TỔNG QUAN
Tổng quan về Probiotic
1.1.1 Khái niệm và lịch sử của Probiotic
Theo tiếng Hy Lạp, “Probiotic” có nghĩa là “dành cho sự sống” Thuật ngữ
“Probiotic” được giới thiệu lần đầu tiên vào năm 1953 bởi nhà khoa học người Đức, Werner Kollath, để biểu thị “các hoạt chất cần thiết cho sự phát triển lành mạnh của sự sống” [29]
Năm 1965, nhà khoa học Lilly và Stillwell đã đặt ra thuật ngữ "Probiotic" trong một ngữ cảnh khác, định nghĩa chúng là "các chất do một sinh vật tiết ra để thúc đẩy sự phát triển của các sinh vật khác" [29]
Năm 1974, Parker đã đưa ra định nghĩa “Probiotic là các sinh vật và chất góp phần cân bằng hệ vi khuẩn đường ruột” [23] Đến năm 2002, Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hợp Quốc (FAO) và
Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) đã định nghĩa Probiotic là những vi sinh vật sống khi được sử dụng với một số lượng nhất định sẽ mang lại lợi ích cho sức khỏe của vật chủ.
1.1.2 Tiêu chuẩn vi sinh vật Probiotic
Trong các thập kỷ qua, nhiều nghiên cứu đã cung cấp bằng chứng cho thấy việc bổ sung Probiotic có khả năng cải thiện hệ VSV đường ruột, ngăn ngừa và điều trị một số bệnh lý thường gặp Tuy nhiên, không phải VSV nào cũng được sử dụng trong các sản phẩm Probiotic VSV sử dụng trong Probiotic cần phải có những tiêu chuẩn sau [29]:
• Nguồn gốc rõ ràng, thuần chủng: VSV Probiotic có nguồn gốc từ con người, được lưu giữ tại ngân hàng giống quốc tế
• Không gây bệnh, không sinh độc tố: Chúng phải nằm trong nhóm GRAS, được đánh giá xác định an toàn và không có động lực
• Có khả năng tồn tại, bám dính lên hàng rào biểu mô ruột, chịu được độ pH thấp, có thể tương tác đến các tế bào miễn dịch liên quan đến ruột [49]
• Dễ nuôi cấy và dễ bảo quản: Khả năng sống sót cao
Các vi khuẩn Probiotic được nghiên cứu và sử dụng rộng rãi nhất là chi Lactobacillus và Bifidobacteria [61] Các loài thuộc hai chi này bao gồm: Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus plantarum, Bifidobacteria breve, Bifidobacteria longum, [9]
Ngoài ra, một số loài thuộc chi Streptococcus, Bacillus, Enterococus và nấm men Saccharomyces cũng được sử dụng làm chế phẩm sinh học trong nhiều năm qua [50]
Lactobacillus acidophilus, thuộc chi Lactobacillus, thuộc họ Lactobacillaceae, nằm trong nhóm vi khuẩn lactic (LAB), được phân lập từ phân trẻ sơ sinh vào năm 1900 [24]
Hình 1.1 Vi khuẩn Lactobacillus acidophilus [12]
L acidophilus là một loại trực khuẩn gram dương, không sinh bào tử, có dạng hỡnh que mảnh đầu trũn, khụng di động, dài 2 – 10àm, thường tồn tại đơn lẻ, xếp đụi hoặc chuỗi ngắn, phản ứng catalase âm tính, ưa eosin và khả năng kháng acid và muối mật tốt Chúng có thể phát triển và sinh sản trong môi trường mà các LAB khác không thể phát triển Chúng có thể sử dụng glucose, fructose, lactose và sucrose để thực hiện quá trình lên men và có thể tạo ra acid DL-lactic thông qua quá trình lên men [24]
L acidophilus là vi khuẩn vi hiếu khí, chúng phát triển tốt trong môi trường kỵ khí, hoặc trong môi trường 5 – 10% CO2 [24] Do khả năng chịu nhiệt kém, nhiệt độ nuôi cấy tối ưu thường là 35 – 38ºC, không phát triển ở nhiệt độ dưới 20ºC, độ pH tối ưu là 5,5 – 6,0 [24]
Sự tồn tại và phát triển của vi khuẩn L acidophilus chịu ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như nhiệt độ, oxy không khí, độ pH Do đó, lượng vi khuẩn L acidophilus thường giảm đáng kể sau thời gian bảo quản kéo dài.
Hệ VSV đường ruột đóng vai trò quan trọng trong hoạt động trao đổi chất và miễn dịch Cấu trúc và chức năng của hệ VSV đường ruột đặc hiệu theo từng cá thể, tùy thuộc vào yếu tố di truyền và yếu tố môi trường [55] Chức năng sinh lý cơ bản của hệ VSV đường ruột bao gồm [32]:
• Phát triển tế bào miễn dịch và cân bằng nội môi biểu mô
• Hỗ trợ chuyển hóa chất béo
• Điều hòa thần kinh ruột và thúc đẩy sự hình thành thành mạch
Ngược lại, nếu hệ VSV đường ruột suy yếu dẫn đến giảm truyền tín hiệu sinh lý và cân bằng nội môi, gây ra một số bệnh bao gồm dị ứng, viêm ruột, béo phì, ung thư và tiểu đường [32]
Probiotic được sử dụng rộng rãi trong thực phẩm, sữa công thức cho trẻ em và thực phẩm bổ sung Điều này chứng tỏ Probiotic có tiềm năng đáng kể trong vai trò điều trị cho nhiều loại bệnh, chủ yếu là các bệnh về đường tiêu hóa (bao gồm tiêu chảy liên quan đến dùng kháng sinh, tiêu chảy cấp do nhiễm trùng, hội chứng ruột kích thích hoặc rối loạn chức năng hệ tiêu hóa) [50]
Tiêu chảy liên quan đến kháng sinh (AAD) là một tác dụng phụ thường gặp khi dùng thuốc kháng sinh Probiotic được cho là có hiệu quả trong việc ngăn ngừa chứng AAD Một số cơ chế được cho là góp phần vào tác dụng chống lại AAD của Probiotic là cạnh tranh các chất dinh dưỡng và vị trí bám dính lên hàng rào biểu mô ruột Ngoài ra, một số loài thuộc chi Lactobacillus có khả năng sản xuất acid lactic, làm giảm pH môi trường và tiết ra ngoại độc tố có tác dụng ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh [27]
Bệnh tiêu chảy cấp tính vẫn là một trong những gánh nặng bệnh tật lớn trên toàn thế giới, đặc biệt là ở các nước đang phát triển Nguyên nhân phổ biến nhất gây tiêu chảy nặng và tử vong do tiêu chảy ở trẻ em là rotavirus [46] Probiotic có thể được coi là một biện pháp can thiệp an toàn trong bệnh tiêu chảy cấp tính do nhiễm trùng Cơ chế chống lại các mần bệnh đường ruột của chúng là cạnh tranh các chất dinh dưỡng và vị trí gắn, một số chủng vi khuẩn có khả năng sinh acid lactic làm giảm pH ruột, tăng cường các phản ứng miễn dịch đặc hiệu và không đặc hiệu để giảm thời gian và mức độ nghiêm trọng của bệnh [11]
Tổng quan về vi nang
Vi nang (microcapsule) là những tiểu phân hình cầu hoặc không xác định có kích thước micromet, được tạo thành bằng cách đóng gói các hoạt chất (rắn, lỏng hoặc khí) trong lớp màng polyme liên tục [44]
Theo quan điểm sinh học, vi nang Probiotic là sản phẩm của quá trình bẫy hay bao gói các tế bào VSV sống trong lớp vỏ là các polyme có nguồn gốc tự nhiên như alginat, cellulose, chitosan, gelatin,… hoặc các polyme có nguồn gốc nhân tạo như polystyren, polyamide, polyacrylat, polyester,… [57], [21]
Vi nang chứa vi sinh vật có thể chia làm 3 loại [56]:
Hình 1.2 Các loại vi nang: (a) hệ chứa, (b) matrix, (c) bao matrix [56]
Hệ chứa vi nang gồm hai thành phần chính: phần lõi chứa đựng VSV và phần vỏ bao bọc bên ngoài Đây là một hình thức điển hình của phương pháp bao gói VSV, với ưu điểm là khả năng bao gói đồng đều các lượng VSV trong từng vi nang.
