Nghiên cứu hình thái phôi sau sinh thiết và bất thường nhiễm sắc thể của phôi thụ tinh trong ống nghiệm

Nghiên cứu hình thái phôi sau sinh thiết và bất thường nhiễm sắc thể của phôi thụ tinh trong ống nghiệmNghiên cứu hình thái phôi sau sinh thiết và bất thường nhiễm sắc thể của phôi thụ tinh trong ống nghiệmNghiên cứu hình thái phôi sau sinh thiết và bất thường nhiễm sắc thể của phôi thụ tinh trong ống nghiệmNghiên cứu hình thái phôi sau sinh thiết và bất thường nhiễm sắc thể của phôi thụ tinh trong ống nghiệmNghiên cứu hình thái phôi sau sinh thiết và bất thường nhiễm sắc thể của phôi thụ tinh trong ống nghiệmNghiên cứu hình thái phôi sau sinh thiết và bất thường nhiễm sắc thể của phôi thụ tinh trong ống nghiệmNghiên cứu hình thái phôi sau sinh thiết và bất thường nhiễm sắc thể của phôi thụ tinh trong ống nghiệmNghiên cứu hình thái phôi sau sinh thiết và bất thường nhiễm sắc thể của phôi thụ tinh trong ống nghiệmNghiên cứu hình thái phôi sau sinh thiết và bất thường nhiễm sắc thể của phôi thụ tinh trong ống nghiệmNghiên cứu hình thái phôi sau sinh thiết và bất thường nhiễm sắc thể của phôi thụ tinh trong ống nghiệmNghiên cứu hình thái phôi sau sinh thiết và bất thường nhiễm sắc thể của phôi thụ tinh trong ống nghiệmNghiên cứu hình thái phôi sau sinh thiết và bất thường nhiễm sắc thể của phôi thụ tinh trong ống nghiệmNghiên cứu hình thái phôi sau sinh thiết và bất thường nhiễm sắc thể của phôi thụ tinh trong ống nghiệmNghiên cứu hình thái phôi sau sinh thiết và bất thường nhiễm sắc thể của phôi thụ tinh trong ống nghiệmNghiên cứu hình thái phôi sau sinh thiết và bất thường nhiễm sắc thể của phôi thụ tinh trong ống nghiệmNghiên cứu hình thái phôi sau sinh thiết và bất thường nhiễm sắc thể của phôi thụ tinh trong ống nghiệmNghiên cứu hình thái phôi sau sinh thiết và bất thường nhiễm sắc thể của phôi thụ tinh trong ống nghiệmNghiên cứu hình thái phôi sau sinh thiết và bất thường nhiễm sắc thể của phôi thụ tinh trong ống nghiệmNghiên cứu hình thái phôi sau sinh thiết và bất thường nhiễm sắc thể của phôi thụ tinh trong ống nghiệmNghiên cứu hình thái phôi sau sinh thiết và bất thường nhiễm sắc thể của phôi thụ tinh trong ống nghiệmNghiên cứu hình thái phôi sau sinh thiết và bất thường nhiễm sắc thể của phôi thụ tinh trong ống nghiệmNghiên cứu hình thái phôi sau sinh thiết và bất thường nhiễm sắc thể của phôi thụ tinh trong ống nghiệmNghiên cứu hình thái phôi sau sinh thiết và bất thường nhiễm sắc thể của phôi thụ tinh trong ống nghiệmNghiên cứu hình thái phôi sau sinh thiết và bất thường nhiễm sắc thể của phôi thụ tinh trong ống nghiệmNghiên cứu hình thái phôi sau sinh thiết và bất thường nhiễm sắc thể của phôi thụ tinh trong ống nghiệmNghiên cứu hình thái phôi sau sinh thiết và bất thường nhiễm sắc thể của phôi thụ tinh trong ống nghiệmNghiên cứu hình thái phôi sau sinh thiết và bất thường nhiễm sắc thể của phôi thụ tinh trong ống nghiệmNghiên cứu hình thái phôi sau sinh thiết và bất thường nhiễm sắc thể của phôi thụ tinh trong ống nghiệm

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là phôi nang của 186 cặp vợ chồng có chỉ định điều trị thụ tinh trong ống nghiệm kết hợp xét nghiệm di truyền trước làm tổ (IVF-PGT-A) Phôi được chia thành 3 nhóm theo tuổi của người mẹ:

- Nhóm I: Phôi của bệnh nhân < 30 tuổi

- Nhóm II: Phôi của bệnh nhân từ 30 - 35 tuổi

- Nhóm III: Phôi của bệnh nhân > 35 tuổi

* Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân

Bệnh nhân được lựa chọn vào nghiên cứu là những bệnh nhân đủ sức khỏe để điều trị IVF, nhưng có nguy cơ cao tạo phôi mang bất thường NST, có ít nhất một trong các yếu tố sau:

- Có tiền sử sảy thai, thai lưu liên tiếp (từ 2 lần trở lên)

- Có tiền sử thất bại làm tổ nhiều lần (từ 2 lần trở lên với phôi chuyển là phôi chất lượng trung bình hoặc phôi tốt)

- Có tiền sử phải đình chỉ thai do thai dị tật

- Bệnh nhân không có tiền sử thai sản bất thường nhưng tuổi cao (từ 35 trở lên)

- Chồng thiểu năng tinh trùng mức độ nặng hoặc tinh trùng phải thu từ mào tinh, tinh hoàn

* Tiêu chuẩn lựa chọn phôi nang

- Phôi nang độ 3 trở lên, có nụ phôi theo phân loại của đồng thuận Istanbul, 2011 (tương ứng với phôi độ IV trở lên theo mô tả phân loại hình thái phôi nang của tác giả William B S và David K G., 1999 [40])

- Phôi nang ngày 5 hoặc ngày 6

- Bệnh nhân mắc các bệnh lý đơn gen

- Bệnh nhân mắc các bệnh lý tại tử cung (polyp buồng tử cung, dính buồng tử cung, quá sản niêm mạc tử cung, nhân xơ tử cung…)

- Các phôi nang không có nụ phôi hoặc các phôi nang phát triển quá chậm (phôi nang ngày 7).

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu theo phương pháp mô tả tiến cứu

* Cỡ mẫu nghiên cứu Áp dụng phương pháp tiến cứu mô tả, sử dụng công thức tính cỡ mẫu: n = Z !"# $ $ % p (1 − p) d $ Trong đó: n: Cỡ mẫu tối thiểu cần thiết, đủ lớn và đủ độ tin cậy p: Tỉ lệ phôi lệch bội nhiễm sắc thể Trong nghiên cứu này chúng tôi chọn p = 51,3% = 0,513 (theo tỉ lệ phôi lệch bội trong nghiên cứu của tác giả Schoolcraft W B và CS năm 2010 [58]) d: Sai số tuyệt đối cho phép, chúng tôi chọn d = 0,04

Z 1-a/2: Hệ số giới hạn tin cậy, với ngưỡng xác suất a = 0,05 thì Z1- a/2 = 1,96

Thay số vào công thức trên, tính được n = 600

Như vậy, theo lý thuyết số phôi tối thiểu cần cho nghiên cứu là 600 phôi Trên thực tế, chúng tôi chọn 623 phôi của 186 bệnh nhân để tiến hành nghiên cứu

2.2.3 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Nghiên cứu được tiến hành trong thời gian từ tháng 10 năm 2017 đến tháng 01 năm 2021 tại Viện Mô phôi lâm sàng Quân đội, Học viện Quân y

2.2.4 Quy trình tiến hành, thu thập số liệu

Bệnh nhân được lựa chọn vào nghiên cứu cùng những phôi đạt tiêu chuẩn lựa chọn sẽ được thực hiện theo quy trình sau:

Bệnh nhân trước khi được tư vấn điều trị, sẽ được khám phụ khoa, siêu âm kiểm tra đánh giá tử cung, phần phụ bằng đầu dò siêu âm đường âm đạo

2.2.4.2 Xét nghiệm nội tiết sinh sản cơ bản vào ngày 2 của chu kỳ kinh

Các chỉ số nội tiết bao gồm: FSH (Follicle Stimulating Hormone), E2 (Estradiol), LH (Luteinizing hormone), P4 (Progesterone), PRL (Prolactin), AMH (Anti-mullerian hormon)

Kích thích buồng trứng bằng phác đồ antagonist Sử dụng GnRH antagonist phối hợp với FSH kích thích nang noãn có thể tránh được hiện tượng hoàng thể hóa sớm mà không cần ức chế tuyến yên từ đầu chu kỳ

Buồng trứng được kích thích từ đầu chu kỳ (ngày 2 hoặc ngày 3 chu kỳ kinh) bằng FSH Thuốc kích thích buồng trứng tiêm trong khoảng 8 - 12 ngày

GnRH antagonist sẽ được tiêm từ ngày 6 FSH hoặc khi siêu âm thấy có nang noãn kích thước đạt từ 14mm trở lên để ngăn sự xuất hiện của đỉnh LH nội sinh [74] Siêu âm theo dõi nang noãn trong suốt quá trình sử dụng thuốc Kể từ ngày tiêm mũi kích thích buồng trứng đầu tiên, thông thường tiến hành siêu âm lại cho bệnh nhân vào ngày thứ 6 tiêm thuốc, sau đó siêu âm kiểm tra cách ngày cho tới khi trên siêu âm buồng trứng thấy có hình ảnh nang noãn kích thước > 18mm hoặc > 3 nang kích thước 17mm thì tiêm mũi kích thích trưởng thành noãn Chọc hút noãn sau tiêm mũi kích thích trưởng thành noãn 34 - 36 giờ [74], [75]

Bệnh nhân được gây mê trong quá trình chọc hút noãn Chọc hút noãn tiến hành dưới hướng dẫn của siêu âm đầu dò âm đạo Dịch nang noãn hút ra được soi dưới kính hiển vi soi nổi để tìm noãn Noãn thu được sẽ được ủ ấm trong môi trường 5% CO2, 37 0 C khoảng 3 giờ trước khi tiêm ICSI [76]

2.2.4.5 Tiêm tinh trùng vào bào tương noãn (ICSI)

ICSI (Intracytoplasmic Sperm Injection): Kỹ thuật ICSI được thực hiện trên đĩa nhiệt của kính hiển vi đảo ngược Nikon TE2000, độ phóng đại 200 lần có gắn bộ vi thao tác Noãn thu từ bệnh nhân được cho vào các giọt môi trường G-IVF plus (Vitrolife) ở ngoại vi của đĩa petri đường kính 30mm đã được phủ dầu Ovoil Sử dụng thể tớch khoảng 1 - 1,5àl dung dịch G-IVF plus có chứa các tế bào tinh trùng đã được lọc rửa cho vào giọt dầu PVP đặt tại trung tâm đĩa petri, mục đích để làm cho tế bào tinh trùng bơi chậm lại, dễ dàng cho kim tiêm siết đuôi bất hoạt tinh trùng Noãn được xoay sao cho thể cực ở vị trí 6 giờ hoặc 12 giờ rồi cố định bằng kim giữ tại điểm 9 giờ Tinh trùng được hút vào kim tiêm và tiêm tinh trùng vào trong bào tương của noãn tại điểm 3 giờ

Sau 16 - 18 giờ thực hiện kỹ thuật ICSI, noãn được đánh giá thụ tinh Đánh giá thụ tinh bình thường khi thấy hợp tử có hai tiền nhân Ảnh 2.1 Hợp tử có 2 tiền nhân của bệnh nhân N T L

(kính hiển vi đảo ngược x 200) 1-Màng trong suốt 2-Tiền nhân 3-Thể cực

* Nguồn: Bệnh nhân nghiên cứu tại Viện Mô phôi lâm sàng Quân đội

Nếu kiểm tra thụ tinh sớm hơn thời điểm trên, 2 tiền nhân có thể chưa xuất hiện, có thể chỉ thấy 1 tiền nhân Nếu kiểm tra thụ tinh muộn hơn thời điểm trên có thể thấy 2 tiền nhân hòa vào nhau, khi đó sẽ có thể đánh giá nhầm là noãn không thụ tinh (ngày hôm sau sẽ thấy phôi phân chia) Trong trường hợp thấy xuất hiện 3 - 4 tiền nhân, đó là do noãn hoàn thành phân bào giảm nhiễm bất thường Noãn thụ tinh bất thường sẽ bị loại bỏ Những noãn thụ tinh bình thường được chuyển sang hộp nuôi mới chứa môi trường LP, tủ ấm 6% CO2, 37 0 C

2.2.4.7 Đục lỗ màng trong suốt giai đoạn phôi phân cắt

Phôi nuôi tới giai đoạn phôi phân cắt (phôi ngày 3) sẽ được tiến hành đục lỗ màng trong suốt để hỗ trợ thoát màng cho phôi ở giai đoạn phôi nang, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình sinh thiết phôi Phôi được cố định bằng kim giữ, sử dụng laser hồng ngoại 1,48àm tạo một lỗ thủng rộng 7 - 10àm trên màng trong suốt Sau khi tạo lỗ trên màng trong suốt, phôi tiếp tục được nuôi cấy tới giai đoạn phôi nang (ngày 5 hoặc ngày 6).

