Đánh giá khả năng bảo vệ và giải phóng vi sinh vật của vi nang tinh bột hồ hoá trong các môi trường mô phỏng pH dịch tiêu hoá .... DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 : Lactobacillus acid
TỔNG QUAN
Tổng quan về Lactobacillus acidophilus
1.1.1 Đặc điểm của Lactobacillus acidophilus:
Năm 1965, Lily và Stillwell sử dụng thuật ngữ probiotic để mô tả chất được tiết ra bởi một sinh vật và kích thích sự phát triển của sinh vật khác [65]
Năm 2002, tổ chức FAO và WHO quyết định đưa ra một định nghĩa thống nhất về probiotic là “các vi sinh vật sống, khi được sử dụng với số lượng thích hợp sẽ mang lại lợi ích sức khỏe cho vật chủ” và hỗ trợ việc sử dụng từ ngữ này trong tương lai Hiện nay, khái niệm probiotic được mô tả đầy đủ hơn: Probiotic, bao gồm vi khuẩn và nấm men, là những vi sinh vật sống đã được chứng minh là có tác dụng có lợi đối với sức khỏe con người [39]
L acidophilus lần đầu được phân lập từ phân trẻ sơ sinh vào năm 1900 và được đặt tên chính thức Lactobacillus acidophilus [31]
Hình 1.1: Ảnh hiển vi điện tử của tế bào Lactobacillus acidophilus [12]
L acidophilus, thuộc chi Lactobacillus, Họ Lactobacillaceae, là trực khuẩn gram dương, không hình thành bào tử Chúng có dạng que mảnh có đầu tròn, dài 2-10 μm, thường tồn tại dưới dạng đơn lẻ, xếp đôi hoặc chuỗi ngắn Hầu hết các chủng L acidophilus là vi khuẩn vi hiếu khí và kỵ khí Nhiệt độ nuôi cấy tối ưu thường là 35 ~ 38°C và về cơ bản không phát triển ở nhiệt độ dưới 20°C L acidophilus có khả năng chịu nhiệt kém và độ pH tối ưu là 5,5 ~ 6,0 Ngoài ra, L acidophilus có khả năng kháng acid và mật tốt [31]
1.1.1.3 Vai trò của Lactobacillus acidophilus trong hệ tiêu hoá
Theo các nghiên cứu hiện nay, L acidophilus tham gia hỗ trợ quá trình tiêu hoá của người chủ yếu thông qua việc sản xuất các chất chuyển hóa và điều hòa hệ vi sinh vật đường ruột [21], [55] Độ pH tối ưu của nhiều vi khuẩn gây bệnh đường ruột là trung tính hoặc hơi kiềm Trong khi đó, acid lactic được sản xuất bởi L acidophilus thông qua quá trình
3 trao đổi chất có thể làm giảm độ pH, do đó ức chế sự phát triển và sinh sản của vi khuẩn gây bệnh [21]
1.1.2 Một số yếu tố ảnh hưởng tới khả năng sống sót của Lactobacillus acidophilus
Dạ dày có tính acid cao, pH trong khoảng 1,0-2,5 ở tất cả các đối tượng Độ pH trung bình được ghi lại trong giờ đầu tiên ở đoạn gần ruột non là 6,6 Độ pH trung bình ở đoạn cuối hồi tràng là 7,5 Khi đến manh tràng, pH giảm mạnh xuống 6,4 Sau đó pH tăng dần từ đại tràng phải sang đại tràng trái với giá trị trung bình là 7,0 [30] Ngoài ra, thức ăn cũng có thể ảnh hưởng đến độ pH của dịch dạ dày Ở trạng thái đói, độ pH trong dạ dày ở người khỏe mạnh nằm trong khoảng 1,3 đến 2,5 Thức ăn có thể làm tăng độ pH lên khoảng 4,5 đến 5,8 Trong vòng 1 giờ sau khi ăn, độ pH của dạ dày giảm xuống dưới 3,1 [41] Mặt khác, L acidophilus có độ pH tối ưu là 5,5 ~ 6,0 [31] Như vậy có thể thấy khả năng sống sót của L acidophilus có thể bị ảnh hưởng bởi pH thấp của dạ dày, và sống được trong môi trường pH của ruột non và đại tràng Vì vậy, cần phải bảo vệ L acidophilus qua môi trường dạ dày, để hướng tới những vị trí có tác dụng như ruột non và đại tràng
1.1.2.2 Thời gian vận chuyển vi sinh vật trong đường tiêu hoá
Thời gian di chuyển của vi sinh vật trong đường tiêu hoá bị ảnh hưởng nhiều bởi yếu tố như bệnh lý, sự có mặt của thức ăn, dạng bào chế… vì vậy rất khó xác định chính xác thời điểm vi sinh vật di chuyển trong đường tiêu hoá [13]
Mặt khác, thời gian vi sinh vật di chuyển trong đường tiêu hoá cũng ảnh hưởng đến khả năng sống sót của vi sinh vật [13]
1.1.2.3 Các thành phần có trong dịch tiêu hoá ¨ Thức ăn
Một nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng thức ăn có thể làm chậm đáng kể sự giải phóng thuốc trong dạ dày bằng cách hình thành một lớp màng bao quanh viên thuốc, từ đó dẫn đến chậm hấp thu thuốc và xuất hiện nồng độ đỉnh cao trong huyết tương muộn [16], [41] Cơ chế này phụ thuộc cả vào thành phần của vi nang và thành phần của thức ăn dùng cùng [16] Ngoài ra, thức ăn cũng có thể ảnh hưởng đến độ pH của dịch dạ dày [41], từ đó có thể ảnh hưởng tới việc hấp thu thuốc (vi nang chứa VSV) ¨ Enzym, muối mật, pepsin
Thành phần chính của dịch tiết dạ dày bao gồm acid hydrochloric (HCl), pepsinogen, chất nhầy và nước [41] Tính acid mạnh của dịch dạ dày có thể ảnh hưởng lớn đến khả năng sống sót của vi sinh vật, dẫn đến hạn chế sự phát triển của vi sinh vật trong đường tiêu hóa
4 [45] Một nghiên cứu đã chỉ ra rằng, việc đưa pepsin vào dịch dạ dày không cho thấy ảnh hưởng gì thêm đến tính chất của vi nang [17]
Sau khi đi qua môn vị, vi khuẩn probiotic sẽ đến ruột non, nơi có nhiều dịch tuỵ và mật Acid mật và enzyme tiêu hoá (bao gồm lipase, protease và amylase) cũng có thể ảnh hưởng đến khả năng tồn tại của vi sinh vật thông qua sự phá vỡ màng tế bào và tổn thương DNA [35] Ở cuối ruột non, khi đến đại tràng, vi sinh vật gặp phải thách thức cạnh tranh với vi khuẩn có sẵn, bám vào lớp chất nhầy của ruột Enzyme tiêu hóa và mật làm giảm độ bám dính của chủng [61] Qua thử nghiệm, hầu hết các chủng Lactobacillus được kiểm tra không nhân lên trong môi trường nước bổ sung 0,3% mật bò và các chủng còn lại thì phát triển rất kém [20] Có thể nói, nhiều loại enzyme tiêu hóa và muối mật trong ruột đe dọa khả năng tồn tại và chức năng của vi sinh vật [45]
1.1.3 Một số xu hướng bảo vệ Probiotic
Việc sử dụng probiotic để tăng sức đề kháng, phòng bệnh đã xuất hiện từ hàng nghìn năm trước Tiêu biểu là các sản phẩm từ sữa, được coi là 1 nhóm lớn các sản phẩm có khả năng mang và vận chuyển các vi khuẩn probiotic, trong số đó sữa lên men và phô mai được tiêu thụ nhiều nhất thế giới Ngoài ra, người ta còn sản xuất các dòng sản phẩm nước trái cây bổ sung probiotic phù hợp với các đối tượng dị ứng/không dung nạp sữa hay nhóm đối tượng có nhu cầu năng lượng thấp [62], [47]
Vi sinh vật probiotic không bao: có thể ở dạng bột hoặc cốm, đơn loài hoặc dạng bào chế nang cứng, đơn hoặc đa loài Một ví dụ như sản phẩm Antibio Pro do công ty dược phẩm Han Wha, Hàn Quốc sản xuất với dạng bào chế gói bột pha hỗn dịch uống Mỗi gói chứa 75mg Lactobacillus acidophilus tương đương với 10 8 CFU/gói Nhược điểm của dạng này là khả năng sống sót của vi sinh vật bị ảnh hưởng lớn trong điều kiện khắc nghiệt của đường tiêu hoá như pH, pepsin, enzym, muối mật…
Vi sinh vật bao tan ở ruột: VSV chứa trong nang có lớp bảo vệ chỉ tan trong ruột, hầu hết probiotic được xử lý với một polyme acrylic acid Tác nhân bảo vệ này chỉ được cho phép sử dụng trong dược phẩm, không thích hợp cho thực phẩm bổ sung probiotic vì có thể gây tác dụng phụ
Vi nang hoá, tạo lớp bao kép, giải phóng vi sinh vật ở ruột: Gồm 2 lớp bao Công nghệ bao kép này đã được công nhận và sử dụng ở một số nước trên thế giới, hiện nay trên thị trường Việt Nam phải kể đến như Duolac của hãng Cell Biotech – Hàn Quốc
Bên cạnh đó, hiện nay việc đóng gói probiotic Lactobacillus acidophilus thông qua việc bao từng lớp polyelectrolytes (PE), chitosan (CHI) và carboxymethyl cellulose (CMC)
5 đã được nghiên cứu để tăng cường khả năng sống sót của VSV trong các điều kiện bất lợi gặp phải trong đường tiêu hóa Khi tiếp xúc lần lượt với SGF (mô phỏng dịch dạ dày) và SIF (mô phỏng dịch ruột) trong 120 phút, người ta quan sát thấy các tế bào tự do gần như chết hoàn toàn Tuy nhiên, đối với các tế bào được phủ ba lớp nano PE (CHI/CMC/CHI), tỷ lệ sống sót của L acidophilus được nâng cao [54] Công trình này cho thấy việc bao gói vi nang probiotic bằng alginate và lớp phủ chitosan là một phương pháp hiệu quả giúp bảo vệ vi sinh vật khỏi ảnh hưởng của dạ dày và hướng tới tiềm năng giải phóng vi sinh vật tại ruột non và đại tràng mô phỏng.
