hà kiều oanh đánh giá ảnh hưởng của tinh bột hồ hoá đến một số đặc tính của vi nang chứa lactobacillus acidophilus

Đánh giá khả năng bảo vệ và giải phóng vi sinh vật của vi nang tinh bột hồ hoá trong các môi trường mô phỏng pH dịch tiêu hoá .... DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 : Lactobacillus acid

HÀ KIỀU OANH 1901535

ĐÁNH GIÁ ẢNH HƯỞNG CỦA TINH BỘT HỒ HOÁ ĐẾN MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA

VI NANG CHỨA Lactobacillus acidophilus

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn: PGS TS Đàm Thanh Xuân Nơi thực hiện:

Bộ môn Công nghệ sinh học Dược Khoa Công nghệ sinh học

Bộ môn Công Nghệ Sinh Học Dược Khoa Công Nghệ Sinh Học

HÀ NỘI – 2024

LỜI CẢM ƠN

Với tất cả lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn đến người cô

đáng kính PGS TS Đàm Thanh Xuân Cô đã dành rất nhiều thời gian và tâm huyết để

chỉ bảo, hướng dẫn, truyền đạt cho em những kinh nghiệm quý báu, động viên và khích lệ em trong suốt quá trình làm khóa luận tốt nghiệp

Bên cạnh đó, em cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS Trần Minh Đức, TS Nguyễn Khắc Tiệp, ThS Lê Ngọc Khánh Cảm ơn các thầy đã luôn giúp đỡ, hỗ trợ và

cho em những lời khuyên bổ ích trong suốt quá trình làm khóa luận

Em xin gửi lời cảm ơn đến tất cả thầy cô, anh chị kỹ thuật viên khoa Công nghệ sinh học Xin cảm ơn các bạn sinh viên nghiên cứu khóa 74, cùng các em ở bộ môn Công

nghệ sinh học Dược đã luôn đồng hành chia sẻ, giúp đỡ em trong thời gian làm khóa luận

Em cũng xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu cùng toàn thể các thầy cô Trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện cho em tham gia nghiên cứu khoa học phải trang bị

cho em những kiến thức quý báu trong suốt khoảng thời gian học tập tại trường

Lời cảm ơn cuối cùng em xin được gửi đến gia đình bạn bè những người đã luôn ở bên cạnh động viên chia sẻ giúp đỡ em để em có thêm động lực vượt qua mọi khó khăn trong cuộc sống và học tập

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 03 tháng 06 năm 2024

Sinh viên

Hà Kiều Oanh

MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về Lactobacillus acidophilus 2

1.1.1 Đặc điểm của Lactobacillus acidophilus: 2

1.1.2 Một số yếu tố ảnh hưởng tới khả năng sống sót của Lactobacillus acidophilus………3

1.1.3 Một số xu hướng bảo vệ Probiotic 4

1.2 Tổng quan về vi nang 5

1.2.1 Định nghĩa vi nang 5

1.2.2 Đặc điểm vi nang 5

1.2.3 Ưu nhược điểm của việc vi nang hoá 6

1.3 Nguyên liệu tạo vi nang 6

1.3.1 Tinh bột 7

1.3.2 Alginat 8

1.3.3 Chitosan 9

1.4 Một số phương pháp tạo vi nang 10

1.5 Một số nghiên cứu gần đây về vi nang probiotic 11

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

2.1 Nguyên liệu và thiết bị 13

2.1.1 Chủng vi sinh vật 13

2.1.2 Hóa chất thiết bị dụng cụ 13

2.1.3 Các môi trường nghiên cứu 14

2.2 Nội dung nghiên cứu 15

2.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ alginat và chitosan đến cấu trúc của vi nang

tinh bột hồ hoá: 15

2.2.2 Đánh giá khả năng bảo vệ và giải phóng vi sinh vật của vi nang tinh bột hồ hoá trong các môi trường mô phỏng pH dịch tiêu hoá 15

2.3 Phương pháp nghiên cứu 15

2.3.1 Phương pháp tiệt khuẩn bằng nhiệt ẩm 15

2.3.2 Phương pháp nuôi cấy thu hỗn dịch tế bào 15

2.3.3 Phương pháp tạo vi nang 16

2.3.4 Phương pháp đông khô vi nang 19

2.3.5 Phương pháp pha loãng liên tục xác định số lượng VSV 19

2.3.6 Phương pháp xác định số lượng VSV vi nang sau đông khô 20

2.3.7 Phương pháp đánh giá độ rã của vi nang trong môi trường mô phỏng pH dịch tiêu hoá 20

2.3.8 Phương pháp đánh giá khả năng bảo vệ vi sinh vật trong môi trường mô phỏng dịch dạ dày, dịch ruột 21

2.3.9 Phương pháp đánh giá khả năng giải phóng vi sinh vật trong môi trường mô phỏng pH ruột non và pH đại tràng 21

2.3.10 Phương pháp xử lý số liệu 22

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, BÀN LUẬN 23

3.1 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ Alginat và Chitosan đến cấu trúc của vi nang tinh bột hồ hoá 23

3.1.1 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ alginat tới quá trình tạo vi nang tinh bột hồ hoá ………23

3.1.2 Khảo sát ảnh hưởng của lớp phủ chitosan đến một số đặc tính của vi nang sử dụng tinh bột hồ hoá 29

3.2.3 Khảo sát khả năng giải phóng kéo dài VSV của vi nang qua các môi trường

mô phỏng pH dịch tiêu hoá 37

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 41

4.1 KẾT LUẬN 41

4.2 ĐỀ XUẤT 41

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

B bifidum : Bifidobacterium bifidum

CFU : Số đơn vị khuẩn lạc (Colony – Forming Units)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 : Danh mục hoá chất sử dụng Bảng 2.2 : Danh mục thiết bị sử dụng Bảng 2.3 : Danh mục dụng cụ sử dụng Bảng 2.4 : Môi trường MRS lỏng Bảng 3.1 : Đặc điểm vi nang alginat-tinh bột hồ hoá khi thay đổi nồng độ

alginat từ 1,0 – 3,0% Bảng 3.2 : So sánh đặc điểm vi nang alginat – TBHH và alginat – TBKHH

với cùng nồng độ alginat Bảng 3.3 : Kết quả lượng VSV bao gói trong vi nang AxCy – VSV đông

khô

DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1 : Lactobacillus acidophilus