Phôi giai đoạn phân cắt sau khi đục lỗ màng trong suốt

(kính hiển vi đảo ngược x 200) 1-Phôi bào 2-Màng trong suốt 3-Lỗ thủng màng trong suốt

* Nguồn: Bệnh nhân nghiên cứu tại Viện Mô phôi lâm sàng Quân đội

2.2.4.8 Đánh giá chất lượng hình thái phôi trước sinh thiết

Phôi nuôi tới giai đoạn phôi nang sẽ được tiến hành đánh giá hình thái phôi trước khi thực hiện sinh thiết

* Đánh giá hình thái phôi theo tiêu chuẩn đồng thuận Istanbul 2011 [41] Đồng thuận Istanbul 2011 đánh giá về hình thái phôi nang bản chất là hệ thống đánh giá rút gọn dựa trên hệ thống đánh giá hình thái phôi của tác giả Schoolcraft W B và Gardner D K năm 1999 [40]

Hình 2.1 Các giai đoạn phát triển của phôi nang

(1) Phôi nang giai đoạn sớm (2) Phôi nang (3) Phôi nang đầy (4) Phôi nang nở rộng.(5) Phôi nang đang thoát màng (6) phôi nang đã thoát màng

Theo Đồng thuận Istanbul, hình thái phôi được đánh giá theo 4 giai đoạn phát triển (1 - 4), hình thái ICM và TE được thể hiện chất lượng đánh giá mức độ tốt, trung bình, kém lần lượt tương ứng số 1, 2, 3 Các chất lượng 1, 2, 3 này tương đương chất lượng hình thái được đánh giá theo ký tự A, B, C theo phân loại của Schoolcraft W B và Gardner D K Sự thay đổi ký hiệu đánh giá từ chữ sang số trong đồng thuận này chỉ nhằm mục đích hỗ trợ thao tác dễ dàng hơn cho quá trình nhập và xử lý dữ liệu của các nhà khoa học, thực tế để thể hiện rõ chất lượng hình thái phôi, hầu hết các nhà khoa học cũng như các labo hỗ trợ sinh sản vẫn sử dụng ký hiệu A, B, C trong quá trình thực hiện kỹ thuật cũng như trong nghiên cứu Do vậy, trong nghiên cứu này, chúng tôi đánh giá phân loại hình thái phôi theo Đồng thuận Istanbul nhưng đặc điểm hình thái ICM và TE vẫn đánh giá thông qua ký tự A, B, C

Bảng 2.1 Đánh giá hình thái phôi nang dựa trên tiêu chuẩn đánh giá theo Đồng thuận Istanbul 2011

Mức độ Đánh giá Mô tả

1 Phôi nang giai đoạn sớm

4 Phôi nang thoát màng (đã thoát màng hoàn toàn hoặc đang thoát màng)

Khối tế bào nụ phôi

A Tốt Nổi bật, quan sát rõ với nhiều tế bào ép chặt, liên kết chặt chẽ với nhau

B Trung bình Quan sát rõ, nhiều tế bào nhưng liên kết lỏng lẻo với nhau C Kém Khó quan sát, có ít tế bào Đám tế bào lá nuôi

A Tốt Nhiều tế bào tạo nên một biểu mô liên kết chặt chẽ B Trung bình Ít tế bào, tạo nên biểu mô lỏng lẻo C Kém Rất ít tế bào

Các nhà phôi học đều đồng thuận rằng hiện tượng “hatching” (đang thoát màng) được định nghĩa là sự thoát ra rõ ràng của một số TE qua màng trong suốt mỏng Tuy nhiên, sự thoát màng sẽ không thể đánh giá chính xác nếu màng trong suốt có lỗ thủng nhân tạo Trong nghiên cứu của chúng tôi, tất cả các phôi đều được hỗ trợ thoát màng bằng cách đục lỗ màng trong suốt từ giai đoạn phôi phân cắt nên độ nở rộng của khoang phôi tại thời điểm TE bắt đầu chồi qua màng trong suốt nhìn chung nhỏ hơn so với phôi thoát màng tự nhiên thông thường ở cùng thời điểm Do vậy, mặc dù phôi trong nghiên cứu của chúng tôi đã bắt đầu thoát màng nhưng đều được đánh giá chung tại thời điểm trước sinh thiết là phôi giai đoạn 3 theo Đồng thuận Istanbul 2011

Hình 2.2 Phân loại chất lượng hình thái phôi nang theo đặc điểm của ICM và TE

Với cách phân loại chất lượng hình thái khối ICM theo 3 mức độ tốt, trung bình, kém tương ứng với ký hiệu A, B, C; tương tự với TE Như vậy, khi chất lượng hình thái ICM và TE kết hợp ngẫu nhiên lại với nhau sẽ tạo nên 9 mức độ chất lượng hình thái phôi: AA, AB, BA, AC, CA, BB, BC, CB, CC

Kết hợp hình thái khối ICM, TE, chúng tôi chia chất lượng hình thái phôi gộp lại thành 4 mức độ chất lượng hình thái: Phôi rất tốt (3AA); phôi tốt (3AB, 3BA); phôi trung bình (3BB, 3AC, 3CA); phôi kém (3BC, 3CB, 3CC) (theo tác giả Capalbo A và CS, 2014) [71]

- Sử dụng phần mềm đo RI-Research Instruments

- Đo đường kính phôi bằng công cụ thước đo trên laser (đo đường kính khối phôi bên trong, không bao gồm màng trong suốt) tại 3 vị trí khác nhau

Lấy giá trị trung bình của 3 lần đo

- Đo độ dày màng trong suốt bằng công cụ thước đo trên laser tại 3 vị trí khác nhau Lấy giá trị trung bình của 3 lần đo Ảnh 2.3 Ảnh đo phôi nang H1 trước sinh thiết của bệnh nhân của bệnh nhân N T H

(kính hiển vi đảo ngược x 200)

* Nguồn: Bệnh nhân nghiên cứu tại Viện Mô phôi lâm sàng Quân đội

* Dụng cụ và trang thiết bị sinh thiết phôi

+ Micropipette loại 2 - 20àl, loại 10 - 100àl

+ Pipette aid, mouth pipette, pipette pasteur vô trùng

+ Đĩa petri 35mm, Nunc 4 giếng chuyên dụng

+ Syringe bịt silicon, pipette falcon 5ml, pipette falcon 1ml

+ Kim holding, kim sinh thiết

+ Đầu cụn 1 - 10àl (cú màng lọc), đầu cụn 2 - 100 àl (cú màng lọc).

Kim giữ và kim sinh thiết phôi Origio, Đan Mạch

* Nguồn: Viện Mô phôi lâm sàng Quân đội

+ Kính hiển vi đảo ngược kèm bộ vi thao tác và bệ ấm

+ Hệ thống hỗ trợ phôi thoát màng bằng laser

+ Kính hiển vi soi nổi kèm bệ ấm

+ Tủ thao tác vô trùng

* Quy trình sinh thiết phôi

Tất cả các phôi nang đạt tới giai đoạn 3 theo tiêu chuẩn phân loại của đồng thuận Istanbul, có nụ phôi, TE đạt chất lượng từ C trở lên sẽ được lựa chọn để sinh thiết phôi

- Chuẩn bị đĩa sinh thiết:

Sử dụng đĩa petri kích thước 30x10mm (Falcon) vô trùng có ghi tên bệnh nhân và đánh số thứ tự giọt tương ứng với số thứ tự phôi Dùng mi- cropipet tạo 4 giọt môi trường LP có đánh số thứ tự và ghi tên bệnh nhân với thể tớch mỗi giọt là 5àl Chuẩn bị 1 giọt mụi trường PVP kộo dài ở giữa thể tớch là 10àl Phủ dầu paraffin lờn cỏc giọt mụi trường đó chuẩn bị và để ổn định 1 giờ trong tủ cấy 37ºC không có CO2

Khởi động máy vi tính và phần mềm laser Gắn kim giữ (bên trái) và kim sinh thiết (bên phải) vào hệ thống vi thao tác Chỉnh áp lực của kim sinh thiết: hút 1 đoạn dầu Paraffin vào kim, tiếp theo hút 1 đoạn PVP (môi trường này có độ nhớt cao sẽ giúp cho áp lực của kim ổn định hơn) Tiến hành sinh thiết khi phôi nang có 6 - 10 TE chui qua lỗ thủng trên màng trong suốt Đặt từng phôi vào từng giọt môi trường sinh thiết, để tủ ấm 37ºC trong thời gian 10 phút Xoay phôi sao cho vị trí các TE chui qua lỗ thủng màng trong suốt tương ứng với điểm 3 giờ Cố định phôi bằng kim giữ tại vị trí 9 giờ Dùng kim sinh thiết MBB-FP XS-35-Origio có đường kính trong 23 - 27àm, đầu vỏt 35ºvừa hỳt vừa kộo cỏc TE, kết hợp với laser để tỏch rời cỏc TE được sinh thiết khỏi phôi Chuẩn bị đĩa rửa các TE sinh thiết: 3 giọt môi trường rửa phụi với thể tớch 30àl mỗi giọt trong đĩa petri kớch thước

30x10mm (Falcon) Các TE sinh thiết được rửa qua 3 giọt môi trường rửa phụi, rồi chuyển vào tube Eppendorf cựng với thể tớch PBS 2,4àl, cất trong hộp chuyên dụng và gửi đến labo sinh học phân tử thuộc Công ty cổ phần Dịch vụ phân tích di truyền Gentis Sau sinh thiết, phôi nang được đặt trong giọt nuôi cấy LP và chuẩn bị trữ đông bằng kỹ thuật thủy tinh hóa Ảnh 2.5 Phôi nang T6 trước sinh thiết và sau sinh thiết của bệnh nhân P T T

(kính hiển vi đảo ngược x 200) A-Phôi nang được cố định bằng kim giữ trước khi sinh thiết: (1) TE; (2) Màng trong suốt; (3) Đám TE đang thoát qua lỗ thủng trên màng trong suốt

B-Phôi nang ngay sau sinh thiết: (1) TE; (2) Màng trong suốt; (3) Đám TE đã được sinh thiết tách khỏi khối phôi trước khi được chuyển tới labo di truyền

* Nguồn: Bệnh nhân nghiên cứu tại Viện Mô phôi lâm sàng Quân đội

* Đánh giá hình thái phôi sau sinh thiết 3 giờ

Nghiên cứu của tác giả Chen H H và CS (2017) cho thấy thời điểm tối ưu để tiến hành trữ đông phôi là trong khoảng 3 - 6 giờ sau sinh thiết do trong khoảng thời gian này, hầu như các phôi đã nở lại hoàn toàn hoặc gần hoàn toàn

Nhóm tác giả kết luận thời điểm này giúp tối ưu cả về tỉ lệ làm tổ và tỉ lệ có thai lâm sàng sau chuyển phôi so với nhóm phôi trữ đông sau sinh thiết dưới 3 giờ [32] Do đó, chúng tôi lựa chọn thời điểm đánh giá hình thái phôi sau sinh thiết (ngay trước thời điểm trữ đông phôi) là 3 giờ sau sinh thiết

- Ngay sau sinh thiết: Phôi có hiện tượng co lại do khoang phôi xẹp

- Quan sát hình thái phôi tại thời điểm sau sinh thiết 3 giờ:

+ Đánh giá tình trạng phôi sống, thoái hoá: Phôi được đánh giá là phôi sống khi > 50% tế bào phôi sống, không bị thoái hoá

+ Đánh giá sự nở lại của phôi: (1) Phôi không nở lại; (2) phôi nở lại rất ít; (3) phôi nở lại không hoàn toàn; (4) phôi nở lại hoàn toàn (theo cách đánh giá của tác giả Allen M.) [44]

- Đo đường kính phôi ở 3 vị trí khác nhau (chỉ đo đường kính khối phôi, không tính màng trong suốt); đo độ dày màng trong suốt ở 3 vị trí khác nhau bằng công cụ thước đo trên laser tại thời điểm sau sinh thiết 3 giờ Lấy giá trị trung bình của 3 lần đo (cách đo theo tác giả Sciorio R và CS, 2021) [50]

2.2.4.10 Trữ đông phôi bằng kỹ thuật thủy tinh hoá

Quy trình trữ đông phôi nang bằng kỹ thuật thuỷ tinh hoá theo phương pháp Cryotop của Massashige Kuwayama (2005) Đông lạnh phôi nang thường quy sử dụng bộ kit đông lạnh của hãng Kitazato (Nhật Bản) sản xuất Áp dụng quy trình đông lạnh cực nhanh theo phương pháp Cryotop của Masashige Kuwayama (2005)

- Chuẩn bị môi trường: Môi trường cân bằng (ES) và môi trường thủy tinh hóa (VS) được chuẩn bị khoảng 30 phút trước khi sử dụng và giữ ở nhiệt độ phũng (25 - 27ºC) Ghi nhón ES, VS1, VS2, mỗi giếng chứa 300àl mụi trường

- Cân bằng thẩm thấu: Đặt phôi nang vào giếng ES, ngay sau khi tiếp xúc với môi trường cân bằng, thể tích phôi sẽ giảm đi nhanh chóng do hiện tượng mất nước và từ từ trở về trạng thái ban đầu, thời gian trong ES là 15 phút

- Thuỷ tinh hoá: Sau khi hoàn thành bước cân bằng, chuyển phôi sang giếng VS1, sau 60 giây, chuyển phôi sang giếng VS2 trong 30 giây, lúc này thể tích phôi sẽ giảm thêm lần nữa, phôi bị co rút lại Nhanh chóng đặt phôi lên phần đầu của cryotop với lượng rất ít môi trường thủy tinh hóa, rồi nhúng trực tiếp vào nitơ lỏng, toàn bộ quá trình diễn ra trong vòng 1 phút 30 giây

- Lưu trữ: Sau khi đậy nắp dụng cụ chứa phôi cho vào cassette đã ghi đầy đủ thông tin bệnh nhân và cất vào thùng chứa nitơ lỏng.