Tổng quan về vi nang
Vi nang (microcapsule) là những tiểu phân hình cầu hoặc không xác định, kích thước từ 0,1 μm tới 5,0 mm (thông thường từ 100 đến 500 μm) có thể được bao bởi các hợp chất cao phân tử có nguồn gốc thiên nhiên hoặc tổng hợp [1]
Từ quan điểm vi sinh học, vi nang hóa có thể được định nghĩa là quá trình bẫy/bao gói các tế bào vi sinh vật bằng cách bao phủ chúng trong lõi nhân (gọi là hydrocolloid) thích hợp nhằm ngăn cách chúng với môi trường xung quanh và giải phóng các tế bào VSV tại vị trí thích hợp trong ruột [51]
Vi nang hoá là phương pháp phổ biến nhất trong nghiên cứu tạo nguyên liệu probiotic hiện nay Vi nang chứa vi sinh vật có thể chia làm 3 loại [57]:
Hình 1.2: Các loại vi nang chứa vi sinh vật [57]
Hệ chứa: cấu tạo bởi 2 phần, phần nhân gồm một hoặc hai dược chất (ít khi gồm nhiều dược chất) Dược chất có thể ở trạng thái rắn, lỏng hoặc dưới dạng một nhũ tương, hỗn dịch, có thể có thêm các chất phụ nhằm mục đích ổn định hoặc điều chỉnh tốc độ giải phóng dược chất Phần vỏ vi nang thường là các hợp chất cao phân tử có nguồn gốc thiên nhiên hoặc tổng hợp, có tác dụng tạo màng mỏng, bề dày từ 0,1 đến 200 micromet Lớp vỏ vi nang sẽ xác định các thuộc tính lý hoá của chúng Hệ chứa điển hình cho vi nang tạo bởi phương pháp bao gói VSV [57]
Matrix: chứa VSV phân tán khắp vi nang, được tạo thành từ phương pháp bẫy Đặc điểm của vi nang dạng này là bao gói được VSV cùng cơ chất 1 cách chắc chắn [57]
Bao matrix: là vi nang dạng matrix có lớp bao phía bên ngoài Lớp bao này có thể có nhiều vai trò khác nhau như bảo vệ nhân chứa VSV khỏi tác động từ môi trường xung quanh như ánh sáng, độ ẩm, nhiệt độ Khi vào cơ thể, có thể bảo vệ VSV khỏi tác động của pH dạ dày, muối mật… [57]
Tạo vi nang bằng phương pháp bẫy có khả năng cố định được lượng tế bào lớn và chắc chắn so với các phương pháp khác [57]
Cơ chế giải phóng và hấp thu hoạt chất (VSV) từ vi nang là do tương tác của vỏ nang với môi trường hoà tan (vỡ màng, hoà tan màng, khuếch tán qua màng hoặc giải phóng cơ học theo cơ chế mài mòn…), khi vỏ nang trương nở, dược chất bên trong sẽ khuếch tán [4]
1.2.3 Ưu nhược điểm của việc vi nang hoá v Ưu điểm:
Bảo vệ hiệu quả VSV được bao gói khỏi tác động của môi trường xung quanh [53]: vi nang có cấu tạo như một màng bán thấm hình cầu giúp tế bào được cách ly với môi trường xung quanh, bảo vệ và làm tăng số lượng tế bào VSV, bằng cách này chúng sẽ được bảo vệ tốt hơn trong các điều kiện bất lợi như acid cao, pH thấp, muối mật… [9]
Có khả năng dự đoán và kiểm soát giải phóng VSV [58]: vi nang hóa cho phép cố định một lượng lớn tế bào vi sinh vật và giải phóng tại các vị trí mong muốn Độ bền cơ học của lớp màng bao vi nang đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ và giải phóng vi sinh vật khi cần thiết Lớp màng phải có độ bền cơ học tương đối để có thể bảo vệ được các vi sinh vật sống bên trong, tuy nhiên lại không nên quá vững chắc [9] v Nhược điểm: Điều kiện bảo quản chặt chẽ: các nguyên liệu polymer dùng để tạo vi nang như alginat, gelatin, tinh bột… [11] thường là các chất VSV có thể tiêu hóa được Do đó nếu trong điều kiện bảo quản không được tốt, VSV được bao gói hay VSV tạp nhiễm từ bên ngoài có thể tiêu hóa làm cho vi nang bị thủng, rách dẫn đến giảm hoặc mất vai trò bảo vệ của vi nang Vì vậy cần phải lưu tâm đến việc lựa chọn chủng vi sinh vật và nguyên liệu thích hợp để bao gói Ngoài ra, kỹ thuật bao gói khá phức tạp và chi phí sản xuất cao.
Nguyên liệu tạo vi nang
Vật liệu polymer sinh học kết hợp với VSV và thực hiện chức năng vận chuyển, bảo vệ VSV Những vật liệu này thường được yêu cầu phải không độc và đạt được mục tiêu giải phóng [19]
7 Người ta sử dụng nhiều loại nguyên liệu khác nhau trong các kỹ thuật bao gói vi nang khác nhau, như alginate, chitosan, carrageenan, gôm (gellan, xanthan,…), gelatin, whey protein, tinh bột Mỗi vật liệu bao gói đều có những đặc điểm riêng trong quá trình tạo vi nang và mang lại hình dạng cũng như độ bền khác nhau cho vi nang [11]
1.3.1.1 Đặc điểm của tinh bột
Tinh bột, là một loại polysaccharid có nguồn gốc tốt trong tự nhiên, đã được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực do tính tương thích sinh học và khả năng phân hủy sinh học tốt [66] Tinh bột được cấu tạo chính từ amylose và amylopectin, trong đó cả hai cấu tử này đều được cấu tạo từ α - D glucose Các gốc glucose trong amylose kết hợp với nhau qua liên kết α -(1–4)-glucosid tạo thành chuỗi, các chuỗi liên kết với nhau bằng liên kết α - (1–6)-glucosid ở điểm phân nhánh [29] Trong đó tỉ lệ amylose và amylopectin có thể thay đổi trong một phạm vi rất rộng, tùy thuộc vào nguồn gốc thực vật của tinh bột Tất cả các hạt tinh bột đều chứa cả vùng kết tinh và vùng vô định hình, cho nên chúng ở dạng bán kết tinh [26] Thông thường, tinh bột không tan trong nước lạnh Tuy nhiên, tinh bột có thể hồ hóa trong nước nóng, đây là một đặc tính quan trọng có ảnh hưởng lớn đến việc điều chế vật liệu sinh học từ tinh bột [34]
Hình 1.3: Cấu trúc hoá học của tinh bột [2]
Tinh bột còn được biết đến trong việc sử dụng làm tá dược bảo vệ trong quá trình đông khô theo cơ chế làm giảm lượng tinh thể nước gắn với màng tế bào VSV trong mẫu Khi tạo vi nang calci alginat, tinh bột được phối hợp như một tá dược độn, góp phần cải thiện thể chất của vi nang sau đông khô, giúp tế bào ổn định hơn, cải thiện khả năng sống sót trong quá trình đông khô và bảo quản [10]
