nguyễn thị hoài khảo sát ảnh hưởng của kích thước vi nang đến một số đặc tính của vi nang chứa lactobacillus acidophilus

LỜI CẢM ƠN

Đề tài “Khảo sát ảnh hưởng của kích thước vi nang đến một số đặc tính của

vi nang chứa Lactobacillus acidophilus” đã được thực hiện và hoàn thành tại Bộ môn

Công nghệ sinh học Dược – Khoa Công nghệ sinh học Trong suốt thời gian thực hiện

khóa luận, em đã nhận được rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ của thầy cô, bạn bè và gia đình

Bằng tất cả sự kính trọng và lòng biết ơn, em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến

PGS TS Đàm Thanh Xuân - người thầy đã luôn tận tình chỉ bảo, hướng dẫn, hỗ trợ

và quan tâm, luôn đưa ra những lời khuyên bổ ích giúp em giải quyết các vấn đề mắc phải trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến TS Nguyễn Khắc Tiệp, ThS Lê Ngọc Khánh,

TS Trần Minh Đức, 3 người thầy đã luôn nhiệt tình giúp đỡ và hỗ trợ em trong suốt

quá trình thực hiện khóa luận Em cũng xin cảm ơn chị Phạm Thị Thanh Huyền, chị

Nguyễn Thị Kim Chi – kỹ thuật viên; chị Trần Thị Minh Thu, chị Đỗ Thị Huyền Thương – học viên cao học khóa 27, các bạn sinh viên cùng nghiên cứu khóa 74, cùng

các em sinh viên nghiên khóa 75, khóa 76, khóa S1K1 đang nghiên cứu tại bộ môn

Công nghệ sinh học Dược đã luôn đồng hành, giúp đỡ và chia sẻ với em trong suốt thời gian thực hiện khóa luận

Tiếp theo, em xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô giáo cùng các anh chị kỹ thuật

viên trong Bộ môn Hóa sinh, Bộ môn Vi sinh và Sinh học, Bộ môn Bào chế Công

nghiệp, Bộ môn Dược cổ truyền đã tạo mọi điều kiện, hỗ trợ em hoàn thành khóa luận

Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến Ban Giám Hiệu cùng toàn thể các Thầy Cô trong Trường Đại học Dược Hà Nội đã trao cho em những kiến thức, kinh nghiệm quý

báu trong suốt thời gian 5 năm học tập tại trường

Cuối cùng, em xin bày tỏ sự cảm ơn tới gia đình, người thân và bạn bè đã luôn

bên cạnh động viên, hỗ trợ em trong học tập và cuộc sống

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 01 tháng 06 năm 2024

Sinh viên

Nguyễn Thị Hoài

MỤC LỤC DANH MỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về Probiotic 2

1.1.1 Khái niệm và lịch sử của Probiotic 2

1.1.2 Tiêu chuẩn vi sinh vật Probiotic 2

1.1.3 Vi khuẩn Lactobacillus acidophilus 3

1.2.3.2 Phương pháp nhũ tương hóa 9

1.2.3.3 Phương pháp phun sấy 10

1.3 Tình hình nghiên cứu gần đây về dạng bào chế vi nang 10

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12

2.1 Nguyên liệu và thiết bị 12

2.1.1 Chủng vi sinh vật dùng trong nghiên cứu 12

2.1.5 Các dung dịch sử dụng trong nghiên cứu 13

2.2 Nội dung nghiên cứu 14

2.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của kích thước vi nang đến một số đặc tính của vi nang.

14

2.2.2 Đánh giá khả năng bảo vệ và giải phóng VSV tại điều kiện pH đường tiêu hóa của các mẫu vi nang chứa Lactobacillus acidophilus có kích thước khác nhau 14

2.3 Phương pháp nghiên cứu 14

2.3.1 Phương pháp tiệt khuẩn 14

2.3.1.1 Phương pháp tiệt khuẩn bằng nhiệt ẩm 14

2.3.1.2 Phương pháp tiệt khuẩn Tyndall 14

2.3.2 Phương pháp nuôi cấy thu hỗn dịch tế bào 14

2.3.3 Phương pháp tạo vi nang 15

2.3.4 Phương pháp đông khô vi nang 16

2.3.5 Phương pháp đo hàm ẩm 16

2.3.6 Phương pháp đo kích thước vi nang 16

2.3.7 Phương pháp pha loãng liên tục xác định số lượng vi sinh vật 16

2.3.8 Phương pháp xác định số lượng vi sinh vật trong vi nang sau đông khô 17

2.3.9 Phương pháp đánh giá độ rã của vi nang trong điều kiện pH đường tiêu hóa 17

2.3.10 Phương pháp đánh giá khả năng bảo vệ vi sinh vật trong dung dịch pH 2,5 17

2.3.11 Phương pháp đánh giá khả năng giải phóng VSV trong dung dịch pH 6,8 182.3.12 Phương pháp xử lý số liệu 18

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 19

3.1 Khảo sát ảnh hưởng của kích thước vi nang đến một số đặc tính của vi nang 19

3.1.1 Khảo sát ảnh hưởng của kích cỡ đầu nhỏ giọt đến kích thước vi nang tạo thành 19

3.1.2 Khảo sát ảnh hưởng của kích thước vi nang đến hàm ẩm của vi nang 22

3.1.3 Khảo sát ảnh hưởng của kích thước vi nang đến mật độ VSV L acidophilus trong vi nang sau đông khô 23

3.2 Đánh giá khả năng bảo vệ và giải phóng VSV tại điều kiện pH đường tiêu hóa của các mẫu vi nang chứa L acidophilus có kích thước khác nhau 24