Ma trận VSV phân tán khắp vi nang, một đặc điểm điển hình của phương pháp bẫy Ưu điểm chính của loại ma trận này là khả năng bao gói chắc chắn VSV cùng cơ chất.
Vi nang bao matrix là loại vi nang có lõi được bao phủ bởi một lớp màng bảo vệ ở bên ngoài Lớp màng này giúp bảo vệ các thành phần bên trong (thường là VSV) khỏi các tác động từ môi trường như độ ẩm, ánh sáng, nhiệt độ và từ các điều kiện khắc nghiệt của đường tiêu hóa như acid dạ dày và muối mật Ngoài ra, lớp màng này còn có thể đóng vai trò kiểm soát giải phóng các thành phần bên trong.
1.2.2 Các nguyên liệu thường sử dụng để tạo vi nang Probiotic Để phát triển một chế phẩm Probiotic hiệu quả, điều quan trọng nhất là phải bảo vệ được các tế bào VSV trong quá trình vận chuyển qua đường tiêu hóa [40] Vì vậy, việc lựa chọn kỹ thuật vi bao cũng như vật liệu màng bao cần phải phù hợp Một số vật liệu hay được sử dụng là: Alginat, Chitosan, Carrageenans, Tinh bột,…[40]
Alginat là một polysaccharide tự nhiên có nguồn gốc từ tảo nâu và tảo biển, được sử dụng phổ biến để điều chế vi nang, ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực dược phẩm [44]
Alginat có cấu trúc gồm các tiểu đơn vị acid β-D-mannuronic (M) và aicd α-L- guluronic (G) được liên kết bằng lên kết β (1-4) glycosid [35], [41] Các yếu tố như tỷ lệ M/G, độ dài của copolyme, trọng lượng phân tử và độ nhớt của alginat rất quan trọng trong việc xác định tính chất của polyme [26] Alginat có tỉ lệ khối G cao có khả năng tạo gel cứng hơn và ngược lại Khi có tỷ lệ khối M cao hơn thì Alginat có độ nhớt cao hơn, gel tạo ra mềm mại và đàn hồi hơn [10]
Natri Alginat được sử dụng rộng rãi trong bào chế vi nang do khả năng tương tích sinh học, phân hủy sinh học, không độc hại và tạo gel dễ dàng [34], [37] Các cation hóa trị hai, ví dụ Ba 2+ và Ca 2+ , có thể nhanh chóng xây dựng hệ thống “hộp trứng” với khối
G để tạo ra hydrogel Alginat thông qua quy trình tạo gel [10]
Hình 1.3 Cấu trúc hóa học của alginat và tạo gel alginat: (a) beta-(1-4)-D- mannuronic acid (M) và khối alpha-(1-4)-L-guluronic acid (G); (b) mô hình hộp trứng [35]
Tinh bột là một loại polysaccharid tự nhiên có nhiều ứng dụng và nguồn gốc khác nhau, như khoai tây, khoai mì, ngô, gạo và lúa mì [25], [42]
Tinh bột gồm amylose và amylopectin Amylose có cấu trúc mạch thẳng, gồm các đơn vị α-D-glucose liên kết α-1,4 glycosid Amylopectin phân nhánh, có liên kết α-1,6 sau 24-30 đơn vị glucose.
Tỷ lệ hàm lượng amylose/amylopectin ảnh hưởng đến tính chất vật lý và hóa học của tinh bột như kích thước hạt tinh bột, độ hồ hóa và độ nhớt [42] Hàm lượng amylose cao hơn trong tinh bột có độ dẻo nhiệt độ và đặc tính gelatin, trong khi độ nhớt tăng theo hàm lượng amylopectin sau quá trình hồ hóa [42]
Tinh bột có tiềm năng trong lĩnh vực y sinh do chi phí thấp, tính chất phong phú, khả năng tương thích sinh học, phân hủy sinh học và đặc tính hydrat hóa [42] Tinh bột được sử dụng như một tá dược bảo vệ trong quá trình đông khô theo cơ chế làm giảm lượng tinh thể nước trong vi nang Calci alginat Từ đó, giúp cải thiện thể chất của vi nang sau đông khô, cải thiện khả năng sống sót của VSV trong quá trình đông khô và bảo quản [6]
Chitosan là một loại polysaccharide cation tự nhiên, là sản phẩm của quá trình khử một hoặc nhiều nhóm Acetyl từ Chitin [45] Chitin được sản xuất từ nhiều nguồn khác nhau như: vỏ giáp xác, thành tế bào nấm và tảo,… [36], [45]
Hình 1.4 Cấu trúc hóa học của chitin và chitosan [60]
Chitosan mang điện tích dương, có tính base yếu (pKa = 6,3) do sự có mặt của các nhóm amin, nó hòa tan trong môi trường acid hữu cơ (pH < 6) như acid formic, acid acetic,… nhưng không tan trong dung dịch acid sulfuric và acid phosphoric [8] Độ hòa tan, tỷ lệ trương nở, hoạt tính sinh học và khả năng phân hủy sinh học của Chitosan phụ thuộc vào mức độ Acetyl hóa [45]
8 Chitosan có các đặc tính quan trọng như khả năng tương thích sinh học, khả năng phân hủy sinh học, độc tính thấp, kháng khuẩn, chống oxy hóa và chống ung thư [45],[43].Vì vậy, nó được nghiên cứu sử dụng rộng rãi trong lĩnh vực y học và dược phẩm, công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm, nông nghiệp và xử lý chất thải [8]
Tình hình nghiên cứu gần đây về dạng bào chế vi nang
Vi nang được coi là dạng bào chế mang tiềm năng lớn trong khoa học thực phẩm và dược phẩm bởi khả năng bảo vệ và kiểm soát tốc độ giải phóng hoạt chất Các nghiên cứu và ứng dụng liên tục được tiến hành để đóng gói các hoạt chất có tính chất đặc biệt trong lĩnh vực chăm sóc sức khỏe, mở ra nhiều triển vọng mới trong việc bảo vệ và kiểm soát tốc độ giải phóng hoạt chất để đạt hiệu quả điều trị tối ưu.