Môi trường và dụng cụ trữ đông phôi Kitazato, Nhật Bản

* Nguồn: Viện Mô phôi lâm sàng Quân đội 2.2.4.11 Xét nghiệm nhiễm sắc thể phôi

Xét nghiệm NST mẫu phôi bào sinh thiết (TE) bằng kỹ thuật NGS sử dụng bộ kit VeriSeq trên máy MiSeq

Bảng 2.2 Hóa chất sinh học phân tử chính sử dụng trong nghiên cứu

STT Hóa chất Nhà sản xuất

1 SurePlex DNA Amplification System Illumina 2 VeriSeq PGS Library Preparation Kit Illumina

4 MiSeq Reagent Kit - PGS Illumina 5 Qubit dsDNA HS Assay Kit Thermo Fisher Scientific 6 Phosphate buffer solution Cell Signalling

8 PCR grade water 1st Base

STT Hóa chất Nhà sản xuất

9 Female/Male human genomic DNA Promega

11 Agarose gel loading dye 6x Intron

13 RedSafe Nucleic Acid staining solu- tion

Bảng 2.3 Thiết bị sinh học phân tử chính sử dụng trong nghiên cứu

TT Thiết bị Nhà sản xuất

1 ProFlex TM 3x32-well PCR system Thermo Fisher

Scientific 2 Next – Generation Sequencing System – MiSeq Illumina 3 Qubit 2.0 Fluorometric Quantitation Life Technologies

5 Bộ điện di NANOPAC 300P Cleaver

7 Cân điện tử Practum Sartorius

8 Máy lắc MS3 basic IKA

9 Một số thiết bị cơ bản của phòng thí nghiệm:

Pipet, giá từ, giá để eppendorf, …

Hình 2.3 Kết quả NGS phôi T1 của bệnh nhân B T T T: 47,XY,+15

* Nguồn: Bệnh nhân nghiên cứu tại Viện Mô phôi lâm sàng Quân đội

Kỹ thuật NGS bao gồm 4 giai đoạn chính sau đây:

Thư viện là các phân đoạn DNA Các mẫu DNA được kiểm tra chất lượng bằng phương pháp điện di và được phân đoạn (fragmentation) bằng siêu âm

Tiếp theo, các phân đoạn DNA này được kết nối với các mã vạch (barcode) và được đánh dấu (indexing) cho các bước phân tích máy tính tiếp theo

- Lai với các mẫu DNA dò (probe) đặc hiệu (2):

Sau khi đã chuẩn bị được thư viện là các phân đoạn DNA, các thư viện này sẽ được dùng để lai với các mẫu dò được thiết kế đặc hiệu cho các locus quan tâm Trước khi đọc, các thư viện này được kiểm tra chất lượng trên thiết bị Tapestation (Agilent) và định lượng bằng máy Qubit (Life Technologies)

Dùng PCR với mồi đặc hiệu adapter để khuếch đại các đoạn DNA trên giá bám thành từng clone

Thư viện được đọc trên thiết bị giải trình tự gen thế hệ mới Miseq Dữ liệu thu được được phân tích trên phần mềm Bluefuse ở giai đoạn tiếp theo

Dữ liệu được xử lý bằng phần mềm Bluefuse Phần mềm này cho phép phát hiện các đột biến, tính toán thống kê ý nghĩa giữa các mẫu nghiên cứu

Những sai khác hay đột biến phát hiện sẽ được so sánh và kiểm chứng với cơ sở dữ liệu đột biến gen người tại http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php

2.2.4.12 Chuẩn bị niêm mạc cho chu kỳ chuyển phôi lưu

Bệnh nhân được dùng liệu pháp hormone ngoại sinh trong quy trình chuẩn bị niêm mạc tử cung (NMTC) theo phác đồ chung của viện:

- Vào ngày 2 hoặc ngày 3 chu kỳ kinh tiến hành siêu âm qua đầu dò âm đạo tần số 5 - 7MHz, máy siêu âm Hãng Hitachi Aloka F37 (Nhật Bản) nếu không có nang tồn dư bệnh nhân được dùng thuốc Estradiol (Valiera 2mg của hãng Abbott Laboratiorios, Hoa Kỳ hoặc Progynova 2mg của hãng Bayer, Đức dạng uống) Liều sử dụng được cá thể hóa theo từng bệnh nhân cụ thể và trong khoảng từ 6 - 12mg/ ngày

- Vào ngày 9 hoặc ngày 10 chu kỳ kinh, siêu âm qua đầu dò âm đạo theo dõi độ dày NMTC và hình thái NMTC cho tới ngày mở cửa sổ và cho thuốc chuyển dạng niêm mạc

Khi độ dày NMTC > 7mm và đã dùng Estradiol tới ngày 13 - 16 chu kỳ kinh là thời điểm để chuyển dạng NMTC Vào ngày mở cửa sổ, bệnh nhân được dùng thuốc chuyển dạng NMTC gồm: Progesteron 800mg/ngày dạng đặt âm đạo (Utrogestrans 200mg của hãng Besins, Pháp hoặc Cyclogest của Actavis UK Ltd, Anh); Dydrogesteron 20mg/ngày dạng uống (Duphaston 10mg của Abbott, Mỹ); Estradiol 4mg/ngày dạng uống (Valiera 2mg hoặc Progynova 2mg) Bệnh nhân dùng đơn thuốc này trong thời gian 5 - 6 ngày tuỳ từng trường hợp cụ thể cho tới ngày chuyển phôi

2.2.4.13 Rã đông phôi để chuyển vào buồng tử cung cho bệnh nhân

Rã đông phôi nang bằng kỹ thuật thuỷ tinh hoá theo phương pháp Cry- otop của Massashige Kuwayama (2005)

- Chuẩn bị môi trường rã đông:

Môi trường rã đông (TS) được chuẩn bị trong đĩa petri đường kính 35mm

Môi trường hòa tan (DS), môi trường rửa (WS) lần lượt được cho vào cỏc giếng DS, WS1, WS2 của đĩa repro, mỗi giếng chứa 300àl mụi trường

Môi trường rã đông được làm ấm đến 37ºC trong thời gian ít nhất là 1,5 giờ

Các môi trường còn lại được làm ấm đến nhiệt độ phòng (25 - 27ºC)

- Rã đông phôi nang: Cryotop chứa phôi lấy từ trong nitơ lỏng, được nhúng trực tiếp vào môi trường rã đông TS, phôi sẽ rời khỏi cryotop vào trong môi trường Sau 1 phút, chuyển phôi sang môi trường hòa tan DS (Dilution)

- Pha loãng: Phôi được đặt trong môi trường hòa tan DS (Dilution) trong 3 phút, nồng độ của chất bảo quản bên trong phôi sẽ được hòa loãng, hình dạng của phôi dần được phục hồi

- Rửa: Từ môi trường hòa tan DS (Dilution), phôi lần lượt chuyển sang WS1(Washing) trong 5 phút và WS2 (Washing) trong 1 phút, trong giai đoạn này phôi sẽ được khôi phục lại hoàn toàn hình thái như trước khi trữ lạnh, chất bảo quản lạnh trong phôi được kéo hết ra môi trường Sau đó, phôi được chuyển sang giọt nuôi cấy LP trong hộp Nunc và nuôi trong tủ cấy Benchtop ở nhiệt độ 37ºC, 6% CO2, 5% O2 trong thời gian 4 giờ trước khi tiến hành chuyển phôi.

Môi trường rã đông phôi Kitazato, Nhật Bản

Các chỉ tiêu nghiên cứu

2.3.1 Các chỉ tiêu lâm sàng, cận lâm sàng trên bệnh nhân nghiên cứu

- Tuổi bệnh nhân Bệnh nhân được chia làm 3 nhóm tuổi: < 30 tuổi, từ 30 - 35 tuổi, > 35 tuổi

+ Do vợ: Vợ tắc hai vòi trứng, buồng trứng đa nang, rối loạn kinh nguyệt…

+ Do chồng: thiểu năng tinh trùng, tinh trùng dị dạng nhiều

+ Do cả hai vợ chồng

+ Tiền sử sảy thai, thai lưu liên tiếp từ 2 lần trở lên

+ Tiền sử đình chỉ thai do thai mang dị tật

+ Tiền sử điều trị IUI, IVF nhiều lần thất bại

- Chỉ số nội tiết đại diện cho khả năng dự trữ buồng trứng AMH, chỉ số AFC vào ngày 2 hoặc ngày 3 chu kỳ kinh

- Số noãn trưởng thành thu được sau chọc hút noãn là những noãn đã có 1 thể cực

- Số noãn thụ tinh là những hợp tử có 2 tiền nhân (16 - 18 giờ sau tiêm ICSI)

- Số phôi giai đoạn phân cắt (phôi ngày 3)

- Số phôi nang (phôi ngày 5 hoặc ngày 6)

- Tỉ lệ có thai sau chuyển phôi (beta hCG ≥ 30mIU/mL)

2.3.2 Các chỉ tiêu về hình thái, cấu trúc phôi nang

- Độ phôi (theo phân loại của đồng thuận Istanbul 2011):

+ Đánh giá thể tích khoang phôi và hiện tượng thoát màng

+ Đánh giá đặc điểm ICM

+ Đánh giá đặc điểm TE

- Phôi nang được chia thành 4 nhóm dựa theo chất lượng hình thái phôi:

+ Phôi chất lượng rất tốt: Phôi 3AA

+ Phôi chất lượng tốt: 3AB, 3BA

+ Phôi chất lượng trung bình: 3BB, 3AC, 3CA

+ Phôi chất lượng kém: 3BC, 3CB, 3CC

- Tỉ lệ các nhóm chất lượng hình thái phôi trong mỗi nhóm tuổi: Tỉ lệ hình thái phôi rất tốt, tốt, trung bình, kém trong mỗi nhóm tuổi

- Độ dày màng trong suốt

2.3.3 Các chỉ số đánh giá sức sống của phôi sinh thiết

- Tỉ lệ phôi sống sau sinh thiết 3 giờ (tỉ lệ %)

- Tỉ lệ phôi nở lại, không nở lại sau sinh thiết 3 giờ:

+ Phôi nở lại hoàn toàn sau sinh thiết là phôi có khoang phôi trở lại trạng thái ban đầu như trước sinh thiết

+ Phôi nở lại gần hoàn toàn sau sinh thiết là phôi có khoang phôi nở lại ≥ 50% so với khoang phôi thời điểm trước sinh thiết

+ Phôi nở lại rất ít sau sinh thiết là phôi có khoang phôi nở lại

0 (tương quan thuận)

2.4.2 Biện pháp khống chế sai số Để hạn chế tối đa nguy cơ sai số có thể xảy ra trong quá trình nghiên cứu, chúng tôi tuân thủ chặt chẽ các nguyên tắc sau:

- Toàn bộ bệnh nhân nghiên cứu là bệnh nhân điều trị tại cùng một đơn vị điều trị hỗ trợ sinh sản: Viện Mô phôi lâm sàng Quân đội, Học viện Quân y

- Toàn bộ phôi được nuôi cấy theo 1 quy trình chung thống nhất tại viện, được đánh giá hình thái và được sinh thiết bởi những chuyên viên phôi học có trên 10 năm kinh nghiệm

- Toàn bộ quá trình nhập liệu luôn có 2 người thực hiện: Nhập liệu và kiểm tra đảm bảo tránh tối đa sai số trong quá trình thu thập số liệu.

Vấn đề đạo đức trong nghiên cứu

- Các thủ tục hành chính trong hồ sơ bệnh án nghiên cứu tuân thủ đúng theo qui định và luật pháp Việt Nam được ban hành trong lĩnh vực Hỗ trợ sinh sản

- Đối tượng nghiên cứu là các cặp vợ chồng điều trị thụ tinh trong ống nghiệm được chỉ định hoặc có nguyện vọng làm sàng lọc di truyền phôi, có đơn xin điều trị hỗ trợ sinh sản và cam kết thực hiện kỹ thuật thụ tinh ống nghiệm Tất cả đối tượng nghiên cứu được giải thích đầy đủ và tự nguyện ký đồng thuận tham gia nghiên cứu Các thông tin cá nhân của bệnh nhân được giữ kín theo đúng nguyên tắc

- Quy trình nghiên cứu không làm ảnh hưởng, gián đoạn, cản trở tới quá trình điều trị của bệnh nhân Các kỹ thuật chỉ được thực hiện bởi các chuyên gia hỗ trợ sinh sản, các chuyên viên phôi học giàu kinh nghiệm.