Bên cạnh đó, có một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng sử dụng tinh bột hồ hoá nhằm tạo ra một hỗn hợp đồng nhất với alginat vì chúng có khả năng liên kết và hoà tan tốt so với tinh bột không hồ hoá [10] Ngoài ra, khi vào trong ruột, tinh bột còn tạo ra nguồn dinh dưỡng đối với vi sinh vật [50]
8 Một số loại tinh bột được sử dụng phổ biến hiện nay như tinh bột ngô, tinh bột sắn, tinh bột củ sen… Các loại hạt tinh bột khác nhau thì có hình dạng, kích thước, hàm lượng amylose, cấu trúc tinh thể, trọng lượng phân tử của amylose và amylopectin,… khác nhau, dẫn tới quá trình và kết quả hồ hoá khác nhau [34] Ví dụ, khi các hạt tinh bột khoai tây trương nở, sẽ lọc một lượng đáng kể amylose, vỡ thành từng miếng trương nở và mất đi tính nguyên vẹn trong nước rất nhanh Ngược lại, các hạt tinh bột sắn sẽ hơi phồng lên, lọc một lượng tương đối nhỏ amylose và giữ nguyên hình dạng tốt trong nước [34]
1.3.1.2 Sự hồ hoá của tinh bột
Sự hồ hóa là một tính chất quan trọng của tinh bột, đã được nghiên cứu về sự thay đổi các tính chất hóa lý của tinh bột, chẳng hạn như độ hòa tan, tính chất lưu biến, tính chất nhiệt, độ trong suốt của bột nhão, độ kết tinh, [34] Tinh bột hồ hóa cũng hoạt động như một chất hỗ trợ cấu trúc làm giảm giảm khoảng trống, giúp tạo ra các hạt hình cầu và giữ được hình dạng cầu của vi nang sau đông khô [56]
Về bản chất, tinh bột hồ hóa là một mạng lưới gel amylose với các hạt trương nở hoạt động như một tá dược độn Khi hỗn hợp nguội đi, động năng giảm xuống, cho phép các phân tử tinh bột liên kết lại và hình thành mạng lưới Sự tái liên kết ngắn hạn này dẫn đến sự thay đổi kết cấu của tinh bột được hồ hoá Việc bảo quản lâu hơn gây ra sự tái kết tinh thuận nghịch của amylopectin, làm tăng độ cứng của các hạt trương nở gắn trong mạng lưới amylose liên tục Amylopectin được cho là sẽ đóng vai trò chủ đạo trong các tính chất của tinh bột, vì tính chất bán tinh thể của tinh bột chủ yếu được cấu thành bởi các chuỗi phân nhánh ngắn của nó Một thử nghiệm đã chỉ ra rằng đặc tính trương nở và hồ hóa của tinh bột một phần được kiểm soát bởi cấu trúc phân tử của amylopectin, thành phần tinh bột và cấu trúc hạt (tỷ lệ tinh thể và vô định hình) Vì lý do này, sự khác biệt về đặc tính trương nở và kết dính giữa các loại tinh bột có thể là do sự thay đổi trong phân bố chiều dài chuỗi đơn vị amylopectin Bên cạnh đó, các thành phần chiếm tỷ lệ nhỏ của tinh bột, chẳng hạn như phospholipid và monoesters photphat cũng có ảnh hưởng lớn đối với các đặc tính này [60]
Alginat là tên gọi chung cho các muối của acid alginic, tồn tại dưới dạng anion Acid alginic là một polysaccharid mạch thẳng ưa nước, cấu tạo từ hai gốc acid uronic là acid β-D-mannuronic (M) và acid α-L-guluronic (G) nối với nhau bằng liên kết 1,4- glycosid [33], [57]
Hình 1.4: Cấu trúc hoá học của alginat [36]
Alginat là polymer được sử dụng phổ biến trong vi nang hoá probiotic với đặc tính an toàn, khả năng tạo gel với kim loại hoá trị II như Ca 2+ nhờ liên kết chéo được mô tả theo mô hình “vỉ trứng” Các ion Ca 2+ khớp vào các khoảng trống tạo nên mạng lưới không gian ba chiều Cấu trúc gel bán thấm này khi sử dụng làm màng bao, chúng có vai trò như một tấm chắn chống lại những yếu tố bất lợi của môi trường và cho phép giải phóng vi sinh vật được bao theo hướng có kiểm soát [33] Tuy nhiên, độ bền cơ học của màng alginat và tính toàn vẹn có thể bị ảnh hưởng bởi pH thấp, sự có mặt của các ion hóa trị I, các chất tạo phức chelat với ion Ca 2+ như phosphat, lactat, citrat [18]
Có thể khắc phục những vấn đề trên bằng cách phối hợp alginat với polymer khác hoặc phủ thêm lớp màng ngoài trên vi nang Kết hợp alginat và tinh bột là một biện pháp phổ biến cải thiện hiệu quả quá trình vi nang hóa [50] Ngoài ra alginat tích điện âm nên có thể lợi dụng bao thêm lớp bao mới nhờ lực hút tĩnh điện với polymer tích điện dương [18], [22]
Chitosan là một polysaccharide cation bao gồm D-glucosamine và N-acetyl- glucosamine được liên kết bằng liên kết β-(1 → 4) Nó có nguồn gốc thương mại bằng cách khử một phần chitin chiết xuất từ động vật giáp xác [32] Ngoài ra, chitosan tạo thành cấu trúc gel thông qua quá trình tạo gel ionotropic và hòa tan ở pH < 6, tương tự như alginate [63]
Hình 1.5: Cấu trúc hoá học Chitin và Chitosan [64]
10 Chitosan có thể thu được từ phản ửng deacetyl hoá của chitin [59] Khi mức độ deacetyl hóa của chitin đạt khoảng 50% (tùy thuộc vào nguồn gốc của polymer), nó có khả năng tan được trong dung dịch có tính acid [63] Chitosan mang điện tích dương, có tính base yếu (pKa của các nhóm amin xấp xỉ 6,5), thấm nước, không tan trong môi trường trung tính và kiềm, tan trong hầu hết dung dịch acid hữu cơ pH dưới 6,5 [59] Tính chất tích điện dương giúp chitosan hoạt động như một chất bám dính sinh học, có khả năng bám vào các bề mặt tích điện âm như alginat Chitosan và alginat liên kết với nhau thông qua nhóm acid của alginat và nhóm amin của chitosan, tạo thành lớp áo kép giúp tăng độ ổn định, do đó giảm thất thoát vi sinh vật Đặc tính này được ứng dụng để chế tạo vi nang bao chitosan [10] Lớp phủ chitosan có nhiều ưu điểm như không độc, tương thích sinh học tốt và cải thiện đặc tính kết dính sinh học và số lượng VSV bao gói [40], [49]
Bên cạnh đó, chitosan có thể gây ra những bất lợi khi làm vật liệu bao bọc cho vi sinh vật do tác dụng ức chế của nó đối với vi sinh vật Do đó, chitosan thường được sử dụng làm lớp phủ hoặc vỏ hơn là chất nền vi nang [61].