Kích thước vi nang là yếu tố vật lý nền tảng tác động đến cảm quan, độ bền, độ đồng nhất của liều lượng, tốc độ và hiệu quả giải phóng dược chất Các nghiên cứu gần đây về vi nang men vi sinh chỉ ra rằng:
Năm 2021, Xue Huang và cộng sự đã nghiên cứu cải thiện độ ổn định và khả năng sống sót của VSV Probiotic bằng cách bổ sung shellac (LAC) Vi nang chứa
Limosilactobacillus reuteri được tạo bằng phương pháp nhũ tương hóa Kết quả của nghiên cứu cho thấy, vi nang có bổ sung LAC có kích thước hạt lớn hơn, cấu trúc đặc hơn, độ hút ẩm thấp hơn và thời gian rã kéo dài hơn so với vi nang không bổ sung LAC Nhóm tác giả đưa đến kết luận rằng việc bổ sung LAC đã góp phần nâng cao khả năng sống sót của Probiotic sau khi đông khô, qua dịch tiêu hóa mô phỏng, sau khi gia nhiệt và bảo quản trong môi trường xung quanh [33]
Năm 2022, Min Zhang và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu bào chế vi nang chứa
Lactobacillus plantarum LN66 bằng phương pháp đông tụ phức tạp Nhóm nghiên cứu đó tạo được vi nang cú kớch thước là 196,57 ± 1,46àm với hiệu suất bao gúi là 75,26 ± 1,95% (w/w) Kết quả là khả năng sống sót của các tế bào VSV được vi nang hóa sau khi ủ trong môi trường đường tiêu hóa mô phỏng đạt 71,33 ± 0,99% (w/w), trong khi khả năng sống sót của các tế bào tự do chỉ là 45,45 ± 0,67% (w/w) Lượng VSV sống
Theo Nghiên cứu của Zhen et al 2019, nồng độ muối trong vi nang bảo quản trong bao bì thủy tinh ở nhiệt độ 4ºC và 25ºC lần lượt cao gấp 1,1 và 1,4 lần so với vi nang bảo quản trong bao bì nhôm.
Năm 2023, Aida Kistaubayeva và cộng sự đã tiến hành tạo vi nang chứa
Lactobacillus rhamnosus GG (LGG), sau đó đánh giá khả năng sống sót và giải phóng
Vi nang alginat chứa VSV phủ xenluloza vi khuẩn (BC) bổ sung prebiotic Pullulan (PUL) hoặc không bổ sung PUL được tạo ra bằng phương pháp nhỏ giọt tách pha đông tụ Vi nang Alg/BC và Alg-PUL/BC có kích thước lần lượt là 2820 nm và 3401 nm, hiệu suất bao gói đạt 109 CFU/g Sau 2 giờ ủ tại dịch dạ dày mô phỏng (SGF), khả năng sống sót của VSV trong vi nang Alg-PUL/BC và Alg/BC lần lượt là 94% và 74%, cao hơn so với VSV dạng tự do (43%) Sau 2 giờ tiếp xúc với dịch tiêu hóa nhỏ mô phỏng (SDF), khả năng sống sót của VSV trong Alg-PUL/BC và Alg/BC lần lượt là 90% và 69% Sau 15 giờ ủ trong dịch ruột kết mô phỏng (SCF), lượng VSV giải phóng ra từ Alg-PUL/BC và Alg/BC lần lượt là 6,18 và 10,3 Log CFU/g.
NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nguyên liệu và thiết bị
2.1.1 Chủng vi sinh vật dùng trong nghiên cứu
Chủng Lactobacilus acidophilus ATCC 4356 – Bộ môn Công nghệ sinh học Dược 2.1.2 Hóa chất
Bảng 2.1 Danh mục hóa chất sử dụng
Tên hóa chất Nguồn gốc Tên hóa chất Nguồn gốc
Cao nấm men Đức Thạch (Agar) Việt Nam
Cao thịt Đức Natri Alginat Ấn Độ
Glucose Trung Quốc Chitosan Đức
Pepton Ấn Độ Tinh bột ngô Việt Nam
Triamoni citrat Trung Quốc Natri citrat Trung Quốc MnSO4.4H2O Trung quốc Natri clorid Trung Quốc MgSO4.7H2O Trung quốc Acid acetic băng Trung Quốc
K2HPO4 Trung Quốc Calci Clorid Trung Quốc
Natri acetat Trung Quốc Nước cất Việt Nam
Bảng 2.2 Danh mục thiết bị sử dụng
Tên thiết bị Nguồn gốc
Cân kỹ thuật Đức – Sartorius
Tủ cấy vô trùng Nhật – Sanyo
Máy khuấy từ Hàn Quốc – Wisd
Máy lắc ổn định nhiệt Trung Quốc – KWF
Máy ly tâm Đức – Sartorius
Nồi hấp tiệt trùng Nhật – ALP
Tủ sấy Hàn Quốc – Daihan
Thiết bị đông khô Đức – Christ alpha
Tủ âm sâu Hàn Quốc – LG
Tủ ấm CO2 Nhật – Sanyo
Máy đo đường kính vòng vô khuẩn Tây Ban Nha – Caliper
Máy đo hàm ẩm Mỹ - Ohaus
Tủ lạnh bảo quản Hàn Quốc – LG
Bảng 2.3 Danh mục các dụng cụ sử dụng
Bình nón các loại Ống nghiệm có nắp
Cốc có mỏ các loại Pipet chia vạch Ống ly tâm Pipet pasteur Ống đong các loại Pipet tips
Lưới vớt hạt Ống tiêm d = 4mm Đĩa petri Kim tiêm cỡ 25G x 1’’
2.1.4 Môi trường sử dụng trong nghiên cứu
Bảng 2.4 Thành phần môi trường MRS lỏng
Nguyên liệu Lượng sử dụng Nguyên liệu Lượng sử dụng
Triamoni citrat 2 g Nước cất vừa đủ 1000 ml pH 6,8 - 7,0
Môi trường MRS thạch = MRS lỏng + thạch Agar (2%) (20g thạch bột/1000ml)
2.1.5 Các dung dịch sử dụng trong nghiên cứu
Dung dịch Natri Alginat 3%: Cân 3g Natri Alginat, ngâm trương nở hoàn toàn trong 100ml nước cất
Dung dịch CaCl2 2% (kl/tt): Cân 2g Calci clorid hòa tan trong 100ml nước cất Dung dịch acid acetic 0,5% (kl/tt): Cân 0,5g acid acetic băng, pha loãng với vừa nước cất vừa đủ 100ml
Dung dịch chitosan 0,4% (kl/tt), pH 5,5 – 6,0: Cân 0,4g Chitosan hòa tan trong 90ml acid acetic 0,5%, điều chỉnh pH đến 5,5 – 6,0 bằng NaOH 1M và HCl 1M, thêm acid acetic 0,5% vừa đủ 100ml
Dung dịch chitosan 0,4%/calci clorid 2% (dung dịch hỗn hợp X), pH 5,5 – 6,0: Cân 2g Calci clorid và 0,4 g chitosan lần lượt hòa tan vào 90ml acid acetic 0,5%, điều chỉnh pH 5,5 – 6,0 bằng dung dịch NaOH 1M và HCl 1M, thêm acid acetic 0,5% vừa đủ 100ml
Dung dịch Natri citrat 2%: Cân 2g Natri citrat hòa tan trong 100ml nước cất Môi trường pH 2,5: Thêm từ từ HCl 1N vào 1000ml nước cất đến khi thu được dung dịch có pH bằng 2,5
14 Môi trường pH 6,8: Hòa tan 28,8g dinatri hydrophosphate và 11,45g kali dihydrophosphat vào 1000ml nước, điều chỉnh đến pH 6,8 bằng dung dịch NaOH 1M và HCl 1M.
