc vi-rút trong dịch não tuỷ Ngoài ra, chấn thương, ung thư, một số loại thuốc hoặc các loại nhiễm khuẩn khác cũng có thể gây ra bệnh viêm màng não Trong đó, viêm màng não do vi khuẩn là rất nghiêm trọng, có tỷ lệ tử vong cao, cần được chăm sóc y tế ngay lập tức [8, 9] Các triệu chứng nhiễm khuẩn cấp tính xảy ra đột ngột khiến bệnh nhân rơi vào trạng thái lơ mơ hoặc hôn mê, tiến triển thành sốc nhiễm khuẩn huyết và suy đa tạng

Mặc dù đã có nhiều cải thiện trong chẩn đoán, điều trị và tiêm chủng, nhưng trong báo cáo ghi nhận năm 2015 vẫn có 8.7 triệu trường hợp mắc bệnh viêm màng não trên toàn thế giới, với 379.000 trường hợp tử vong [10] Đặc biệt, khu vực kéo dài từ Ethiopia đến Senegal thuộc châu Phi cận Sahara được mệnh danh là “vành đai viêm màng não” với tỷ lệ mắc bệnh cao nhất trên thế giới và thường xuyên xuất hiện điểm dịch Tại Hoa Kỳ, tỷ lệ mắc bệnh viêm màng não do vi khuẩn hàng năm là khoảng 1,38 ca/ 100.000 dân với tỷ lệ tử vong là 14,3% [10] Một

trong những căn nguyên nguy hiểm thường gặp là vi khuẩn Neisseria meningitidis

Hình 1 1 Xu hướng căn nguyên vi khuẩn gây viêm màng não theo năm, từ năm 1997 đến

năm 2010 [4]

4

Số ca bệnh được ước tính dựa trên số ca mắc mới trên 100.000 người tại Hoa Kỳ Năm 2000 và năm 2005 là hai thời điểm triển khai chương trình tiêm vác-xin phối hợp 7 biến thể pneumococcal (PCV7) và vác-xin phối hợp meningococcal (MCV4) *p value được tính dựa trên so sánh giữa năm 1997 và năm 2010 Theo thống kê từ kho dữ liệu của Hoa Kỳ từ năm 1997 đến năm 2010 có đến 50882 trường hợp viêm mang não do vi khuẩn Trong đó, 5 nguyên nhân phổ biến nhất bao gồm: S pneumoniae, Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae, các loại tụ cầu và vi khuẩn Gram âm

Neisseria meningitidis (hay còn gọi là não mô cầu) là một vi khuẩn song

cầu gram âm, có vỏ, hiếu khí, thuộc họ Neisseriaceae Trên thế giới đã phân loại được 13 nhóm huyết thanh, trong đó có 6 loại huyết thanh (A, B, C, W135, X và Y) gây bệnh viêm màng não hoặc nhiễm khuẩn huyết ở người, chủ yếu ở đối tượng là trẻ em và thanh thiếu niên Theo thống kê năm 2010, bệnh viêm màng não riêng do

vi khuẩn Neisseria meningitidis xảy ra với 12.833 trường hợp chiếm tỷ lệ 0,123 ca/100.000 người, là căn nguyên phổ biến thứ 2 chỉ sau Streptococcus pneumoniae

với 21.858 trường hợp và tỷ lệ chiếm 0.3 ca/ 100.000 người (Hình 1 1) [4] Theo số liệu mới nhất cập nhật tại Trung tâm Kiểm soát bệnh tật Hoa Kỳ, tỷ lệ mắc đã giảm xuống còn 0,06 ca/100.000 người [11] Các trường hợp viêm màng não do

Neisseria meningitidis thường xảy ra lẻ tẻ, tuy nhiên vẫn có tỷ lệ dưới 2% diễn biến

thành dịch Ngoài ra, viêm màng não do não mô cầu được cho là căn bệnh tối nguy hiểm bởi phần lớn đối tượng mắc bệnh là trẻ em – đối tượng dễ bị tổn thương Tỷ lệ mắc bệnh cao nhất ở trẻ dưới 1 tuổi, sau đó là nhóm trẻ thành niên độ tuổi từ 16 đến 23 và người già [4, 11]

Tác nhân gây bệnh N meningitidis có thể lây truyền trực tiếp thông qua

tiếp xúc với nước bọt, dịch tiết, niêm mạc của người mang mầm bệnh, vi khuẩn trong không khí Vi khuẩn có thể cư trú trong vòm họng của những người mang mầm bệnh nhưng không có triệu chứng, hoặc triệu chứng nhẹ như sốt hoặc viêm mũi họng (chiếm 10 – 15%) Đây được coi là thể nhiễm khuẩn không có triệu chứng thường hay gặp trong các vụ dịch và đó là nguồn lây truyền dịch rất quan trọng trong cộng đồng Bệnh viêm màng não có các thể lâm sàng đa dạng như viêm màng não tuỷ cấp có mủ, nhiễm khuẩn huyết, viêm khớp hay viêm màng trong

5 tim Sau khi xâm nhập vào cơ thể, não mô cầu gây bệnh viêm màng não hoặc nhiễm khuẩn huyết nặng ở trẻ em và người lớn, hậu quả là ảnh hưởng đến mạch máu và các cơ quan nội tạng khác

1.1.2 Dịch tễ học viêm màng não ở Việt Nam

Tại Việt Nam, viêm màng não thường xuyên xuất hiện ở các bệnh nhi dưới 15 tuổi, đặc biệt là trẻ em dưới 1 tuổi (chiếm 45,6%) [12] Bệnh gặp cao nhất từ

tháng 5 đến tháng 7 (11,8% đến 26,3%) Trong đó, N.meningitidis là một trong

những nguyên nhân phổ biến (0,46%), chỉ sau viêm não Nhật Bản và phế cầu (33,2% và 10,41%) Tỉ lệ điều trị khỏi hoàn toàn là 54,7%; để lại di chứng 19,9% và tỷ lệ tử vong 5,2% [12] Nghiên cứu của Cuong Chi Ngo và cộng sự thực hiện điều tra trên đối tượng bệnh nhân nhiễm khuẩn hệ thần kinh trung ương tại Bệnh viện

Bạch Mai từ năm 2012 đến năm 2014 cũng chỉ ra N.meningitidis là một trong

những căn nguyên phổ biến, chiếm tỷ lệ 3,2% trong tổng số 27,5% số căn nguyên phân lập được [13]

Nghiên cứu của Nguyễn Xuân Kiên chỉ ra rằng đối tượng làm nghề nông nghiệp, làm rừng, làm rẫy, làm nông nghiệp và bộ đội có tỷ lệ nhiễm não mô cầu cao hơn những người làm nghề tự do và các nghề khác [14] Nghiên cứu cũng chỉ ra tỷ lệ nhóm huyết thanh não mô cầu gây bệnh ở Việt Nam chủ yếu là B và C (chiếm 92,31%) [14] Nếu phát hiện kịp thời, điều trị tích cực, đúng phác đồ thì tỷ lệ khỏi bệnh đạt 85 - 95% Thế nhưng viêm màng não mô cầu lại có diễn biến cực kỳ nhanh chóng và mức độ lây lan cao chỉ bằng tiếp xúc trực tiếp quan đường hô hấp Do đó, việc phát hiện sớm và điều trị kịp thời cho bệnh nhân là hết sức quan trọng Đồng thời, những người tiếp xúc gần cần được sàng lọc phát hiện và khoanh vùng nhanh chóng