3.2.1 Ảnh hưởng của kích thước tới thời gian rã hoàn toàn của vi nang trong điều kiện pH đường tiêu hóa 25

3.2.2 Đánh giá ảnh hưởng của kích thước đến khả năng bảo vệ VSV sau khi qua dung dịch pH 2,5 28

3.2.3 Đánh giá ảnh hưởng của kích thước đến khả năng giải phóng VSV trong dung dịch pH 6,8 31

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 354.1 Kết luận 354.2 Đề xuất 35TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Kí hiệu, chữ

viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt

salt glycyrrhizic acid

Allapinin - monoamonium salt glycyrrhizic acid

FAO

Food and Agriculture Organization of the United Nations

Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc

phỏng

Bảng 3.3 Kết quả thời gian rã của các mẫu vi nang AT, ATC-1, ATC-2 27

Bảng 3.4 Khả năng bảo vệ VSV trong các mẫu vi nang sau 2 giờ ủ tại môi trường pH 2,5 29

Bảng 3.5 Khả năng giải phóng VSV của các mẫu vi nang AT, ATC-1, ATC-2 trong môi trường pH 6,8 32

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Vi khuẩn Lactobacillus acidophilus [13] 3

Hình 1.2 Các loại vi nang: (a) hệ chứa, (b) matrix, (c) bao matrix [57] 5

Hình 1.3 Cấu trúc hóa học của alginat và tạo gel alginat: (a) beta-(1-4)-D-mannuronic acid (M) và khối alpha-(1-4)-L-guluronic acid (G); (b) mô hình hộp trứng [36] 6

Hình 1.4 Cấu trúc hóa học của chitin và chitosan [61] 7

Hình 1.5 Mô hình ép đùn tạo giọt [57] 8

Hình 1.6: Sơ đồ quy trình tạo vi nang bằng phương pháp nhũ hóa [57] 9

Hình 3.1 Hình ảnh các vi nang AT, ATC-1, ATC-2 tươi và sau đông khô được tạo bởi các dụng cụ nhỏ giọt K1, K2, K3 20

Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn mật độ VSV trung bình trong các mẫu vi nang sau đông khô (n = 3) 23

Hình 3.3.a Hình ảnh vi nang AT sau 20 phút ủ tại môi trường pH 6,8 25

Hình 3.3.b Hình ảnh vi nang AT sau 35 phút ủ tại môi trường pH 6,8 25

Hình 3.3.c Hình ảnh vi nang AT sau 40 phút ủ tại môi trường pH 6,8 26

Hình 3.4.a Hình ảnh vi nang ATC-1 sau 60 phút ủ tại môi trường pH 6,8 26

Hình 3.4.b Hình ảnh vi nang ATC-1 sau 125 phút ủ tại môi trường pH 6,8 26

Hình 3.5.a Hình ảnh vi nang ATC-2 sau 90 phút ủ tại môi trường pH 6,8 27

Hình 3.5.b Hình ảnh vi nang ATC-2 sau 150 phút ủ tại môi trường pH 6,8 27

Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn số lượng VSV được bảo vệ trong các mẫu vi nang sau khi ủ 2h tại môi trường pH 2,5 (n = 3) 29

Hình 3.7 Đồ thị biểu diễn lượng VSV giải phóng ra tại môi trường pH 6,8 của các mẫu vi nang (n = 3) 32

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hiện nay, các sản phẩm chứa VSV Probiotic đang ngày càng được sử dụng phổ biến trong phòng ngừa và điều trị một số bệnh liên quan đến hệ vi sinh đường ruột [59] Chế phẩm Probiotic thường được dùng đường uống với các dạng bào chế như bột, cốm, viên nén, viên nang, hỗn dịch uống,… phù hợp với mọi đối tượng bao gồm trẻ sơ sinh, trẻ em, người lớn và người cao tuổi Theo định nghĩa của WHO/FAO, “Probiotic là những vi sinh vật sống, khi sử dụng với số lượng thích hợp sẽ mang lại lợi ích cho vật chủ” Như vậy, để có hiệu quả khi sử dụng, các chế phẩm Probiotic cần phải giải phóng một lượng vi sinh vật đủ lớn tại đích tác dụng Một số yếu tố khắc nghiệt như nhiệt độ, ánh sáng, độ ẩm trong quá trình sản xuất và bảo quản; môi trường pH acid và nồng độ muối mật cao trong quá trình tiêu hóa đã làm cho các chế phẩm Probiotic đường uống khó duy trì được lượng vi sinh vật ở mức khuyến nghị sau quá trình tiêu hóa [58]