Nội dung nghiên cứu
2.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của kích thước vi nang đến một số đặc tính của vi nang
- Khảo sát ảnh hưởng của kích cỡ đầu nhỏ giọt đến kích thước vi nang tạo thành
- Khảo sát ảnh hưởng của kích thước vi nang đến hàm ẩm của vi nang
- Khảo sát ảnh hưởng của kích thước vi nang đến mật độ VSV L acidophilus trong vi nang sau đông khô
2.2.2 Đánh giá khả năng bảo vệ và giải phóng VSV tại điều kiện pH đường tiêu hóa của các mẫu vi nang chứa Lactobacillus acidophilus có kích thước khác nhau
- Ảnh hưởng của kích thước tới thời gian rã hoàn toàn của vi nang trong điều kiện pH đường tiêu hóa
- Đánh giá ảnh hưởng của kích thước đến khả năng bảo vệ VSV sau khi qua dung dịch pH 2,5
- Đánh giá ảnh hưởng của kích thước đến khả năng giải phóng VSV trong dung dịch pH 6,8.
Phương pháp nghiên cứu
2.3.1.1 Phương pháp tiệt khuẩn bằng nhiệt ẩm
Phương pháp hấp tiệt trùng được sử dụng rộng rãi để tiệt trùng các dụng cụ thủy tinh, môi trường và dung dịch thường dùng trong nghiên cứu Phương pháp này bao gồm bọc các vật dụng cần tiệt trùng bằng giấy báo hoặc đựng trong bình nón thủy tinh có nút bông, sau đó thực hiện hấp tiệt ở nhiệt độ 115ºC trong thời gian 20 phút để loại bỏ hoàn toàn các vi sinh vật gây hại.
2.3.1.2 Phương pháp tiệt khuẩn Tyndall
Cân một lượng tinh bột vào bình nón, đậy kín bằng nút bông Tiến hành đun cách thủy ở 70 – 80ºC trong 1 giờ, sau đó ủ trong tủ ấm 37ºC trong 24 giờ Lặp lại bước trên trong 3 ngày liên tục[1]
2.3.2 Phương pháp nuôi cấy thu hỗn dịch tế bào
Để chuẩn bị môi trường canh tác cho vi khuẩn, ta cân và đong các thành phần của môi trường MRS lỏng theo công thức đã xác định Sau đó, hòa tan hỗn hợp này trong 100ml nước cất vô trùng Chia môi trường đã pha chế vào 10 ống nghiệm sạch, mỗi ống 10ml, và đậy kín bằng nắp Tiến hành hấp tiệt trùng các ống nghiệm chứa môi trường ở nhiệt độ 115ºC trong 20 phút để tiêu diệt hết các vi sinh vật có thể gây ô nhiễm Để nguội hỗn hợp đến khoảng 37-40ºC, sau đó cấy chủng vi khuẩn giống vào các ống nghiệm với nồng độ 10% (khối lượng/thể tích) trong tủ cấy vô trùng Cuối cùng, các ống nghiệm đã được cấy chủng được ủ trong tủ ấm ở điều kiện 37ºC và 5% CO2 trong thời gian 24 giờ để tạo điều kiện phát triển cho vi khuẩn.
Cân, đong các thành phần nguyên liệu theo công thức môi trường MRS lỏng vào bình nón có nút bông Tiến hành tiệt khuẩn môi trường ở 115 độ C trong 20 phút bằng nồi hấp tiệt trùng Để nguội đến nhiệt độ phòng Cấy giống đã hoạt hóa vào bình nón với tỷ lệ 10% (tt/tt) trong tủ cấy vô trùng Ủ trong tủ ấm 37ºC, 5% CO2 trong 24 giờ, thu được bình nón chứa hỗn dịch tế bào VSV
Sau khi nhân giống 24 giờ, hỗn dịch trong bình nón được ly tâm ở 4000 vòng/phút trong 10 phút Gạn bỏ phần dịch trong, thu được sinh khối tế bào
2.3.3 Phương pháp tạo vi nang a) Tạo vi nang không chứa vi sinh vật
Dung dịch Natri Alginat 3%, dd Calci Clorid 2%, dd Chitosan 0,4%/Calci Clorid 2%, dd Chitosan 0,4%, nước cất được tiệt khuẩn bằng phương pháp nhiệt ẩm Tinh bột được tiệt khuẩn bằng phương pháp Tyndall
Các dụng cụ nhỏ giọt K1, K2, K3:
K1: Đầu kim tiêm, cỡ kim 25G x 1’’ (d = 0,241mm) K2: Đầu pipet Pasteur, d = 2mm
K3: Đầu ống tiêm to, d = 4mm Tiến hành:
Dung dịch Natri Alginat 3% sau khi tiệt khuẩn, được để nguội đến nhiệt độ phòng, bổ sung tinh bột với nồng độ 10% (kl/tt) Khuấy từ 20 phút cho hỗn dịch được phân tán đều, đồng nhất (Hỗn dịch AT)
Sử dụng các đầu nhỏ giọt có kích thước khác nhau, nhỏ chậm hỗn dịch alginate tung (AT) vào dung dịch CaCl2 2% Để yên hỗn dịch trong 30 phút cho vi nang ổn định Tiếp theo, thu các hạt vi nang bằng lưới lọc và rửa sạch.