1.2 Vai trò của chẩn đoán sớm mầm bệnh trong nhiễm khuẩn do Neisseria

meningitidis

Viêm màng não được coi là một bệnh truyền nhiễm nguy hiểm, cần được chẩn đoán và điều trị càng sớm càng tốt Biểu hiện bệnh chủ yếu là viêm màng não (70%), nhiễm khuẩn huyết đơn thuần (27%), và các biểu hiện lâm sàng khác (3%) [15] Tỷ lệ tử vong do nhiễm não mô cầu có thể lên tới 50% ở những bệnh nhân

6 không được điều trị Điều trị sớm và tích cực có thể giảm tỷ lệ tử vong xuống khoảng 10 – 14% [8] Sự phát triển và ứng dụng rộng rãi vác-xin phòng bệnh viêm màng não do não mô cầu giúp cải thiện tỷ lệ mắc mới Tuy nhiên, ngay cả khi được điều trị, trong số những bệnh nhân sống sót vẫn có tới 11 – 19% bệnh nhân phải mang các biến chứng lâu dài Các biến chứng của bệnh viêm màng não có thể kể đến bao gồm đau mãn tính, sẹo da, viêm khớp (10%), cắt cụt chi, suy giảm thần kinh từ suy giảm thính giác và thị giác đến suy giảm chức năng vận động (3%) [8]

Bệnh do N meningitidis thường tiến triển nhanh, thời gian cửa sổ từ lúc

xuất hiện triệu chứng đầu tiên đến khi tử vong chỉ tính bằng giờ Nghiên cứu của Thompson chỉ ra các triệu chứng không điển hình như sốt, chán ăn, buồn nôn và nôn xuất hiện trong 4-6 giờ đầu của bệnh Rất nhanh sau đó (giờ thứ 8 của bệnh), bệnh nhân biểu hiện các triệu chứng nặng như đau chân, lạnh chân tay, khó thở, ban xuất huyết hoại tử Thời gian trung bình đến lúc nhập viện là 19 tiếng, và có thể tử vong trong vòng 24 giờ đầu của bệnh [16] Nếu được phát hiện và điều trị đúng căn nguyên từ sớm, kết cục của bệnh nhân có thể được cải thiện Mặc dù chiến thuật điều trị kháng sinh sớm ở những bệnh nhân nghi ngờ nhiễm não mô cầu ở những vùng dịch tễ có đem lại hiệu quả, nhưng việc sử dụng kháng sinh bao vây lại là yếu tố nguy cơ của hình thành và gia tăng đề kháng kháng sinh Theo báo cáo thống kê tại Pháp, năm 2012-2015 ghi nhận chỉ khoảng 2% não mô cầu giảm nhạy cảm với cephalosporin thế hệ III [17]

Các chuyên gia khuyến cáo nên điều trị dự phòng cho những người có nguy cơ bị lây nhiễm càng sớm càng tốt, lý tưởng nhất là trước 24 giờ sau khi chẩn đoán xác định bệnh nhân nhiễm não mô cầu, nhằm bảo vệ những người có cơ địa nhạy cảm khỏi tiến triển thành bệnh và ngăn ngừa sự tiếp tục lây lan của chúng ra cộng

đồng Khả năng nhiễm não mô cầu ở những người tiếp xúc gần với bệnh nhân như

trong trường mầm non, doanh trại quân đội, kí túc xá, nhà tù là cao và khả năng này tăng lên đáng kể trong trường hợp những người sống cùng nhà [18] Ngoài ra, bất cứ ai tiếp xúc trực tiếp với chất tiết từ miệng bệnh nhân như hôn, dùng chung cốc, bát, hô hấp nhân tạo, nhân viên y tế chăm sóc trực tiếp cũng tăng nguy cơ nhiễm não mô cầu Nếu không có các biện pháp phòng bệnh hiệu quả, những người nhạy

7 cảm có thể bị bệnh nhiễm não mô cầu sớm, chỉ trong vòng một vài ngày đầu Không những vậy, chẩn đoán sớm nhiễm não mô cầu trên lâm sàng gặp nhiều khó khăn do triệu chứng của bệnh không đặc hiệu Từ đó, đặt ra nhu cầu cần có phương tiện để chẩn đoán nhanh mầm bệnh, thực hiện được tại chỗ để hướng dẫn điều trị kháng sinh cho bệnh nhân nghi ngờ nhiễm não cầu khuẩn

1.3 Các phương pháp chẩn đoán Neisseria meningitidis hiện nay

Cho đến hiện nay, hướng dẫn chẩn đoán do Trung tâm kiểm soát bệnh tật Hoa Kỳ (Center for Disease Control – CDC) và Tổ chức Y tế thế giới (WHO) đều khuyến cáo sử dụng 2 phương pháp để chẩn đoán xác định viêm màng não do

Neisseria meningitidis là nuôi cấy và sinh học phân tử dựa trên phản ứng chuỗi

trùng hợp (PCR hoặc realtime-PCR)

1.3.1 Nuôi cấy vi khuẩn

Nuôi cấy vi khuẩn là tiêu chuẩn vàng để chẩn đoán mầm bệnh vi khuẩn bao

gồm cả Neisseria meningitidis Trên vi trường, N meningitidis là loại song cầu

khuẩn, Gram âm, hình hạt cà phê, có thể xuất hiện ngoại bào hoặc nội bào bạch cầu

hạt N meningitidis được cho là một loại vi khuẩn khó nuôi cấy, chúng có thể phát

triển trong môi trường với nhiệt độ 35 – 37oC và 5% CO2 Sau khoảng 18 – 24 giờ, khuẩn lạc có màu xám trên thạch sô-cô-la và không có sắc tố trên trên đĩa thạch máu Trên thạch máu, khuẩn lạc có hình dạng tròn, nhẵn, lồi và óng Các khuẩn lạc

thuần nghi ngờ N meningitidis có thể được định danh bằng thử nghiệm oxydase

dương tính, xét nghiệm đường KIA và huyết thanh học để xác định nhóm huyết thanh [5, 6] Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp này là tỷ lệ âm tính giả cao và thời gian chờ kết quả lâu (>24 giờ) Điều này ảnh hưởng rất lớn đến kết quả điều trị của bệnh nhân bởi diễn biến cấp tính của bệnh viêm màng não có thể khiến bệnh nhân trở nặng sau 4 – 6 giờ và có thể tử vong trong vòng 24 giờ đầu của bệnh

1.3.2 Phản ứng chuỗi trùng hợp thời gian thực (Realtime PCR)

Hiện nay, phương pháp realtime PCR có thể cho kết quả chẩn đoán sau vài giờ Đây là một kỹ thuật cho phép phát hiện nhanh hầu hết vật chất đặc trưng cho

từng vi sinh vật, bao gồm Neisseria meningitidis Phương pháp này phát hiện vật

8 chất di truyền là DNA nhờ sử dụng sự luân nhiệt lặp lại của các chu kỳ bao gồm tách mạch, ủ mồi và kéo dài chuỗi Theo đó, đoạn mồi được sử dụng sẽ kết hợp đặc hiệu với đoạn gen đích và khuếch đại chúng lên đến hàng triệu đến hàng tỷ bản sao theo cấp số nhân Đồng thời, kỹ thuật này sử dụng một đầu dò có gắn huỳnh quang giúp thiết bị có thể ghi nhận được tín hiệu DNA đích sau mỗi chu kỳ nhân lên Qua đó có thể phát hiện được đoạn gen đặc trưng của loài vi sinh vật trong các mẫu bệnh

phẩm Một trong những gen mục tiêu thường được sử dụng để phát hiện N

meningitidis là ctrA, gen mã hoá cho một protein ngoài màng có chức năng điều

chỉnh sự vận chuyển qua màng Gen ctrA được cho là đặc hiệu cho N meningitidis,

và trình tự của gen này được bảo tồn cao trong hầu hết các tuýp huyết thanh của não mô cầu [19] Phương pháp này giúp phát hiện DNA của vi sinh vật với độ nhạy và độ đặc hiệu cao Realtime PCR được cho là ưu việt hơn nuôi cấy ở chỗ có thể phát hiện được cả vi-rút và cả những vi khuẩn khó nuôi cấy Tuy nhiên, để áp dụng phương pháp này, cần có các thiết bị đắt tiền như máy luân nhiệt PCR hay hệ thống đọc tín hiệu huỳnh quang như Realtime-PCR