Một số phương pháp tạo vi nang
Có nhiều phương pháp khác nhau để tạo vi nang dựa vào các quá trình hoá học, hoá lý, tĩnh điện, cơ học Đối với vi nang probiotic thường sử dụng các phương pháp tách pha đông tụ, phương pháp nhũ hoá, phương pháp phun sấy, phương pháp đông khô, phương pháp phun đông khô,… [46]
Phương pháp nhỏ giọt tách pha đông tụ: Đây là phương pháp kinh điển nhất trong tạo vi nang Phương pháp này liên quan đến việc chuyển tiếp từ pha lỏng sang pha gel do tương tác ion xảy ra giữa một polyme mang điện tích và một tác nhân khác mang điện tích trái dấu Sự tương tác này tạo thành liên kết chéo giữa các đại phân tử, gây nên sự đông tụ của phức hợp tạo thành Các polymer tự nhiên và bán tổng hợp như alginat, gôm gellan, chitosan, pectin, carboxymethyl cellulose thường được ưu tiên sử dụng do tính tương thích sinh học và có khả năng phân hủy sinh học Các polyme này mang điện tích âm (hoặc dương) trong cấu trúc, sau khi tạo liên kết chéo với các tác nhân mang điện tích trái dấu (Ca 2+ , tripolyphosphat ), chúng hình thành nên một cấu trúc dạng mạng lưới không gian ba chiều lưu giữ VSV [46]
Phương pháp khác: phương pháp nhũ tương hoá, phun sấy, đông khô, phun đông khô ít được sử dụng hơn do chi phí đắt đỏ, thiết bị phức tạp, phương pháp phun sấy còn làm giảm khả năng sống sót của vi sinh vật do ảnh hưởng của nhiệt độ [46]
11 Nhằm tăng cường khả năng bảo vệ vi sinh vật trong vi nang, người ta thường tiến hành phủ thêm các lớp polymer bên ngoài Các lớp phủ này sẽ tương tác với bề mặt vi nang tạo thành một lớp màng liên tục trên bề mặt vi nang Lớp phủ này làm giảm tính thấm của vi nang, giảm sự tiếp xúc của VSV với oxy trong quá trình bảo quản và làm tăng sự ổn định của vi nang ở pH thấp và nhiệt độ cao [37], [48] Bên cạnh đó lớp phủ còn giúp tạo ra một số đặc tính mới cho vi nang như khả năng bám dính, kiểm soát giải phóng VSV [22] Các lớp bao phủ bề mặt vi nang có thể được tạo bởi nhiều cách khác nhau, cụ thể là bao từng lớp, kỹ thuật được sử dụng thường là ngâm, nhúng, phun hay tưới lên bề mặt vi nang các dịch bao thích hợp để tạo thành một hay nhiều lớp bao trên bề mặt Đối với vi nang chứa VSV, kỹ thuật hay được thực hiện nhất là ngâm vi nang vào dung dịch polyme, dẫn đến sự hình thành lớp phủ và quá trình đồng trùng hợp được tạo ra giữa bề mặt của vi nang và polyme bao phủ Nguyên tắc của kỹ thuật này dựa trên lực hút tĩnh điện hóa học giữa vật liệu tích điện âm và dương [22], [18]
Chitosan là một polymer thường được sử dụng để tạo lớp phủ vi nang alginat do khả năng tích điện trái dấu của chitosan và alginat Có 2 phương pháp chính để tạo lớp phủ chitosan: một là phối hợp ngay trong quá trình đông tụ bằng cách bổ sung chitosan/acid acetic vào dung dịch calci clorid; hai là phối hợp sau khi đông tụ bằng cách ngâm vi nang trong dung dịch chitosan/acid acetic Dựa vào kết quả của tác giả Nguyễn Thị Trang, sử dụng phương pháp phối hợp sau đông tụ bằng cách ngâm vi nang trong dung dịch chitosan/acid acetic để tiến hành nghiên cứu này
Kỹ thuật đông khô: Đông khô được sử dụng rộng rãi trong các ngành công nghiệp thực phẩm và dược phẩm để làm khô các thành phần nhạy cảm với nhiệt, do đó nó bảo quản một lượng đáng kể VSV sống sót [28], [38] Tác hại do nhiệt độ thấp và sự thăng hoa của nước trong quá trình đông khô đối với VSV là tương đối nhỏ so với nhiệt độ cao được sử dụng trong sấy phun, giúp cải thiện khả năng sống sót của VSV [57] Tuy nhiên, quá trình này có những hạn chế như tốn thời gian và chi phí [44].
Một số nghiên cứu gần đây về vi nang probiotic
Trong số các kỹ thuật hiện có, việc bẫy vi khuẩn acid lactic trong hạt calci alginate khá phổ biến Lợi ích của alginat là không độc đối với các tế bào VSV được cố định, đồng thời nó là một chất phụ gia thực phẩm đã được công nhận [24] Hiện nay, các vật liệu cốt lõi được nghiên cứu rộng rãi bao gồm alginate, chitosan, carrageenan, gôm, gelatin, whey protein và tinh bột Các nguyên liệu này đã chứng minh khả năng kháng acid ở một mức
12 độ nào đó, tuy nhiên, chỉ một số ít có thể duy trì khả năng tồn tại của VSV ở độ pH thấp tới 2,0 Mặc dù vậy chúng vẫn tồn tại một số nhược điểm [42]
Một nghiên cứu đã sử dụng lớp phủ làm từ protein đậu nành để cải thiện việc cung cấp VSV trong ruột Mục đích của ý tưởng này là bảo vệ VSV khỏi các điều kiện khắc nghiệt như độ pH thấp và enzyme của dịch dạ dày mô phỏng Nghiên cứu khả năng sống sót trong điều kiện đường tiêu hóa in vitro của hai chủng L plantarum CECT 220 và L casei CECT 475 và người ta nhận thấy rằng protein đậu nành cô đặc có hiệu quả trong việc tăng cường khả năng sống sót của các chủng probiotic và bảo vệ chúng khỏi điều kiện của dịch tiêu hóa [27]
Một nghiên cứu khác đã đóng gói các chủng L acidophilus trong hỗn hợp tinh bột kháng và gel alginate calci, bằng cách ép đùn, dẫn đến tăng tỷ lệ sống sót của các chủng trong phô mai Iran và ngay cả sau khi bảo quản trong 6 tháng [27]
Vì tinh bột hồ hóa với lớp phủ chitosan làm giảm độ xốp của hạt alginate và giảm sự rò rỉ của men vi sinh [23], [25], [52] nên vi nang từ tinh bột hồ hóa phối hợp cùng alginat rồi được phủ một lớp chitosan được biết đến là có thể bảo vệ thành công và đáng kể vi khuẩn probiotic chống lại tình trạng bất lợi của tình trạng dạ dày-ruột mô phỏng ở người [10]
Có thể nhận thấy, việc sử dụng tinh bột hồ hoá là một trong những phương pháp có tiềm năng tăng khả năng bảo vệ sự sống sót của vi sinh vật trong điều kiện khắc nghiệt của đường tiêu hoá
NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nguyên liệu và thiết bị
Chủng Lactobacillus acidophilus ATCC 4356 - bộ môn Công nghệ Sinh học Dược
2.1.2 Hóa chất thiết bị dụng cụ
Bảng 2.1 Danh mục hoá chất sử dụng
Tên hoá chất Nguồn gốc Tên hoá chất Nguồn gốc
Glucose Trung Quốc Natri acetat Trung Quốc
Pepton Ấn Độ Natri citrat Trung Quốc
Cao thịt Đức Natri alginat Ấn Độ
Cao nấm men Đức Calci clorid Trung Quốc
KH2PO4 Trung Quốc Acid acetic băng Trung Quốc
MgSO4.7H2O Trung Quốc Chitosan Đức
MnSO4.4H2O Trung Quốc Thạch (Agar) Việt Nam
Natri clorid Trung Quốc Tinh bột sắn Việt Nam
Triamoni citrat Trung Quốc Nước cất Việt Nam
Bảng 2.2 Danh mục thiết bị sử dụng
Tên thiết bị Nguồn gốc Tên thiết bị Nguồn gốc
Cân kỹ thuật Đức-Sartorius Tủ cấy vô trùng Nhật-Sanyo
Máy khuấy từ Hàn Quốc-Wisd Tủ sấy Hàn Quốc-Daihan
Máy lắc ổn nhiệt Trung Quốc-KWF Thiết bị đông khô Đức-Christ alpha
Máy ly tâm Đức-Sartorius Tủ âm sâu Hàn Quốc-LG
Nồi hấp tiệt trùng Nhật-ALP Tủ ấm CO2 Nhật-Sanyo
Bảng 2.3 Danh mục dụng cụ sử dụng
Bình nón các loại Pipet Pasteur Ống đong các loại Pipet chia vạch
Cốc có mỏ các loại Pipet tips Ống nghiệm có nắp Lưới vớt hạt Ống ly tâm Đĩa petri
2.1.3 Các môi trường nghiên cứu
Bảng 2.4 Môi trường MRS lỏng
Nguyên liệu Lượng sử dụng Nguyên liệu Lượng sử dụng
Triamoni citrat 2 g Nước cất vừa đủ 1000 ml pH 6,8 – 7,0
Môi trường MRS thạch = MRS lỏng + thạch agar (2%) (20 g thạch bột/1000 ml môi trường)
2.1.4 Các dung dịch sử dụng trong nghiên cứu
• Dung dịch acid acetic 0,5% (kl/tt): cân 0,5 g acid acetic băng, pha loãng với nước vừa đủ 100 ml
• Dung dịch calci clorid 2% (kl/tt): hoà tan 2 g calci clorid trong 100 ml nước cất
• Dung dịch chitosan 0,5% (kl/tt); pH 5,5 – 6,0: cân 0,5 g chitosan hoà tan vào trong
90 ml acid acetic 0,5% Điều chỉnh pH khoảng 5,5 – 6,0 bằng NaOH 1M và HCl 1M, thêm acid acetic 0,5% vừa đủ 100 ml
• Dung dịch chitosan 0,75% (kl/tt); pH 5,5 – 6,0: cân 0,75 g chitosan hoà tan vào trong
90 ml acid acetic 0,5% Điều chỉnh pH khoảng 5,5 – 6,0 bằng NaOH 1M và HCl 1M, thêm acid acetic 0,5% vừa đủ 100 ml
• Dung dịch chitosan 1% (kl/tt); pH 5,5 – 6,0: cân 1 g chitosan hoà tan vào trong 90 ml acid acetic 0,5% Điều chỉnh pH khoảng 5,5 – 6,0 bằng NaOH 1M và HCl 1M, thêm acid acetic 0,5% vừa đủ 100 ml
• Dung dịch natri citrat 2% (kl/tt) Cân 2 g natri citrat hoà tan trong nước cất vừa đủ
• Nước cất hấp tiệt khuẩn ở 115°C trong 20 phút
• Môi trường mô phỏng pH dạ dày (pH 2,5): Thêm từ từ HCl 1N vào 1000 ml nước cất đến pH 2,5
• Môi trường mô phỏng pH ruột non (pH 6,8): Hoà tan 28,8 g dinatri hydrophosphat và 11,45 g kali dihydrophosphat trong nước cất vừa đủ 1000 ml
• Môi trường mô phỏng pH đại tràng (pH 7,4): Hoà tan 0,6 g kali dihydrophosphat; 6,4 g dinatri hydrophosphat và 5,85 g natri clorid trong nước vừa đủ 1000 ml.