Hình 1.2 : Các loại vi nang chứa vi sinh vật Hình 1.3 : Cấu trúc hoá học của tinh bột Hình 1.4 : Cấu trúc hoá học của alginat Hình 1.5 : Cấu trúc hoá học của Chitin và Chitosan Hình 3.1 : Hình ảnh vi nang alginat – tinh bột hồ hoá khi thay đổi nồng độ

alginat từ 1,0 – 3,0% Hình 3.2 : Đặc điểm vi nang alginat – tinh bột hồ hoá và alginat – tinh bột

không hồ hoá với các nồng độ alginat 1% và 2% Hình 3.3 : Hình ảnh dịch ủ vi nang sau 3 giờ ủ trong môi trường mô phỏng

pH đại tràng

Hình 3.4 : Đặc điểm vi nang tươi và vi nang đông khô sử dụng TBHH phối

hợp với alginat 1% chứa VSV khi thay đổi nồng độ chitosan Hình 3.5 : Đặc điểm vi nang tươi và vi nang đông khô sử dụng TBHH phối

hợp với alginat 2% chứa VSV khi thay đổi nồng độ chitosan Hình 3.6 : Biểu đồ so sánh số lượng VSV sống sót trong vi nang AxCy chứa

VSV trước và sau khi ủ 2 giờ trong dịch mô phỏng pH dạ dày Hình 3.7 : Biểu đồ so sánh số lượng VSV bảo vệ được trong vi nang sau 2h

ủ trong dịch dạ dày mô phỏng và giải phóng ra sau 4h ủ trong dịch ruột mô phỏng với các mẫu vi nang AxCy

Hình 3.8 : Biểu đồ so sánh số lượng VSV được bảo vệ sau 4h ủ trong môi

trường pH ruột non và giải phóng sau 3h ủ trong dịch mô phỏng pH đại tràng với các mẫu vi nang AxCy

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong những năm gần đây, các sản phẩm có chứa probiotic có tác dụng có lợi cho sức khỏe ngày càng được quan tâm Tuy nhiên, khả năng sống sót của vi khuẩn probiotic luôn là vấn đề đáng quan tâm khi chúng tiếp xúc với môi trường khắc nghiệt trong quá trình bào chế, bảo quản và di chuyển qua đường tiêu hóa Để khắc phục những vấn đề này, vi

Tinh bột được biết đến là một tá dược không độc hại, giá thành thấp, có khả năng tương thích sinh học và phân huỷ sinh học tốt Là một loại vật liệu polymer tự nhiên, tinh bột là sự lựa chọn lý tưởng cho vật liệu tạo vi nang Một số nghiên cứu cho rằng các vi nang làm từ tinh bột có khả năng giải phóng liên tục và kéo dài Hiện nay, vi nang làm từ tinh bột được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau Quá trình biến tính mang lại cho tinh bột những đặc tính hóa lý khác nhau để đáp ứng các nhu cầu khác nhau cho các ứng dụng tinh bột Các đặc tính của vi nang làm từ các loại tinh bột khác nhau là khác nhau [67] Từ những ưu điểm của việc kết hợp tinh bột và alginat nên đây được cho là một xu hướng mới trong việc bào chế vi nang [7]

Với mục đích tăng cường khả năng bảo vệ vi sinh vật trong đường tiêu hoá, dựa trên sự ảnh hưởng của tinh bột hồ hoá đến các đặc tính của vi nang và kết quả nghiên cứu của tác

giả Nguyễn Thị Trang [6], đề tài “ Đánh giá ảnh hưởng của tinh bột hồ hoá đến một số

đặc tính của vi nang chứa Lactobacillus acidophilus” được tiến hành với các mục tiêu

nghiên cứu như sau:

1 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ Alginat và Chitosan đến một số đặc điểm của vi nang tinh bột hồ hoá

2 Đánh giá khả năng bảo vệ và giải phóng vi sinh vật của vi nang tinh bột hồ hoá tại các môi trường mô phỏng pH dịch tiêu hoá

2

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về Lactobacillus acidophilus 1.1.1 Đặc điểm của Lactobacillus acidophilus:

1.1.1.1 Khái niệm probiotic:

Năm 1965, Lily và Stillwell sử dụng thuật ngữ probiotic để mô tả chất được tiết ra bởi một sinh vật và kích thích sự phát triển của sinh vật khác [65]

Năm 2002, tổ chức FAO và WHO quyết định đưa ra một định nghĩa thống nhất về probiotic là “các vi sinh vật sống, khi được sử dụng với số lượng thích hợp sẽ mang lại lợi ích sức khỏe cho vật chủ” và hỗ trợ việc sử dụng từ ngữ này trong tương lai Hiện nay, khái

niệm probiotic được mô tả đầy đủ hơn: Probiotic, bao gồm vi khuẩn và nấm men, là những vi sinh vật sống đã được chứng minh là có tác dụng có lợi đối với sức khỏe con người [39] 1.1.1.2 Lactobacillus acidophilus

L acidophilus lần đầu được phân lập từ phân trẻ sơ sinh vào năm 1900 và được đặt tên chính thức Lactobacillus acidophilus [31]

Hình 1.1: Ảnh hiển vi điện tử của tế bào Lactobacillus acidophilus [12]

L acidophilus, thuộc chi Lactobacillus, Họ Lactobacillaceae, là trực khuẩn gram

dương, không hình thành bào tử Chúng có dạng que mảnh có đầu tròn, dài 2-10 μm, thường

tồn tại dưới dạng đơn lẻ, xếp đôi hoặc chuỗi ngắn Hầu hết các chủng L acidophilus là vi

khuẩn vi hiếu khí và kỵ khí Nhiệt độ nuôi cấy tối ưu thường là 35 ~ 38°C và về cơ bản

không phát triển ở nhiệt độ dưới 20°C L acidophilus có khả năng chịu nhiệt kém và độ pH tối ưu là 5,5 ~ 6,0 Ngoài ra, L acidophilus có khả năng kháng acid và mật tốt [31] 1.1.1.3 Vai trò của Lactobacillus acidophilus trong hệ tiêu hoá

Theo các nghiên cứu hiện nay, L acidophilus tham gia hỗ trợ quá trình tiêu hoá của

người chủ yếu thông qua việc sản xuất các chất chuyển hóa và điều hòa hệ vi sinh vật đường ruột [21], [55] Độ pH tối ưu của nhiều vi khuẩn gây bệnh đường ruột là trung tính hoặc

hơi kiềm Trong khi đó, acid lactic được sản xuất bởi L acidophilus thông qua quá trình