Cả hai phương pháp nuôi cấy và Realtime-PCR đều yêu cầu thực hiện trong các phòng thí nghiệm quy chuẩn nghiêm ngặt Điều này là một cản trở lớn khi đặt ra vấn đề tầm soát diện rộng trong vùng dịch hoặc chẩn đoán ở những nơi điều kiện cơ sở thiếu thốn Bởi lẽ, khu vực dịch bùng phát thường xảy ra ở những nơi điều kiện cơ sở vật chất hạ tầng hạn chế Trong khi đó, việc chẩn đoán xác định các căn nguyên gây bệnh của các vụ dịch này, nhất là những ngày đầu không phải luôn thuận lợi Thực tế cho thấy nhiều vụ dịch chỉ phát hiện được mầm bệnh sau khi dịch bệnh đã lan ra diện rộng Và ngay cả khi đã xác định có dịch bệnh lưu hành thì việc ngăn ngừa sự lây lan đang là vấn đề nan giải Khi có một vụ dịch xảy ra việc kiểm soát an ninh, cách ly các đối tượng có nguy cơ cao như người vừa đi từ khu vực có dịch đến, những người vừa tiếp xúc với bệnh nhân… đang gặp nhiều khó khăn Đặc biệt đối với ngành quân y, còn đòi hỏi phải triển khai được chẩn đoán trong điều kiện hành quân, đảm bảo bí mật quân sự và hoàn toàn thiếu các hạ tầng cơ bản như điện, nước, thông tin liên lạc Chính vì lẽ đó, việc ứng dụng các công nghệ mới trong chẩn đoán là rất cần thiết để thân thiện với người dùng hơn, hạn

9 chế sử dụng các thiết bị đắt tiền, phù hợp với thực tế ứng dụng chẩn đoán thực địa trong cộng đồng hoặc các khu căn cứ quân sự với trang thiết bị đơn giản

1.4 Phát hiện Neisseria meningitidis bằng phương pháp LAMP kết hợp

CRISPR-Cas

Các phương pháp xét nghiệm trước đây vẫn còn tồn tại những hạn chế khiến chúng khó có thể triển khai tại thực địa Do đó, các phương pháp khuếch đại đẳng nhiệt ngày càng được quan tâm Ưu điểm của các phản ứng đẳng nhiệt có thể kể đến như giá thành rẻ, độ nhạy cao, có thể khuếch đại và kéo dài chuỗi chỉ trong một điều kiện nhiệt độ mà không cần phải sử dụng đến thiết bị luân nhiệt như phản ứng PCR Trong đó, phương pháp khuếch đại qua trung gian vòng lặp (Loop – mediate isothermal amplification – LAMP) đã được phát triển thương mại và đã có

nhiều nghiên cứu trong cộng đồng khoa học

Bên cạnh đó, hệ thống CRISPR-Cas sử dụng một enzyme cắt đặc hiệu endonuclease cas12 có khả năng nhận biết chính xác trình tự DNA đích, cắt đặc hiệu DNA đích mạch đôi Ngoài ra, enzyme này còn thể hiện hoạt tính exonuclease, có thể cắt các DNA mạch đơn ngắn, điển hình như đoạn đầu dò có gắn huỳnh quang [20] Nhờ đó, sự kết hợp của 2 phản ứng LAMP và CRISPR-Cas hứa hẹn trở thành một phương pháp sàng lọc với độ nhạy và độ đặc hiệu cao, có thể triển khai tại các cơ sở y tế với trang thiết bị hạn chế

1.4.1 Khuếch đại đẳng nhiệt qua trung gian vòng lặp – LAMP

Khuếch đại đẳng nhiệt qua trung gian vòng lặp (Loop – mediate isothermal amplification - LAMP) được Notomi và cộng sự phát triển từ năm 2000 và được mô tả là một công nghệ mới cho phép khuếch đại acid nucleic (DNA) ở một nhiệt độ không đổi mà không cần phải sử dụng các thiết bị luân nhiệt phức tạp như phản ứng kéo dài chuỗi PCR [7, 21] Chỉ sau hơn hai thập kỷ, LAMP đã trở thành phương pháp khuếch đại đẳng nhiệt được sử dụng rộng rãi nhất, được tham khảo trong khoảng 3.700 ấn phẩm khoa học (Hình 1 2), 8 thử nghiệm lâm sàng [22] và được WHO phê duyệt như một phương pháp phân tử hỗ trợ chẩn đoán bệnh lao phổi [23] và SARS-CoV-2 [24]

10

Hình 1 2 Số lượng xuất bản khoa học mỗi năm liên quan đến các phương pháp

LAMP từ năm 2000 đến năm 2021 So sánh số lượng các ấn phẩm khoa học của khuếch đại đẳng nhiệt qua trung gian

vòng lặp (LAMP) với các phương pháp khác như khuếch đại dựa trên trình tự axit nucleic (NASBA), khuếch đại vòng tròn (RCA) và khuếch đại qua polymerase tái tổ

hợp (RPA) [21]

LAMP dựa vào hoạt động dịch chuyển sợi của enzyme DNA polymerase kết hợp với một bộ mồi gồm bốn đến sáu đoạn mồi [7, 25] Các đoạn mồi trong phản ứng bao gồm F3, B3, FIP, BIP định ra 6 vùng F1c, F2c, F3c, B1, B2 và B3 trên mạch DNA đích (Hình 1 3)

Ngoài ra, để tăng hiệu suất, phản ứng còn được bổ sung thêm hai mồi F, Loop-B Sau khi được ủ ở nhiệt độ thích hợp, các mồi FIP, BIP gắn với gen đích nhờ các vùng liên kết bổ sung Enzyme DNA Polymerase trượt trên mạch từ vị trí bắt cặp mồi, vừa tháo xoắn vừa tổng hợp mạch mới bổ sung Ngay sau đó, sự tổng hợp mạch từ vị trí liên kết mồi F3 đẩy mạch vừa tổng hợp ra khỏi khuôn Trên mạch mới này, F1c của mồi FIP liên kết bổ sung với trình tự F1 vừa tổng hợp, tạo thành cấu trúc vòng đầu mạch Tương tự như vậy với mồi BIP và B3 Theo cách này, quá trình khuếch đại tạo ra các DNA có cấu trúc hình quả tạ (Hình 1 3) [26]

Loop-11

Hình 1 3 Nguyên lý khuếch đại đẳng nhiệt qua trung gian vòng lặp (LAMP) sử dụng 4 đến 6 đoạn mồi bao gồm F3, B3, FIP, BIP, Loop-F, Loop-B

(Source: Trends in Parasitology)

Sản phẩm cuối cùng tạo ra là các DNA có dạng mạch vòng có chiều dài khác nhau và cấu trúc có nhiều vòng giống như súp lơ [27] Sản phẩm sau khuếch đại có thể được phát hiện thông qua phương pháp nhuộm màu SYBR xanh hoặc đo độ đục do kết tủa magie pyrophosphate Do hoạt động dịch chuyển sợi cao của enzyme DNA Polymerase, một lượng DNA khổng lồ có trọng lượng phân tử cao được tạo ra nhanh chóng Điều này cho phép khuếch đại DNA mục tiêu lên đến 109bản sao trong vòng chưa đầy một giờ