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

Đặc điểm của bệnh nhân nghiên cứu

Nghiên cứu được tiến hành trên 186 bệnh nhân có chỉ định làm IVF- PGT-A tại Viện Mô phôi lâm sàng Quân đội, Học viện Quân y, từ tháng 10 năm 2017 đến tháng 01 năm 2021 Trong tổng số 661 phôi nang của 186 bệnh nhân tham gia nghiên cứu, có 655 phôi đạt tiêu chuẩn lựa chọn và sau sinh thiết sàng lọc di truyền, có 623 phôi cho kết quả nhiễm sắc thể rõ ràng Do đó, chỉ 623 phôi này được đưa vào phân tích kết quả 623 phôi nang chia thành 3 nhóm theo độ tuổi của người mẹ:

- Nhóm I : gồm 92 phôi nang của 22 bệnh nhân trong độ tuổi < 30

- Nhóm II : gồm 279 phôi nang của 79 bệnh nhân trong độ tuổi 30 - 35

- Nhóm III : gồm 252 phôi nang của 85 bệnh nhân trong độ tuổi > 35

Sau toàn bộ quá trình thu thập và xử lý số liệu, nghiên cứu thu được kết quả như sau:

Bảng 3.1 Nguyên nhân vô sinh trên nhóm bệnh nhân làm IVF-PGT-A

n = 85) Cả 3 nhóm

p* p(1-2-3) = 0,003; p(1-2) = 0,963; p(1-3) = 0,044; p(2-3) = 0,002 Do chồng 5 (22,7) 16 (20,3) 35 (41,2) 56 (30,1) p* p(1-2-3) = 0,016; p(1-2) = 0,394; p(1-3) = 0,006; p(2-3) = 0,020 Do cả 2 vợ chồng 10 (45,5) 23 (29,1) 9 (10,6) 42 (22,6) p* p(1-2-3) = 0,379

nhóm

Bảng 3.2 Tiền sử thai sản có liên quan

Cả 3 nhóm Không có tiền sử đặc biệt 2 (9,1) 4 (5,1) 12 (14,1) 18 (9,7) p* p(1-2-3) = 0,146

Sảy thai, thai lưu liên tiếp nhiều lần 18 (81,8) 61 (77,2) 52 (61,2) 131

(70,4) p* p(1-2-3) = 0,037; p(1-2) = 0,644; p(1-3) = 0,070; p(2-3) = 0,027 Đình chỉ thai do thai dị tật 0 (0) 2 (2,5) 0 (0) 2 (1,1) p*

Làm IUI, IVF nhiều lần thất bại 2 (9,1) 12 (15,2) 21 (24,7) 35 (18,8) p* p(1-2-3) = 0,137

* Kiểm định χ 2 Nhận xét: Thống kê tiền sử thai sản cho thấy những trường hợp có tiền sử sảy thai, thai lưu liên tiếp chiếm phần lớn các ca điều trị IVF-PGT-A với tỉ lệ 70,4% Đây cũng là nhóm tiền sử chiếm tỉ lệ cao nhất trong tất cả các nhóm tuổi, tỉ lệ bệnh nhân nghiên cứu có tiền sử này cao nhất ở nhóm tuổi 35 Trong toàn bộ bệnh nhân tham gia nghiên cứu, chỉ có hai trường hợp có tiền sử phải đình chỉ thai do thai mang dị tật, cả hai trường hợp này đều nằm trong nhóm 2

Bảng 3.3 Nồng độ AMH, AFC, số noãn trưởng thành, số noãn thụ tinh, số phôi ngày 3, số phôi nang thu được ở mỗi nhóm

n = 22) Nhóm 2 (n = 79) Nhóm 3 (n = 85)

Hình thái, cấu trúc phôi nang trước sinh thiết, sau sinh thiết và sau rã đông đông

Đánh giá trên 623 phôi nghiên cứu, các đặc điểm về hình thái phôi thu được kết quả như sau:

3.2.1 Hình thái, cấu trúc của phôi nang trước sinh thiết và sau sinh thiết 3 giờ

* Hình thái phôi trước sinh thiết

Tại thời điểm ngay trước sinh thiết, phôi được đánh giá chất lượng hình thái theo đồng thuận Istanbul, chất lượng hình thái phôi được thể hiện trong biểu đồ 3.1

Biểu đồ 3.1 Tỉ lệ chất lượng hình thái phôi nang

Nhận xét: Trong tổng số 623 phôi sinh thiết, phôi hình thái rất tốt, tốt trung bình và kém chiếm tỉ lệ gần tương đương nhau Sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05)

Biểu đồ 3.2 Tỉ lệ các nhóm chất lượng hình thái phôi theo nhóm tuổi

Nhận xét: Biểu đồ 3.2 thể hiện tỉ lệ phôi hình thái rất tốt, tốt, trung bình và kém trong mỗi nhóm tuổi mẹ Số liệu cho thấy mặc dù có sự thay đổi về tỉ lệ mỗi loại hình thái phôi giữa các nhóm tuổi tuy nhiên chưa thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p1-2-3 > 0,05).

Chất lượng hình thái phôi rất tốt và phôi tốt

Phôi rất tốt P4 của bệnh nhân D T T P.; Phôi tốt H1 của bệnh nhân N T

M H (kính hiển vi đảo ngược x 200)

Rất tốt Tốt Trung bình Kém

Chất lượng hình thái phôi trung bình và kém

Tỉ lệ bất thường nhiễm sắc thể của phôi thụ tinh trong ống nghiệm và mối liên quan với hình thái phôi mối liên quan với hình thái phôi

3.3.1 Tỉ lệ bất thường NST của phôi thụ tinh trong ống nghiệm

Trong 655 phôi nang đạt tiêu chuẩn lựa chọn được đưa vào nghiên cứu, sau sinh thiết, xét nghiệm di truyền, chỉ có 623 phôi cho kết quả nhiễm sắc thể rõ ràng đạt tỉ lệ 95,1%; 19 phôi không lên tín hiệu (2,9%) và 13 phôi tín hiệu bị nhiễu (2%) Những phôi không lên tín hiệu hoặc tín hiệu nhiễu sẽ được lên kế hoạch rã đông sinh thiết xét nghiệm di truyền lại hoặc không xét nghiệm lại tuỳ tình trạng phôi và sự thống nhất giữa bác sĩ và bệnh nhân Những phôi này cũng đã được đưa ra khỏi nghiên cứu hình thái ngay từ đầu Do vậy cũng như phân tích trên hình thái phôi, đánh giá kết quả nhiễm sắc thể trong nghiên cứu chỉ tiến hành trên 623 phôi nang

Bảng 3.11 Kết quả NST phôi theo nhóm tuổi

Phôi NST bình thường 47 51,1 151 54,1 90 35,7 288 46,2 p* p(1-2-3) < 0,001; p(1-2) = 0,613; p(1-3) = 0,01; p(2-3) < 0,001 Phôi NST bất thường 22 23,9 82 29,4 119 47,2 223 35,8 p* p(1-2-3) < 0,001; p(1-2) = 0,310; p(1-3) < 0,001; p(2-3) < 0,001 Phôi khảm 23 25,0 46 16,5 43 17,1 112 18,0 p* p(1-2-3) = 0,164

Nhận xét: Tỉ lệ phôi chuẩn bội ở nhóm 1 và nhóm 2 cao hơn có ý nghĩa so với nhóm 3 (p < 0,05) Tỉ lệ phôi bất thường NST ở nhóm 1 và nhóm 2 thấp hơn có ý nghĩa so với nhóm 3 (p < 0,05) Không có sự khác biệt đáng kể về tỉ lệ phôi chuẩn bội và tỉ lệ phôi bất thường NST giữa nhóm 1 và nhóm 2 Tỉ lệ phôi khảm khác biệt không có ý nghĩa giữa 3 nhóm

Trong tổng số 623 phôi có 223 phôi kết quả NST bất thường Số phôi bất thường NST trong nhóm 1, 2, 3 lần lượt là 22, 82, 119 phôi Tỉ lệ các loại bất thường NST được thể hiện trong bảng 3.12

Bảng 3.12 Tỉ lệ các loại bất thường NST phôi theo nhóm tuổi

Phôi bất thường số lượng NST

Phôi bất thường cấu trúc NST

* Kiểm định χ 2 Phôi đa bất thường là những phôi mang cả bất thường số lượng và bất thường cấu trúc NST

Nhận xét: Trong số các loại bất thường NST, bất thường số lượng NST chiếm tỉ lệ cao nhất (167/223) Tỉ lệ phôi bất thường số lượng NST tăng cao có ý nghĩa ở nhóm 3 so với nhóm 1 (80,7% so với 54,6%) Ngược lại, tỉ lệ phôi bất thường cấu trúc NST giảm có nghĩa ở nhóm 3 so với nhóm 1 (5,9% so với 22,7%; p < 0,05) Tỉ lệ phôi đa bất thường khác biệt không có ý nghĩa thống kê giữa 3 nhóm (p > 0,05)

Trong 223 phôi bất thường NST có 167 phôi bất thường số lượng NST

Số phôi bất thường số lượng NST trong 3 nhóm 1, 2, 3 lần lượt là 12, 59, 96 phôi Tỉ lệ phôi với các kiểu bất thường số lượng NST khác nhau được thống kê trong bảng 3.13

Bảng 3.13 Tỉ lệ một số kiểu bất thường số lượng NST theo nhóm tuổi

Loại bất thường số lượng NST

Bất thường số lượng nhiều NST 02 16,7 18 30,5 50 52,1 70 41,9 p* p(1-2-3) = 0,007; p(1-2) = 0,331; p(1-3) = 0,023; p(2-3) = 0,010

* Kiểm định χ 2 Phôi bất thường số lượng nhiều NST là những phôi mang bất thường số lượng từ 2 NST trở lên

Nhận xét: Trên toàn bộ 623 phôi, phôi bất thường số lượng NST chiếm tỉ lệ 26,8% (167/623), tỉ lệ phôi đa bội, monosomy, trisomy và bất thường số lượng nhiều NST trong quần thể phôi nghiên cứu nói chung lần lượt là 0,48%

(3/623); 8,83% (55/623); 6,26% (39/623) và 11,24% (70/623) Đánh giá trên 167 phôi bất thường số lượng NST, chưa thấy sự khác biệt có ý nghĩa về tỉ lệ phôi trisomy giữa 3 nhóm Tỉ lệ phôi monosomy giảm rõ rệt ở nhóm 3 so với nhóm 1 và nhóm 2 Ngược lại, tỉ lệ phôi bất thường số lượng nhiều NST tăng có ý nghĩa ở nhóm 3 so với 2 nhóm còn lại

Biểu đồ 3.4 Tần suất bất thường số lượng ở từng NST của phôi theo nhóm tuổi

Nhận xét: Trong tổng số 332 bất thường NST xuất hiện trong 167 phôi bất thường số lượng NST Bất thường số lượng có thể gặp ở bất kỳ NST nào Bất thường số lượng NST số 21 gặp ở cả 3 nhóm tuổi và có xu hướng tăng theo sự tăng của tuổi mẹ NST hay gặp bất thường số lượng ở nhóm tuổi < 30 là NST số 4, 5, 15, 20 (11,1%), 14 (16,7%) NST hay gặp bất thường số lượng NST ở nhóm tuổi 30 - 35 là NST số 16 (14,9%), 21 (7,9%), 22 (9,9%) Ở nhóm tuổi > 35, bất thường số lượng hay gặp ở NST 16 (11,7%), 21 (10,5%), 22 (9,3%)

Bấ t th ư ờn g số lư ợn g NS T %

Nhóm I Nhóm II Nhóm III

Biểu đồ 3.5 Tỉ lệ phôi monosomy ở từng NST theo nhóm tuổi

Nhận xét: Trong tổng số 55 phôi bất thường monosomy, không gặp phôi monosomy NST số 1, 3, 5, 7, 10, 13 Nhìn chung, phôi monosomy hay gặp nhất ở NST 15 (12,7%), 16 (18,2%), 21 (12,7%), 22 (9,1%) và bất thường thiếu hụt 1 NST giới tính (9,1%) Ở nhóm tuổi < 30, monosomy NST số 15, 16, 20 (28,6%; 14,3%; 28,6%) chiếm ưu thế Nhóm tuổi 30 - 35, tỉ lệ phôi bất thường monosomy cao nhất là monosomy 15, 16, 18, 22 (12,5%); tình trạng phôi thiếu một NST giới tính cũng chiếm tỉ lệ tương đối cao (8,3%) Ở nhóm tuổi > 35, tỉ lệ phôi monosomy cao nhất ở NST 16, 21 (25%; 20,8%)

Ph ôi m on os om y %

Nhóm I Nhóm II Nhóm III

Biểu đồ 3.6 Tần suất bất thường monosomy ở từng NST của phôi theo nhóm tuổi

Nhận xét: Phân tích trên tất cả các phôi bất thường (bao gồm phôi monosomy, phôi bất thường số lượng nhiều NST trong đó có bất thường monosomy và các phôi đa bất thường có mang bất thường monosomy) Kết quả cho thấy trong tổng số 64 bất thường monosomy xuất hiện, không gặp bất thường monosomy NST 5, 10, 13 Ở nhóm tuổi < 30, tần suất bất thường monosomy hay gặp ở NST 15, 20 (22,2%) Ở nhóm tuổi 30 - 35, tần suất bất thường monosomy hay gặp ở NST 16 (13,3%), 22 (10%), thiếu 1 NST giới tính (20%) Ở nhóm tuổi > 35, bất thường monosomy hay xuất hiện ở NST 16 (24%) và NST 21 (24%)

Nhóm I Nhóm II Nhóm III

Biểu đồ 3.7 Tỉ lệ phôi trisomy ở từng NST theo nhóm tuổi

Nhận xét: Khảo sát về phôi trisomy, số liệu cho thấy trong 39 phôi trisomy, không gặp phôi trisomy NST số 8, 9, 10, 18, 19 Ở nhóm tuổi < 30, phôi trisomy xuất hiện chủ yếu ở NST 1 (33,3%), 14 (33,3%), 21 (33,4%) Ở nhóm tuổi 30 - 35, hay gặp nhất là phôi trisomy NST 3 (12,5%), NST 16 (43,8%) Ở nhóm tuổi > 35, phôi trisomy hay gặp nhất ở NST 16 (20%), 21 (20%)

Hình 3.1 Kết quả NGS phôi X2 của bệnh nhân B T X: +22

* Nguồn: Bệnh nhân nghiên cứu tại Viện Mô phôi lâm sàng Quân đội

Nhóm I Nhóm II Nhóm III

Trong 223 phôi bất thường NST, nghiên cứu phân tích và thống kê cho thấy có tổng cộng 552 bất thường trisomy Tần suất bất thường trisomy của từng NST được thể hiện trong biểu đồ 3.8

Biểu đồ 3.8 Tần suất bất thường trisomy ở từng NST của phôi theo nhóm tuổi

Nhận xét: Số liệu cho thấy bất thường trisomy có thể xuất hiện ở bất kỳ NST nào Bất thường trisomy xuất hiện nhiều ở NST số 16 (11,3%); 21 (9%), 22 (6,9%), NST giới tính (15,1%) Ở nhóm tuổi < 30, tần suất bất thường trisomy xuất hiện nhiều ở NST 16 (15,1%), tỉ lệ thừa 1 NST giới tính ở nhóm tuổi này là 28,3% Ở nhóm tuổi 30 - 35, bất thường trisomy hay gặp ở NST 16 (11,7%), bất thường 3 NST giới tính cũng gặp ở nhóm tuổi này với tỉ lệ khá cao (25,2%) Ở nhóm tuổi > 35, bất thường trisomy xuất hiện nhiều ở NST 16 (10,1%), 21 (10,9%), 22 (10,1%)