3 trao đổi chất có thể làm giảm độ pH, do đó ức chế sự phát triển và sinh sản của vi khuẩn gây bệnh [21]

1.1.2 Một số yếu tố ảnh hưởng tới khả năng sống sót của Lactobacillus acidophilus

1.1.2.1 pH

Dạ dày có tính acid cao, pH trong khoảng 1,0-2,5 ở tất cả các đối tượng Độ pH trung bình được ghi lại trong giờ đầu tiên ở đoạn gần ruột non là 6,6 Độ pH trung bình ở đoạn cuối hồi tràng là 7,5 Khi đến manh tràng, pH giảm mạnh xuống 6,4 Sau đó pH tăng dần từ đại tràng phải sang đại tràng trái với giá trị trung bình là 7,0 [30] Ngoài ra, thức ăn cũng có thể ảnh hưởng đến độ pH của dịch dạ dày Ở trạng thái đói, độ pH trong dạ dày ở người khỏe mạnh nằm trong khoảng 1,3 đến 2,5 Thức ăn có thể làm tăng độ pH lên khoảng 4,5 đến 5,8 Trong vòng 1 giờ sau khi ăn, độ pH của dạ dày giảm xuống dưới 3,1 [41] Mặt

khác, L acidophilus có độ pH tối ưu là 5,5 ~ 6,0 [31] Như vậy có thể thấy khả năng sống sót của L acidophilus có thể bị ảnh hưởng bởi pH thấp của dạ dày, và sống được trong môi trường pH của ruột non và đại tràng Vì vậy, cần phải bảo vệ L acidophilus qua môi trường

dạ dày, để hướng tới những vị trí có tác dụng như ruột non và đại tràng

1.1.2.2 Thời gian vận chuyển vi sinh vật trong đường tiêu hoá

Thời gian di chuyển của vi sinh vật trong đường tiêu hoá bị ảnh hưởng nhiều bởi yếu tố như bệnh lý, sự có mặt của thức ăn, dạng bào chế… vì vậy rất khó xác định chính xác thời điểm vi sinh vật di chuyển trong đường tiêu hoá [13]

Mặt khác, thời gian vi sinh vật di chuyển trong đường tiêu hoá cũng ảnh hưởng đến khả năng sống sót của vi sinh vật [13]

1.1.2.3 Các thành phần có trong dịch tiêu hoá

¨ Thức ăn Một nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng thức ăn có thể làm chậm đáng kể sự giải phóng thuốc trong dạ dày bằng cách hình thành một lớp màng bao quanh viên thuốc, từ đó dẫn đến chậm hấp thu thuốc và xuất hiện nồng độ đỉnh cao trong huyết tương muộn [16], [41] Cơ chế này phụ thuộc cả vào thành phần của vi nang và thành phần của thức ăn dùng cùng [16] Ngoài ra, thức ăn cũng có thể ảnh hưởng đến độ pH của dịch dạ dày [41], từ đó có thể ảnh hưởng tới việc hấp thu thuốc (vi nang chứa VSV)

¨ Enzym, muối mật, pepsin Thành phần chính của dịch tiết dạ dày bao gồm acid hydrochloric (HCl), pepsinogen, chất nhầy và nước [41] Tính acid mạnh của dịch dạ dày có thể ảnh hưởng lớn đến khả năng sống sót của vi sinh vật, dẫn đến hạn chế sự phát triển của vi sinh vật trong đường tiêu hóa

4 [45] Một nghiên cứu đã chỉ ra rằng, việc đưa pepsin vào dịch dạ dày không cho thấy ảnh hưởng gì thêm đến tính chất của vi nang [17]

Sau khi đi qua môn vị, vi khuẩn probiotic sẽ đến ruột non, nơi có nhiều dịch tuỵ và mật Acid mật và enzyme tiêu hoá (bao gồm lipase, protease và amylase) cũng có thể ảnh hưởng đến khả năng tồn tại của vi sinh vật thông qua sự phá vỡ màng tế bào và tổn thương DNA [35]

Ở cuối ruột non, khi đến đại tràng, vi sinh vật gặp phải thách thức cạnh tranh với vi khuẩn có sẵn, bám vào lớp chất nhầy của ruột Enzyme tiêu hóa và mật làm giảm độ bám

tra không nhân lên trong môi trường nước bổ sung 0,3% mật bò và các chủng còn lại thì phát triển rất kém [20] Có thể nói, nhiều loại enzyme tiêu hóa và muối mật trong ruột đe dọa khả năng tồn tại và chức năng của vi sinh vật [45]

1.1.3 Một số xu hướng bảo vệ Probiotic

Việc sử dụng probiotic để tăng sức đề kháng, phòng bệnh đã xuất hiện từ hàng nghìn năm trước Tiêu biểu là các sản phẩm từ sữa, được coi là 1 nhóm lớn các sản phẩm có khả năng mang và vận chuyển các vi khuẩn probiotic, trong số đó sữa lên men và phô mai được tiêu thụ nhiều nhất thế giới Ngoài ra, người ta còn sản xuất các dòng sản phẩm nước trái cây bổ sung probiotic phù hợp với các đối tượng dị ứng/không dung nạp sữa hay nhóm đối tượng có nhu cầu năng lượng thấp [62], [47]

Vi sinh vật probiotic không bao: có thể ở dạng bột hoặc cốm, đơn loài hoặc dạng

bào chế nang cứng, đơn hoặc đa loài Một ví dụ như sản phẩm Antibio Pro do công ty dược phẩm Han Wha, Hàn Quốc sản xuất với dạng bào chế gói bột pha hỗn dịch uống Mỗi gói

chứa 75mg Lactobacillus acidophilus tương đương với 108 CFU/gói Nhược điểm của dạng này là khả năng sống sót của vi sinh vật bị ảnh hưởng lớn trong điều kiện khắc nghiệt của đường tiêu hoá như pH, pepsin, enzym, muối mật…

Vi sinh vật bao tan ở ruột: VSV chứa trong nang có lớp bảo vệ chỉ tan trong ruột,

hầu hết probiotic được xử lý với một polyme acrylic acid Tác nhân bảo vệ này chỉ được cho phép sử dụng trong dược phẩm, không thích hợp cho thực phẩm bổ sung probiotic vì có thể gây tác dụng phụ