LAMP có tiềm năng được sử dụng như một xét nghiệm sàng lọc đơn giản tại hiện trường hoặc tại điểm chăm sóc lâm sàng Đặc tính của LAMP là đẳng nhiệt, giúp loại bỏ nhu cầu sử dụng các máy luân nhiệt đắt tiền Do đó, phương pháp này có tính ứng dụng cao trong chẩn đoán và sàng lọc các bệnh truyền nhiễm ở các

nước chưa và đang phát triển Vì sử dụng một DNA polymerase, tiêu biểu là Bst –

Bacillus stearothermophilus giúp cho việc chống chịu tốt hơn với các chất nền, chất

12 ức chế từ mẫu lâm sàng Một số báo cáo gần đây đã mô tả việc phát hiện thành công

mầm bệnh từ các mẫu máu lâm sàng khi chỉ cần trải qua bước xử lý nhiệt

Tuy nhiên phương pháp này có một số nhược điểm như sinh phẩm thường không có sẵn, yêu cầu khắt khe trong việc thiết kế mồi Để thiết kế một bộ mồi phù hợp và có hiệu quả cao là một thách thức, vì thực tế, không phải vị trí nào cũng có thể được chọn làm vị trí mục tiêu Hơn nữa, số lượng mồi lớn trên mỗi mục tiêu làm tăng khả năng xảy ra tương tác giữa các mồi và mồi với các tập hợp mục tiêu, dẫn đến sai lệch và gây ra hiện tượng dương tính giả

1.4.2 Clustered regularly interspaced short palindromic repeats –

CRISPR-Cas

CRISPR-Cas (Clustered Regularly Interspaved Short Palindromic Repeats- Cas) là phản ứng phân cắt phân tử nucleic acid dựa vào enzyme cắt RNAse hoặc DNAse thông qua trình tự đặc hiệu của phân tử guide RNA – gRNA hay CRISPR RNAs – crRNAs

Hình 1 4 Cấu trúc hệ thống CRISPR-Cas loại 1 (phức hợp tác động đa enzyme) và

loại 2 (phức hợp tác động đơn enzyme)

CRISPR-Cas thường được sử dụng rộng rãi như một công cụ chỉnh sửa gen,

ví dụ như CRISPR-Cas9, CRISPR-Cas12a, CRISPR-Cas12b Ngoài ứng dụng chỉnh sửa gen, kỹ thuật CRISPR-Cas hiện nay còn được ứng dụng để nhận diện đặc

hiệu trình tự đích sau khi trải qua bước khuếch đại Hầu hết các protein cas được cấu tạo bởi hai mô-đun chức năng chính: “adaptation module” (cung cấp vật liệu di truyền vào hệ thống CRISPR tạo ra crRNA) và “effector module” (được hướng dẫn bởi crRNA, nhắm mục tiêu và phân cắt axit nucleic đích) [28] Hầu hết adaptation module trong các hệ thống CRISPR-Cas bao gồm hai protein thiết yếu cas1 và cas2

13 Ngược lại, effector module cho thấy sự khác biệt rất lớn giữa các hệ thống CRISPR, từ đó tạo ra các đặc tính đa dạng giữa chúng và phân loại các hệ thống này thành lớp 1 hay lớp 2 (Hình 1 4)

Trong đó, cas12a thuộc hệ thống CRISPR-Cas lớp 2, nhóm V-B được xác

định từ vi khuẩn Lachnospiraceae ND2006, có hoạt tính cắt mạnh mẽ, thể duy trì

hoạt tính nuclease ổn định trong khoảng nhiệt độ từ 16oC đến 48oC [29] Theo đó, sự có mặt của crRNA sẽ dẫn enzyme cas đến kết hợp với đoạn DNA đích có chứa trình tự PAM phù hợp và trình tự liên kết bổ sung với vị trí protospacer trên crRNA (Hình 1 5)

Hình 1 5 Phức hợp DNA-crRNA-tracrRNA CrRNA và tracrRNA sau khi liên kết với DNA đích tại vị trí protospacer, chúng sẽ dẫn phức hợp enzyme cas đến và nhận biết và cắt đoạn DNA đích một cách đặc hiệu Trong đó DNA đích phải chứa một đầu PAM có trình tự là NGG (đối với SpCas9), ATTN (đối với BthCas12b), TTN (đối với cas12a và cas12b) (N có thể là A, T, G hoặc C)

Sau khi nhận diện thành công, chúng cắt phân tử DNA đích một cách đặc hiệu, từ đó tính chất exonuclease (clollateral activity hay còn được gọi là hoạt tính trans-cleavage) được đồng thời hoạt hoá, enzyme lộ ra một đầu cắt mạnh mẽ các

phân tử single strand DNA (ssDNA) có trong hỗn hợp phản ứng [30] Do đó xảy ra

hiện tượng phân rã các đầu dò gắn huỳnh quang (Fluorescent-quencher- probe), giải phóng tín hiệu huỳnh quang có thể ghi nhận được (Hình 1 6A) Trong thí nghiệm của Wang và cộng sự đã ghi nhận được đồng thời tín hiệu cắt đồng thời của hệ

14 thống này đối với dsDNA và ssDNA theo thời gian và khác biệt có ý nghĩa thống kê so với những phản ứng không có DNA đích (Hình 1 6B và Hình 1 6C) [20]

Hình 1 6 Hoạt tính trans-cleavage của hệ thống CRISPR-Cas (A) enzyme cas thể hiện hoạt tính trans-cleavage cắt các đoạn đầu dò gắn huỳnh quang (B) phản ứng CRISPR-Cas cắt đặc hiệu các DNA đích mạch đôi (target dsDNA) và các đoạn DNA mạch đơn (target ssDNA), tín hiệu cắt ở hai mẫu này khác biệt so với các phản ứng đối chứng âm ( no template control và non-target genome DNA) (C) Khảo sát đồng thời tín hiệu cắt các sản phẩm DNA đích mạch đôi (dsDNA) và DNA mạch đơn (ssDNA) trong phản ứng CRISPR-Cas theo thời gian[20]

Để các phương pháp sinh học phân tử được tiếp cận dễ dàng hơn, các nhà nghiên cứu đã phát triển một loại que đọc nhanh nhằm phát hiện sự có mặt của DNA mục tiêu trong phản ứng Khi đó, các ssDNA không phải là probe thông thường mà đầu quencher được thay bằng biotin và đầu gắn Fluorescent có thể gắn

15 FAM hoặc FITC Que thử sử dụng nguyên lý sắc ký ái lực, giúp phát hiện sản phẩm đích sau khuếch đại một cách gián tiếp Nhờ có sự phát triển này mà bước phiên giải kết quả sau phản ứng khuếch đại được rút ngắn thời gian hơn so với điện di và giảm chi phí cũng như dễ dàng hơn so với thiết bị đọc tín hiệu huỳnh quang