Vi nang hóa Probiotic là một công nghệ đầy hứa hẹn giúp bảo vệ các chủng vi khuẩn Probiotic khỏi các điều kiện khắc nghiệt trong quá trình sản xuất, bảo quản và tiêu hóa [30] Các yếu tố cần được xem xét khi thiết kế các công thức vi nang bao gồm vật liệu đóng gói, kỹ thuật đóng gói và các thông số của quy trình Kích thước vi nang là một trong những thông số vật lý đầu ra quan trọng, ảnh hưởng trực tiếp đến cảm quan, đồng đều phân liều, độ ổn định và tốc độ và khả năng giải phóng vi sinh vật Do đó, đề

tài “Khảo sát ảnh hưởng của kích thước vi nang đến một số đặc tính của vi nang

chứa Lactobacillus acidophilus” được thực hiện với các mục tiêu chính như sau:

1 Khảo sát ảnh hưởng của kích thước vi nang đến hàm ẩm và mật độ vi sinh vật

trong vi nang đông khô chứa Lactobacillus acidophilus

2 Khảo sát khả năng bảo vệ và giải phóng VSV tại điều kiện pH đường tiêu hóa của các mẫu vi nang có kích thước khác nhau

2

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về Probiotic

1.1.1 Khái niệm và lịch sử của Probiotic

Theo tiếng Hy Lạp, “Probiotic” có nghĩa là “dành cho sự sống” Thuật ngữ “Probiotic” được giới thiệu lần đầu tiên vào năm 1953 bởi nhà khoa học người Đức, Werner Kollath, để biểu thị “các hoạt chất cần thiết cho sự phát triển lành mạnh của sự sống” [29]

Năm 1965, thuật ngữ “Probiotic” được Lilly và Stillwell dùng trong một bối cảnh khác để chỉ “các chất do một sinh vật tiết ra để kích thích sự phát triển của sinh vật khác” [29]

Năm 1974, Parker đã đưa ra định nghĩa “Probiotic là các sinh vật và chất góp phần cân bằng hệ vi khuẩn đường ruột” [23]

Đến năm 2002, Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hợp Quốc (FAO) và Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) đã đề xuất định nghĩa về Probiotic như sau: “Probiotic là những vi sinh vật sống, mà khi được sử dụng với số lượng thích hợp sẽ mang lại lợi ích sức khỏe cho vật chủ” [31], [16]

1.1.2 Tiêu chuẩn vi sinh vật Probiotic

Trong các thập kỷ qua, nhiều nghiên cứu đã cung cấp bằng chứng cho thấy việc bổ sung Probiotic có khả năng cải thiện hệ VSV đường ruột, ngăn ngừa và điều trị một số bệnh lý thường gặp Tuy nhiên, không phải VSV nào cũng được sử dụng trong các sản phẩm Probiotic VSV sử dụng trong Probiotic cần phải có những tiêu chuẩn sau [29]:

• Nguồn gốc rõ ràng, thuần chủng: VSV Probiotic có nguồn gốc từ con người, được lưu giữ tại ngân hàng giống quốc tế

• Không gây bệnh, không sinh độc tố: Chúng phải nằm trong nhóm GRAS, được đánh giá xác định an toàn và không có động lực

• Có khả năng tồn tại, bám dính lên hàng rào biểu mô ruột, chịu được độ pH thấp, có thể tương tác đến các tế bào miễn dịch liên quan đến ruột [49]

• Dễ nuôi cấy và dễ bảo quản: Khả năng sống sót cao Các vi khuẩn Probiotic được nghiên cứu và sử dụng rộng rãi nhất là chi

Lactobacillus và Bifidobacteria [61] Các loài thuộc hai chi này bao gồm: Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus plantarum, Bifidobacteria breve, Bifidobacteria longum, [9]

Ngoài ra, một số loài thuộc chi Streptococcus, Bacillus, Enterococus và nấm men Saccharomyces cũng được sử dụng làm chế phẩm sinh học trong nhiều năm qua [50]

3

1.1.3 Vi khuẩn Lactobacillus acidophilus

Lactobacillus acidophilus, thuộc chi Lactobacillus, thuộc họ Lactobacillaceae,

nằm trong nhóm vi khuẩn lactic (LAB), được phân lập từ phân trẻ sơ sinh vào năm 1900 [24]

Hình 1.1 Vi khuẩn Lactobacillus acidophilus [12]

L acidophilus là một loại trực khuẩn gram dương, không sinh bào tử, có dạng

hình que mảnh đầu tròn, không di động, dài 2 – 10µm, thường tồn tại đơn lẻ, xếp đôi hoặc chuỗi ngắn, phản ứng catalase âm tính, ưa eosin và khả năng kháng acid và muối mật tốt Chúng có thể phát triển và sinh sản trong môi trường mà các LAB khác không thể phát triển Chúng có thể sử dụng glucose, fructose, lactose và sucrose để thực hiện quá trình lên men và có thể tạo ra acid DL-lactic thông qua quá trình lên men [24]

L acidophilus là vi khuẩn vi hiếu khí, chúng phát triển tốt trong môi trường kỵ

nuôi cấy tối ưu thường là 35 – 38ºC, không phát triển ở nhiệt độ dưới 20ºC, độ pH tối ưu là 5,5 – 6,0 [24]

Khả năng tồn tại và sống sót của vi khuẩn L acidophilus phụ thuộc vào nhiều yếu tố, bao gồm: nhiệt độ, oxy không khí, độ pH Do đó, số lượng L acidophilus thường

bị giảm đáng kể sau thời gian dài bảo quản [47]