Để tạo ra vi nang ATC-1, quá trình đông tụ được thực hiện đồng thời với việc phối hợp chitosan Hỗn dịch AT được nhỏ giọt xuống dung dịch chitosan 0,4%/canxi clorid 2% bằng các đầu nhỏ giọt có kích thước khác nhau Sau đó, hỗn hợp được để yên trong 30 phút để vi nang ổn định Cuối cùng, lưới được sử dụng để thu hạt và rửa sạch 3 lần bằng nước cất.
Vi nang ATC-2: Được tạo thành bằng cách phối hợp Chitosan sau quá trình đông tụ Alginat Dùng các đầu nhỏ giọt có kích thước khác nhau, nhỏ hỗn hợp dung dịch AT xuống dung dịch Calci clorid 2%, để yên 30 phút cho vi nang ổn định Dùng lưới thu hạt, rửa 3 lần bằng nước cất Sau đó, chuyển vi nang sang dung dịch Chitosan 0,4%, kết hợp khuấy từ trong 30 phút Dùng lưới thu hạt, rửa 3 lần với nước cất
16 b) Tạo vi nang chứa VSV
Chuẩn bị các dụng cụ, hóa chất cần thiết để tạo vi nang như mục a), tiến hành tiệt khuẩn theo phương pháp đã được trình bày ở mục 2.3.1.Sinh khối VSV sau khi nuôi cấy được thu theo phương pháp đã trình bày ở mục 2.3.2
Dung dịch Natri Alginat 3% sau khi hấp tiệt khuẩn được để nguội đến nhiệt độ phòng, bổ sung thêm sinh khối VSV với tỷ lệ lượng sinh khối thu được từ 100ml môi trường nuôi cấy với 50ml hỗn dịch Alginat Đồng nhất hóa bằng máy khuấy từ 15 phút để sinh khối VSV phân tán đều Bổ sung thêm tinh bột với nồng độ 10% (kl/tt), đồng nhất hóa bằng máy khuấy từ thu được hỗn dịch AT-VSV
Sau đó, sử dụng hỗn dịch AT-VSV, tiến hành tạo các vi nang AT, ATC-1, ATC-2 với các dụng cụ nhỏ giọt có kích thước khác nhau như mục a) thu được các vi nang chứa VSV Thao tác được thực hiện trong buồng cấy vô trùng
2.3.4 Phương pháp đông khô vi nang
Sau khi dàn đều vi nang tươi đã rửa sạch và tiệt khuẩn trong đĩa Petri, chúng được tiền đông trong tủ âm sâu ở -80ºC trong 24 giờ Tiếp theo, vi nang được đông khô trong buồng lạnh của máy đông khô ở -50ºC, áp suất 0,100 mbar trong 24 giờ để loại bỏ độ ẩm, tạo thành dạng bột khô.
Kết thúc quá trình đông khô, mẫu vi nang được lấy ra và bảo quản trong đĩa petri quấn parafin, được để ở tủ lạnh ở nhiệt độ khoảng 2 – 8ºC
2.3.5 Phương pháp đo hàm ẩm
Tiến hành đo hàm ẩm của các mẫu vi nang trên thiết bị Ohaus theo phương pháp mất khối lượng do làm khô [6] Cân khoảng 0,1g mỗi mẫu vi nang, gia nhiệt đến 105ºC Sau thời gian 3 – 5 phút, đọc kết quả hàm ẩm của mẫu vi nang
2.3.6 Phương pháp đo kích thước vi nang
Sử dụng thiết bị đo đường kính vòng vô khuẩn Haloes Caliper với các thông số: độ phóng đại 2,25 lần; kích thước đo 0 – 35mm và độ phân giải 0,1mm [6] Tiến hành cho từng hạt vi nang lên phiến kính, đặt lên vị trí đo và điều khiển vị trí để đo được đường kính của hạt Đo kích thước “n” hạt, tính đường kính trung bình và độ lệch chuẩn của “n” hạt vi nang
THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Khảo sát ảnh hưởng của kích thước vi nang đến một số đặc tính của vi nang
Kích thước vi nang là một thông số vật lý quan trọng, ảnh hưởng trực tiếp đến cảm quan, độ ổn định và độ đồng đều phân liều các hợp chất được vi nang hóa Vì vậy, nghiên cứu tiến hành tạo vi nang bằng phương pháp tách pha đông tụ với các dụng cụ nhỏ giọt có kích thước khác nhau và khảo sát ảnh hưởng của kích thước đến một số đặc tính của vi nang như hàm ẩm, mật độ VSV trong vi nang sau đông khô
3.1.1 Khảo sát ảnh hưởng của kích cỡ đầu nhỏ giọt đến kích thước vi nang tạo thành
Chuẩn bị các dụng cụ, hóa chất, thiết bị cần thiết để tiến hành tạo các mẫu vi nang
AT, ATC-1, ATC-2 theo phương pháp đã được trình bày ở mục 2.3.3:
• Vi nang AT: Alginat 3% - Tinh bột 10%
• Vi nang ATC-1: Alginat 3% - Tinh bột 10% - Chitosan 0,4% (phối hợp Chitosan trong quá trình đông tụ Alginat)
• Vi nang ATC-2: Alginat 3% - Tinh bột 10% - Chitosan 0,4% (bao phủ Chitosan sau quá trình đông tụ Alginat)
Mỗi mẫu vi nang, dùng các loại dụng cụ nhỏ giọt có các kích cỡ tăng dần K1 < K2 < K3 để tạo ra vi nang có các kích thước tương ứng:
• K1: Đầu kim tiêm, cỡ kim 25G x 1’’ (d = 0,241mm)
• K3: Đầu ống tiêm to, d = 4mm
Tiến hành tạo các mẫu vi nang AT, ATC-1, ATC-2 với các dụng cụ nhỏ giọt K1, K2, K3 theo phương pháp đã được trình bày ở mục 2.3.3 Các mẫu vi nang được đông khô theo phương pháp đã được trình bày ở mục 2.3.4
Quan sát hình thái của vi nang tươi và vi nang sau đông khô Đo kích thước 20 hạt/mẫu vi nang tươi, tính đường kính trung bình và độ lệch chuẩn theo phương pháp đã được trình bày ở mục 2.3.6 Kết quả được trình bày ở hình 3.1 và bảng 3.1
Vi nang AT tươi Vi nang AT sau đông khô
Vi nang ATC-1 tươi Vi nang ATC-1 sau đông khô
Vi nang ATC-2 tươi Vi nang ATC-2 sau đông khô
Hình 3.1 Hình ảnh các vi nang AT, ATC-1, ATC-2 tươi và sau đông khô được tạo bởi các dụng cụ nhỏ giọt K1, K2, K3
Bảng 3.1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của kích cỡ dụng cụ nhỏ giọt đến kích thước vi nang AT, ATC-1, ATC-2 (n = 20)
Mẫu vi nang Kích thước vi nang tươi (mm) = mean ± SD
Nhận xét và bàn luận:
Về mặt cảm quan, tất cả các mẫu vi nang tươi có màu trắng, hình cầu, bề mặt trơn nhẵn, kích thước tương đối đồng đều (với SD dao động từ 0,07 – 0,10mm) Vi nang sau đông khô màu trắng, hình hơi cầu, bề mặt hơi xù xì, thể chất khô, cứng, cấu trúc xốp
Kích thước vi nang phụ thuộc vào đường kính của dụng cụ nhỏ giọt Theo thứ tự tăng dần của kích thước đầu nhỏ giọt K1 < K2 < K3, vi nang AT có kích thước trung bình lần lượt là: 2,31mm, 3,82mm, 4,97mm; vi nang ATC-1 có kích thước trung bình lần lượt là: 2,41mm, 3,90mm, 4,94mm; vi nang ATC-2 có kích thước trung bình lần lượt là: 2,37mm, 3,76mm, 4,88mm.