1.5 Biểu hiện, tinh sạch protein tái tổ hợp và ứng dụng trong phản ứng

khuếch đại đẳng nhiệt qua trung gian vòng lặp LAMP

1.5.1 Protein tái tổ hợp và ứng dụng của chúng

Protein tái tổ hợp là các protein được mã hóa bởi DNA tái tổ hợp Công nghệ DNA tái tổ hợp là kỹ thuật chuyển những đơn vị có chứa thông tin di truyền xác định từ sinh vật này chèn vào hệ gen của sinh vật khác và được biểu hiện tạo protein có cấu trúc và chức năng ản xuất protein tự nhiên bằng cách sử dụng các phương pháp công nghệ như tế bào tái tổ hợp Thay vì nhân bản và trích xuất protein từ nguồn tự nhiên, quá trình tái tổ hợp cho phép sản xuất các protein có cấu trúc và chức năng giống như protein tự nhiên, nhưng được sản xuất có mức độ tinh khiết cao hơn và có thể điều chỉnh được Các protein tái tổ hợp thường được sản xuất

bằng cách chèn gen mã hóa protein vào các tế bào nhân vật, như E.coli, và sau đó tế

bào này được nhân đôi để tạo ra số lượng lớn protein Sau đó, protein được chiết xuất và tinh lọc để loại bỏ các tạp chất Protein tái tổ hợp đã đem lại nhiều giá trị to lớn trong các lĩnh vực thực phẩm, sinh học, y học, dược học… Riêng trong lĩnh vực y học, protein tái tổ hợp có nhiều ứng dụng trong việc tạo kháng thể đơn dòng tái tổ hợp, sử dụng trong liệu pháp miễn dịch trong điều trị ung thư, sản xuất hormones tái tổ hợp, các cytokines và các thuốc hóa trị khác (Hình 1 7) Ngoài ra, các enzyme trong lĩnh vực sinh học phân tử cũng được sản xuất từ công nghệ protein tái tổ hợp này

1.5.2 Làm thế nào để sản xuất protein tái tổ hợp đạt chất lượng

Các bước chung để sản xuất một protein tái tổ hợp bao gồm: tối ưu lựa chọn gen, tổng hợp gen mã hóa protein mong muốn, biểu hiện protein, tinh sạch và đánh giá protein tái tổ hợp biểu hiện được Mã gen và điều kiện biểu hiện tối ưu được lựa chọn để mở rộng mô hình biểu hiện và thu một lượng lớn protein tái tổ hợp có độ tinh sạch cao (Hình 1 8)

17

Hình 1 8 Các bước sản xuất protein tái tổ hợp

Đầu tiên, cần xác định gen mã hóa protein cần sản xuất Gen này có thể được chiết xuất từ mô cơ thể tự nhiên hoặc được tạo ra trong phòng thí nghiệm thông qua các phương pháp như tổ hợp ngược (reverse engineering) hoặc tổ hợp gene (gene synthesis)

Sau khi có gen, cần chèn gen này vào một vectơ plasmid Việc này có thể được thực hiện thông qua các phương pháp như phương pháp cắt dính vectơ (ligation) hoặc phương pháp tái tổ hợp DNA (recombinant DNA techniques)

Chuyển gen vào tế bào chủ: Phản ứng polymerase chain reaction (PCR) hoặc chiêu X của tế bào (cell transformation) được sử dụng để chuyển gen đã được chèn vào vectơ plasmid vào tế bào chủ, thông thường là tế bào vi khuẩn như E coli

Biểu hiện protein: Sau khi được chuyển vào tế bào chủ, gen sẽ được tế bào chủ hiểu đọc và chuyển thành protein tương ứng Quá trình này có thể diễn ra tự nhiên hoặc được kích hoạt bằng cách thêm các yếu tố như promotor mạnh

Tinh sạch protein: Sau khi protein được biểu hiện, người ta sẽ tiến hành tinh sạch protein từ tế bào chủ Các phương pháp chiết xuất thường sử dụng bao gồm cấy lọc tế bào (cell filtration), lysozyme tế bào (cell lysis), kỹ thuật trầm kết protein (protein precipitation) và sắc ký cột (chromatography)

18 Nói chung để sản xuất protein tái tổ hợp đạt chất lượng cần trải qua rất nhiều công đoạn, phụ thuộc vào lựa chọn vật chủ và phương pháp tinh sạch phù hợp

1.5.3 Biểu hiện và tinh sạch protein tái tổ hợp Bst large fragment ứng

trong phản ứng khuếch đại đẳng nhiệt qua trung gian vòng lặp

1.5.3.1.Biểu hiện protein tái tổ hợp Bst large fragment ứng trong phản ứng

khuếch đại đẳng nhiệt qua trung gian vòng lặp

Protein tái tổ hợp có tính ứng dụng cao trong các phản ứng sinh học phân tử Phổ biến nhất là enzyme khuếch đại kéo dài chuỗi DNA Polymerase trong các phản PCR và Realtime PCR Enzyme đầu tiên có ứng dụng to lớn nhất là Taq DNA Polymerase được phân lập đầu tiên từ vi khuẩn ưa nhiệt Thermus Aquas (Taq) [31] Taq DNA Polymerase có đặc tính chịu được nhiệt độ cao phù hợp với đặc tính của phản ứng PCR/ realtime PCR Tuy nhiên, như thế là không đủ, công nghệ protein đã phát triển thêm rất nhiều biến thể với các đặc tính khác nhau, mở rộng thêm nhiều ứng dụng của loại enzyme này Điển hình như biến thể Phusion® và Q5® có thêm hoạt tính chỉnh sửa lỗi ghép cặp 3′-5′ (3′-5′ proofreading exonuclease activity) mà Taq DNA polymerase không có Hoạt tính này giúp cải thiện độ chính xác của quá trình khuếch đại Theo đó, tỷ lệ lỗi của Q5 polymerase là 5,3 × 10-7 cải thiện gấp 100 lần so với Platinum Taq là 2,28 × 10-5 [32, 33] Tương tự như vậy, đối với các phản ứng khuếch đại đẳng nhiệt cũng có nhiều enzyme và biến thển của chúng được phân lập hoặc được tạo ra nhờ công nghệ ptotein tái tổ hợp

Trong phản ứng LAMP, enzyme Bst DNA Polymerase đóng vai trò rất quan

trọng Bst DNA Polymerase được phân lập lần đầu tiên từ chủng Bacillus

stearothermophilus Loại enzyme này có đặc tính chịu nhiệt, hoạt động DNA

polymerase loại dịch chuyển sợi, chúng tổng hợp một sợi DNA mới trong khi tự phân tách liên kết hydro của DNA mẫu sợi kép Do đó, DNA có thể được tổng hợp ở nhiệt độ không đổi và quá trình tổng hợp không bị ức chế bởi cấu trúc thứ cấp của

DNA[34] Một trong những biến thể của enzyme này là Bst Polymerase Large Fragment, là một phần của protein Bacillus stearothermophilus DNA Polymerase,

chúng thiếu miền 5´ → 3´ exonuclease, giúp tập trung cao độ hoạt tính dịch chuyển

19 sợi 5´ → 3´ polymerase của enzyme [35] Điều này giúp cải thiện năng suất dịch chuyển sợi của enzyme hơn phiên bản cũ Sau này có thêm nhiều nghiên cứu tạo ra một số biến chủng mới giúp cải thiện chức năng, mới đây nhất là biến thể enzyme

Bst 3.0 có thêm hoạt tính phiên mã ngược, đang được thương mại hoá [36, 37]