Nhóm I Nhóm II Nhóm III

Bảng 3.14 Tỉ lệ các loại phôi khảm theo nhóm tuổi

Khảm số lượng nhiều NST 7 30,4 25 54,3 14 32,6 46 41,1 p* p(1-2-3) = 0,098

* Kiểm định χ 2 Khảm số lượng nhiều NST là phôi khảm số lượng từ 2 NST trở lên

Khảm đa bất thường NST là những phôi khảm cả số lượng và cấu trúc NST

Nhận xét: Trong tổng số 112 phôi khảm với các bất thường khảm số lượng NST, khảm cấu trúc NST và khảm đa bất thường, số phôi dạng khảm bất thường số lượng NST là 80 phôi chiếm tỉ lệ cao nhất (71,4%) Đánh giá tỉ lệ các loại phôi khảm theo nhóm tuổi, chưa thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về tỉ lệ phôi khảm số lượng NST và tỉ lệ phôi khảm cấu trúc NST giữa 3 nhóm (p > 0,05); riêng tỉ lệ phôi khảm đa bất thường NST tăng cao có ý nghĩa ở nhóm tuổi mẹ < 30 so với nhóm tuổi 30 - 35 và nhóm tuổi > 35 (p < 0,05)

Biểu đồ 3.9 Tỉ lệ phôi khảm monosomy theo nhóm tuổi

Nhận xét: Các phôi khảm monosomy xuất hiện ở NST số 6, 10, 15, 20,

22 và khảm thiếu 1 NST giới tính Không gặp phôi khảm monosomy các NST 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 21 Tỉ lệ phôi khảm monosomy có xu hướng tăng dần theo nhóm tuổi, lần lượt chiếm tỉ lệ 11%

Hình 3.2 Kết quả NGS phôi G2 của bệnh nhân V T G: -20 (Tỉ lệ khảm 50%)

* Nguồn: Bệnh nhân nghiên cứu tại Viện Mô phôi lâm sàng Quân đội

Ph ôi k hả m M on os om y %

Nhóm I Nhóm II Nhóm III

Biểu đồ 3.10 Tỉ lệ phôi khảm trisomy theo nhóm tuổi

BÀN LUẬN

Đặc điểm của bệnh nhân nghiên cứu

Bất thường nhiễm sắc thể phôi có thể gặp ở mọi lứa tuổi của các cặp vợ chồng trong độ tuổi sinh sản Tuy nhiên, hầu hết các nghiên cứu trên thế giới đều chỉ ra rằng tỉ lệ bất thường nhiễm sắc thể phôi tăng theo tuổi của người mẹ và ít phụ thuộc hơn vào tuổi cũng như chất lượng tinh trùng của người cha [6], [78] Tỉ lệ bất thường NST phôi bắt đầu tăng cao khi phụ nữ > 35 tuổi, tuy nhiên theo nghiên cứu của tác giả Liu X Y và CS năm 2020 cho thấy ở đối tượng bệnh nhân sảy thai liên tiếp thì ngay cả ở độ tuổi < 35, tỉ lệ phôi mang bất thường NST cũng đã tăng cao hơn có ý nghĩa thống kê so với phụ nữ cùng nhóm tuổi có tiền sử thai sản bình thường hoặc có sảy thai nhưng tần số thấp [62], [7] Độ tuổi tối ưu nhất đối với NST phôi là 26 - 30 tuổi, một nghiên cứu năm 2021 chỉ ra rằng ở độ tuổi này, tỉ lệ phôi bất thường NST thấp, chỉ khoảng 20 - 27% [79] Dựa vào các đặc điểm liên quan đến nguy cơ bất thường NST ở các độ tuổi khác nhau đã được chứng minh theo thời gian bởi nhiều nghiên cứu đi trước, chúng tôi lựa chọn chia đối tượng nghiên cứu của mình theo 3 nhóm tuổi mẹ: Nhóm I: Gồm phôi của các bệnh nhân < 30 tuổi; Nhóm 2: Phôi của bệnh nhân 30 - 35 tuổi; Nhóm III: Phôi của các bệnh nhân > 35 tuổi Từ đó đánh giá sự biến đổi hình thái phôi, đánh giá tỉ lệ bất thường nhiễm sắc thể của phôi và phân tích mối liên quan giữa hình thái phôi với bất thường nhiễm sắc thể trên những bệnh nhân điều trị thụ tinh trong ống nghiệm kết hợp sàng lọc di truyền phôi

4.1.1 Nguyên nhân vô sinh trên đối tượng bệnh nhân hiếm muộn có chỉ định làm IVF-PGT-A

Các nghiên cứu thống kê cho thấy nguyên nhân vô sinh của các cặp vợ chồng hiếm muộn nói chung có thể đến từ phía người vợ, người chồng hoặc do cả hai vợ chồng, tuy nhiên cũng có những trường hợp các cặp vợ chồng không tìm ra nguyên nhân Năm 2015, tác giả Masoumi S Z và CS đã tiến hành nghiên cứu mô tả cắt ngang trên 1200 người nam và nữ điều trị hiếm muộn, kết quả cho thấy tỉ lệ nguyên nhân do yếu tố nam chiếm 66%; tỉ lệ nguyên nhân do các yếu tố nữ cao hơn, chiếm 88,9% [80] Có rất nhiều yếu tố gây vô sinh từ phía người phụ nữ như: Rối loạn kinh nguyệt, bệnh lý tại vòi trứng, buồng trứng, tử cung… làm người phụ nữ khó có thể mang thai Bên cạnh đó, nhiều trường hợp người phụ nữ hoàn toàn có thể mang thai tự nhiên nhưng lại không giữ được thai Có nhiều nguyên nhân dẫn tới tình trạng này, trong đó yếu tố được các nhà khoa học quan tâm hàng đầu là tuổi của người phụ nữ Các nghiên cứu đều cho thấy khi tuổi mẹ càng cao thì tỉ lệ bất thường nhiễm sắc thể của cả noãn và phôi càng cao và năng lực của noãn và phôi càng giảm, góp phần làm tăng tỉ lệ nguyên nhân vô sinh đến từ phía người phụ nữ [63], [62] Trong nghiên cứu của chúng tôi, thống kê cho thấy tỉ lệ nguyên nhân vô sinh do người vợ tăng từ 27,3% ở nhóm tuổi < 30 lên 35,3% ở nhóm tuổi > 35 (bảng 3.1)

Song song cùng yếu tố tuổi mẹ, tuổi của người cha cũng rất được quan tâm Tuy nhiên, đánh giá về ảnh hưởng yếu tố tuổi của người cha lên chất lượng phôi còn một số ý kiến khác nhau Nghiên cứu năm 2015 của tác giả García Ferreyra J và CS thể hiện ở những người cha tuổi cao có thể làm tăng bất thường NST phôi và gợi ý nên tầm soát di truyền phôi trước khi chuyển ở những trường hợp có chồng > 50 tuổi [81] Trái chiều với nhóm tác giả này, kết quả của tác giả Kim M K và CS năm 2019 nghiên cứu trên 571 phôi nang có sàng lọc di truyền đã cho thấy tuổi của người cha tác động không có ý nghĩa tới bộ nhiễm sắc thể phôi [82] Có những kết quả khác biệt như vậy có thể bởi tuổi của nam giới chưa thực sự song hành cùng chất lượng tinh trùng, mà bản chất, chất lượng tinh trùng mới là yếu tố ảnh hưởng trực tiếp tới chất lượng phôi Nghiên cứu của tác giả Loutradi K E và CS năm 2006 trên

219 cặp vợ chồng làm IVF-ICSI Các cặp vợ chồng được chia thành 5 nhóm:

Nhóm 1: Chồng có chất lượng tinh dịch đồ bình thường; nhóm 2: Chồng thiểu năng tinh trùng mức độ nhẹ; nhóm 3: Chồng thiểu năng tinh trùng nặng; nhóm 4: Chồng không có tinh trùng do tắc ống dẫn tinh, thu tinh trùng bằng kỹ thuật chọc hút mào tinh; nhóm 5: Chồng không có tinh trùng không do tắc ống dẫn tinh, tinh trùng được thu trực tiếp từ tinh hoàn Kết quả đánh giá trên tỉ lệ thụ tinh, chất lượng phôi giai đoạn phôi phân cắt, chất lượng phôi nang giữa 5 nhóm cho thấy sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê giữa nhóm 1 và 2, tuy nhiên sự khác biệt rõ rệt khi so sánh giữa nhóm 1 với nhóm 3, 4 và 5

Nghiên cứu kết luận chất lượng tinh dịch có ảnh hưởng xấu đến sự thụ tinh và quá trình phát triển của phôi [83]

Năm 2020, một nghiên cứu khác của tác giả Kahraman S và CS cũng trên đối tượng bệnh nhân nam vô sinh do thiểu năng tinh trùng nặng hoặc không có tinh trùng trong tinh dịch điều trị IVF - PGT-A Số liệu được thu thập trong vòng 8 năm và kết quả cho thấy tỉ lệ phôi bất thường nhiễm sắc thể và tỉ lệ phôi khảm tăng trên đối tượng bệnh nhân này, đặc biệt là nhóm bệnh nhân nam điều trị thụ tinh trong ống nghiệm bằng tinh trùng thu trực tiếp từ tinh hoàn [84] Đồng thời, nhóm tác giả cũng đánh giá về tỉ lệ phôi bất thường NST ở 2 nhóm lớn: Nhóm 1: Chồng thiểu năng tinh trùng nặng (gồm 3 nhóm nhỏ: mật độ tinh trùng 1 - 5triệu/ml; < 1triệu/ml; thu tinh trùng từ tinh hoàn), vợ < 36 tuổi; nhóm 2: Chồng thiểu năng tinh trùng nặng (3 nhóm nhỏ: mật độ tinh trùng 1 - 5triệu/ml; < 1triệu/ml; thu tinh trùng từ tinh hoàn), vợ ≥ 36 tuổi

Kết quả cho thấy ở nhóm < 36 tuổi, tỉ lệ phôi bất thường NST cao nhất ở phân nhóm chồng vô tinh thu tinh trùng từ tinh hoàn Ở nhóm tuổi vợ ≥ 36, tỉ lệ bất thường NST phôi cũng cao hơn có ý nghĩa ở phân nhóm chồng thu tinh trùng từ tinh hoàn và phân nhóm thiểu tinh nặng mật độ tinh trùng < 1triệu/ml Kết luận nghiên cứu nhóm tác giả nhấn mạnh nên cân nhắc sàng lọc di truyền trước làm tổ cho những trường hợp chồng thiểu năng tinh trùng nặng

Theo tác giả Masoumi S Z và CS (2015), Kahraman S và CS (2020) cho thấy tỉ lệ vô sinh liên quan đến các yếu tố nam giới nói chung chiếm tỉ lệ từ 50 - 66% các trường hợp hiếm muộn, trong đó trên 20% được chẩn đoán là do thiểu năng tinh trùng nặng [80], [84] Một bài báo cáo tổng quan năm 2015 chỉ ra rằng tỉ lệ vô sinh nam trong một số nghiên cứu ở các quần thể khác nhau dao động từ 23% - 50% và 20% các trường hợp vô sinh nguyên nhân do cả vợ và chồng [85] Tương đồng với các nghiên cứu đó, tỉ lệ vô sinh do chồng trong nghiên cứu của chúng tôi là 30,1% và tỉ lệ vô sinh do cả vợ cả chồng chiếm 22,6% (bảng 3.1)

4.1.2 Tiền sử thai sản liên quan

Toàn bộ bệnh nhân được lựa chọn vào nghiên cứu của chúng tôi đều là những bệnh nhân nguy cơ cao tạo phôi bất thường NST, có chỉ định làm sàng lọc di truyền NST phôi, do vậy tiền sử thai sản là một yếu tố lựa chọn quan trọng Phần đông các cặp vợ chồng chúng tôi thu thập số liệu đều rất vất vả trong quá trình điều trị hỗ trợ sinh sản: Tiền sử làm IVF thất bại làm tổ nhiều lần (chiếm tỉ lệ 18,8% tổng số bệnh nhân nghiên cứu); sảy thai, thai lưu liên tiếp nhiều lần (chiếm tỉ lệ rất cao: 70,4%); từng phải đình chỉ thai do thai mang dị tật (1,1%) (bảng 3.2) Đây đều là những yếu tố định hướng tới khả năng cao lý do vô sinh đến từ phía bất thường NST phôi

Hàng loạt nghiên cứu trên thế giới đã chỉ ra mối liên quan chặt chẽ giữa sảy thai liên tiếp và bất thường nhiễm sắc thể Sảy thai liên tiếp có thể do bất thường NST bố mẹ, có thể do đột biến NST phôi thai [7], [86], [87] Không chỉ sảy thai liên tiếp gợi ý đến tình trạng phôi thai mang bất thường NST, thất bại làm tổ nhiều lần ở những bệnh nhân điều trị thụ tinh trong ống nghiệm cũng có thể là hậu quả của bất thường NST phôi [88] Năm 2003, tác giả Pehlivan T và CS nghiên cứu trên 49 bệnh nhân có tiền sử thất bại làm tổ liên tiếp Các tác giả đã sử dụng kỹ thuật FISH trên phôi bào được sinh thiết từ phôi ngày 3, khảo sát NST 13, 16, 18, 21, 22, X và Y Kết quả cho thấy tỉ lệ bất thường NST phôi ở nhóm bệnh nhân này cao hơn có ý nghĩa thống kê so với nhóm chứng [89] Tương tự, Das M và CS (2012) cũng kết luận bất thường NST phôi là một trong những nguyên nhân chính gây nên tình trạng thất bại làm tổ nhiều lần [88]