Như vậy, khi tạo vi nang bằng phương pháp nhỏ giọt tách pha đông tụ, nếu tăng kích cỡ đường kính của dụng cụ nhỏ giọt thì kích thước vi nang tạo thành sẽ tăng theo Điều này có thể giải thích do sự hình thành hydrogel giữa phân tử Alginat và ion Ca 2+ Khi giọt hỗn dịch Natri alginat – Tinh bột được nhỏ xuống và tiếp xúc với dung dịch Calci clorid, màng gel nhanh chóng được hình thành bao xung quanh giọt và phát triển theo hướng từ ngoài vào trong theo sự khuếch tán của ion Ca 2+ từ nơi có nồng độ cao đến nơi có nồng độ thấp [13] Vì vậy, khi tăng kích cỡ đầu nhỏ giọt sẽ làm tăng kích thước hạt vi nang tạo thành Điều này phù hợp với nghiên cứu trước đây của Bounthavy Phegsavatdy, tác giả đã dùng các dụng cụ nhỏ giọt D1 (d = 0,2421mm); D2 (d = 2mm); D3 (d = 4mm) để tạo vi nang Carrageenan có đường kính trung bình lần lượt là 2,11mm; 4,13mm; 5,23mm [3] Đồng thời, kết quả ở bảng 3.1 cũng cho thấy, việc sử dụng Chitosan trong công thức vi nang không làm ảnh hưởng tới kích thước hạt Cụ thể, với dụng cụ nhỏ giọt có kích cỡ K1, kích thước trung bình của công thức vi nang không có Chitosan (mẫu AT) là 2,31mm xấp xỉ kích thước trung bình của công thức vi nang có bao Chitosan ATC-1, ATC-2 lần lượt là 2,41mm, 2,37mm Với dụng cụ nhỏ giọt có kích cỡ K2, kích thước trung bình của công thức vi nang không có Chitosan (mẫu AT) là 3,82mm xấp xỉ kích thước trung bình của công thức vi nang có bao Chitosan ATC-1, ATC-2 lần lượt là 3,90mm; 3,76mm Với dụng cụ nhỏ giọt có kích cỡ K3, kích thước trung bình của công thức vi nang không có Chitosan (mẫu AT) là 4,97mm xấp xỉ kích thước trung bình của công thức vi nang có Chitosan ATC-1, ATC-2 lần lượt là 4,94mm; 4,88mm Như vậy, bổ sung Chitosan không làm thay đổi kích thước của vi nang tạo thành Theo Koo Sun- mo và cộng sự, việc bổ sung Chitosan làm thay đổi cấu trúc vi nang nhưng không làm thay đổi hình dạng hay kích thước của vi nang [39] Tuy nhiên, cũng có một số nghiên cứu có kết quả ngược lại Lóránd Erdélyi và cộng sự đã tiến hành tạo vi nang bằng đầu vũi phun cú kớch thước 150àm, sau đú khuấy và ủ trong dung dịch Chitosan 0,4% trong
30 phút Nhóm tác giả đo kích thước vi nang bằng kính hiển vi quang học và cho kết quả là đường kớnh trung bỡnh của vi nang được bao Chitosan là 203,5 ± 31,98àm lớn hơn so với vi nang khụng được bao Chitosan là 187,21 ± 24,36àm [20] Núi chung, việc so sánh kết quả giữa các nghiên cứu sẽ đáng tin cậy hơn nếu điều kiện và phương pháp của các nghiên cứu giống nhau hoàn toàn
3.1.2 Khảo sát ảnh hưởng của kích thước vi nang đến hàm ẩm của vi nang Đối với chế phẩm Probiotic đông khô, hàm ẩm là một trong những yếu tố quan trọng cần kiểm soát Sự có mặt của nước ảnh hưởng tới sự phát triển của các VSV trong chế phẩm Probiotic Do đó, nghiên cứu tiến hành theo dõi hàm ẩm của các mẫu vi nang có kích thước khác nhau
Tạo mẫu vi nang AT, ATC-1, ATC-2 sử dụng dụng cụ nhỏ giọt K1, K2, K3 theo mục 3.1.1 Tiến hành đông khô vi nang theo phương pháp mục 2.3.4 Sau đông khô, bảo quản vi nang trong đĩa petri quấn parafin trong tủ lạnh ở nhiệt độ 2 - 8ºC Đo hàm ẩm vi nang sau đông khô và sau 30 ngày bảo quản bằng thiết bị Ohaus ở 105ºC trong 3 - 5 phút theo mục 2.3.5 Kết quả hàm ẩm trình bày tại bảng 3.2.