1.1.4 Tác dụng của Probiotic

Hệ VSV đường ruột đóng vai trò quan trọng trong hoạt động trao đổi chất và miễn dịch Cấu trúc và chức năng của hệ VSV đường ruột đặc hiệu theo từng cá thể, tùy thuộc vào yếu tố di truyền và yếu tố môi trường [55] Chức năng sinh lý cơ bản của hệ VSV đường ruột bao gồm [32]:

4 • Phát triển tế bào miễn dịch và cân bằng nội môi biểu mô • Tiêu hóa thức ăn

• Hỗ trợ chuyển hóa chất béo • Điều hòa thần kinh ruột và thúc đẩy sự hình thành thành mạch Ngược lại, nếu hệ VSV đường ruột suy yếu dẫn đến giảm truyền tín hiệu sinh lý và cân bằng nội môi, gây ra một số bệnh bao gồm dị ứng, viêm ruột, béo phì, ung thư và tiểu đường [32]

Probiotic được sử dụng rộng rãi trong thực phẩm, sữa công thức cho trẻ em và thực phẩm bổ sung Điều này chứng tỏ Probiotic có tiềm năng đáng kể trong vai trò điều trị cho nhiều loại bệnh, chủ yếu là các bệnh về đường tiêu hóa (bao gồm tiêu chảy liên quan đến dùng kháng sinh, tiêu chảy cấp do nhiễm trùng, hội chứng ruột kích thích hoặc rối loạn chức năng hệ tiêu hóa) [50]

Tiêu chảy liên quan đến kháng sinh (AAD) là một tác dụng phụ thường gặp khi dùng thuốc kháng sinh Probiotic được cho là có hiệu quả trong việc ngăn ngừa chứng AAD Một số cơ chế được cho là góp phần vào tác dụng chống lại AAD của Probiotic là cạnh tranh các chất dinh dưỡng và vị trí bám dính lên hàng rào biểu mô ruột Ngoài ra, một số loài thuộc chi Lactobacillus có khả năng sản xuất acid lactic, làm giảm pH môi trường và tiết ra ngoại độc tố có tác dụng ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh [27]

Bệnh tiêu chảy cấp tính vẫn là một trong những gánh nặng bệnh tật lớn trên toàn thế giới, đặc biệt là ở các nước đang phát triển Nguyên nhân phổ biến nhất gây tiêu chảy nặng và tử vong do tiêu chảy ở trẻ em là rotavirus [46] Probiotic có thể được coi là một biện pháp can thiệp an toàn trong bệnh tiêu chảy cấp tính do nhiễm trùng Cơ chế chống lại các mần bệnh đường ruột của chúng là cạnh tranh các chất dinh dưỡng và vị trí gắn, một số chủng vi khuẩn có khả năng sinh acid lactic làm giảm pH ruột, tăng cường các phản ứng miễn dịch đặc hiệu và không đặc hiệu để giảm thời gian và mức độ nghiêm trọng của bệnh [11]

Hội chứng ruột kích thích (IBS) là một loại rối loạn chức năng đường tiêu hóa thường gặp Triệu chứng biểu hiện bao gồm đau bụng, đầy hơi, khó chịu khi táo bón hoặc tiêu chảy Sự thay đổi hệ vi sinh vật đường ruột là một trong những yếu tố góp phần gây ra IBS Mặc dù cơ chế tác động của Probiotic trong cơ thể người chưa được hiểu đầy đủ, nhưng việc bổ sung Probiotic có thể cải thiện các triệu chứng của IBS thông qua việc ức chế sự phát triển quá mức của vi khuẩn gây bệnh, ngăn ngừa sự xâm nhập của mầm bệnh vào vật chủ, và cải thiện chức năng của hàng rào miễn dịch ruột [19]

Ngoài ra, một số tác dụng khác đã được báo cáo ở các chủng Probiotic khác nhau bao gồm đặc tính chống ung thư [9], đặc tính chống oxy hóa, tác dụng giảm cholesteron

5 (43) và ức chế alpha-glucosidase [50] Người khỏe mạnh có thể sử dụng Probiotic như một phương pháp ngăn ngừa một số bệnh và điều chỉnh khả năng miễn dịch

1.2 Tổng quan về vi nang

1.2.1 Khái niệm

Vi nang (microcapsule) là những tiểu phân hình cầu hoặc không xác định có kích thước micromet, được tạo thành bằng cách đóng gói các hoạt chất (rắn, lỏng hoặc khí) trong lớp màng polyme liên tục [44]

Theo quan điểm sinh học, vi nang Probiotic là sản phẩm của quá trình bẫy hay bao gói các tế bào VSV sống trong lớp vỏ là các polyme có nguồn gốc tự nhiên như alginat, cellulose, chitosan, gelatin,… hoặc các polyme có nguồn gốc nhân tạo như polystyren, polyamide, polyacrylat, polyester,… [57], [21]

Vi nang chứa vi sinh vật có thể chia làm 3 loại [56]:

Hình 1.2 Các loại vi nang: (a) hệ chứa, (b) matrix, (c) bao matrix [56]