Nội dung nghiên cứu
Gồm có 2 nội dung chính
2.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ alginat và chitosan đến cấu trúc của vi nang tinh bột hồ hoá:
- Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ alginat tới quá trình tạo vi nang tinh bột hồ hoá
- Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ lớp phủ chitosan tới một số đặc tính của vi nang tinh bột hồ hoá
2.2.2 Đánh giá khả năng bảo vệ và giải phóng vi sinh vật của vi nang tinh bột hồ hoá trong các môi trường mô phỏng pH dịch tiêu hoá
Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Phương pháp tiệt khuẩn bằng nhiệt ẩm Áp dụng để tiệt khuẩn dung dịch nước, pipet tips, dụng cụ thủy tinh Nguyên liệu dụng cụ tiệt khuẩn được bọc giấy bạc, giấy báo hoặc đựng trong bình nón
2.3.2 Phương pháp nuôi cấy thu hỗn dịch tế bào v Hoạt hóa giống
Cân, đong các thành phần trong công thức môi trường MRS lỏng (công thức nêu trong mục 2.1.3) Hòa tan các thành phần thu được 100 ml môi trường Phân chia môi trường vào các ống nghiệm sạch, mỗi ống nghiệm 10 ml MRS lỏng Đậy kín bằng nắp ống nghiệm Hấp tiệt khuẩn môi trường ở 115°C trong 20 phút trong nồi hấp tiệt khuẩn, sau đó để nguội xuống nhiệt độ 37-40°C Cấy giống vào những ống nghiệm trên với nồng độ 10% (kl/tt) Ủ các ống nghiệm đã được cấy giống trong tủ ấm 5% CO2 trong 24 giờ ở 37°C v Nhân giống
16 Pha môi trường MRS lỏng theo công thức nêu ở mục 2.1.3 trong các bình nón đậy nút bông Đem hấp tiệt khuẩn ở 115°C trong 20 phút trong nồi hấp tiệt trùng Để nguội ở nhiệt độ phòng Cấy giống với tỷ lệ 10% vào bình nón trong tủ cấy vô trùng Ủ bình nón chứa vi sinh vật trong tủ ấm CO2 ở 37°C trong 24 giờ v Thu sinh khối
Hỗn dịch nhân giống sau 24 giờ ly tâm ở 4000 vòng/phút trong 10 phút, gạn bỏ phần dịch trong thu sinh khối tế bào
2.3.3 Phương pháp tạo vi nang
2.3.3.1 Chuẩn bị vi nang không chứa VSV v Vi nang Alginat x% phối hợp Tinh Bột Hồ Hoá 5%
Hỗn hợp alginat x%-tinh bột hồ hoá (5%) (kl/tt): Hấp tiệt khuẩn ở 115°C trong 20 phút, khuấy đều bằng máy khuấy từ cho đến khi đồng nhất
Dung dịch calci clorid 2% pha theo công thức nêu ở mục 2.1.4
Dùng pipet Pasteur có kích thước đầu pipet cỡ 2 mm nhỏ hỗn hợp trên xuống dung dịch calci clorid 2%, để yên 30 phút cho vi nang ổn định Dùng lưới vớt hạt thu vi nang và rửa sạch bằng nước cất
Sơ đồ minh hoạ: v Vi nang Alginat x% phối hợp Tinh Bột Không Hồ Hoá 5%
Dịch alginat x% (kl/tt): Hấp tiệt khuẩn ở 115°C trong 20 phút, khuấy đều bằng máy khuấy từ Khi dịch hỗn hợp đã nguội, thêm tinh bột sắn vào, kết hợp khuấy từ cho đến khi đồng nhất thu được hỗn hợp tạo vi nang
Alginat x% ngâm trương nở trong nước + 5% Tinh Bột
Hỗn hợp tạo vi nang
Dung dịch Calci clorid 2% 1 Ngâm vi nang 30 phút
2 Rửa sạch vi nang bằng nước cất
Vi nang Alginat x% phối hợp Tinh Bột Hồ Hoá 5%
17 Dung dịch calci clorid 2% pha theo công thức nêu ở mục 2.1.4
Dùng pipet Pasteur có kích thước đầu pipet cỡ 2 mm nhỏ hỗn hợp tạo vi nang xuống dung dịch calci clorid 2%, để yên 30 phút cho vi nang ổn định Dùng lưới vớt hạt thu vi nang và rửa sạch bằng nước cất
Sơ đồ minh hoạ: v Vi nang Alginat x% phối hợp Tinh Bột Hồ Hoá 5% có thay đổi nồng độ lớp phủ Chitosan y%
Hỗn hợp alginat x%-tinh bột hồ hoá (5%) (kl/tt): Hấp tiệt khuẩn ở 115°C trong 20 phút, khuấy đều bằng máy khuấy từ cho đến khi đồng nhất
Dung dịch calci clorid 2%; dung dịch chitosan 0,5%; dung dịch chitosan 0,75%; dung dịch chitosan 1% pha theo công thức nêu ở mục 2.1.4
Dùng pipet Pasteur có kích thước đầu pipet cỡ 2 mm nhỏ hỗn hợp trên xuống dung dịch calci clorid 2%, để yên 30 phút cho vi nang ổn định Dùng lưới vớt hạt thu vi nang và rửa sạch bằng nước cất Chuyển vi nang sang dung dịch chitosan y% kết hợp với khuấy từ trong 30 phút Dùng lưới vớt hạt vi nang và rửa sạch bằng nước cất
Alginat x% ngâm trương nở trong nước
Hỗn hợp tạo vi nang
Dung dịch Calci clorid 2% 1 Ngâm vi nang 30 phút
2 Rửa sạch vi nang bằng nước cất
Vi nang Alginat x% phối hợp Tinh Bột Không Hồ Hoá
Hấp tiệt khuẩn Dịch Alginat x%
2.3.3.2 Tạo vi nang chứa VSV
Hỗn hợp alginat x% - tinh bột hồ hoá (5%) – VSV (kl/tt): Ly tâm 100ml hỗn dịch nhân giống sau 24 giờ, thu được sinh khối VSV Phối hợp sinh khối VSV vào trong 50 ml hỗn hợp trên thu được tạo vi nang chứa vi sinh vật
Dung dịch calci clorid 2%; dung dịch chitosan 0,5%; dung dịch chitosan 0,75%; dung dịch chitosan 1% pha theo công thức nêu ở mục 2.1.4
Dùng pipet Pasteur có kích thước đầu pipet cỡ 2 mm nhỏ hỗn hợp tạo vi nang chứa VSV trên xuống dung dịch calci clorid 2%, để yên 30 phút cho vi nang ổn định Dùng lưới vớt hạt thu vi nang và rửa sạch bằng nước cất Chuyển vi nang sang dung dịch chitosan y% kết hợp với khuấy từ trong 30 phút Dùng lưới vớt hạt vi nang và rửa sạch bằng nước cất Các nguyên liệu sử dụng vô khuẩn Thao tác thực hiện hoàn toàn trong tủ cấy vô trùng
Alginat x% ngâm trương nở trong nước + 5% Tinh Bột
Hỗn hợp tạo vi nang
Dung dịch Calci clorid 2% 1 Ngâm vi nang 30 phút
2 Rửa sạch vi nang bằng nước cất
Vi nang Alginat x% phối hợp Tinh Bột Hồ Hoá 5%
Dung dịch Chitosan y% 1 Ngâm vi nang trong Chitosan 30 phút
2 Rửa sạch vi nang bằng nước cất
Vi nang Alginat x% phối hợp Tinh Bột Hồ Hoá 5%, lớp phủ Chitosan y%
2.3.4 Phương pháp đông khô vi nang
Tiền đông: vi nang được đựng trong đĩa petri hoặc lọ thủy tinh đã rửa sạch và tiệt khuẩn, sau đó đông lạnh trong tủ âm sâu -70°C trong 24 giờ cho đông rắn hoàn toàn
Làm khô: các mẫu sau tiền đông được làm khô trong buồng lạnh của máy đông khô ở -50°C, áp suất 0,100 mbar trong 24 giờ
Kết thúc quá trình đông khô, lấy mẫu ra khỏi thiết bị, chuyển các mẫu vi nang từ đĩa petri vào lọ thủy tinh kín, bảo quản ở nhiệt độ khoảng 2-8°C
2.3.5 Phương pháp pha loãng liên tục xác định số lượng VSV