Vi nang hoá, tạo lớp bao kép, giải phóng vi sinh vật ở ruột: Gồm 2 lớp bao Công

nghệ bao kép này đã được công nhận và sử dụng ở một số nước trên thế giới, hiện nay trên thị trường Việt Nam phải kể đến như Duolac của hãng Cell Biotech – Hàn Quốc

Bên cạnh đó, hiện nay việc đóng gói probiotic Lactobacillus acidophilus thông qua

việc bao từng lớp polyelectrolytes (PE), chitosan (CHI) và carboxymethyl cellulose (CMC)

5 đã được nghiên cứu để tăng cường khả năng sống sót của VSV trong các điều kiện bất lợi gặp phải trong đường tiêu hóa Khi tiếp xúc lần lượt với SGF (mô phỏng dịch dạ dày) và SIF (mô phỏng dịch ruột) trong 120 phút, người ta quan sát thấy các tế bào tự do gần như chết hoàn toàn Tuy nhiên, đối với các tế bào được phủ ba lớp nano PE (CHI/CMC/CHI),

tỷ lệ sống sót của L acidophilus được nâng cao [54] Công trình này cho thấy việc bao gói

vi nang probiotic bằng alginate và lớp phủ chitosan là một phương pháp hiệu quả giúp bảo vệ vi sinh vật khỏi ảnh hưởng của dạ dày và hướng tới tiềm năng giải phóng vi sinh vật tại ruột non và đại tràng mô phỏng

1.2 Tổng quan về vi nang

1.2.1 Định nghĩa vi nang

Vi nang (microcapsule) là những tiểu phân hình cầu hoặc không xác định, kích thước từ 0,1 μm tới 5,0 mm (thông thường từ 100 đến 500 μm) có thể được bao bởi các hợp chất cao phân tử có nguồn gốc thiên nhiên hoặc tổng hợp [1]

Từ quan điểm vi sinh học, vi nang hóa có thể được định nghĩa là quá trình bẫy/bao gói các tế bào vi sinh vật bằng cách bao phủ chúng trong lõi nhân (gọi là hydrocolloid) thích hợp nhằm ngăn cách chúng với môi trường xung quanh và giải phóng các tế bào VSV tại vị trí thích hợp trong ruột [51]

6

Matrix: chứa VSV phân tán khắp vi nang, được tạo thành từ phương pháp bẫy Đặc

điểm của vi nang dạng này là bao gói được VSV cùng cơ chất 1 cách chắc chắn [57]

Bao matrix: là vi nang dạng matrix có lớp bao phía bên ngoài Lớp bao này có thể

có nhiều vai trò khác nhau như bảo vệ nhân chứa VSV khỏi tác động từ môi trường xung quanh như ánh sáng, độ ẩm, nhiệt độ Khi vào cơ thể, có thể bảo vệ VSV khỏi tác động của pH dạ dày, muối mật… [57]

Tạo vi nang bằng phương pháp bẫy có khả năng cố định được lượng tế bào lớn và chắc chắn so với các phương pháp khác [57]

Cơ chế giải phóng và hấp thu hoạt chất (VSV) từ vi nang là do tương tác của vỏ nang với môi trường hoà tan (vỡ màng, hoà tan màng, khuếch tán qua màng hoặc giải phóng cơ học theo cơ chế mài mòn…), khi vỏ nang trương nở, dược chất bên trong sẽ khuếch tán [4]

1.2.3 Ưu nhược điểm của việc vi nang hoá

v Ưu điểm: Bảo vệ hiệu quả VSV được bao gói khỏi tác động của môi trường xung quanh [53]: vi nang có cấu tạo như một màng bán thấm hình cầu giúp tế bào được cách ly với môi trường xung quanh, bảo vệ và làm tăng số lượng tế bào VSV, bằng cách này chúng sẽ được bảo vệ tốt hơn trong các điều kiện bất lợi như acid cao, pH thấp, muối mật… [9]

Có khả năng dự đoán và kiểm soát giải phóng VSV [58]: vi nang hóa cho phép cố định một lượng lớn tế bào vi sinh vật và giải phóng tại các vị trí mong muốn Độ bền cơ học của lớp màng bao vi nang đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ và giải phóng vi sinh vật khi cần thiết Lớp màng phải có độ bền cơ học tương đối để có thể bảo vệ được các vi sinh vật sống bên trong, tuy nhiên lại không nên quá vững chắc [9]

v Nhược điểm: Điều kiện bảo quản chặt chẽ: các nguyên liệu polymer dùng để tạo vi nang như alginat, gelatin, tinh bột… [11] thường là các chất VSV có thể tiêu hóa được Do đó nếu trong điều kiện bảo quản không được tốt, VSV được bao gói hay VSV tạp nhiễm từ bên ngoài có thể tiêu hóa làm cho vi nang bị thủng, rách dẫn đến giảm hoặc mất vai trò bảo vệ của vi nang Vì vậy cần phải lưu tâm đến việc lựa chọn chủng vi sinh vật và nguyên liệu thích hợp để bao gói Ngoài ra, kỹ thuật bao gói khá phức tạp và chi phí sản xuất cao

1.3 Nguyên liệu tạo vi nang

Vật liệu polymer sinh học kết hợp với VSV và thực hiện chức năng vận chuyển, bảo vệ VSV Những vật liệu này thường được yêu cầu phải không độc và đạt được mục tiêu giải phóng [19]

7 Người ta sử dụng nhiều loại nguyên liệu khác nhau trong các kỹ thuật bao gói vi nang khác nhau, như alginate, chitosan, carrageenan, gôm (gellan, xanthan,…), gelatin, whey protein, tinh bột Mỗi vật liệu bao gói đều có những đặc điểm riêng trong quá trình tạo vi nang và mang lại hình dạng cũng như độ bền khác nhau cho vi nang [11]

1.3.1 Tinh bột

1.3.1.1 Đặc điểm của tinh bột

Tinh bột, là một loại polysaccharid có nguồn gốc tốt trong tự nhiên, đã được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực do tính tương thích sinh học và khả năng phân hủy sinh học tốt [66] Tinh bột được cấu tạo chính từ amylose và amylopectin, trong đó cả hai cấu

tử này đều được cấu tạo từ α - D glucose Các gốc glucose trong amylose kết hợp với nhau

qua liên kết α (1–4)glucosid tạo thành chuỗi, các chuỗi liên kết với nhau bằng liên kết α