Hệ chứa: Bao gồm 2 phần, phần lõi chứa VSV ở trong và phần vỏ bao bên ngoài Đây là loại điển hình cho phương pháp bao gói VSV Ưu điểm của vi nang loại này là khả năng bao gói được lượng VSV đồng nhất trong các vi nang

Matrix: VSV được phân tán khắp toàn bộ vi nang, là loại điển hình cho phương pháp bẫy Ưu điểm của loại này là bao gói được VSV cùng cơ chất một cách chắc chắn

Bao Matrix: Là vi nang loại matrix được phủ một lớp màng bao phía bên ngoài Lớp bao này giúp bảo vệ phần lõi chứa VSV khỏi các tác động từ môi trường như độ ẩm, ánh sáng, nhiệt độ và giúp bảo vệ VSV khỏi điều kiện khắc nghiệt của đường tiêu hóa như acid dạ dày và muối mật Đồng thời, lớp bao này có thể là lớp bao kiểm soát giải phóng [56]

1.2.2 Các nguyên liệu thường sử dụng để tạo vi nang Probiotic

Để phát triển một chế phẩm Probiotic hiệu quả, điều quan trọng nhất là phải bảo vệ được các tế bào VSV trong quá trình vận chuyển qua đường tiêu hóa [40] Vì vậy, việc lựa chọn kỹ thuật vi bao cũng như vật liệu màng bao cần phải phù hợp Một số vật liệu hay được sử dụng là: Alginat, Chitosan, Carrageenans, Tinh bột,…[40]

α-L-Natri Alginat được sử dụng rộng rãi trong bào chế vi nang do khả năng tương tích

G để tạo ra hydrogel Alginat thông qua quy trình tạo gel [10]

Hình 1.3 Cấu trúc hóa học của alginat và tạo gel alginat: (a) mannuronic acid (M) và khối alpha-(1-4)-L-guluronic acid (G); (b) mô hình hộp

beta-(1-4)-D-trứng [35]

(a) Cấu trúc Alginat

(b) Mô hình hộp trứng

Tỷ lệ hàm lượng amylose/amylopectin ảnh hưởng đến tính chất vật lý và hóa học của tinh bột như kích thước hạt tinh bột, độ hồ hóa và độ nhớt [42] Hàm lượng amylose cao hơn trong tinh bột có độ dẻo nhiệt độ và đặc tính gelatin, trong khi độ nhớt tăng theo hàm lượng amylopectin sau quá trình hồ hóa [42]

Tinh bột có tiềm năng trong lĩnh vực y sinh do chi phí thấp, tính chất phong phú, khả năng tương thích sinh học, phân hủy sinh học và đặc tính hydrat hóa [42] Tinh bột được sử dụng như một tá dược bảo vệ trong quá trình đông khô theo cơ chế làm giảm lượng tinh thể nước trong vi nang Calci alginat Từ đó, giúp cải thiện thể chất của vi nang sau đông khô, cải thiện khả năng sống sót của VSV trong quá trình đông khô và bảo quản [6]

1.2.2.3 Chitosan

Chitosan là một loại polysaccharide cation tự nhiên, là sản phẩm của quá trình khử một hoặc nhiều nhóm Acetyl từ Chitin [45] Chitin được sản xuất từ nhiều nguồn khác nhau như: vỏ giáp xác, thành tế bào nấm và tảo,… [36], [45]

Hình 1.4 Cấu trúc hóa học của chitin và chitosan [60]

Chitosan mang điện tích dương, có tính base yếu (pKa = 6,3) do sự có mặt của các nhóm amin, nó hòa tan trong môi trường acid hữu cơ (pH < 6) như acid formic, acid acetic,… nhưng không tan trong dung dịch acid sulfuric và acid phosphoric [8] Độ hòa tan, tỷ lệ trương nở, hoạt tính sinh học và khả năng phân hủy sinh học của Chitosan phụ thuộc vào mức độ Acetyl hóa [45]

8 Chitosan có các đặc tính quan trọng như khả năng tương thích sinh học, khả năng phân hủy sinh học, độc tính thấp, kháng khuẩn, chống oxy hóa và chống ung thư [45],[43].Vì vậy, nó được nghiên cứu sử dụng rộng rãi trong lĩnh vực y học và dược

phẩm, công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm, nông nghiệp và xử lý chất thải [8]

Trong quá trình tạo vi nang Probiotic, Chitosan được dùng làm lớp phủ cho các hạt Calci alginat, tạo thành lớp màng bền vững thông qua tương tác tĩnh điện giữa các gốc amino của nó và các gốc carboxyl có trong Alginat Lớp phủ Chitosan được cho là có tác dụng bảo vệ tế bào khi chúng được ủ trong dịch tiêu hóa mô phỏng (GI) [40]

1.2.3 Phương pháp tạo vi nang

Các kỹ thuật vi bao đã nhận được sự quan tâm đáng kể từ các nhà nghiên cứu, trong đó phương pháp phổ biến được áp dụng nhất để tạo vi nang bao gồm: phương pháp nhỏ giọt (ép đùn), phương pháp nhũ tương và phương pháp phun sấy [48], [47]

1.2.3.1 Phương pháp nhỏ giọt

Phương pháp nhỏ giọt còn có nhiều tên gọi khác như tách pha đông tụ, ép đùn [26] Đây là một kỹ thuật bao hoặc cố định VSV phổ biến nhất vì nó đơn giản, dễ thực hiện, chi phí thấp và không cần sử dụng nhiệt độ cao, một yếu tố gây ức chế sự phát triển của VSV [21]