2.3.5.1 Chuẩn bị môi trường pha loãng và môi trường đếm xác định số lượng VSV
Cân, đong chính xác các thành phần theo công thức môi trường MRS thạch (nêu ở mục 2.1.3) Hòa tan các thành phần tan trong nước, chuyển dung dịch trên vào bình nón thích hợp, phân tán thạch vào dung dịch Đậy kín bằng nút bông Hấp tiệt khuẩn ở 115°C trong 20 phút trong nồi hấp tiệt khuẩn Lấy bình đựng môi trường ra khỏi nồi hấp, phân phối môi trường lên các đĩa petri đã được rửa sạch, hấp tiệt khuẩn và sấy khô (bề dày lớp thạch trên các đĩa khoảng 2 mm) sao cho mặt thạch nhẵn, phẳng Chờ cho thạch nguội và đông rắn lại, đậy kín
Alginat x% ngâm trương nở trong nước + 5% Tinh Bột
Hỗn hợp tạo vi nang
Dung dịch Calci clorid 2% 1 Ngâm vi nang 30 phút
2 Rửa sạch vi nang bằng nước cất
Vi nang Alginat x% phối hợp Tinh Bột Hồ Hoá 5%
Dung dịch Chitosan y% 1 Ngâm vi nang trong Chitosan 30 phút
2 Rửa sạch vi nang bằng nước cất
Vi nang Alginat x% phối hợp Tinh Bột Hồ Hoá 5%, lớp phủ Chitosan y%
Hỗn hợp tạo vi nang chứa VSV Sinh khối VSV
2.3.5.2 Phương pháp cấy đếm xác định số lượng VSV
Hút chính xác 1,00 ml dịch chứa tế bào VSV cần xác định số lượng vào ống nghiệm thứ nhất chứa 9 ml nước cất đã chuẩn bị ở trên, lắc đều Sau đó lại hút 1,00 ml dịch đã đồng nhất trong ống nghiệm thứ nhất pha loãng sang ống nghiệm thứ 2, lắc đều
Tiếp tục pha loãng như vậy cho đến nồng độ cuối cùng Hút 0,2 ml dịch ở mỗi ống nghiệm của 3 nồng độ pha loãng cuối cùng, cấy lên bề mặt đĩa thạch đã được chuẩn bị, mỗi nồng độ cấy trên 2 đĩa Ủ các đĩa trong tủ ấm 5% CO2 ở 37°C Sau 48 giờ, đếm số khuẩn lạc mọc trong mỗi đĩa petri và lấy giá trị trung bình số khuẩn lạc mọc trong các đĩa có cùng nồng độ pha loãng Mỗi tế bào VSV được nuôi cấy trên đĩa thạch sẽ phát triển thành một khuẩn lạc Do đó, dựa vào kết quả xác định số lượng khuẩn lạc, ta có thể tính được số lượng VSV có trong 1,00 g hoặc 1,00 ml nguyên liệu theo công thức sau:
X: số VSV có trong 1,00 g hoặc 1,00 ml nguyên liệu (CFU/g hoặc CFU/ml)
An: số khuẩn lạc trung bình trong các đĩa cấy ở nồng độ pha loãng 10 n m: khối lượng mẫu cân để xác định số lượng VSV (g)
V: thể tích dịch cấy trải lên mỗi đĩa petri (ml)
2.3.6 Phương pháp xác định số lượng VSV vi nang sau đông khô
Cân 0,2 g vi nang rồi chuyển vào 20 ml dung dịch natri citrat 2% Khuấy từ với tốc độ khoảng 400 - 500 vòng/phút đến khi vi nang rã hoàn toàn và phân tán đồng nhất Hút chính xác 1,00 ml dịch trên tiến hành pha loãng, nuôi cấy để xác định số lượng VSV sống sót theo phương pháp nêu ở mục 2.3.5
2.3.7 Phương pháp đánh giá độ rã của vi nang trong môi trường mô phỏng pH dịch tiêu hoá
THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, BÀN LUẬN
Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ Alginat và Chitosan đến cấu trúc của vi
nang tinh bột hồ hoá
3.1.1 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ alginat tới quá trình tạo vi nang tinh bột hồ hoá v Mục tiêu: Tạo các vi nang alginat – TBHH với nồng độ alginat thay đổi từ 1% - 3% để xác định nồng độ alginat thích hợp trong quá trình tạo vi nang tinh bột hồ hoá v Tiến hành:
Tạo vi nang Ax chứa Alginat x% phối hợp Tinh Bột Hồ Hoá 5% theo mục 2.3.3.1 Đông khô vi nang tươi theo phương pháp nêu ở mục 2.3.4
Nhận xét quá trình tạo vi nang, cảm quan về hình dạng, màu sắc, bề mặt ngoài của vi nang tươi và vi nang đông khô v Kết quả và bàn luận: ỉ Kết quả:
Hình ảnh các mẫu vi nang tươi và vi nang đông khô dưới camera thường được thể hiện ở hình 3.1
A1 đông khô A2 đông khô A3 đông khô
Hình 3.1: Hình ảnh vi nang alginat – tinh bột hồ hoá khi thay đổi nồng độ alginat từ
Bảng 3.1: Đặc điểm vi nang alginat-tinh bột hồ hoá khi thay đổi nồng độ alginat từ
Khả năng tạo vi nang
Dễ dàng tạo vi nang cầu đẹp: hỗn hợp A1 có độ nhớt vừa phải, dễ dàng hút lên pipet, thời gian tạo vi nang nhanh
Dễ dàng tạo vi nang cầu đẹp: hỗn hợp A2 có độ nhớt vừa phải, dễ dàng hút lên pipet, thời gian tạo vi nang nhanh
Khó khăn trong việc tạo vi nang: hỗn hợp
A3 quá đặc, khó hút lên pipet, thời gian tạo vi nang lâu Mẫu tươi
Vi nang cầu đẹp, bề mặt trơn nhẵn, màu trắng đục
Vi nang cầu đẹp, bề mặt trơn nhẵn, màu trắng đục
Vi nang kéo đuôi, bề mặt trơn nhẵn, màu trắng đục
Vi nang co ngót nhẹ, hơi móp méo nhưng vẫn giữ
Vi nang co ngót nhẹ, hơi móp méo nhưng
Vi nang co ngót nhẹ, bề mặt vi nang xù xì,
25 được độ cầu, bề mặt vi nang xù xì, màu trắng, cấu trúc nhẹ xốp vẫn giữ được độ cầu, bề mặt vi nang xù xì, màu trắng, cấu trúc nhẹ xốp màu trắng, cấu trúc nhẹ xốp ỉ Bàn luận:
Về quá trình tạo vi nang tươi: có thể tạo vi nang bằng cách sử dụng hỗn hợp alginat x% và TBHH 5% với nồng độ alginat 1-3% Khi nồng độ alginat tăng dần, hỗn hợp tạo vi nang có độ nhớt tăng dần nhưng không quá chênh lệch, khiến cho tốc độ nhỏ giọt giảm dần Ở nồng độ alginat 1 và 2% hỗn hợp tạo vi nang có độ nhớt phù hợp, nên quá trình tạo vi nang dễ dàng (nồng độ alginat 1% cho khả năng tạo giọt dễ dàng nhất, khi tăng nồng độ alginat đến 2% độ nhớt đã tăng lên đáng kể, dù vẫn cho giọt vi nang đẹp nhưng quá trình cần mất nhiều thời gian hơn): vi nang tươi có cấu trúc đều đẹp, bề mặt trơn nhẵn Khi tăng nồng độ alginat lên 3%, hỗn hợp A3 có độ nhớt cao, khó khăn trong việc nhỏ vi nang, dễ gây tắc đầu pipet, thời gian tạo vi nang lâu, vi nang tươi kéo đuôi dài ảnh hưởng tới thẩm mĩ của sản phẩm
Về đặc điểm vi nang đông khô: Các mẫu sau đông khô đều co ngót, móp méo, cấu trúc nhẹ xốp, bề mặt xù xì và có màu trắng Sau đông khô về cơ bản các mẫu dù co ngót ít nhưng vẫn giữ được hình dạng ban đầu