Trong nghiên cứu này, hoạt tính 5´ → 3´ polymerase của enzyme khuếch đại

đẳng nhiệt được quan tâm hơn cả trên đối tượng đích là DNA Đây là lý do enzyme

Bst Large Fragment tái tổ hợp được lựa chọn nghiên cứu sản xuất Nghiên cứu lựa

chọn biểu hiện enzyme này từ plasmid pET15b_BstLF_6XHis, chứa trình tự mã hoá cho enzyme Bst Large Fragment, được gửi tặng từ nhóm nghiên cứu thuộc Đại học Stanford, California Đồng thời, Escherichia coli (E.coli) là vật chủ cho mô hình biểu hiện enzyme tái tổ hợp này E coli là vi khuẩn gram âm, hiếu kỵ khí tuỳ tiện,

có khả năng sinh trưởng phát triển nhanh (thời gian thế hệ khoảng 20 phút) và nhu cầu dinh dưỡng đơn giản Vật chủ biểu hiện này có nhiều ưu điểm nổi bật như: thao tác gen đơn giản, hiệu suất biểu hiện cao, có thể đạt 50% tổng protein tế bào sau vài giờ cảm ứng, có thể lên men mật độ cao, môi trường nuôi cấy rẻ tiền và hệ thống máy móc, trang thiết bị đơn giản Ban đầu hệ thống này có nhược điểm là đa số protein tái tổ hợp được tạo ra ở dạng thể vùi và dễ bị tấn công bởi protease, dẫn đến khó thu nhận protein và hiệu suất không cao Tuy nhiên, nhược điểm này có thể

được khắc phục bằng cách sử dụng chủng E.coli đột biến BL21 không có protease

E.coli BL21 [F-, ompT, hsdS (rB-, mB-), gal] là chủng vi khuẩn thuộc nhóm B, đã

biến đổi thiếu Lon và OmpT, giúp tránh thoái hoá các protein tái tổ hợp do protease

Ngoài ra,sự kết hợp với prophage DE3 vào bộ gen của BL21 [F-, ompT, hsdSB

(rB-, mB-)(rB-, gal(rB-, dcm(DE3)] tạo ra hế thống biểu hiện T7 dưới sự điều khiển của promotor lacUV5 [38] DNA bộ gen của chủng này chứa gen T7 mã hoá cho enzyme T7 RNA Polymerase, hoạt động dưới sự điều khiển của operon lac Bình thường, lac repressor do gen lacI tổng hợp sẽ bám vào vùng lac operator, ngăn không phiên mã T7 (Hình 1 9) Khi có mặt của chất cảm ứng IPTG (Isopropyl β-D-

1-thiogalactopyranoside) – một đồng phân của lactose, lac repressor sẽ kết hợp với

chất này, từ đó loại bỏ sự ức chế của lacI, kích hoạt phiên mã T7 và tạo ra enzyme

T7 RNA Polymerase [39] Hệ thống này thường được dùng trong biểu hiện protein

20 có gắn thẻ His-tag trong vector biểu hiện pET Theo đó, trình tự mã hoá cho protein

mục tiêu được đưa vào vector pET dưới sự kiểm soát của promotor T7 Do vậy, khi

cảm ứng tạo ra T7 RNA Polymerase trong tế bào vật chủ, gen mục tiêu sẽ được kích hoạt phiên mã và cuối cùng tạo ra số lượng lớn protein (Hình 1 9)

Hình 1 9 Hệ thống T7 promoter biểu hiện protein từ plasmid pET [39]

Bên cạnh đó, có một trình tự Lac operator (LacO) ngay sau T7 promoter thường xuyên bị tác động bởi lac repressor (LacI), giúp kiểm soát chặt chẽ quá trình

biểu hiện gen Chủng chủ E.coli BL21 (DE3) có thể được thiết kế chứa thêm plasmid pLysS giúp tế bào chủ tổng hợp được một lượng nhỏ T7 Lysozyme có vai trò làm bất hoạt T7 RNA Polymerase [39] Nhờ vậy, chủng chủ này sẽ hạn chế được tối đa sự tổng hợp protein từ hệ thống vector biểu hiện pET khi không có mặt chất cảm ứng, giúp tăng tối đa hiệu suất biểu hiện

1.5.3.2.Tinh sạch protein tái tổ hợp Bst large fragment bằng hệ thống sắc ký

ái lực ion kim loại

Kết thúc quá trình biểu hiện, hỗn hợp protein thu được bao gồm lượng lớn protein mục tiêu và cả những protein tạp khác của tế bào vật chủ Vì vậy, hỗn hợp

21 protein này cần được tiến hành sạch để phân tách protein mục tiêu khỏi môi trường tạp nhiễm Trong nhiều phương pháp tinh sạch protein khác nhau, sắc ký ái lực ion kim loại (immobilized metal affinity chromatography - IMAC) là phương pháp được sử dụng phổ biến nhất hiện nay Phương pháp này được phát triển lần đầu tiên vào năm 1975 bởi Porath và cộng sự [40]

Sắc ký ái lực kim loại (immobilized metal affinity chromatography - IMAC) là phương pháp tinh sạch chọn lọc các đại phân tử như polypeptide, protein, DNA,… Ưu điểm của IMAC là khả năng thực hiện phân tách ở nồng độ muối cao và hằng số liên kết tương đối cao của các kim loại với phối tử Ion kim loại được cố định trên bề mặt , chúng tương tác với cặp electron duy nhất của Ni-tơ hoặc Oxy của chuỗi bên acid amin (Hình 1 10a) Qua nhiều nghiên cứu nhận thấy rằng các ion kim loại chuyển tiếp như Cu2+, Ni2+ và Zn2+ ưu tiên liên kết với các chuỗi bên chứa Ni-tơ hơn và đã được ứng dụng trong IMAC để liên kết vòng imidazole của gốc histidine trong peptide và protein [41] Mặt khác, các ion kim loại như Fe3+ và Al3+ lại liên kết với các nhóm giàu oxy hơn như nhóm cacboxyl của axit aspartic và axit glutamic hoặc oxy của nhóm phosphate

Hệ thống vector biểu hiện pET cho phép biểu hiện protein dung hợp với một đoạn poly-histidine Vector này chứa đoạn gen mã hoá cho histidine được gọi là thẻ His (His-tag) Đoạn này có thể chứa 6, 8 hoặc 10 thẻ His Tuỳ theo plasmid và protein tái tổ hợp mà His-tag có thể dung hợp ở đầu N hoặc đầu C hoặc ở giữa protein Bằng cách này, protein tái tổ hợp có thể thu hồi với độ sạch trên 90% khi sử dụng sắc ký ái lực kim loại Ni2+-nitrilotriacetic acid (Ni-NTA) Bản chất của phương pháp này là nhờ ái lực mạnh của histidine với Ni2+ gắn trên cột sắc ký, các protein tạp khác không có đuôi histidine sẽ bị rửa trôi trong quá trình tinh sạch Cuối cùng protein tái tổ hợp được thu hồi dựa trên sự thay đổi pH hoặc bổ sung nồng độ cao các gốc cạnh tranh như imidazole [42, 43]

22

Hình 1 10 Sơ đồ minh hoạ IMAC [42] (a) Trung tâm hấp phụ Ni2+ - IDA và Ni2+ - NTA tương tác với thẻ histidine của protein Các phần tử imidazole của gốc histidine được thể hiện trong miền xoắn ốc tiếp xúc của protein (b) Tinh chế protein bằng IMAC Các protein tái tổ hợp chứa thẻ 6x Histidine (H6) liên kết với Ni2+ được rửa giải bởi liên kết cạnh tranh của imidazole

Histidine trong thẻ His-tag của protein đích đóng vai trò như một chất cho điện tử, và bị giữ lại bởi các ion kim loại là chất nhận điện tử Trong quá trình chạy sắc ký, các protein khác của tế bào vật chủ không có histidine sẽ không bám lên cột Một số chất có histidine hoặc cysteine ít sẽ bị rửa trôi khi bổ sung nồng độ thấp chất cạnh tranh imidazole Imidazole là một chất cho điện tử mạnh, có khả năng tạo thành liên kết cộng hoá trị với Ni2+ Do đó, nồng độ cao của imidazole trong đệm rửa giải sẽ cạnh tranh với thẻ His-tag để đẩy protein tái tổ hợp qua cột (Hình 1 10b) Dung dịch cuối cùng thu được chứa protein đích đã loại sạch các protein tạp của tế bào vật chủ