Hình 1.5 Mô hình ép đùn tạo giọt [56]

Phối hợp Alginat với Tế bào Probiotic

Khí

Lõi

Tế bào VSV

Vi nang Calci Alginat chứa VSV

Alginat

Phối hợp Alginat với Tế bào Probiotic

9 Nguyên tắc của phương pháp này là dựa trên sự tạo gel của polysaccharide anion

nang thu được từ phương pháp này được gọi là hạt và có kích thước khác nhau từ vài micromet đến vài minimet phụ thuộc vào kích thước của dụng cụ nhỏ giọt (pipet pasteur, kim tiêm,…) Các hạt vi nang này ổn định trong môi trường acid, nhưng bị phân hủy trong môi trường chứa Citrat hoặc Phosphate [21]

Có nhiều loại polyme khác nhau có thể được sử dụng để thu được hạt vi nang từ phương pháp này, nhưng các chất hay được sử dụng nhất là Alginat, K-carageenan và Whey protein [53]

Ưu điểm của phương pháp nhỏ giọt tách pha đông tụ này là rất phù hợp ở quy mô phòng thí nghiệm, nhưng vẫn còn những khó khăn khi phát triển lên quy mô công nghiệp, chẳng hạn như năng suất thấp [21]

1.2.3.2 Phương pháp nhũ tương hóa

Trong kỹ thuật này, một lượng huyền phù chứa tế bào vi sinh vật và polyme (được gọi là pha không liên tục) được phân tán vào một lượng dầu thực vật (pha liên tục) [26] Hỗn hợp này được đồng nhất nhờ sự có mặt của các chất nhũ hóa để tạo nhũ tương nước/dầu Khi nhũ tương hình thành, các polyme hòa tan trong nước được đông tụ từ

Tốc độ khuấy ảnh hưởng đến kích thước và hình dạng của các giọt tạo thành Các vi nang thu được từ phương pháp này thường có kích thước nhỏ, tuy nhiên phân bố kích thước và hình dạng không đều [51]

Hình 1.6: Sơ đồ quy trình tạo vi nang bằng phương pháp nhũ hóa [56]

Các nhà nghiên cứu khác cũng sử dụng kỹ thuật nhũ tương kép (nước/dầu/nước) để bao bọc các chủng vi khuẩn Probiotic và được báo cáo rằng có cải thiện khả năng sống sót qua môi trường dạ dày mô phỏng GI [21]

Bước (1): Tạo nhũ tương nước/dầu

Bước (2): Thêm CaCl2

Vi nang Probitotic

Hỗn hợp Polyme Tế bào Probiotic

Dầu thực vật

Alginat Lõi

Tế bào VSV

10 Một số dầu thực vật hay được sử dụng trong phương pháp này là dầu đậu nành, dầu hướng dương, dầu hạt cải và dầu ngô [21]

Nhược điểm của phương pháp này so với phương pháp nhỏ giọt tách pha đông tụ là chi phí cao hơn do cần nguyên liệu thô là dầu thực vật và chất nhũ hóa để ổn định nhũ tương Ngoài ra, lượng dầu dư, chất nhũ hóa và các chất hoạt động bề mặt có thể gây độc cho tế bào Probiotic [26]

1.2.3.3 Phương pháp phun sấy

Phun sấy là một phương pháp thích hợp để sản xuất vi nang Probiotic ở quy mô lớn Hỗn dịch chứa VSV được bơm qua súng phun bằng luồng khí ở áp suất cao, đi qua buồng sấy ở nhiệt độ thích hợp, dung môi được bốc hơi liên tục tạo thành các vi nang khô chứa VSV Tuy nhiên, do nhiệt độ cao và sự mất nước nhanh có thể làm giảm khả năng sống sót của VSV [21]

Kích thước vi nang được bào chế bằng phương pháp này phụ thuộc vào các đặc tính của dược chất, tá dược và các thông số quy trình như tốc độ cấp khí, nhiệt độ khí vào, kích thước đầu súng phun, áp lực và tốc độ phun dịch [21]

1.3 Tình hình nghiên cứu gần đây về dạng bào chế vi nang

Vi nang là một dạng bào chế có tiềm năng lớn trong khoa học thực phẩm và dược phẩm, vì chúng có khả năng bảo vệ và kiểm soát tốc độ giải phóng hoạt chất [57] Việc đóng gói các hoạt chất có đặc tính đặc biệt vẫn được các nhà khoa học ngày đêm nghiên cứu và ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau, đặc biệt là trong chăm sóc sức khỏe

Kích thước vi nang là một thông số vật lý quan trọng, ảnh hưởng trực tiếp đến cảm quan, độ ổn định, độ đồng đều phân liều, tốc độ và khả năng giải phóng hoạt chất Dưới đây là một số nghiên cứu gần đây về vi nang Probiotic:

Năm 2021, Xue Huang và cộng sự đã nghiên cứu cải thiện độ ổn định và khả năng sống sót của VSV Probiotic bằng cách bổ sung shellac (LAC) Vi nang chứa