Qua kết quả trên, nhận thấy nồng độ alginat có ảnh hưởng đến quá trình nhỏ giọt tạo vi nang và độ cầu của vi nang tinh bột hồ hoá Công thức alginat 1% và alginat 2% phối hợp với TBHH 5% cho kết quả vi nang cầu đều, thời gian tạo vi nang ngắn và vi nang ít móp méo sau đông khô, nên được chọn cho các thí nghiệm tiếp theo v So sánh vi nang sử dụng tinh bột hồ hoá và tinh bột không hồ hoá với cùng nồng độ alginat được chọn ỉ Tiến hành:
Tạo vi nang Ax sử dụng Tinh Bột Hồ Hoá và Tinh Bột Không Hồ Hoá theo mục 2.3.3.1 (với nồng độ alginat x%) Đông khô vi nang tươi theo mục 2.3.4 ỉ Kết quả:
Hình ảnh các mẫu vi nang tươi và vi nang đông khô dưới camera thường được thể hiện ở hình 3.2, trong đó:
A1 đông khô – TBKHH A1 đông khô – TBHH
A2 đông khô – TBKHH A2 đông khô – TBHH
Hình 3.2: Hình ảnh vi nang alginat – TBHHvà alginat – TBKHH với các nồng độ alginat 1% và 2%
Bảng 3.2: So sánh đặc điểm vi nang alginat – TBHH và alginat – TBKHH với cùng nồng độ alginat
Vi nang cầu đẹp, bề mặt trơn nhẵn, màu trắng đục
Vi nang có nhiều hình dạng, kích cỡ to nhỏ khác nhau, các viên dính chùm thành cụm, màu trắng đục (đục hơn TBHH)
Vi nang cầu đẹp, bề mặt trơn nhẵn, màu trắng đục
Vi nang có nhiều hình dạng, kích cỡ to nhỏ khác nhau (tuy nhiên vẫn đều hơn mẫu A1T0) , các viên dính chùm thành cụm, màu trắng đục (đục hơn TBHH)
Vi nang co ngót nhẹ, hơi móp méo nhưng vẫn giữ được độ cầu, bề mặt vi nang xù xì,
Vi nang co ngót nhiều, bề mặt xù xì, màu trắng, cấu trúc xốp
Vi nang co ngót nhẹ, hơi móp méo nhưng vẫn giữ được độ cầu, bề mặt vi nang xù xì,
Vi nang co ngót nhiều (tuy nhiên vẫn ít hơn mẫu A1T0), bề mặt xù xì,
28 màu trắng, cấu trúc nhẹ xốp màu trắng, cấu trúc nhẹ xốp màu trắng, cấu trúc xốp ỉ Bàn luận
Về quá trình tạo vi nang tươi: Với TBHH, có thể tạo vi nang với nồng độ alginat
1% hoặc 2% cho vi nang tươi có kích thước đồng đều nhưng khi sử dụng TBKHH với cùng nồng độ alginat thì không thể tạo vi nang với kích thước đồng đều Với mẫu sử dụng TBHH (5%), độ nhớt của dịch alginat phù hợp (1-2%) nên quá trình tạo hạt dễ dàng, hạt thu được cầu đều, thời gian tạo hạt ngắn Với mẫu sử dụng TBKHH, độ nhớt của dịch alginat thấp (1- 2%) khiến tinh bột dễ sa lắng xuống đáy trong quá trình tạo vi nang dẫn tới hỗn hợp tạo vi nang khó phân bố đều tinh bột Đồng thời do hỗn hợp tạo vi nang có độ nhớt thấp nên quá trình tạo hạt khó khăn, hạt tạo ra không đều về kích thước và bị kéo đuôi Bên cạnh đó, vi nang tạo ra có ma sát nghỉ trên bề mặt lớn, khiến vi nang dính thành chùm, khó dàn đều lên bề mặt đĩa petri, có thể ảnh hưởng tới kết quả quá trình đông khô Cả 2 nồng độ alginat 1- 2% phối hợp với tinh bột không hồ hoá 5% đều không cho kết quả tạo vi nang ổn định
Về đặc điểm vi nang đông khô: các mẫu sau đông khô đều co ngót, móp méo, cấu trúc xốp Với mẫu sử dụng TBHH: vi nang co ngót ít, vẫn giữ được hình dạng cầu đều, bề mặt xù xì, có cấu trúc nhẹ xốp Với mẫu sử dụng TBKHH: vi nang bị co ngót nhiều (mẫu có nồng độ alginat 1% co ngót nhiều hơn mẫu có nồng độ alginat 2%) Điều này cho thấy khả năng tạo hạt cũng như duy trì độ cầu (cấu trúc) của TBKHH kém hơn TBHH có cùng nồng độ
Qua kết quả nghiên cứu, nhận thấy tinh bột hồ hoá có ảnh hưởng đến quá trình nhỏ giọt vi nang cũng như khả năng tạo vi nang đồng đều về hình dạng, kích thước, độ cầu Công thức alginat 1 – 2% phối hợp với tinh bột hồ hoá 5% cho kết quả vi nang ít co ngót, giữ vững độ cầu tốt sau khi đông khô (vượt trội hơn khi dùng tinh bột không hồ hoá cùng nồng độ) Nguyên nhân có thể giải thích do tinh bột hồ hoá Tinh bột hồ hóa được biết đến là một mạng lưới gel amylose với các hạt trương nở như một tá dược độn Khi hỗn hợp nguội đi, động năng giảm xuống, cho phép các phân tử tinh bột liên kết lại và tạo thành mạng lưới Sự tái liên kết ngắn hạn này dẫn đến sự thay đổi kết cấu của tinh bột được hồ hoá [60] Trường hợp này, tinh bột hồ hóa hoạt động như một chất hỗ trợ cấu trúc để giảm khoảng trống để tạo ra các hạt hình cầu, và giúp giữ được hình dạng hình cầu của vi nang sau khi đông khô [10], [56]
So sánh với kết quả của tác giả Đỗ Thị Thanh [3]: Khi sử dụng tinh bột không hồ hoá, công thức vi nang được lựa chọn tối ưu là alginat 3% phối hợp TBKHH 10% Trong khi qua kết quả nghiên cứu trên, nếu sử dụng TBHH, công thức vi nang tối ưu được chọn là
29 alginat 1 – 2% phối hợp TBHH 5% cho thể chất vi nang đẹp Như vậy, có thể nói việc sử dụng TBHH giúp giảm nồng độ alginat và tinh bột sử dụng mà vẫn tạo thể chất vi nang đẹp, tiết kiệm nguyên liệu trong quá trình sản xuất
3.1.2 Khảo sát ảnh hưởng của lớp phủ chitosan đến một số đặc tính của vi nang sử dụng tinh bột hồ hoá
Thí nghiệm này lựa chọn khảo sát 3 nồng độ Chitosan là 0,5% - 0,75% - 1% và ảnh hưởng của chúng lên một số đặc tính của vi nang sử dụng TBHH v Tiến hành
Tạo vi nang alginat x% phối hợp TBHH 5%, thay đổi nồng độ lớp phủ Chitosan y% theo phương pháp đã nêu ở mục 2.3.3.1 thu được 6 mẫu vi nang AxCy (A1C1; A1C0,75;
A1C0,5; A2C1; A2C0,75; A2C0,5) với nồng độ alginat x%, lớp phủ chitosan y% Đông khô vi nang tươi theo phương pháp nêu ở mục 2.3.4 Đánh giá độ rã của 6 mẫu vi nang AxCy trong môi trường mô phỏng pH dịch tiêu hoá chuẩn bị theo phương pháp nêu ở mục 2.3.7:
- Chuẩn bị các môi trường mô phỏng pH dịch tiêu hoá: pH dạ dày, pH ruột non, pH đại tràng theo mục 2.1.4
Ủ vi nang đông khô qua các môi trường tiêu hóa mô phỏng, quan sát thấy hình thái, cấu trúc, độ trương nở, độ rã của vi nang và sự thay đổi dịch ủ Sau khi ủ ở môi trường dịch dạ dày mô phỏng, lớp màng bên ngoài cùng của vi nang bị bong tróc, lớp phủ bị tróc ra thành dạng màng kết tụ lại Sau khi ủ ở môi trường dịch ruột non mô phỏng, vi nang vẫn giữ được cấu trúc tổng thể, chỉ có lớp phủ tan dần Khi ủ ở môi trường dịch ruột già mô phỏng, cấu trúc vi nang hầu như biến mất, chỉ còn lớp màng bọc bên trong.