-(1–6)-glucosid ở điểm phân nhánh [29] Trong đó tỉ lệ amylose và amylopectin có thể thay đổi trong một phạm vi rất rộng, tùy thuộc vào nguồn gốc thực vật của tinh bột Tất cả các hạt tinh bột đều chứa cả vùng kết tinh và vùng vô định hình, cho nên chúng ở dạng bán kết

tinh [26] Thông thường, tinh bột không tan trong nước lạnh Tuy nhiên, tinh bột có thể hồ hóa trong nước nóng, đây là một đặc tính quan trọng có ảnh hưởng lớn đến việc điều chế

vật liệu sinh học từ tinh bột [34]

Hình 1.3: Cấu trúc hoá học của tinh bột [2]

Tinh bột còn được biết đến trong việc sử dụng làm tá dược bảo vệ trong quá trình đông khô theo cơ chế làm giảm lượng tinh thể nước gắn với màng tế bào VSV trong mẫu Khi tạo vi nang calci alginat, tinh bột được phối hợp như một tá dược độn, góp phần cải thiện thể chất của vi nang sau đông khô, giúp tế bào ổn định hơn, cải thiện khả năng sống sót trong quá trình đông khô và bảo quản [10]

Bên cạnh đó, có một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng sử dụng tinh bột hồ hoá nhằm tạo ra một hỗn hợp đồng nhất với alginat vì chúng có khả năng liên kết và hoà tan tốt so với tinh bột không hồ hoá [10] Ngoài ra, khi vào trong ruột, tinh bột còn tạo ra nguồn dinh dưỡng đối với vi sinh vật [50]

8 Một số loại tinh bột được sử dụng phổ biến hiện nay như tinh bột ngô, tinh bột sắn, tinh bột củ sen… Các loại hạt tinh bột khác nhau thì có hình dạng, kích thước, hàm lượng amylose, cấu trúc tinh thể, trọng lượng phân tử của amylose và amylopectin,… khác nhau, dẫn tới quá trình và kết quả hồ hoá khác nhau [34] Ví dụ, khi các hạt tinh bột khoai tây trương nở, sẽ lọc một lượng đáng kể amylose, vỡ thành từng miếng trương nở và mất đi tính nguyên vẹn trong nước rất nhanh Ngược lại, các hạt tinh bột sắn sẽ hơi phồng lên, lọc

một lượng tương đối nhỏ amylose và giữ nguyên hình dạng tốt trong nước [34]

1.3.1.2 Sự hồ hoá của tinh bột

Sự hồ hóa là một tính chất quan trọng của tinh bột, đã được nghiên cứu về sự thay đổi các tính chất hóa lý của tinh bột, chẳng hạn như độ hòa tan, tính chất lưu biến, tính chất nhiệt, độ trong suốt của bột nhão, độ kết tinh, [34] Tinh bột hồ hóa cũng hoạt động như một chất hỗ trợ cấu trúc làm giảm giảm khoảng trống, giúp tạo ra các hạt hình cầu và giữ được hình dạng cầu của vi nang sau đông khô [56]

Về bản chất, tinh bột hồ hóa là một mạng lưới gel amylose với các hạt trương nở hoạt động như một tá dược độn Khi hỗn hợp nguội đi, động năng giảm xuống, cho phép các phân tử tinh bột liên kết lại và hình thành mạng lưới Sự tái liên kết ngắn hạn này dẫn đến sự thay đổi kết cấu của tinh bột được hồ hoá Việc bảo quản lâu hơn gây ra sự tái kết tinh thuận nghịch của amylopectin, làm tăng độ cứng của các hạt trương nở gắn trong mạng lưới amylose liên tục Amylopectin được cho là sẽ đóng vai trò chủ đạo trong các tính chất của tinh bột, vì tính chất bán tinh thể của tinh bột chủ yếu được cấu thành bởi các chuỗi phân nhánh ngắn của nó Một thử nghiệm đã chỉ ra rằng đặc tính trương nở và hồ hóa của tinh bột một phần được kiểm soát bởi cấu trúc phân tử của amylopectin, thành phần tinh bột và cấu trúc hạt (tỷ lệ tinh thể và vô định hình) Vì lý do này, sự khác biệt về đặc tính trương nở và kết dính giữa các loại tinh bột có thể là do sự thay đổi trong phân bố chiều dài chuỗi đơn vị amylopectin Bên cạnh đó, các thành phần chiếm tỷ lệ nhỏ của tinh bột, chẳng hạn như phospholipid và monoesters photphat cũng có ảnh hưởng lớn đối với các đặc tính này [60]

1.3.2 Alginat

Alginat là tên gọi chung cho các muối của acid alginic, tồn tại dưới dạng anion Acid alginic là một polysaccharid mạch thẳng ưa nước, cấu tạo từ hai gốc acid uronic là acid β-D-mannuronic (M) và acid α-L-guluronic (G) nối với nhau bằng liên kết 1,4- glycosid [33], [57]

9

Hình 1.4: Cấu trúc hoá học của alginat [36]

Alginat là polymer được sử dụng phổ biến trong vi nang hoá probiotic với đặc tính an toàn, khả năng tạo gel với kim loại hoá trị II như Ca2+ nhờ liên kết chéo được mô tả theo mô hình “vỉ trứng” Các ion Ca2+ khớp vào các khoảng trống tạo nên mạng lưới không gian ba chiều Cấu trúc gel bán thấm này khi sử dụng làm màng bao, chúng có vai trò như một tấm chắn chống lại những yếu tố bất lợi của môi trường và cho phép giải phóng vi sinh vật được bao theo hướng có kiểm soát [33] Tuy nhiên, độ bền cơ học của màng alginat và tính toàn vẹn có thể bị ảnh hưởng bởi pH thấp, sự có mặt của các ion hóa trị I, các chất tạo phức chelat với ion Ca2+ như phosphat, lactat, citrat [18]

Có thể khắc phục những vấn đề trên bằng cách phối hợp alginat với polymer khác hoặc phủ thêm lớp màng ngoài trên vi nang Kết hợp alginat và tinh bột là một biện pháp

phổ biến cải thiện hiệu quả quá trình vi nang hóa [50] Ngoài ra alginat tích điện âm nên có

thể lợi dụng bao thêm lớp bao mới nhờ lực hút tĩnh điện với polymer tích điện dương [18], [22]