Limosilactobacillus reuteri được tạo bằng phương pháp nhũ tương hóa Kết quả của

nghiên cứu cho thấy, vi nang có bổ sung LAC có kích thước hạt lớn hơn, cấu trúc đặc hơn, độ hút ẩm thấp hơn và thời gian rã kéo dài hơn so với vi nang không bổ sung LAC Nhóm tác giả đưa đến kết luận rằng việc bổ sung LAC đã góp phần nâng cao khả năng sống sót của Probiotic sau khi đông khô, qua dịch tiêu hóa mô phỏng, sau khi gia nhiệt và bảo quản trong môi trường xung quanh [33]

Năm 2022, Min Zhang và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu bào chế vi nang chứa

Lactobacillus plantarum LN66 bằng phương pháp đông tụ phức tạp Nhóm nghiên cứu

đã tạo được vi nang có kích thước là 196,57 ± 1,46µm với hiệu suất bao gói là 75,26 ± 1,95% (w/w) Kết quả là khả năng sống sót của các tế bào VSV được vi nang hóa sau khi ủ trong môi trường đường tiêu hóa mô phỏng đạt 71,33 ± 0,99% (w/w), trong khi khả năng sống sót của các tế bào tự do chỉ là 45,45 ± 0,67% (w/w) Lượng VSV sống

11 sót trong vi nang được bảo quản trong bao bì thủy tinh ở nhiệt độ 4ºC và 25ºC cao gấp 1,1 và 1,4 lần so với vi nang được bảo quản trong bao bì nhôm [62]

Năm 2023, Aida Kistaubayeva và cộng sự đã tiến hành tạo vi nang chứa

Lactobacillus rhamnosus GG (LGG), sau đó đánh giá khả năng sống sót và giải phóng

VSV qua điều kiện khắc nghiệt của đường tiêu hóa (GI) Vi nang Alginat chứa VSV phủ Bacterial Cellulose (BC) có hoặc không bổ sung Prebiotic Pullulan (PUL) được tạo thành bằng phương pháp nhỏ giọt tách pha đông tụ Kết quả là vi nang Alg/BC và Alg-PUL/BC được tạo ra với kích thước lần lượt là 2820µm và3401 µm với hiệu suất bao

nang Alg-PUL/BC và Alg/BC lần lượt là 94% và 74% cao hơn so với tế bào VSV ở dạng tự do chỉ đạt 43% Sau 2 giờ tiếp xúc với SDF, khả năng sống sót của VSV trong công thức vi nang Alg-PUL/BC và Alg/BC lần lượt là 90% và 69% Sau 15 giờ ủ trong SCF, lượng tế bào VSV giải phóng ra được ghi nhận đối với công thức vi nang Alg-PUL/BC và Alg/BC lần lượt là 6,18 và 10,3 Log CFU/g [38]

12

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu và thiết bị

2.1.1 Chủng vi sinh vật dùng trong nghiên cứu

Chủng Lactobacilus acidophilus ATCC 4356 – Bộ môn Công nghệ sinh học Dược

2.1.2 Hóa chất

Bảng 2.1 Danh mục hóa chất sử dụng Tên hóa chất Nguồn gốc Tên hóa chất Nguồn gốc

2.1.3 Thiết bị, dụng cụ

2.1.3.1 Thiết bị

Bảng 2.2 Danh mục thiết bị sử dụng Tên thiết bị Nguồn gốc

13

2.1.3.2 Dụng cụ

Bảng 2.3 Danh mục các dụng cụ sử dụng

2.1.4 Môi trường sử dụng trong nghiên cứu

2.1.4.1 Môi trường MRS lỏng

Bảng 2.4 Thành phần môi trường MRS lỏng Nguyên liệu Lượng sử dụng Nguyên liệu Lượng sử dụng

Môi trường MRS thạch = MRS lỏng + thạch Agar (2%) (20g thạch bột/1000ml)

2.1.5 Các dung dịch sử dụng trong nghiên cứu

Dung dịch Natri Alginat 3%: Cân 3g Natri Alginat, ngâm trương nở hoàn toàn trong 100ml nước cất

Dung dịch acid acetic 0,5% (kl/tt): Cân 0,5g acid acetic băng, pha loãng với vừa nước cất vừa đủ 100ml

Dung dịch chitosan 0,4% (kl/tt), pH 5,5 – 6,0: Cân 0,4g Chitosan hòa tan trong 90ml acid acetic 0,5%, điều chỉnh pH đến 5,5 – 6,0 bằng NaOH 1M và HCl 1M, thêm acid acetic 0,5% vừa đủ 100ml

Dung dịch chitosan 0,4%/calci clorid 2% (dung dịch hỗn hợp X), pH 5,5 – 6,0: Cân 2g Calci clorid và 0,4 g chitosan lần lượt hòa tan vào 90ml acid acetic 0,5%, điều chỉnh pH 5,5 – 6,0 bằng dung dịch NaOH 1M và HCl 1M, thêm acid acetic 0,5% vừa đủ 100ml

Dung dịch Natri citrat 2%: Cân 2g Natri citrat hòa tan trong 100ml nước cất Môi trường pH 2,5: Thêm từ từ HCl 1N vào 1000ml nước cất đến khi thu được dung dịch có pH bằng 2,5