Bảng 3.2 Kết quả hàm ẩm của các mẫu vi nang sau đông khô và sau 30 ngày bảo quản 2 - 8ºC
Thời điểm Mẫu vi nang Hàm ẩm (%)
Nhận xét và bàn luận:
Theo Dược điển Việt Nam V, hàm ẩm đối với các chế phẩm Probiotic đông khô không vượt quá 5% [2] Kết quả ở bảng 3.2 cho thấy, tất cả các mẫu vi nang ngay sau đông khô đều có hàm dưới 5% và không có sự chênh lệch lớn giữa các mẫu vi nang có kích thước khác nhau Cụ thể, theo chiều tăng dần của kích thước dụng cụ nhỏ giọt K1
< K2 < K3, mẫu vi nang AT có hàm ẩm lần lượt là 3,25%; 1,65%; 1,64%; mẫu vi nang ATC-1 có hàm ẩm lần lượt là 2,19%; 1,32%; 1,59%; mẫu vi nang ATC-2 có hàm ẩm lần lượt là 2,29%; 1,61%; 1,64%
Sau một tháng bảo quản, hàm ẩm của tất cả các mẫu vi nang đều tăng lên Mẫu có hàm ẩm cao nhất là mẫu vi nang không bao Chitosan (mẫu AT) kích thước nhỏ K1 đạt 4,91% Mẫu có hàm ẩm thấp nhất là mẫu vi nang bao Chitosan bằng phương pháp 2 giai đoạn (ATC-2) kích thước K2 đạt 1,97% Hàm ẩm của tất cả các mẫu đều tăng có thể do trong quá trình bảo quản, hơi nước trong không khí có thể thấm qua bao bì thủy tinh dùng để bảo quản mẫu, các mẫu vi nang hút ẩm và làm cho hàm ẩm tăng lên Hàm ẩm vi nang đông khô phụ thuộc đáng kể vào độ ẩm tương đối của môi trường
3.1.3 Khảo sát ảnh hưởng của kích thước vi nang đến mật độ VSV L acidophilus trong vi nang sau đông khô
Lactobacillus acidophilus được nuôi cấy trong 100ml dung dịch MRS theo phương pháp đã được trình bày ở mục 2.3.2 Sau 24 giờ nhân giống, hỗn dịch được ly tâm ở tốc độ 4000 vòng/phút trong 15 phút, gạn bỏ phần dung dịch, thu sinh khối tế bào VSV Lượng sinh khối tế bào VSV thu được từ 100ml môi trường nuôi cấy MRS được phối hợp với 50ml dung dịch Alginat 3% (kl/tt), đồng nhất hóa bằng máy khuấy từ trong
10 phút Bổ sung Tinh bột 10% (kl/tt) vào hỗn dịch trên, đồng nhất hóa bằng máy khuấy từ trong 15 phút Tiến hành tạo các mẫu vi nang AT, ATC-1, ATC-2 với các dụng cụ nhỏ giọt K1, K2, K3 theo phương pháp đã được trình bày ở mục 2.3.3
Các mẫu vi nang được đông khô theo phương pháp đã được trình bày ở mục 2.3.4 Sau khi đông khô, tiến hành phá 0,1g vi nang mỗi mẫu trong 10,0ml dung dịch Natri citrat 2% theo phương pháp đã được trình bày ở mục 3.3.8 Hút chính xác 1,00ml dịch phá vi nang, tiến hành pha loãng liên tục và xác định số lượng vi sinh vật theo phương pháp đã được trình bày ở mục 2.3.7 Kết quả mật độ VSV trung bình trong các mẫu vi nang sau đông khô được trình bày ở hình 3.2
Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn mật độ VSV trung bình trong các mẫu vi nang sau đông khô (n = 3)
Mậ t độ V SV ( Log C FU /g )
Mật độ VSV trung bình trong các mẫu vi nang sau đông khô (n = 3)
Nhận xét và bàn luận:
Đánh giá khả năng bảo vệ và giải phóng VSV tại điều kiện pH đường tiêu hóa của các mẫu vi nang chứa L acidophilus có kích thước khác nhau
“Probiotic là những vi sinh vật sống, mà khi được sử dụng với số lượng thích hợp sẽ mang lại lợi ích sức khỏe cho vật chủ” Theo tiêu chuẩn của FAO/WHO, chế phẩm Probiotic cần phải giải phóng lượng VSV tối thiểu 6 Log CFU/g tại đích tác dụng [28]
Vì vậy, nghiên cứu tiến hành tạo các mẫu vi nang chứa VSV với kích thước khác nhau và khảo sát ảnh hưởng của kích thước đến thời gian rã, khả năng bảo vệ và khả năng giải phóng VSV tại môi trường pH đường tiêu hóa
3.2.1 Ảnh hưởng của kích thước tới thời gian rã hoàn toàn của vi nang trong điều kiện pH đường tiêu hóa
Thời gian rã hoàn toàn của vi nang là một thông số quan trọng, quyết định đến đích giải phóng VSV tại đường tiêu hóa Do đó, nghiên cứu tiến hành khảo sát thời gian rã hoàn toàn của các mẫu vi nang có kích thước khác nhau
Tạo các mẫu vi nang AT, ATC-1, ATC-2 với 3 dụng cụ nhỏ giọt K1, K2, K3 như mục 3.1.1 Vi nang được đông khô theo phương pháp đã được trình bày ở mục 2.3.4
Các mẫu vi nang được ủ lần lượt qua từng môi trường pH 2,5 và pH 6,8 ở 37ºC trong máy lắc quay tròn tốc độ 75 vòng/phút trong thời gian nhất định Trong quá trình ủ, hình thái của vi nang và dịch ủ được quan sát theo thời gian Kết quả quan sát được trình bày chi tiết trong các hình 3.3, 3.4, 3.5 và bảng 3.3.
Hình 3.3.a Hình ảnh vi nang AT sau 20 phút ủ tại môi trường pH 6,8
Hình 3.3.b Hình ảnh vi nang AT sau 35 phút ủ tại môi trường pH 6,8
Hình 3.3.c Hình ảnh vi nang AT sau 40 phút ủ tại môi trường pH 6,8
Hình 3.4.a Hình ảnh vi nang ATC-1 sau 60 phút ủ tại môi trường pH 6,8
Hình 3.4.b Hình ảnh vi nang ATC-1 sau 125 phút ủ tại môi trường pH 6,8
Hình 3.5.a Hình ảnh vi nang ATC-2 sau 90 phút ủ tại môi trường pH 6,8
Hình 3.5.b Hình ảnh vi nang ATC-2 sau 150 phút ủ tại môi trường pH 6,8 Bảng 3.3 Kết quả thời gian rã của các mẫu vi nang AT, ATC-1, ATC-2
Thời gian rã của các mẫu vi nang trong môi trường pH 6,8
Nhận xét và bàn luận:
Kết quả ở bảng 3.3 cho thấy, kích thước vi nang ảnh hưởng tới thời gian rã của vi nang trong môi trường pH tiêu hóa Sau 2 giờ ủ tại môi trường pH 2,5 ở 37ºC trong máy lắc quay tròn tốc độ 75 vòng/phút, tất cả các mẫu vi nang đều không rã, dịch ủ trong, vi nang trương nở nhẹ Sau khi chuyển sang môi trường pH 6,8, tiếp tục ủ ở điều kiện trên, thời gian rã hoàn toàn của các mẫu vi nang dao động từ 20 – 150 phút và có sự khác biệt giữa các vi nang có kích thước khác nhau Mẫu vi nang không bao chitosan (mẫu AT) kích thước nhỏ (K1) có thời gian rã hoàn toàn ngắn nhất là 20 phút Mẫu vi
28 nang bao chitosan bằng phương pháp 2 giai đoạn (mẫu ATC-2) kích thước lớn (K2, K3) có thời gian rã hoàn toàn dài nhất là 150 phút
Kích thước vi nang ảnh hưởng đáng kể đến thời gian phân rã Vi nang lớn hơn có thời gian phân rã lâu hơn Điều này là do cấu trúc "hộp trứng" của vi nang được hình thành thông qua phương pháp nhỏ giọt, với ion Ca2+ liên kết với nhóm -COO- trong phân tử Alginat Trong môi trường axit (pH 2,5), tinh bột nở ra, tạo điều kiện cho ion H+ xâm nhập và thay thế ion Ca2+ trong cấu trúc "hộp trứng" Sau đó, ở môi trường trung tính (pH 6,8), các nhóm COO- bị khử, cho phép ion H+ và Na+ xâm nhập sâu hơn và phá vỡ cấu trúc vi nang Vi nang nhỏ hơn có diện tích tiếp xúc lớn hơn, dẫn đến quá trình trao đổi ion nhanh hơn giữa Ca2+, H+ và Na+, từ đó làm giảm thời gian phân rã của vi nang.