1.3.3 Chitosan

Chitosan là một polysaccharide cation bao gồm D-glucosamine và glucosamine được liên kết bằng liên kết β-(1 → 4) Nó có nguồn gốc thương mại bằng cách khử một phần chitin chiết xuất từ động vật giáp xác [32] Ngoài ra, chitosan tạo thành cấu trúc gel thông qua quá trình tạo gel ionotropic và hòa tan ở pH < 6, tương tự như alginate [63]

N-acetyl-Hình 1.5: Cấu trúc hoá học Chitin và Chitosan [64]

10 Chitosan có thể thu được từ phản ửng deacetyl hoá của chitin [59] Khi mức độ deacetyl hóa của chitin đạt khoảng 50% (tùy thuộc vào nguồn gốc của polymer), nó có khả năng tan được trong dung dịch có tính acid [63] Chitosan mang điện tích dương, có tính base yếu (pKa của các nhóm amin xấp xỉ 6,5), thấm nước, không tan trong môi trường trung tính và kiềm, tan trong hầu hết dung dịch acid hữu cơ pH dưới 6,5 [59] Tính chất tích điện dương giúp chitosan hoạt động như một chất bám dính sinh học, có khả năng bám vào các

của alginat và nhóm amin của chitosan, tạo thành lớp áo kép giúp tăng độ ổn định, do đó giảm thất thoát vi sinh vật Đặc tính này được ứng dụng để chế tạo vi nang bao chitosan [10] Lớp phủ chitosan có nhiều ưu điểm như không độc, tương thích sinh học tốt và cải thiện đặc tính kết dính sinh học và số lượng VSV bao gói [40], [49]

Bên cạnh đó, chitosan có thể gây ra những bất lợi khi làm vật liệu bao bọc cho vi sinh vật do tác dụng ức chế của nó đối với vi sinh vật Do đó, chitosan thường được sử dụng làm lớp phủ hoặc vỏ hơn là chất nền vi nang [61]

1.4 Một số phương pháp tạo vi nang

Có nhiều phương pháp khác nhau để tạo vi nang dựa vào các quá trình hoá học, hoá lý, tĩnh điện, cơ học Đối với vi nang probiotic thường sử dụng các phương pháp tách pha đông tụ, phương pháp nhũ hoá, phương pháp phun sấy, phương pháp đông khô, phương pháp phun đông khô,… [46]

Phương pháp nhỏ giọt tách pha đông tụ: Đây là phương pháp kinh điển nhất trong

tạo vi nang Phương pháp này liên quan đến việc chuyển tiếp từ pha lỏng sang pha gel do tương tác ion xảy ra giữa một polyme mang điện tích và một tác nhân khác mang điện tích trái dấu Sự tương tác này tạo thành liên kết chéo giữa các đại phân tử, gây nên sự đông tụ của phức hợp tạo thành Các polymer tự nhiên và bán tổng hợp như alginat, gôm gellan, chitosan, pectin, carboxymethyl cellulose thường được ưu tiên sử dụng do tính tương thích sinh học và có khả năng phân hủy sinh học Các polyme này mang điện tích âm (hoặc dương) trong cấu trúc, sau khi tạo liên kết chéo với các tác nhân mang điện tích trái dấu (Ca2+, tripolyphosphat ), chúng hình thành nên một cấu trúc dạng mạng lưới không gian ba chiều lưu giữ VSV [46]

Phương pháp khác: phương pháp nhũ tương hoá, phun sấy, đông khô, phun đông

khô ít được sử dụng hơn do chi phí đắt đỏ, thiết bị phức tạp, phương pháp phun sấy còn làm giảm khả năng sống sót của vi sinh vật do ảnh hưởng của nhiệt độ [46]

Kỹ thuật phủ Chitosan:

11 Nhằm tăng cường khả năng bảo vệ vi sinh vật trong vi nang, người ta thường tiến hành phủ thêm các lớp polymer bên ngoài Các lớp phủ này sẽ tương tác với bề mặt vi nang tạo thành một lớp màng liên tục trên bề mặt vi nang Lớp phủ này làm giảm tính thấm của vi nang, giảm sự tiếp xúc của VSV với oxy trong quá trình bảo quản và làm tăng sự ổn định của vi nang ở pH thấp và nhiệt độ cao [37], [48] Bên cạnh đó lớp phủ còn giúp tạo ra một số đặc tính mới cho vi nang như khả năng bám dính, kiểm soát giải phóng VSV [22] Các lớp bao phủ bề mặt vi nang có thể được tạo bởi nhiều cách khác nhau, cụ thể là bao từng lớp, kỹ thuật được sử dụng thường là ngâm, nhúng, phun hay tưới lên bề mặt vi nang các dịch bao thích hợp để tạo thành một hay nhiều lớp bao trên bề mặt Đối với vi nang chứa VSV, kỹ thuật hay được thực hiện nhất là ngâm vi nang vào dung dịch polyme, dẫn đến sự hình thành lớp phủ và quá trình đồng trùng hợp được tạo ra giữa bề mặt của vi nang và polyme bao phủ Nguyên tắc của kỹ thuật này dựa trên lực hút tĩnh điện hóa học giữa vật liệu tích điện âm và dương [22], [18]

Chitosan là một polymer thường được sử dụng để tạo lớp phủ vi nang alginat do khả năng tích điện trái dấu của chitosan và alginat Có 2 phương pháp chính để tạo lớp phủ chitosan: một là phối hợp ngay trong quá trình đông tụ bằng cách bổ sung chitosan/acid acetic vào dung dịch calci clorid; hai là phối hợp sau khi đông tụ bằng cách ngâm vi nang trong dung dịch chitosan/acid acetic Dựa vào kết quả của tác giả Nguyễn Thị Trang, sử dụng phương pháp phối hợp sau đông tụ bằng cách ngâm vi nang trong dung dịch chitosan/acid acetic để tiến hành nghiên cứu này

Kỹ thuật đông khô:

Đông khô được sử dụng rộng rãi trong các ngành công nghiệp thực phẩm và dược phẩm để làm khô các thành phần nhạy cảm với nhiệt, do đó nó bảo quản một lượng đáng kể VSV sống sót [28], [38] Tác hại do nhiệt độ thấp và sự thăng hoa của nước trong quá trình đông khô đối với VSV là tương đối nhỏ so với nhiệt độ cao được sử dụng trong sấy phun, giúp cải thiện khả năng sống sót của VSV [57] Tuy nhiên, quá trình này có những hạn chế như tốn thời gian và chi phí [44]