Bên cạnh tiền sử sảy thai, thai lưu liên tiếp, thất bại làm tổ nhiều lần, sự tăng cao tỉ lệ phôi bất thường NST ở những người phụ nữ lớn tuổi cũng đã được rất nhiều nghiên cứu chứng minh [1], [9], [7] Chính vì sự liên quan chặt chẽ với tỉ lệ phôi bất thường NST như vậy nên các bệnh nhân có tiền sử sảy thai, thai lưu liên tiếp, điều trị IVF nhiều lần thất bại hay tuổi cao đều cần thiết được tư vấn cân nhắc điều trị thụ tinh trong ống nghiệm kết hợp xét nghiệm di truyền trước làm tổ

4.1.3 Dự trữ buồng trứng và mối tương quan của nó với tuổi mẹ và số lượng noãn trưởng thành

FSH (Follicle Stimulating Hormone), LH (Luteinizing Hormone), PRL (Prolactin), Progesterol, AMH (Anti-Mullerian Hormone) là những hormone quan trọng ở phụ nữ trong độ tuổi sinh sản, đặc biệt trên phụ nữ hiếm muộn

Trong số đó, vai trò của AMH nhận được sự quan tâm của nhiều nhà khoa học từ lâu và đến nay vẫn rất nhiều nghiên cứu xoay quanh yếu tố này AMH là hormone phản ánh dự trữ buồng trứng của người phụ nữ, được tiết ra từ tế bào hạt của nang noãn giai đoạn phát triển từ nang tiền hốc đến nang noãn có hốc nhỏ, đây là dấu ấn sinh học đáng tin cậy để tiên lượng về chất lượng noãn trong thụ tinh ống nghiệm và khi nồng độ AMH < 0,47ng/mL là tín hiệu của một chu kỳ kích trứng tiên lượng kém cần tư vấn kỹ càng cho người bệnh trước khi bước vào điều trị [90]

Biểu đồ 4.1 Nồng độ AMH, số AFC, số noãn MII, số noãn thụ tinh, số phôi ngày 3 và số phôi nang trung bình theo các nhóm tuổi

Không chỉ ảnh hưởng lên chất lượng noãn thu được của người mẹ, nồng độ AMH thấp còn ảnh hưởng đến tỉ lệ bất thường NST của thai nhi, đồng nghĩa với việc ảnh hưởng lên tỉ lệ bất thường NST phôi Nghiên cứu năm 2015 của nhóm tác giả Shim S H cùng CS cho thấy nồng độ AMH thấp hơn có ý nghĩa thống kê ở nhóm bệnh nhân sảy thai sớm làm karyotype thai nhi mang NST bất thường so với nhóm bệnh nhân sảy thai sớm có karyotype thai nhi bình thường (3,43 ± 3,18 với 4,60 ± 3,86, p = 0,022) [64] Một nghiên cứu khác năm 2019 về AMH của tác giả Mc Cormack Catherine D và CS chỉ ra rằng ở phụ nữ dù tuổi < 35 hay ≥ 35 thì nồng độ AMH của những bệnh nhân sảy thai sớm liên tiếp đều thấp hơn so với những phụ nữ cùng nhóm tuổi trong quần thể bình thường [91] Trong nghiên cứu của chúng tôi, bệnh nhân đều là các trường hợp có nguy cơ cao tạo bất thường NST phôi, 70,4% bệnh nhân có tiền sử sảy thai, thai lưu liên tiếp Nồng độ AMH trung bình của bệnh nhân trong nghiên cứu của chúng tôi là 3,99 ± 3,14ng/mL, tăng nhẹ so với nồng độ AMH trung bình trên nhóm bệnh nhân sảy thai sớm làm karyotype thai nhi bất thường (3,43 ± 3,1814ng/mL) và thấp hơn so với AMH trung bình của nhóm bệnh nhân sảy thai sớm xét nghiệm karyotype thai nhi kết quả bình thường (4,60 ± 3,86ng/mL) trong nghiên cứu của tác giả Shim S H và CS

AMH là hormone liên quan chặt chẽ với tuổi của người mẹ và số noãn thu được sau chọc noãn trên bệnh nhân điều trị IVF, do đó đối với bệnh nhân khi chuẩn bị bước vào một chu kỳ kích trứng trong điều trị hỗ trợ sinh sản, để cân nhắc liều Gonadotropin phù hợp, yếu tố đầu tiên các nhà lâm sàng quan tâm đến là chỉ số AMH Đánh giá mối liên hệ giữa AMH và tuổi người mẹ, nghiên cứu của tác giả Sun X Y và CS năm 2020 trên tổng số 314 bệnh nhân điều trị thụ tinh trong ống nghiệm cho thấy nồng độ AMH có xu hướng giảm theo sự gia tăng của tuổi mẹ Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng nồng độ AMH trong máu có liên quan chặt chẽ với số noãn thu được: Đối tượng nghiên cứu được chia làm ba nhóm: Nhóm 1: tuổi mẹ từ 22 - 28; nhóm 2: tuổi mẹ 29 - 35; nhóm 3: tuổi mẹ từ 36 - 43 Số liệu kết quả thể hiện nồng độ AMH có mối tương quan thuận có ý nghĩa thống kê với số noãn thu được ở nhóm 2, 3 [92] Kết quả này tương đồng với kết quả nghiên cứu của chúng tôi: AMH trung bình ở 3 nhóm tuổi < 30; 30 - 35; > 35 lần lượt là 5,48 ± 3,04; 3,99 ± 3,35; 3,59 ± 2,86ng/mL (bảng 3.3) Số liệu cho thấy nồng độ AMH trung bình giảm có ý nghĩa theo sự tăng của tuổi mẹ (p < 0,05); đồng thời số noãn trưởng thành thu được cũng giảm có ý nghĩa khi tuổi mẹ tăng cao, số noãn trưởng thành trung bình ở 3 nhóm I, II, II lần lượt là 12,5 ± 6,18; 9,83 ± 4,55; 8,16 ± 4,69 (p < 0,05) Sự giảm số lượng nang noãn theo độ tuổi người mẹ cũng được chứng minh trong nghiên cứu của năm 2022 của tác giả Kozlowski I F và CS tiến hành trên ba nhóm bệnh nhân: Nhóm I: Bệnh nhân tuổi ≤ 35 tuổi; nhóm II: Tuổi từ 36 - 39; nhóm III: Tuổi ≥ 40 Kết quả cho thấy tuổi người phụ nữ càng cao, số noãn và số noãn trưởng thành thu được càng giảm [93]

Bên cạnh AMH, một yếu tố khác cũng có vai trò hỗ trợ các nhà lâm sàng tiên lượng hiệu quả điều trị kích thích buồng trứng cho bệnh nhân, đó là số nang thứ cấp AFC (Antral Follicle Count) Đây là những nang noãn có kích thước 2 - 10mm đếm được trong buồng trứng dưới siêu âm vào ngày 2 hoặc ngày 3 chu kỳ kinh Số liệu của chúng tôi cho thấy tuổi mẹ càng cao, số AFC trung bình càng ít, kết quả này tương đồng với kết quả nghiên cứu của tác giả Barbakadze L và CS năm 2015 cũng minh chứng rằng tuổi mẹ càng cao, chỉ số AFC càng giảm, nghiên cứu của nhóm tác giả này cũng cho thấy mối tương quan thuận giữa chỉ số AFC và nồng độ AMH trong máu, sử dụng AMH kết hợp AFC có thể giúp cải thiện độ chính xác sự đánh giá của bác sĩ lâm sàng về khả năng dự trữ buồng trứng cũng như tiên lượng đáp ứng điều trị của người bệnh [94].

Hình thái, cấu trúc phôi nang trước sinh thiết, sau sinh thiết 3 giờ và sau rã đông 4 giờ sau rã đông 4 giờ

4.2.1 Hình thái, cấu trúc của phôi nang trước sinh thiết

Chất lượng hình thái phôi nang dù đánh giá theo tiêu chuẩn phân loại nào cũng đều dựa vào các đặc điểm hình thái cơ bản của phôi: Độ nở rộng của khoang phôi, đặc điểm ICM và TE Tuỳ vào cách phân chia theo thể tích khoang phôi và mức độ thoát màng mà giai đoạn phát triển của phôi nang được ký hiệu có chút khác biệt ở các hệ thống phân loại khác nhau Phôi độ 4 theo phân độ của tác giả Gardner D K tương đương với phôi độ 3 theo phân loại hình thái của đồng thuận Istanbul Do đó, phôi có chất lượng hình thái tốt nhất theo phân loại hình thái của tác giả Gardner là phôi 4AA, 4AB, 4BA, tương ứng với phôi 3AA, 3AB, 3BA theo Đồng thuận Istanbul Để thuận tiện cho việc nghiên cứu, đánh giá, một số tác giả gộp các loại hình thái phôi thành 3 nhóm chất lượng hình thái phôi: Phôi tốt, phôi trung bình, kém [10]

Một số nghiên cứu khác lại chia chi tiết hơn thành 4 loại: Phôi rất tốt, phôi tốt, phôi trung bình, phôi kém Trong đó, phôi rất tốt là những phôi có chất lượng hình thái tế bào nổi trội nhất, lá nuôi và nụ phôi đều được đánh giá loại A; đây là những phôi về mặt hình thái được đánh giá là phôi đẹp nhất và sức sống tiên lượng tốt nhất Tiếp đến là phôi tốt, gồm những phôi AB, BA; phôi trung bình gồm những phôi BB, AC, CA; các hình thái còn lại thuộc nhóm phôi chất lượng kém [33], [71] Với mục đích đánh giá tỉ mỉ về chất lượng hình thái phôi sinh thiết của bệnh nhân điều trị IVF-PGT-A, chúng tôi lựa chọn chia chất lượng hình thái phôi thành 4 loại để có thể có cái nhìn tổng quát, đầy đủ hơn về các đặc điểm hình thái phôi nang trải qua các giai đoạn, trải qua các kỹ thuật khác nhau trước khi được chuyển vào buồng tử cung của người mẹ Đồng thời, chúng tôi cũng thu thập số liệu bao gồm cả phôi sinh thiết có chất lượng hình thái rất kém với hình thái ICM và TE đều là loại C (3CC); đây hầu hết là phôi của những bệnh nhân có tiền sử sảy thai, thai lưu liên tiếp hoặc thất bại làm tổ nhiều lần (chưa rõ nguyên nhân) nhưng sau chọc noãn tạo phôi lại thu được số lượng phôi nang rất ít, bệnh nhân vẫn có nguyện vọng xét nghiệm di truyền những phôi này sau khi đã được bác sĩ tư vấn đầy đủ thông tin

Trong nghiên cứu của chúng tôi, đối tượng bệnh nhân tham gia nghiên cứu đều là các bệnh nhân có tiền sử nguy cơ cao tiên lượng tạo phôi bất thường NST Quan sát về mặt hình thái phôi, số liệu cho thấy trong 623 phôi sinh thiết đi được tới chặng cuối cùng có kết quả NST, các loại hình thái phôi (rất tốt, tốt, trung bình, kém) chiếm tỉ lệ gần như tương đương nhau giữa các nhóm tuổi (p(1-2-3) > 0,05) (biểu đồ 3.2) Đánh giá số lượng phôi rất tốt và phôi tốt, chúng tôi thấy rằng tổng số phôi với 2 loại hình thái này ở 3 nhóm tuổi chiếm tỉ lệ tương đối đồng đều, tương ứng với nhóm 1, 2, 3 lần lượt 52,1%;

55,6%; 54,7% Kết quả này đồng thuận với kết quả nghiên cứu của tác Sainte- Rose R và CS năm 2021, nhóm tác giả chỉ phân chia phôi thành 3 loại chất lượng hình thái tốt, trung bình, kém Nghiên cứu cho thấy tỉ lệ phôi hình thái tốt ở các nhóm tuổi < 30, 30 - 36 và > 36 không có sự khác biệt đáng kể, lần lượt là 46%; 48%; 49% [79]

Trong 288 phôi NST bình thường, tổng số phôi rất tốt chúng tôi thu được chiếm 38,2% (110 phôi), chiếm tỉ lệ cao hơn so với các loại hình thái phôi khác (bảng 3.15) Kết quả này tương đồng với kết quả nghiên cứu của Zhang W Y và CS công bố năm 2022, nhóm tác giả cho thấy trong tổng số 610 phôi chuẩn bội thu thập từ 431 bệnh nhân chuyển phôi lưu, số lượng phôi có hình thái AA là 197 phôi, chiếm tỉ lệ 32,3%, cao hơn tỉ lệ các loại hình thái phôi khác [69]

* Đường kính phôi và độ dày màng trong suốt

Nghiên cứu về đường kính phôi nang trong IVF không can thiệp hỗ trợ thoát màng, năm 2015, tác giả Lagalla C và CS nghiên cứu trên 124 phôi nang của 75 bệnh nhân chuyển 1 hoặc 2 phôi tươi tại Trung tâm Sức khoẻ sinh sản Italia Mỗi phôi, nhóm tác giả tiến hành đánh giá hình thái phôi vào thời điểm 116 ± 1 giờ sau thụ tinh, đo đường kính phôi nang (đo một đường ngang tại vị trí rộng nhất của phôi không tính màng trong suốt) Các phôi được chia làm 3 nhóm phụ thuộc vào mức độ nở của khoang phôi Kết quả thu được: Nhúm 1: Đường kớnh phụi trung bỡnh 140 ± 8,6àm; nhúm 2: Đường kớnh phụi trung bỡnh 165 ± 5,2àm; nhúm 3: Đường kớnh phụi trung bỡnh 190 ± 9àm Trong đú, hỡnh thỏi phụi nhúm 1 tương đương với phụi loại 2 theo Đồng thuận Istanbul; phôi nhóm 2, nhóm 3 tương ứng với hình thái loại 3 theo Đồng thuận Istanbul [49]