Đánh giá khả năng bảo vệ và giải phóng vi sinh vật của vi nang TBHH tại các môi trường mô phỏng pH dịch tiêu hoá
môi trường mô phỏng pH dịch tiêu hoá
Từ kết quả mục 3.1 có thể thấy việc sử dụng TBHH 5% và lớp phủ chitosan với các nồng độ 0,5% - 0,75% - 1% cho công thức vi nang alginat 1% và 2% giúp cải thiện độ rã của vi nang trong môi trường dịch tiêu hoá mô phỏng
Nghiên cứu dưới đây nhằm đánh giá khả năng bảo vệ và giải phóng vi sinh vật tại các vị trí trên đường tiêu hoá Lựa chọn 6 công thức vi nang AxCy (alginat x% - chitosan y%) để tiến hành khảo sát: A1C1; A1C0,75; A1C0,5; A2C1; A2C0,75; A2C0,5
3.2.1 Tạo vi nang chứa vi sinh vật theo công thức A x C y (alginat x% - TBHH 5% - lớp phủ chitosan y% sau quá trình đông tụ)
Thí nghiệm dưới đây nhằm tạo 6 mẫu vi nang chứa vi sinh vật có công thức A1C1;
Tạo vi nang AxCy – VSV theo phương pháp đã nêu ở mục 2.3.3.2 thu được 6 mẫu vi nang A1C1; A1C0,75; A1C0,5; A2C1; A2C0,75; A2C0,5 chứa VSV Đông khô vi nang tươi theo phương pháp đã nêu ở mục 2.3.4
Nhận xét quá trình tạo vi nang, cảm quan về hình dạng, màu sắc, bề mặt bên ngoài của vi nang tươi và vi nang đông khô Đồng thời đánh giá khả năng bao gói VSV của vi nang đông khô theo phương pháp đã nêu ở mục 2.3.6 Kết quả được trình bày ở hình 3.4 v Kết quả
A1C0,5 đông khô A1C0,75 đông khô A1C1 đông khô
Hình 3.4: Đặc điểm vi nang tươi và vi nang đông khô sử dụng TBHH phối hợp với alginat 1% chứa VSV khi thay đổi nồng độ chitosan
A2C0,5 đông khô A2C0,75 đông khô A2C1 đông khô
Hình 3.5: Đặc điểm vi nang tươi và vi nang đông khô sử dụng TBHH phối hợp với alginat 2% chứa VSV khi thay đổi nồng độ chitosan
Bảng 3.4: Kết quả lượng VSV bao gói trong vi nang A x C y – VSV đông khô
Số lượng VSV (log CFU/g)
Khi thêm sinh khối VSV vào hỗn hợp Ax (Alginat x% - tinh bột hồ hoá 5%) thì quá trình tạo vi nang vẫn diễn ra dễ dàng Vi nang tươi chứa VSV có cấu trúc đều, bề mặt trơn nhẵn, màu trắng ngà (do đã thêm sinh khối) Vi nang đông khô co lại giảm kích thước nhưng vẫn giữ được độ cầu đều, bề mặt xù xì nhẹ và xốp, màu trắng ngà Có thể thấy việc thêm sinh khối vào không ảnh hưởng nhiều đến quá trình tạo vi nang, hình thái và cấu trúc của vi nang
Về khả năng bao gói vi sinh vật, các mẫu vi nang AxCy – VSV đều cho kết quả bao gói đạt trên 9,00 log CFU/g đáp ứng được yêu cầu chế phẩm probiotic trên thị trường Kết quả này hoàn toàn phù hợp với một số nghiên cứu [10] đã chứng minh quá trình vi nang hoá L casei và B bifidum trong TBHH-calci alginat với lớp phủ chitosan giúp tăng cường khả năng bảo vệ VSV trong môi trường dạ dày, ruột mô phỏng Có thể lý giải như sau: tinh bột hồ hoá với vai trò tạo khả năng liên kết tốt giữa tinh bột và alginat tạo thành một hỗn hợp đồng nhất hơn Bên cạnh đó, tinh bột hồ hóa cũng hoạt động như một chất hỗ trợ cấu trúc để giảm khoảng trống để tạo ra các hạt hình cầu, ngăn chặn sự sụp đổ cấu trúc của vi nang khi đông khô [10], [50]
3.2.2 Đánh giá khả năng bảo vệ VSV của vi nang qua các môi trường mô phỏng pH dịch tiêu hoá
Thí nghiệm dưới đây nhằm đánh giá khả năng bảo vệ của vi sinh vật trong môi trường mô phỏng pH dạ dày và ruột non của vi nang AxCy – VSV v Tiến hành § Xác định số lượng VSV trong vi nang AxCy – VSV đông khô theo phương pháp đã nêu ở mục 2.3.6
35 § Xác định số lượng VSV còn sống sót sau khi ủ trong dịch mô phỏng pH dạ dày của vi nang AxCy – VSV theo phương pháp đã nêu ở mục 2.3.8 § Xác định lượng VSV sống sót sau khi ủ trong dịch mô phỏng pH dạ dày (có thêm pepsin) của vi nang AxCy – VSV theo phương pháp đã nêu ở mục 2.3.8 Ủ 0,2 g vi nang vào 20 ml dung dịch dạ dày mô phỏng (có bổ sung pepsin) đã hấp tiệt khuẩn trong máy lắc tốc độ 75 vòng/phút, nhiệt độ 37°C Sau 2 giờ ủ, tách vi nang ra khỏi dịch acid, rửa sạch bằng nước cất đã tiệt khuẩn Chuyển vi nang vào bình nón chứa 20 ml dung dịch natri citrat 2% đã tiệt khuẩn, khuấy từ với tốc độ 400 – 500 vòng/phút đến khi vi nang rã hoàn toàn Tiến hành cấy đếm xác định số lượng VSV sống sót theo phương pháp nêu ở mục 2.3.5 v Kết quả và bàn luận ỉ Kết quả
Hình 3.6: Biểu đồ so sánh số lượng VSV sống sót trong vi nang A x C y chứa VSV trước và sau khi ủ 2 giờ trong dịch mô phỏng pH dạ dày ỉ Bàn luận:
Tất cả các mẫu vi nang đều đc bảo vệ qua môi trường pH dạ dày, lượng VSV còn lại trong vi nang của các mẫu A1C1; A1C0,75; A1C0,5 trên 8 log CFU/g và trong các mẫu A2C1;
Tại thời điểm trước khi tiếp xúc với dịch dạ dày lượng VSV trong 6 mẫu vi nang đều trên 9,00 log CFU/g Sau khi ủ trong môi trường mô phỏng pH dạ dày trong 2 giờ, số lượng
Mẫu A1-1 Mẫu A1-0,75 Mẫu A1-0,5 Mẫu A2-1 Mẫu A2-0,75 Mẫu A2-0,5
Số lượng VSV sống sót log CFU/g
Phá vi nang đông khô Phá vi nang sau pH 2,5
36 VSV giảm xuống nhưng đều trên 8,00 log CFU/g do ảnh hưởng của pH acid Việc giảm lượng vi sinh vật có thể được lý giải như sau:
Hình thành mô hình “vỉ trứng” chứa và bảo vệ VSV: trong quá trình tạo vi nang, các ion Ca 2+ liên kết với nhóm -COO - của các đơn vị polygluonat của alginat tạo thành mô hình
“vỉ trứng” chứa và bảo vệ VSV trong đó
Sự thất thoát VSV do sự trao đổi ion trong pH dạ dày: Khi ủ ở pH dạ dày, ion Ca 2+ có thể trao đổi với ion H + trong acid, từ đó làm mất ion Ca 2+ trong mô hình “vỉ trứng”, tạo thành những “khoảng trống” làm thất thoát VSV ra bên ngoài và bị ảnh hưởng trực tiếp bởi acid dạ dày
Dưới điều kiện khắc nghiệt của pH dịch dạ dày, vi nang vẫn bảo vệ được một lượng lớn VSV là do tính vượt trội của hai thành phần trong công thức:
Việc sử dụng tinh bột hồ hoá như bàn luận ở mục 3.1.2: sử dụng tinh bột hồ hoá giúp tạo ra một hỗn hợp đồng nhất với alginat vì chúng có khả năng liên kết và hoà tan tốt so với tinh bột không hồ hoá [10] Vi nang có cấu trúc bền chặt hơn, “lấp đầy khoảng trống” trong vi nang, từ đó hạn chế sự trao đổi ion, giảm thất thoát VSV Ngoài ra, khi vào trong ruột, tinh bột còn tạo ra nguồn dinh dưỡng đối với vi sinh vật [50]
Vi nang có sử dụng màng bao chitosan sẽ bổ sung lớp áo polycation bên ngoài làm giảm tính thấm của vi nang, tạo ra một rào cản đối với ion H + trong môi trường acid [37], [48] Do đó làm giảm tác động tới phức hợp alginat – calci lõi, bảo vệ được vi sinh vật trong môi trường acid
Từ kết quả của biểu đồ hình 3.5, nhận thấy lượng VSV được bao gói sống sót sau đông khô và sau 2h ủ trong môi trường mô phỏng pH dạ dày (pH 2,5) của các mẫu có nồng độ chitosan cao hơn (A1C1; A2C1) thì khả năng bảo vệ VSV tốt hơn Điều này có thể giải thích như sau: chitosan mang điện tích dương, có khả năng bám vào bề mặt tích điện âm là alginat, tạo thành lớp áo kép giúp giảm tính thấm của vi nang [10] Với nồng độ chitosan cao (1%) thì số lượng cấu tử chitosan liên kết với alginat tăng lên, giúp màng bảo vệ được dai chắc hơn so với nồng độ chitosan thấp (0,5%), từ đó giảm lượng VSV thất thoát ra ngoài môi trường, tăng lượng VSV bảo vệ được trong vi nang