1.5 Một số nghiên cứu gần đây về vi nang probiotic

Trong số các kỹ thuật hiện có, việc bẫy vi khuẩn acid lactic trong hạt calci alginate khá phổ biến Lợi ích của alginat là không độc đối với các tế bào VSV được cố định, đồng thời nó là một chất phụ gia thực phẩm đã được công nhận [24] Hiện nay, các vật liệu cốt lõi được nghiên cứu rộng rãi bao gồm alginate, chitosan, carrageenan, gôm, gelatin, whey protein và tinh bột Các nguyên liệu này đã chứng minh khả năng kháng acid ở một mức

12 độ nào đó, tuy nhiên, chỉ một số ít có thể duy trì khả năng tồn tại của VSV ở độ pH thấp tới 2,0 Mặc dù vậy chúng vẫn tồn tại một số nhược điểm [42]

Một nghiên cứu đã sử dụng lớp phủ làm từ protein đậu nành để cải thiện việc cung cấp VSV trong ruột Mục đích của ý tưởng này là bảo vệ VSV khỏi các điều kiện khắc nghiệt như độ pH thấp và enzyme của dịch dạ dày mô phỏng Nghiên cứu khả năng sống

sót trong điều kiện đường tiêu hóa in vitro của hai chủng L plantarum CECT 220 và L casei CECT 475 và người ta nhận thấy rằng protein đậu nành cô đặc có hiệu quả trong việc

tăng cường khả năng sống sót của các chủng probiotic và bảo vệ chúng khỏi điều kiện của dịch tiêu hóa [27]

Một nghiên cứu khác đã đóng gói các chủng L acidophilus trong hỗn hợp tinh bột

kháng và gel alginate calci, bằng cách ép đùn, dẫn đến tăng tỷ lệ sống sót của các chủng trong phô mai Iran và ngay cả sau khi bảo quản trong 6 tháng [27]

Vì tinh bột hồ hóa với lớp phủ chitosan làm giảm độ xốp của hạt alginate và giảm sự rò rỉ của men vi sinh [23], [25], [52] nên vi nang từ tinh bột hồ hóa phối hợp cùng alginat rồi được phủ một lớp chitosan được biết đến là có thể bảo vệ thành công và đáng kể vi khuẩn probiotic chống lại tình trạng bất lợi của tình trạng dạ dày-ruột mô phỏng ở người [10]

Có thể nhận thấy, việc sử dụng tinh bột hồ hoá là một trong những phương pháp có tiềm năng tăng khả năng bảo vệ sự sống sót của vi sinh vật trong điều kiện khắc nghiệt của đường tiêu hoá

13

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu và thiết bị

KH2PO4 Trung Quốc Acid acetic băng Trung Quốc

Natri clorid Trung Quốc Tinh bột sắn Việt Nam

2.1.2.2 Thiết bị

Bảng 2.2 Danh mục thiết bị sử dụng

Cân kỹ thuật Đức-Sartorius Tủ cấy vô trùng Nhật-Sanyo Máy khuấy từ Hàn Quốc-Wisd Tủ sấy Hàn Quốc-Daihan Máy lắc ổn nhiệt Trung Quốc-KWF Thiết bị đông khô Đức-Christ alpha

Máy ly tâm Đức-Sartorius Tủ âm sâu Hàn Quốc-LG Nồi hấp tiệt trùng Nhật-ALP Tủ ấm CO2 Nhật-Sanyo

2.1.2.3 Dụng cụ

14

Bảng 2.3 Danh mục dụng cụ sử dụng

2.1.3 Các môi trường nghiên cứu

2.1.3.1 Môi trường MRS lỏng

Bảng 2.4 Môi trường MRS lỏng

Nguyên liệu Lượng sử dụng Nguyên liệu Lượng sử dụng

2.1.4 Các dung dịch sử dụng trong nghiên cứu

• Dung dịch acid acetic 0,5% (kl/tt): cân 0,5 g acid acetic băng, pha loãng với nước vừa đủ 100 ml

• Dung dịch calci clorid 2% (kl/tt): hoà tan 2 g calci clorid trong 100 ml nước cất • Dung dịch chitosan 0,5% (kl/tt); pH 5,5 – 6,0: cân 0,5 g chitosan hoà tan vào trong

90 ml acid acetic 0,5% Điều chỉnh pH khoảng 5,5 – 6,0 bằng NaOH 1M và HCl 1M, thêm acid acetic 0,5% vừa đủ 100 ml

• Dung dịch chitosan 0,75% (kl/tt); pH 5,5 – 6,0: cân 0,75 g chitosan hoà tan vào trong 90 ml acid acetic 0,5% Điều chỉnh pH khoảng 5,5 – 6,0 bằng NaOH 1M và HCl 1M, thêm acid acetic 0,5% vừa đủ 100 ml

• Dung dịch chitosan 1% (kl/tt); pH 5,5 – 6,0: cân 1 g chitosan hoà tan vào trong 90 ml acid acetic 0,5% Điều chỉnh pH khoảng 5,5 – 6,0 bằng NaOH 1M và HCl 1M, thêm acid acetic 0,5% vừa đủ 100 ml

15 • Dung dịch natri citrat 2% (kl/tt) Cân 2 g natri citrat hoà tan trong nước cất vừa đủ

100 ml • Nước cất hấp tiệt khuẩn ở 115°C trong 20 phút • Môi trường mô phỏng pH dạ dày (pH 2,5): Thêm từ từ HCl 1N vào 1000 ml nước

cất đến pH 2,5 • Môi trường mô phỏng pH ruột non (pH 6,8): Hoà tan 28,8 g dinatri hydrophosphat

và 11,45 g kali dihydrophosphat trong nước cất vừa đủ 1000 ml • Môi trường mô phỏng pH đại tràng (pH 7,4): Hoà tan 0,6 g kali dihydrophosphat;

6,4 g dinatri hydrophosphat và 5,85 g natri clorid trong nước vừa đủ 1000 ml

2.2 Nội dung nghiên cứu

Gồm có 2 nội dung chính

2.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ alginat và chitosan đến cấu trúc của vi nang tinh

bột hồ hoá: - Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ alginat tới quá trình tạo vi nang tinh bột hồ hoá

- Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ lớp phủ chitosan tới một số đặc tính của vi nang

tinh bột hồ hoá 2.2.2 Đánh giá khả năng bảo vệ và giải phóng vi sinh vật của vi nang tinh bột hồ hoá

trong các môi trường mô phỏng pH dịch tiêu hoá

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp tiệt khuẩn bằng nhiệt ẩm

Áp dụng để tiệt khuẩn dung dịch nước, pipet tips, dụng cụ thủy tinh Nguyên liệu dụng cụ tiệt khuẩn được bọc giấy bạc, giấy báo hoặc đựng trong bình nón

2.3.2 Phương pháp nuôi cấy thu hỗn dịch tế bào

v Hoạt hóa giống

Cân, đong các thành phần trong công thức môi trường MRS lỏng (công thức nêu trong mục 2.1.3) Hòa tan các thành phần thu được 100 ml môi trường Phân chia môi trường vào các ống nghiệm sạch, mỗi ống nghiệm 10 ml MRS lỏng Đậy kín bằng nắp ống nghiệm Hấp tiệt khuẩn môi trường ở 115°C trong 20 phút trong nồi hấp tiệt khuẩn, sau đó để nguội xuống nhiệt độ 37-40°C Cấy giống vào những ống nghiệm trên với nồng độ 10% (kl/tt) Ủ các ống nghiệm đã được cấy giống trong tủ ấm 5% CO2 trong 24 giờ ở 37°C v Nhân giống

16 Pha môi trường MRS lỏng theo công thức nêu ở mục 2.1.3 trong các bình nón đậy nút bông Đem hấp tiệt khuẩn ở 115°C trong 20 phút trong nồi hấp tiệt trùng Để nguội ở nhiệt độ phòng Cấy giống với tỷ lệ 10% vào bình nón trong tủ cấy vô trùng Ủ bình nón chứa vi sinh vật trong tủ ấm CO2 ở 37°C trong 24 giờ

v Thu sinh khối

Hỗn dịch nhân giống sau 24 giờ ly tâm ở 4000 vòng/phút trong 10 phút, gạn bỏ phần dịch trong thu sinh khối tế bào

2.3.3 Phương pháp tạo vi nang

2.3.3.1 Chuẩn bị vi nang không chứa VSV

v Vi nang Alginat x% phối hợp Tinh Bột Hồ Hoá 5%

Sơ đồ minh hoạ:

v Vi nang Alginat x% phối hợp Tinh Bột Không Hồ Hoá 5%

Chuẩn bị:

Dịch alginat x% (kl/tt): Hấp tiệt khuẩn ở 115°C trong 20 phút, khuấy đều bằng máy khuấy từ Khi dịch hỗn hợp đã nguội, thêm tinh bột sắn vào, kết hợp khuấy từ cho đến khi đồng nhất thu được hỗn hợp tạo vi nang

Alginat x% ngâm trương nở trong nước + 5% Tinh Bột

Hỗn hợp tạo vi nang Dung dịch Calci clorid 2% 1 Ngâm vi nang 30 phút

2 Rửa sạch vi nang bằng nước cất Vi nang Alginat x% phối hợp Tinh Bột Hồ Hoá 5%

Hấp tiệt khuẩn

Sơ đồ minh hoạ:

v Vi nang Alginat x% phối hợp Tinh Bột Hồ Hoá 5% có thay đổi nồng độ lớp phủ

Chitosan y%

Chuẩn bị:

Hỗn hợp alginat x%-tinh bột hồ hoá (5%) (kl/tt): Hấp tiệt khuẩn ở 115°C trong 20 phút, khuấy đều bằng máy khuấy từ cho đến khi đồng nhất

Dung dịch calci clorid 2%; dung dịch chitosan 0,5%; dung dịch chitosan 0,75%; dung

dịch chitosan 1% pha theo công thức nêu ở mục 2.1.4

Tiến hành:

Dùng pipet Pasteur có kích thước đầu pipet cỡ 2 mm nhỏ hỗn hợp trên xuống dung dịch calci clorid 2%, để yên 30 phút cho vi nang ổn định Dùng lưới vớt hạt thu vi nang và rửa sạch bằng nước cất Chuyển vi nang sang dung dịch chitosan y% kết hợp với khuấy từ trong 30 phút Dùng lưới vớt hạt vi nang và rửa sạch bằng nước cất

Sơ đồ minh hoạ:

Alginat x% ngâm trương nở trong nước

5% Tinh Bột

Hỗn hợp tạo vi nang Dung dịch Calci clorid 2% 1 Ngâm vi nang 30 phút

2 Rửa sạch vi nang bằng nước cất

Vi nang Alginat x% phối hợp Tinh Bột Không Hồ Hoá

5% Hấp tiệt khuẩn Dịch Alginat x%

Dung dịch calci clorid 2%; dung dịch chitosan 0,5%; dung dịch chitosan 0,75%; dung

dịch chitosan 1% pha theo công thức nêu ở mục 2.1.4

Tiến hành:

Dùng pipet Pasteur có kích thước đầu pipet cỡ 2 mm nhỏ hỗn hợp tạo vi nang chứa VSV trên xuống dung dịch calci clorid 2%, để yên 30 phút cho vi nang ổn định Dùng lưới vớt hạt thu vi nang và rửa sạch bằng nước cất Chuyển vi nang sang dung dịch chitosan y% kết hợp với khuấy từ trong 30 phút Dùng lưới vớt hạt vi nang và rửa sạch bằng nước cất Các nguyên liệu sử dụng vô khuẩn Thao tác thực hiện hoàn toàn trong tủ cấy vô trùng

Sơ đồ minh hoạ:

Alginat x% ngâm trương nở trong nước + 5% Tinh Bột

Hỗn hợp tạo vi nang Dung dịch Calci clorid 2% 1 Ngâm vi nang 30 phút

2 Rửa sạch vi nang bằng nước cất Vi nang Alginat x% phối hợp Tinh Bột Hồ Hoá 5%

Hấp tiệt khuẩn

Dung dịch Chitosan y% 1 Ngâm vi nang trong Chitosan 30 phút

2 Rửa sạch vi nang bằng nước cất Vi nang Alginat x% phối hợp Tinh Bột Hồ Hoá 5%, lớp phủ Chitosan y%