23

1.6 Tình hình nghiên cứu kết hợp LAMP và CRISPR-Cas trong phát hiện

Neisseria meningitidis

Phương pháp khuếch đại đẳng nhiệt LAMP đã được ứng dụng trong nhiều

nghiên cứu nhằm phát hiện Neisseria meningitidis Một báo cáo phân tích tổng hợp

[44] chỉ ra rằng LAMP có thể chẩn đoán não mô cầu với độ nhạy cao 94% Trong nghiên cứu của DoKyung Lee và cộng sự đã đánh giá giá trị lâm sàng khi ứng dụng

của phương pháp LAMP phát hiện Neisseria meningitidis trên mẫu bệnh phẩm dịch

não tủy, nghiên cứu chỉ ra rằng so với phương pháp PCR, LAMP có độ nhạy và độ đặc hiệu lần lượt là 100% và 99,6% [45] Với những ưu điểm như rẻ tiền, dễ tiếp cận, dễ triển khai tại các khu vực hạn chế trang thiết bị, LAMP là một công cụ chẩn đoán giàu tiềm năng

Nhiều báo cáo cũng đã đề cập đến các trường hợp dương tính giả và ô nhiễm sản phẩm phản ứng của LAMP [46, 47] Các chiến lược được đưa ra để tăng độ đặc hiệu của phản ứng LAMP như sử dụng thêm một đầu dò phát hiện trên máy huỳnh quang [48], hay sử dụng bộ mồi có gắn huỳnh quang [49],… Hay như báo cáo của nhóm nghiên cứu trước đó về việc kết hợp CRISPR-Cas12a có thể giảm tỷ lệ dương tính giả ở những phản ứng khuếch đại đẳng nhiệt LAMP [50]

Tuy nhiên, phương pháp đọc kết quả vẫn chưa thực sự thân thiện với người dùng Thông thường, sản phẩm sau khuếch đại LAMP có thể được thể hiện trên hình ảnh điện di nhuộm Ethidium bromide độc hại, có thể gây ung thư ngay cả khi tiếp xúc qua da; hoặc phương pháp nhuộm SYBR Green I, xen vào các DNA sợi đôi và chuyển màu xanh, nhưng sự chuyển màu không mạnh mẽ đôi khi gây hiểu nhầm, khó nhận định kết quả [51]; hoặc sử dụng thuốc nhuộm hydroxynaphthol blue, dựa vào sự thay đổi nồng độ Mg2+ trong phản ứng, trong khi đó nồng độ Mg2+ tối ưu trong phản ứng không phải lúc nào cũng phù hợp [52] Như trong nghiên cứu trước đó, CRISPR-Cas12a được kết hợp cùng với LAMP để giảm tỷ lệ dương tính giả, thế nhưng đọc kết quả vẫn phải thông qua máy đọc huỳnh quang tức thời (hay hệ thống Realtime PCR)

24 Những tiếp cận mới thân thiện hơn trong việc đọc kết quả trực tiếp bằng que thử nhanh đã, đang được phát triển Như trong nghiên cứu của Julia joung và cộng sự đã kết hợp LAMP-CRISPR/Cas trong phát triển bộ thử nhanh phát hiện vi-rút SARS-CoV2 [53] Hoặc trong nghiên cứu của Huaming Xu và cộng sự đã chứng minh lợi ích của việc đọc kết quả LAMP-CRISPR bằng que thử nhanh [54] Tuy nhiên chưa có nghiên cứu nào trên thế giới cũng như trong nước thực hiện LAMP

kết hợp CRISPR-Cas và đọc kết quả bằng que thử nhanh để phát hiện N

meningitidis Thực tế, cũng chưa có một kit thử nhanh thương mại nào trên thế giới

giúp triển khai phát hiện sàng lọc N meningitidis Trong khi đó, chẩn đoán các bệnh

lý cấp tính, đặc biệt là bệnh tối nguy hiểm không chỉ yêu cầu tính chính xác mà cần đòi hỏi thời gian nhanh, có thể thực hiện trong điều kiện thiếu thốn vật chất và hạ tầng, đặc biệt cần thiết trong kiểm soát bệnh tại hiện trường, tránh lây lan thành dịch

Plasmid pET15b_BstLF_6XHis, chứa trình tự mã hoá cho enzyme Bst

Large Fragment, được gửi tặng từ nhóm nghiên cứu thuộc Đại học Stanford, California Tế bào khả biến BL21 Star™ (DE3)pLysS One Shot™ Chemically

Competent E coli (#C602003, Invitrogen);

Enzyme thương mại EnGen® Lba Cas12a (Cpf1) (#M0653T, NEB, Ipswich, MA, USA), bộ mồi, đoạn đầu dò dùng trong phản ứng LAMP và CRISPR được tổng hợp bởi Integrated DNA Technologies (IDT, Coralville, IA, USA), các hoá chất khác từ Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)

Kit thương mại realtime PCR phát hiện não mô cầu BactoReal® Kit

Neisseria meningitidis (IVD) (ingenetix GmbH, Austria) có chứng chỉ CE-IVD

Các chủng chuẩn tham chiếu và chủng đối chứng lâm sàng được sử dụng để

đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu bao gồm: N meningitidis nhóm B (MC58, #ATCC

BAA-335); N meningitidis serogroup C (M1628, #ATCC 13102); W135 (M-1574,

#ATCC 43744); N gonorrhoeae (F-18, #ATTC 49226); Escherichia coli DH5α

(#18258012, Thermo Fisher Scientific Inc), nhận từ Trung tâm Tài nguyên Sinh học

toàn cầu (ATCC) Que test nhanh (PCRD – Abingdon health)

2.1.2 Đối tượng nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng DNA tách chiết thu thập từ mẫu bệnh phẩm của 139 bệnh

nhân nghi ngờ nhiễm Neisseria meningitidis, được thu thập theo tiêu chuẩn sau:

+ Tiêu chuẩn lựa chọn: Bệnh nhân nghi ngờ nhiễm khuẩn huyết và/hoặc viêm màng não mủ hoặc người có các tiếp xúc gần với bệnh nhân đã được chẩn đoán

26 nhiễm não mô cầu

+ Loại bệnh phẩm: dịch quệt nhày họng, máu hoặc dịch não tuỷ (theo chỉ định của bác sĩ)

+ Thời điểm lấy mẫu: Ngay khi bệnh nhân vào viện, tốt nhất trước thời điểm dùng kháng sinh

+ Địa điểm lấy mẫu: tại Bệnh viện Trung ương Quân đội 108 hoặc nơi sinh sống

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp, thời gian, địa điểm thực hiện nghiên cứu

Phương pháp nghiên cứu: mô tả cắt ngang Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 10/2022 đến tháng 09/2023 Địa điểm thực hiện: Trung tâm Nghiên cứu Y học Việt Đức, bệnh viện Trung ương Quân đội 108

2.2.2 Các bước tiến hành nghiên cứu

Các bước tiến hành nghiên cứu đợc khái quát trong sơ đồ nghiên cứu dưới đây:

Hình 2 1 Sơ đồ nghiên cứu

27

2.2.3 Thiết kế mồi/probe/gRNA cho phản ứng LAMP/ CRISPR-Cas

Trước hết nghiên cứu lựa chọn vùng bảo thủ là vùng gen mã hoá protein

vận chuyển màng ctrA để thiết kế mồi khuếch đại cho cả 5 chủng phổ biến Nghiên

cứu đã lựa chọn một số bộ mồi theo chỉnh sửa tối ưu của phần mềm

PrimerExplorerV5 dựa trên xem xét một số yếu tố quan trọng được miêu tả sau đây:

• Nhiệt độ nóng chảy (Tm) nên nằm trong khoảng (64 - 66°C) cho mỗi vùng F1c và B1c, khoảng 60oC (59 - 61°C) cho mỗi vùng F2, B2, F3, B3 và khoảng 65°C (64 - 66°C) cho mỗi mồi LF, LB

• Độ ổn định ở cuối mỗi mồi (đầu 3’) đóng vai trò là điểm bắt đầu của quá trình khuếch đại và do đó phải có mức độ ổn định cao Cụ thể đầu 3’ của mỗi F2/B2, F3/B3 và LF/LB và đầu 5’ của F1c/B1c được thiết kế sao cho năng lượng tự do (∆G) ≤ – 4 kcal/mol

• %GC ở mỗi mồi nên nằm trong khoảng từ 40 – 65% • Các mồi được thiết kế sao cho chúng không tạo thành cấu trúc thứ cấp Để ngăn chặn sự hình thành các dime mồi, điều quan trọng là phải đảm bảo rằng các đầu 3’ không bổ sung cho nhau

• Mồi LAMP cũng yêu cầu khoảng cách giữa các vùng được thiết kế sao cho khoảng cách từ cuối F2 đến hết B2 (vùng khuếch đại bằng phương pháp LAMP) nằm trong khoảng 120 bp và 160 bp Các đoạn mồi cũng được thiết kế sao cho khoảng cách từ đầu 5’ của F2 đến đầu 5’ của F1 (phần tạo thành vòng lặp) nằm trong khoảng từ 40 bp đến 60 bp Các đoạn mồi cũng được thiết kế sao cho khoảng cách giữa F2 và F3 nằm trong khoảng từ 0 đến 60 bp

Các trình tự mồi đều được kiểm tra lại bằng công cụ Blast nucleotide để

kiểm tra sự bắt cặp chéo với các chủng khác N meningitidis kết quả cho thấy các trình tự hoàn toàn đặc hiệu với N meningitidis và không bị bắt chéo không đặc hiệu

với các chủng khác

Về thiết kế gRNA cho phản ứng CRISPR-Cas, nhóm nghiên cứu sau khi tham khảo các tài liệu công bố về cấu trúc gRNA của LbCas12a nhận thấy, gRNA

28 của LbCas12a chỉ gồm 2 phần crRNA đặc hiệu cho hệ thống cắt LbCas12a và protospacer đặc hiệu cho não mô cầu Ngoài ra, vùng trình tự protospacer cần đặt sau vùng đặc hiệu PAM 5’ TTN-3’ để tương thích với hệ thống cắt LbCas12a Nghiên cứu lựa chọn vùng protospacer nằm giữa phân vùng thiết kế mồi của F1 và B1 Như vậy, gRNA thiết kế có độ dài khoảng 40 đến 44 bp chỉ chứa các ribonucleotide A, U, G, C

2.2.4 Tách chiết DNA chứng dương và DNA mẫu bệnh phẩm

200 μL mẫu bệnh phẩm/ dịch nuôi chứa chủng não mô cầu được phá tế bào bằng cách bổ sung 200 μL (200mM NaOH + 2% SDS), ủ 95oC trong 10m Sau đó thêm 250 μL Tris-HCl Ph 4,2 Tiếp theo bổ sung 400 μL 25:24:1 (Phenol:Cloroform:isoamyl alcohol) Ly tâm 13.200 rpm/20m/4oC Lúc này hỗn hợp chia làm 2 pha Hút lấy pha trên chuyển sang ống Eppendorf mới Bổ sung thêm isopropanol 1:1 Ly tâm 13.200 rpm/30m/4oC Loại dịch và rửa với 700 μL Ethanol 70% Làm khô cồn, sau đó hoàn nguyên bằng 50 μL TE1X Sản phẩm DNA sau tách chiết được đo hàm lượng và độ tinh sạch bằng máy đo quang NanoPhotometer® P 300 khảo sát các chỉ số nồng độ DNA; A260/280 và A260/230

2.2.5 Thiết lập dải nồng độ chuẩn dương

Tách chiết DNA từ khuẩn lạc nuôi cấy chủng chuẩn N meningitidis tuýp B

mã MC58 Sau đó được pha loãng thành các nồng độ thấp bao gồm 100; 101; 102; 103 bản sao/phản ứng Các mẫu chuẩn được liệt kê trong bảng sau:

29 + Panel chuẩn dương được sử dụng để tối ưu trong quá trình thiết lập phương pháp LAMP kết hợp CRISPR-Cas phát hiện não mô cầu

2.2.6 Biểu hiện và tinh sạch enzyme Bst Large Fragment tái tổ hợp

Enzyme Bst Large Fragment là một trong những biến thể tái tổ hợp của Bst

DNA Polymerase (enzyme thiết yếu cho phản ứng khuếch đại đẳng nhiệt LAMP) Nhằm tự chủ nguồn enzyme, nghiên cứu thực hiện biểu hiện và tinh sạch enzyme

tái tổ hợp này Quy trình biểu hiện và tinh sạch enzyme tái tổ hợp Bst Large

Fragment được tiến hành như sau :

- Plasmid pET15b_BstLF_6XHis (Stanford, California), mang trình tự gen mã hóa protein Bst Large Fragment được biến nạp vào tế bào E coli BL21(DE3)pLysS

(Invitrogen) - Khuẩn lạc thuần sau biến nạp được tăng sinh trong 5 mL môi trường LB (1% peptone, 1% NaCl, 0,5% cao nấm men, pH 7,0 – 7,5) có bổ sung 100mg/mL kháng sinh ampicillin ở 37oC trong 8 – 12 giờ, lắc 160 vòng/phút

- Sau đó, tiếp tục tăng sinh trong 500 mL môi trường LB có bổ sung ampicillin, nuôi ở 37oC , lắc 160 vòng/phút cho đến khi OD600 đạt 0,6 – 0,8 Tế

bào được cảm ứng biểu hiện enzyme BstLF bằng 0,5 – 1,5 mM IPTG ở 37oC trong 3 - 7 giờ, lắc 160 vòng/phút

- Ly tâm 4000xg trong 10 phút ở 4oC thu sinh khối Cặn tế bào được ly giải bởi dịch ly giải – Lysis buffer (50mM Tris-HCl pH7,5, 300mM NaCl, 5mM Imidazole, 0,5% TritonX, 1mM DTT, 0,1mM EDTA, 10% Glycerol), đảo trộn đều

- Phá tế bào bằng siêu âm theo chương trình 4ON-4OFF, Amplitude 40% trong 10 phút ở trên đá lạnh Thu hồi protein tại pha lỏng bằng ly tâm với tốc độ tối đa (15.000xg) trong 45 phút tại 4oC (dịch thu hồi lysate)

- Protein thu được trong dịch ly giải được tinh sạch theo phương pháp ái lực ion bằng Ni-NTA Resin (Thermo Scientific, USA) Hạt Ni-NTA Resin được chuyển vào ống eppendorf, sau đó ly tâm 500xg trong 2 phút, loại bỏ cồn Hạt Ni-NTA được cân bằng bởi đệm cân bằng (50mM Tris-HCl pH7,5, 300mM NaCl,