Kết quả ở bảng 3.3 chỉ ra rằng chitosan có khả năng kéo dài thời gian rã của vi nang Khi sử dụng cùng loại dụng cụ nhỏ giọt, công thức vi nang có chứa chitosan (ATC-1, ATC-2) có thời gian rã lâu hơn so với công thức vi nang không có chitosan (AT) Điều này được giải thích rằng các nhóm amino trong chitosan và các nhóm carboxyl trong alginat liên kết với nhau thông qua tương tác tĩnh điện, tạo thành một lớp màng bền vững, kéo dài thời gian rã của vi nang.
3.2.2 Đánh giá ảnh hưởng của kích thước đến khả năng bảo vệ VSV sau khi qua dung dịch pH 2,5 pH acid là một trong những yếu tố bất lợi đối với VSV Probiotic [18] Do đó, nghiên cứu tiến hành khảo sát khả năng bảo vệ VSV L acidophilus của các mẫu vi nang có kích thước khác nhau khi di chuyển qua môi trường pH 2,5
Tạo các mẫu vi nang AT, ATC-1, ATC-2 chứa sinh khối VSV với 3 dụng cụ nhỏ giọt K1, K2, K3 như mục 3.1.3 Vi nang tươi được đông khô theo phương pháp đã được trình bày ở mục 2.3.4
Cân 0,1g mỗi mẫu vi nang sau đông khô, tiến hành ủ trong 10,0ml môi trường pH 2,5 trong máy lắc quay tròn ở 37ºC, tốc độ 75 vòng/phút Sau 2 giờ, rửa vi nang bằng nước cất 3 lần, tiến hành phá vi nang bằng 10,0 ml dung dịch Natri citrat 2% theo phương pháp đã được trình bày ở mục 2.3.10 Hút chính xác 1,00ml dịch phá vi nang, tiến hành pha loãng liên tục và xác định số lượng VSV theo phương pháp đã được trình bày ở mục 2.3.7
29 Kết quả khả năng bảo vệ VSV qua dung dịch pH 2,5 của các mẫu vi nang được thể hiện tại hình 3.6 và bảng 3.4:
Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn số lượng VSV được bảo vệ trong các mẫu vi nang sau khi ủ 2h tại môi trường pH 2,5 (n = 3)
Bảng 3.4 Khả năng bảo vệ VSV trong các mẫu vi nang sau 2 giờ ủ tại môi trường pH 2,5
Mẫu vi nang Mật độ VSV (Log CFU/g) %VSV được bảo vệ so với trước khi ủ Sau đông khô Sau khi ủ 2 giờ tại pH 2,5
Nhận xét và bàn luận:
Kết quả ở hình 3.6 cho thấy, lượng VSV sống sót của tất cả các mẫu vi nang sau khi ủ 2 giờ trong môi trường pH 2,5 ở điều kiện 37ºC, tốc độ lắc 75 vòng/phút, đều đạt trên 6 Log CFU/g Trong đó, mẫu có lượng VSV sống sót cao nhất là công thức vi nang ATC-2 dùng dụng cụ nhỏ giọt có kích cỡ K1 (đạt 8.34 Log CFU/g); mẫu có lượng VSV sống sót thấp nhất là công thức vi nang AT dùng dụng cụ nhỏ giọt có kích cỡ K3 (đạt 6,56 Log CFU/g)
Lượng V SV ( Log C FU /g ) Đồ thị biểu diễn lượng VSV được bảo vệ sau khi ủ 2 giờ trong dung dịch pH 2,5 (n = 3)
30 Kết quả ở bảng 3.4 cho thấy, lượng VSV của tất cả các mẫu vi nang sau khi ủ 2 giờ tại môi trường pH 2,5 đều giảm so với lượng VSV trong vi nang sau đông khô Điều này có thể giải thích do khi ủ trong môi trường pH 2,5, các phân tử tinh bột có trong công thức vi nang hấp thụ nước và trương nở, làm giãn chuỗi liên kết trong cấu trúc vi nang, tạo điều kiện cho một lượng nhỏ ion H + xâm nhập và trao đổi với ion Ca 2+ trong mô hình “hộp trứng” của vi nang Calci alginat, làm thất thoát một lượng VSV ra môi trường [22]
Kích thước vi nang ảnh hưởng đến khả năng bảo vệ VSV trong môi trường pH 2,5 Vi nang lớn hơn có hàm lượng tinh bột cao hơn, trương nở nhiều hơn khi ở pH thấp, dẫn đến thất thoát VSV đáng kể Mặt khác, vi nang nhỏ hơn có diện tích bề mặt lớn hơn, giúp chúng liên kết tốt hơn với chitosan, tạo thành lớp phủ chất lượng và tăng hiệu quả bảo vệ VSV.
Tuy nhiên, xu hướng này lại không thấy rõ với công thức ATC-1, %VSV được bảo vệ qua môi trường pH 2,5 xấp xỉ nhau giữa 3 kích thước K1, K2, K3 (lần lượt là 95,42%; 96,65%; 94,35%) Nguyên nhân có thể do sự khác biệt về cấu trúc bên trong của vi nang Vi nang ATC-2 được tạo thành bằng cách phủ Chitosan sau quá trình đông tụ Calci alginat nên có cấu trúc tương tự vi nang AT Còn vi nang ATC-1 được tạo bằng cách phối hợp chitosan ngay trong quá trình đông tụ có cấu trúc đặc hơn so với vi nang
AT, ATC-2 do sự có mặt của Chitosan trong phần lõi Từ đó, khả năng hấp thụ và trương nở của vi nang bị hạn chế và không thấy rõ được sự khác biệt giữa 3 kích thước