14 Môi trường pH 6,8: Hòa tan 28,8g dinatri hydrophosphate và 11,45g kali dihydrophosphat vào 1000ml nước, điều chỉnh đến pH 6,8 bằng dung dịch NaOH 1M và HCl 1M

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của kích thước vi nang đến một số đặc tính của vi nang

- Khảo sát ảnh hưởng của kích cỡ đầu nhỏ giọt đến kích thước vi nang tạo thành

- Khảo sát ảnh hưởng của kích thước vi nang đến hàm ẩm của vi nang

- Khảo sát ảnh hưởng của kích thước vi nang đến mật độ VSV L acidophilus

trong vi nang sau đông khô

2.2.2 Đánh giá khả năng bảo vệ và giải phóng VSV tại điều kiện pH đường tiêu hóa của các mẫu vi nang chứa Lactobacillus acidophilus có kích thước khác nhau

- Ảnh hưởng của kích thước tới thời gian rã hoàn toàn của vi nang trong điều kiện pH đường tiêu hóa

- Đánh giá ảnh hưởng của kích thước đến khả năng bảo vệ VSV sau khi qua dung dịch pH 2,5

- Đánh giá ảnh hưởng của kích thước đến khả năng giải phóng VSV trong dung dịch pH 6,8

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp tiệt khuẩn

2.3.1.1 Phương pháp tiệt khuẩn bằng nhiệt ẩm

Phương pháp này được dùng để tiệt khuẩn các dụng cụ thủy tinh, môi trường và dung dịch được sử dụng trong nghiên cứu Nguyên liệu cần tiệt khuẩn được bọc giấy báo hoặc đựng trong bình nón thủy tinh có nút bông, tiến hành tiệt khuẩn bằng nồi hấp ở nhiệt độ 115ºC trong 20 phút [2]

2.3.1.2 Phương pháp tiệt khuẩn Tyndall

Cân một lượng tinh bột vào bình nón, đậy kín bằng nút bông Tiến hành đun cách thủy ở 70 – 80ºC trong 1 giờ, sau đó ủ trong tủ ấm 37ºC trong 24 giờ Lặp lại bước trên trong 3 ngày liên tục[1]

2.3.2 Phương pháp nuôi cấy thu hỗn dịch tế bào

Hoạt hóa giống [6]: Cân, đong các thành phần nguyên liệu theo công thức môi trường MRS lỏng vào cốc có mỏ, hòa tan trong 100ml nước cất Chia môi trường ra 10 ống nghiệm sạch, mỗi ống 10ml MRS lỏng Đậy kín bằng nắp ống nghiệm Hấp tiệt khuẩn môi trường ở 115ºC trong 20 phút, sau đó để nguội đến khoảng 37 – 40ºC Cấy chủng giống vào các ống nghiệm trên với nồng độ 10% (kl/tt) trong tủ cấy vô trùng Ủ các ống nghiệm đã được

15 Nhân giống [6]:

Cân, đong các thành phần nguyên liệu theo công thức môi trường MRS lỏng vào bình nón có nút bông Tiến hành tiệt khuẩn môi trường ở 115 độ C trong 20 phút bằng nồi hấp tiệt trùng Để nguội đến nhiệt độ phòng Cấy giống đã hoạt hóa vào bình nón

được bình nón chứa hỗn dịch tế bào VSV

Thu sinh khối [6]: Sau khi nhân giống 24 giờ, hỗn dịch trong bình nón được ly tâm ở 4000 vòng/phút trong 10 phút Gạn bỏ phần dịch trong, thu được sinh khối tế bào

2.3.3 Phương pháp tạo vi nang

a) Tạo vi nang không chứa vi sinh vật Chuẩn bị:

Dung dịch Natri Alginat 3%, dd Calci Clorid 2%, dd Chitosan 0,4%/Calci Clorid 2%, dd Chitosan 0,4%, nước cất được tiệt khuẩn bằng phương pháp nhiệt ẩm Tinh bột được tiệt khuẩn bằng phương pháp Tyndall

Vi nang AT: Dùng các đầu nhỏ giọt có kích thước khác nhau, nhỏ hỗn dịch AT xuống dung dịch CaCl2 2%, để yên 30 phút cho vi nang ổn định Dùng lưới thu hạt, rửa 3 lần bằng nước cất

Vi nang ATC-1: Được tạo thành bằng cách phối hợp Chitosan ngay trong quá trình đông tụ Dùng các đầu nhỏ giọt có kích thước khác nhau, nhỏ hỗn dịch AT xuống dung dịch Chitosan 0,4%/Calci Clorid 2%, để yên 30 phút cho vi nang ổn định Dùng lưới thu hạt, rửa 3 lần bằng nước cất

Vi nang ATC-2: Được tạo thành bằng cách phối hợp Chitosan sau quá trình đông tụ Alginat Dùng các đầu nhỏ giọt có kích thước khác nhau, nhỏ hỗn hợp dung dịch AT xuống dung dịch Calci clorid 2%, để yên 30 phút cho vi nang ổn định Dùng lưới thu hạt, rửa 3 lần bằng nước cất Sau đó, chuyển vi nang sang dung dịch Chitosan 0,4%, kết hợp khuấy từ trong 30 phút Dùng lưới thu hạt, rửa 3 lần với nước cất