Tại Việt Nam, nghiên cứu của tác giả Đoàn Thị Hằng năm 2013 trên phôi nang không hỗ trợ thoát màng, không sinh thiết cho thấy đường kính phụi trung bỡnh trước trữ đụng là 153,50 ± 9,4àm [95] Nghiờn cứu của tỏc giả Dương Đình Hiếu năm 2016 đánh giá chi tiết hơn đưa ra kết quả đường kính trung bình phôi nang chất lượng tốt, trung bình, xấu lần lượt là 181,7 ± 8,5àm; 178,2 ± 10,3àm; 168,1 ± 7,2àm [96] Trong nghiờn cứu của chỳng tụi, đường kớnh phụi trung bỡnh là 136,81 ± 11,57àm (bảng 3.5) Đường kớnh phôi trung bình trong nghiên cứu của chúng tôi nhỏ hơn so với các nghiên cứu khác do: Thứ nhất, khi đo đường kính phôi trong các nghiên cứu trước đây, các tác giả đo toàn bộ độ rộng của phôi tính cả màng trong suốt, trong khi trong nghiên cứu của chúng tôi đường kính phôi chỉ được tính là đường kính khối phôi bên trong không bao gồm màng trong suốt Thứ hai, trong các nghiên cứu kể trên, phôi nghiên cứu là phôi không sinh thiết, không có đục lỗ màng trong suốt hỗ trợ thoát màng, phôi trong nghiên cứu của chúng tôi là phôi được đục lỗ màng trong suốt chủ động vào giai đoạn ngày 3 của tuổi phôi (giai đoạn phôi phân cắt), khi phôi phát triển qua giai đoạn phôi nang đầy bước sang giai đoạn phôi nang nở rộng, một số TE đã bắt đầu thoát qua lỗ thủng màng trong suốt, đây cũng là thời điểm tiến hành sinh thiết phôi Do vậy, mức độ nở rộng của khoang phôi cũng như đường kính phôi chúng tôi đánh giá không đạt được tới ngưỡng phôi nở rộng tối đa như phôi nang tự thoát màng theo sinh lý thông thường Kết quả của chúng tôi cũng phù hợp với nghiên cứu của tác giả Kirkegaard K và CS năm 2012, nghiên cứu này cho thấy phôi được đục lỗ màng trong suốt hỗ trợ thoát màng từ giai đoạn phôi phân cắt, tại thời điểm thoát màng, kích thước của những phôi này sẽ nhỏ hơn có ý nghĩa so với những phôi phát triển tự nhiên [37]

Thống kê phân tích số liệu 623 phôi trước sinh thiết, chúng tôi thu được độ dày màng trong suốt trung bỡnh là 16,43 ± 2,39àm (bảng 3.5) Kết quả của chúng tôi phù hợp với kết quả nghiên cứu của tác giả Coello A và CS (2017)

Theo nghiên cứu của nhóm tác giả này, độ dày màng trong suốt của phôi nang dao động trung bỡnh từ 12 - 19àm [42] Tại Việt Nam, nghiờn cứu của tỏc giả Đoàn Thị Hằng (2013) khảo sát trên 1375 phôi nang cho thấy độ dày màng trong suốt của phôi nang giai đoạn phôi nở rộng trước khi được trữ đông là 13,60 ± 1,50àm Nghiờn cứu của tỏc giả Dương Đỡnh Hiếu cụng bố năn 2016 đánh giá chi tiết hơn khi phân tích theo từng loại chất lượng phôi nang Theo tác giả, độ dày màng trong suốt trung bình của phôi tốt, trung bình, xấu lần lượt là 9,4 ± 2,2àm; 10,1 ± 2,2àm; 11,7 ± 1,3àm So với kết quả nghiờn cứu của hai tác giả trên, độ dày màng trong suốt của phôi trong nghiên cứu của chúng tôi tương đối dày hơn (16,43 ± 2,39àm so với 13,60 ± 1,50àm; 9,4 ± 2,2àm; 10,1 ± 2,2àm; 11,7 ± 1,3àm) Điều này được lý giải tương tự như lý do đường kớnh phôi của chúng tôi nhỏ hơn so với đường kính phôi nang trong một số nghiên cứu khác Do phôi trong nghiên cứu của chúng tôi là phôi đã được đục lỗ màng trong suốt hỗ trợ phôi thoát màng từ giai đoạn phôi phân cắt, trong khi đó phôi trong các nghiên cứu khác là phôi nang phát triển và thoát màng tự nhiên Tác giả Kirkegaard K và CS cũng chỉ ra rằng phôi được đục lỗ màng trong suốt từ giai đoạn phôi phân cắt, tại thời điểm thoát màng, không chỉ kích thước của những phôi này sẽ nhỏ hơn mà độ dày màng trong suốt cũng dày hơn có ý nghĩa so với những phôi phát triển tự nhiên [37]

4.2.2 Mức độ nở lại, đường kính phôi, độ dày màng trong suốt của phôi sau sinh thiết 3 giờ

Theo tiêu chuẩn lựa chọn trong nghiên cứu của chúng tôi, các phôi được lựa chọn vào nghiên cứu là phôi nang độ 3 theo phân loại của Đồng thuận Istanbul Đường kính phôi trung bình đo tại thời điểm trước sinh thiết trong nghiờn cứu của chỳng tụi là 136,81 ± 11,57àm (bảng 3.8) Việc sử dụng laser tiếp cận và lấy đi một số tế bào từ đám TE thoát qua lỗ thủng màng trong suốt gây hiện tượng xẹp sinh lý của khoang phôi ngay sau sinh thiết, tuy nhiên sau sinh thiết, 100% phôi sống, không có phôi nào bị thoái hoá Kết quả này của chúng tôi phù hợp với kết quả nhiều nghiên cứu đã thực hiện trước đây cho thấy kỹ thuật sinh thiết không ảnh hưởng tới sức sống cũng như tiềm năng phát triển của phôi [22], [33], [35] Đánh giá phôi tại thời điểm sau sinh thiết 3 giờ (trước khi trữ đông phôi), tỉ lệ phôi nở lại trong nghiên cứu của chúng tôi là 97,1% Theo nhóm tác giả Chen H H (2017), thời điểm tối ưu để tiến hành trữ đông phôi là trong khoảng 3 - 6 giờ sau sinh thiết [32], tương tự, theo Allen M và CS (2022), trữ đông phôi tại thời điểm phôi nở lại với thời gian trung bình sau sinh thiết là 3,3 giờ cho tỉ lệ trẻ sinh sống sau chuyển phôi rất khả quan [44]

Cũng trong năm 2022, một nghiên cứu khác của tác giả Miki T và CS thực hiện một nghiên cứu tỉ mỉ trên 1202 phôi nang của chuột Nhóm tác giả đánh giá rất chi tiết về mức độ nở lại, tốc độ phát triển của phôi trong các nhóm phôi được chia theo khoảng thời gian từ lúc sinh thiết tới thời điểm trữ đông phôi 0 giờ, 1 giờ, 2 giờ, 3 giờ, 4 giờ Nghiên cứu đưa ra gợi ý quá trình trữ đông phôi nang sinh thiết nên được thực hiện trong vòng 1 giờ hoặc hơn 3 giờ sau khi sinh thiết TE [97] Những nghiên cứu này là cơ sở để chúng tôi lựa chọn đánh giá hình thái phôi sau sinh thiết trong nghiên cứu của mình là 3 giờ kể từ lúc sinh thiết phôi Đánh giá tại thời điểm sau sinh thiết phôi 3 giờ, tỉ lệ phôi nở lại trong nghiên cứu của chúng tôi cũng tương đồng với kết quả nghiên cứu của tác giả Capalbo A và CS (2016) và nghiên cứu của Chen H H và CS (2017) cho thấy: Trong vòng 3 giờ sau sinh thiết, trên 90% phôi sẽ nở lại; sau 4,5 - 6 giờ sau sinh thiết, 97,8% phôi nang nở lại [35], [32] Số liệu của chúng tôi chưa thấy sự khác biệt có ý nghĩa về tỉ lệ phôi chất lượng hình thái tốt, trung bình giữa 2 nhóm phôi nở lại (hoàn toàn hoặc gần hoàn toàn) và nhóm phôi không nở lại (hoặc nở lại ít) sau sinh thiết (p > 0,05) Tuy nhiên, chúng tôi nhận thấy tỉ lệ phôi hình thái rất tốt thấp hơn rõ rệt và tỉ lệ phôi hình thái kém cao hơn rõ rệt ở nhóm phôi không nở lại (hoặc nở lại rất ít) so với nhóm phôi nở lại (hoàn toàn hoặc gần hoàn toàn) sau sinh thiết (5,6% so với 30,4% và 44,4% so với 19%)

* Đường kính phôi và màng trong suốt Đánh giá 623 phôi sau sinh thiết 3 giờ trong nghiên cứu của chúng tôi, số phôi nở lại (hoàn toàn hoặc gần hoàn toàn) là 605 phôi, số phôi không nở lại (hoặc nở lại ít) là 18 phôi (bảng 3.6) Nhìn chung, so với thời điểm trước sinh thiết, đường kính trung bình của phôi sau sinh thiết 3 giờ vẫn nhỏ hơn có ý nghĩa so với đường kính trung bình phôi thời điểm trước sinh thiết (136,51 ± 12,17àm so với 136,81 ± 11,57àm), tuy nhiờn độ dày màng trong suốt trung bình của phôi sau sinh thiết mỏng hơn không đáng kể so với thời điểm trước sinh thiết (16,42 ± 2,39àm so với 16,43 ± 2,39àm) (bảng 3.8) Đường kớnh phôi và độ dày màng trong suốt phản ánh mức độ hồi phục của phôi về mặt kích thước và thể tích Tại thời điểm 3 giờ sau sinh thiết, số phôi nở lại hoàn toàn hoặc gần hoàn toàn so với trạng thái ban đầu (trạng thái trước sinh thiết) trong nghiên cứu của chúng tôi đạt là 97,1%; 2,9% phôi chưa nở lại hoặc nở lại rất ít Do vậy, kết quả đường kính phôi trung bình sau sinh thiết 3 giờ nhỏ hơn so với thời điểm trước sinh thiết là phù hợp Sự nở lại của phôi tại thời điểm sau sinh thiết 3 giờ chỉ đạt mức về trạng thái ban đầu hoặc gần hoàn toàn về trạng thái ban đầu cũng là lý do tạo nên sự thay đổi không đáng kể của độ dày màng trong suốt sau sinh thiết do màng trong suốt sẽ chỉ thật sự mỏng đi khi phôi phát triển mạnh mẽ với sự tăng thể tích rõ rệt của khoang phôi

4.2.3 Mức độ nở lại, đường kính phôi và độ dày màng trong suốt của phôi sau rã đông 4 giờ

* Mức độ nở lại Đánh giá hình thái phôi sau rã đông, đã có một số nghiên cứu tiến hành trên những khoảng thời gian khác nhau Nhìn chung, khoảng thời gian tính từ thời điểm rã đông tới thời điểm phôi được đánh giá hình thái dao động từ 1 - 6 giờ Một số tác giả gợi ý nên đánh giá hình thái phôi trong khoảng 2 - 4 giờ sau rã đông [42] Dựa theo các nghiên cứu đã tiến hành trước đây và để phù hợp với quy trình labo, nghiên cứu của chúng tôi lựa chọn đánh giá hình thái phôi tại thời điểm 4 giờ sau rã đông ngay trước chuyển phôi

Nghiên cứu về hình thái phôi sau rã đông, năm 2017, tác giả Coello A và CS khảo sát trên 528 phôi nang của 386 chu kỳ rã đông phôi (phôi không sinh thiết xét nghiệm NST), kết quả cho thấy sau rã đông, 97,2% phôi sống

Trong số các phôi sống sau rã đông, 93% phôi nở lại và 7% phôi không nở lại Sau chuyển phôi, nhóm phôi nở lại sau rã đông (hoàn toàn hoặc 1 phần) cho tỉ lệ làm tổ cao hơn có ý nghĩa so với nhóm phôi không nở lại [42] Trong nghiên cứu của chúng tôi, do chỉ những phôi cho kết quả rõ ràng NST bình thường mới được rã đông, vì vậy, tỉ lệ phôi sống sót và nở lại sau rã đông là 100% Kết quả của chúng tôi cũng đồng thuận với hàng loạt những nghiên cứu đã thực hiện trên phôi sàng lọc NST: Nghiên cứu của tác giả Chen H H và CS (2017) trên 357 phôi sinh thiết cho thấy sau rã đông, 100% phôi nở lại; nghiên cứu của tác giả Maggiulli R và CS (2019) cũng cho kết quả tương tự; tác giả Allen M và CS (2022) khảo sát trên 196 phôi nang chuẩn bội cho kết quả sau rã đông, 100% phôi sống [32], [36], [44]

Tỉ lệ bất thường nhiễm sắc thể của phôi thụ tinh trong ống nghiệm và mối liên quan với hình thái phôi

4.3.1 Tỉ lệ bất thường NST của phôi thụ tinh trong ống nghiệm

* Tỉ lệ bất thường NST nói chung của phôi thụ tinh trong ống nghiệm

Trong nghiên cứu của chúng tôi, xét nghiệm đánh giá nhiễm sắc thể phôi được thực hiện sử dụng kỹ thuật NGS, kết quả tỉ lệ khuếch đại gen thành công là 95%, đồng thuận với kết quả nghiên cứu của tác giả Nguyễn Thị Bích Vân công bố năm 2022 [99] Đánh giá về chất lượng phôi NST nói chung, xét trên toàn bộ 623 phôi xét nghiệm có kết quả NST rõ ràng, chúng tôi nhận thấy tỉ lệ phôi chuẩn bội, phôi bất thường NST lần lượt là 46,2%, 35,8% (bảng 3.11) Các tỉ lệ này của chúng tôi tương đồng với kết quả của nhiều nghiên cứu đã thực hiện trước đây

Tác giả Chen H H và CS năm 2017 phân tích kết quả xét nghiệm NST của 1329 phôi nang của 223 bệnh nhân, số liệu cho thấy tỉ lệ phôi chuẩn bội đạt 43,3% [32] Cùng năm đó, nghiên cứu của tác giả Majumdar G và CS chỉ ra rằng tỉ lệ bất thường NST phôi nói chung là 39,7% và tỉ lệ này ở nhóm phụ nữ tuổi < 37 là 34,5% [9] Năm 2022, nghiên cứu của tác giả Yu E J và CS trên 647 phôi nang chia làm 2 nhóm: Phôi nang được sinh thiết trước trữ đông và phôi nang được sinh thiết sau rã đông, kết quả thu được tỉ lệ phôi chuẩn bội dao động từ 39,9% (ở những trường hợp rã đông phôi nang và sinh thiết phôi sau rã đông) đến 46,4% ở những trường hợp phôi nuôi đến giai đoạn phôi nang, sinh thiết và trữ đông Nghiên cứu cũng thể hiện sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê về tỉ lệ phôi chuẩn bội giữa nhóm phôi nang sinh thiết trước khi trữ đông và nhóm phôi nang sinh thiết sau khi rã đông phôi [47]

Tỉ lệ phôi khảm trong nghiên cứu của chúng tôi là 18% Năm 2021, nhóm nghiên cứu của tác giả Viotti M và CS công bố kết quả thu thập thông tin từ 1000 phôi nang khảm được cung cấp bởi 5 trung tâm IVF khác nhau Tỉ lệ phôi khảm ở các trung tâm này dao động từ 11% - 25,7%, trung bình là 18,6% [100] Nghiên cứu của Gao J và CS (2023) cũng cho thấy tỉ lệ phôi khảm ở phôi sinh thiết ngày 5, ngày 6 lần lượt là 15,6%; 17,8% [72] Số liệu cho thấy phôi khảm chiếm một số lượng không nhỏ trong các phôi thụ tinh ống nghiệm nói chung, đây là hi vọng cho các bệnh nhân sàng lọc di truyền cơ hội có phôi chuyển, đặc biệt là trên những bệnh nhân không có phôi NST bình thường

* Tỉ lệ bất thường NST của phôi thụ tinh trong ống nghiệm theo tuổi mẹ Đánh giá chi tiết NST phôi theo tuổi mẹ, chúng tôi nhận thấy rằng tỉ lệ phôi chuẩn bội giảm có ý nghĩa ở nhóm tuổi mẹ > 35 so với nhóm tuổi < 30 và nhóm tuổi 30 - 35 (35,7% so với 51,1% và 54,1%; p < 0,05), đồng thời, tỉ lệ bất thường NST tăng cao ở nhóm tuổi > 35 (bảng 3.11) Sự gia tăng tỉ lệ phôi bất thường NST theo sự tăng của tuổi mẹ đã được nhiều nghiên cứu chứng minh Trước đây, đa phần các nghiên cứu quan tâm nhiều đến ngưỡng tuổi 40 của phụ nữ, nhấn mạnh khi tuổi mẹ từ 40 trở lên, nguy cơ bất thường NST phôi tăng cao [6], [55] Tuy nhiên vài năm trở lại đây, các nghiên cứu đề cập nhiều đến mốc tuổi 35 của người mẹ, bên cạnh các kết quả cho thấy tỉ lệ bất thường NST phôi bắt đầu tăng đáng kể từ tuổi 35, các nhà khoa học còn chứng minh từ ngưỡng tuổi này, vai trò của sàng lọc NST mới thực sự phát huy được giá trị của nó trong việc cải thiện tỉ lệ trẻ sinh sống sau chuyển phôi

Tác giả Munné S và CS (2012) phân tích số liệu đã chứng minh tỉ lệ phôi chuẩn bội từ 50,9% ở nhóm tuổi mẹ < 35, giảm xuống 37,5% ở nhóm tuổi mẹ 35 - 39 và còn 34,8% khi tuổi mẹ ≥ 40 Simopoulou M và CS công bố một bài báo năm 2021 phân tích cho thấy kỹ thuật PGT-A không giúp cải thiện kết quả lâm sàng trên quần thể bệnh nhân điều trị thụ tinh ống nghiệm nói chung nhưng giúp tăng tỉ lệ trẻ sinh sống khoẻ mạnh ở bệnh nhân > 35 tuổi [7], [101] Tại Việt Nam, nghiên cứu của tác giả Nguyễn Thị Bích Vân công bố năm 2022 cũng cho thấy tỉ lệ phôi bất thường NST tăng đáng kể ở các nhóm tuổi mẹ > 35 so với nhóm tuổi mẹ < 35 [99]

Trong các loại bất thường NST, bất thường số lượng NST là loại bất thường ảnh hưởng lớn tới sức sống, tiềm năng phát triển, làm tổ của phôi, gây ra những dị tật nặng nề cho trẻ sau sinh Nghiên cứu của tác giả Hassold T cùng CS năm 1985 thống kê cho thấy chỉ đánh giá riêng bất thường trisomy đã chiếm tới gần 30% các trường hợp sảy thai tự phát ở người phụ nữ [102]

Bất thường số lượng NST cũng là loại bất thường chiếm tỉ lệ cao nhất trong phôi thụ tinh ống nghiệm Trong nghiên cứu của chúng tôi, tỉ lệ này là 74,9% trên tổng số phôi bất thường (bảng 3.12) Chúng tôi nhận thấy bất thường số lượng NST có thể gặp ở bất kì NST nào, hay gặp nhất ở nhóm tuổi < 30 là bất thường NST số 14, tuy nhiên cỡ mẫu của nhóm tuổi này trong nghiên cứu của chúng tôi còn thấp Ở nhóm tuổi 30 - 35 và > 35, bất thường số lượng NST hay gặp nhất ở NST số 16, 21, 22 Đồng thuận với kết quả của chúng tôi, nghiên cứu của tác giả Rubio C và CS từ nhiều năm trước đã chỉ ra tỉ lệ bất thường NST số 16 và 22 cao hơn có ý nghĩa ở nhóm phụ nữ có tiền sử sảy thai liên tiếp đồng thời cũng cho thấy bất thường NST gặp nhiều nhất ở NST 16, 21, 22 [52] Một nghiên cứu khác của tác giả Alfarawati S và CS cũng nhấn mạnh về sự tăng mạnh nguy cơ bất thường của NST 21 theo tuổi người mẹ [1] Bài báo tổng quan của tác giả Viotti M công bố năm 2020 phân tích chỉ ra rằng bất thường số lượng NST phổ biến nhất là ở NST 15, 16, 21, 22; ít gặp hơn là bất thường số lượng NST từ 1 đến 6 (là những NST lớn) [103] Bất thường số lượng NST chiếm tỉ lệ lớn trong số các loại bất thường NST phôi, gây ảnh hưởng đến tiềm năng phát triển, làm tổ của phôi và tăng theo tuổi của tuổi mẹ, vì những lý do đó, đây là một trong những nguyên nhân chính gây nên tình trạng khó mang thai, dễ sảy thai và nguy cơ trẻ sinh ra mang dị tật cao ở phụ nữ nhiều tuổi

Trong bất thường số lượng NST phôi, 2 loại bất thường phổ biến là monosomy và trisomy chiếm tỉ lệ trên tổng số phôi nghiên cứu lần lượt là 8,83% (55/623) và 6,26% (39/623) (bảng 3.13), tương đối gần với tỉ lệ monosomy, trisomy trong nghiên cứu của tác giả Liu X Y và CS (2020) lần lượt là 9,3% và 7,5% [7] Đánh giá các NST bị rối loạn, nghiên cứu của chúng tôi không gặp phôi monosomy NST 1, 3, 5, 7, 10, 13; không gặp phôi trisomy NST 8, 10, 18, 19 Thừa một NST 18 là một bất thường được nhắc đến trong nhiều nghiên cứu, tuy nhiên trong nghiên cứu của chúng tôi lại không gặp trường hợp nào, chỉ gặp trisomy 18 ở những phôi đa bất thường Giả thiết đặt ra có thể là do các phôi trisomy từ bệnh nhân tuyển chọn vào nghiên cứu của chúng tôi đã không thể phát triển được đến giai đoạn phôi nang Số liệu chúng tôi thống kê cho thấy phôi monosomy gặp nhiều nhất là monosomy 15, 16, 21, 22 Phôi trisomy gặp nhiều nhất là trisomy 16, 17, 21, 22 Kết quả của chúng tôi có nhiều điểm giống với kết quả nghiên cứu của tác giả Zhang X và

CS năm 2020 thể hiện bất thường số lượng NST bao gồm monosomy và trisomy chỉ giới hạn gặp ở NST 14, 15, 16, 18, 21 và 22 Khảo sát bất thường phôi theo tuổi mẹ, nhóm tác giả cũng chỉ ra sự khác biệt không đáng kể về tỉ lệ phôi monosomy giữa nhóm tuổi < 35 và ≥ 35 ( 20,5%; 24,4%) cũng như sự khác biệt không đáng kể về tỉ lệ phôi trisomy giữa 2 nhóm tuổi này (27,5%;

28%) [104] Đồng thuận với Zhang X và CS, trong nghiên cứu của chúng tôi, tỉ lệ phôi trisomy khác biệt không có ý nghĩa thống kê giữa 3 nhóm tuổi < 30;

30 - 35 và > 35 (p(1-2-3) > 0,05) (bảng 3.13) Chúng tôi cũng nhận thấy rằng ở nhóm tuổi > 35, NST 21 luôn có mặt trong số các NST hay xuất hiện bất thường số lượng NST nhất (monosomy và trisomy) (Biểu đồ 3.4; 3.5; 3.6;

3.7) Điều này giải thích cho tình trạng nguy cơ cao trẻ sinh ra mắc hội chứng Down khi thai phụ nhiều tuổi Các nhà khoa học đã chứng minh cùng với NST 13 và 18, NST 21 là 1 NST nhỏ, chứa ít gen, do đó, phôi mang bất thường trisomy 1 trong 3 NST này vẫn có khả năng sống trong khi hầu hết những bất thường trisomy ở các NST khác đều làm cho phôi ngừng phát triển

Tuy nhiên, dù vẫn có khả năng sống nhưng những phôi bất thường số lượng 1 trong 3 NST này gây ra cho trẻ những hội chứng bệnh lý trầm trọng (Patau, Edwards, Down) [103]

Nếu như bất thường số lượng NST là loại bất thường chiếm tỉ lệ cao và tăng dần theo tuổi mẹ thì ngược lại, bất thường cấu trúc NST chiếm tỉ lệ nhỏ hơn và có xu hướng giảm dần theo sự gia tăng của tuổi mẹ Nghiên cứu của tác giả Gui J và CS năm 2022 cho thấy tỉ lệ bất thường cấu trúc NST phôi giảm từ 17,1% ở nhóm bệnh nhân < 35 tuổi xuống còn 4% ở nhóm bệnh nhân

≥ 35 tuổi [105] Kết quả này tương đồng với kết quả trong nghiên cứu của chúng tôi với tỉ lệ phôi bất thường cấu trúc NST giảm dần theo nhóm tuổi, lần lượt ở nhóm tuổi < 30, 30 - 35; > 35 là 22,7%; 11%; 5,9% (p(1-2-3) < 0,05) (bảng 3.12) Bất thường cấu trúc NST nói chung không ảnh hưởng nghiêm trọng tới sức sống của phôi như bất thường số lượng NST, tuy nhiên đa phần gây ảnh hưởng tới sức khoẻ của trẻ sinh ra, do vậy tầm soát sớm để phát hiện bất thường cấu trúc NST bằng PGT-A hoặc PGT-SR (PGT for chromosome structural rearrangements) rất cần thiết với những phụ nữ có tiền sử giữ thai khó khăn bởi khác với bất thường số lượng NST, bất thường cấu trúc NST xảy ra sớm với nguy cơ cao ngay khi phụ nữ còn ở độ tuổi còn trẻ

Bên cạnh phôi bất thường NST, phôi khảm rất được các nhà khoa học quan tâm bởi giá trị của nó có thể cân nhắc lựa chọn làm phôi chuyển trong một số trường hợp bệnh nhân không có phôi nào NST bình thường Thống kê khảo sát về phôi khảm, số liệu chúng tôi phân tích cho thấy tỉ lệ phôi khảm là 18% (bảng 3.11), phù hợp với kết quả trong nghiên cứu của tác giả Viotti M và CS 2021, nhóm tác giả thu thập thông tin từ 1000 phôi nang bất thường dạng khảm được cung cấp bởi 5 trung tâm IVF khác nhau Tỉ lệ phôi khảm ở các trung tâm này dao động từ 11 - 25,7%, trung bình là 18,6% [100] Nghiên cứu của tác giả Gao J và CS (2023) cũng cho thấy tỉ lệ phôi khảm ở phôi sinh thiết ngày 5, ngày 6 lần lượt là 15,6%; 17,8% [72] Chúng tôi cũng nhận ra một đặc điểm của phôi khảm: đó là trong khi tỉ lệ phôi bất thường NST tăng theo tuổi của người mẹ, thì tỉ lệ phôi khảm lại không có sự khác biệt có ý giữa các nhóm tuổi Tỉ lệ phôi khảm ở nhóm tuổi mẹ < 30; 30 - 35; > 35 lần lượt là 25%; 16,5%; 17,1% (p(1-2-3) > 0,05) Nghiên cứu của tác giả Yeoh M H cùng CS công bố năm 2019 cũng chứng minh tỉ lệ phôi khảm gần như không biến đổi theo sự tăng của tuổi mẹ [106]