nguyễn thu phương đánh giá khả năng sống sót của lactobacillus acidophilus trong vi nang alginat carrageenan

Phương pháp đánh giá khả năng sống sót của vi sinh vật được bảo vệ và giải phóng trong môi trường pH dịch tiêu hóa .... Trong số các nguyên liệu tạo vi nang đã được biết đến, carrageenan

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THU PHƯƠNG

ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG SỐNG SÓT CỦA

Lactobacillus acidophilus TRONG VI NANG

ALGINAT - CARRAGEENAN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2024

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THU PHƯƠNG

Mã sinh viên: 1901557

ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG SỐNG SÓT CỦA

Lactobacillus acidophilus TRONG VI NANG

ALGINAT - CARRAGEENAN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:

1 ThS Lê Ngọc Khánh 2 ThS Kiều Thị Hồng

Nơi thực hiện:

Bộ môn Công nghệ sinh học Dược Khoa Công nghệ sinh học

HÀ NỘI – 2024

LỜI CẢM ƠN

Khóa luận đã được thực hiện và hoàn thành tại Bộ môn Công nghệ sinh học Dược -

Khoa Công nghệ sinh học Trong suốt thời gian thực hiện khóa luận, em rất biết ơn vì đã

nhận được nhiều sự quan tâm, giúp đỡ của thầy cô, bạn bè và gia đình

Với tất cả lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn đến PGS TS

Đàm Thanh Xuân, ThS Lê Ngọc Khánh, ThS Kiều Thị Hồng, TS Nguyễn Khắc Tiệp, TS Trần Minh Đức đã luôn tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ em từ những ngày đầu

tiên thực hiện khóa luận Cảm ơn thầy cô đã luôn ở bên động viên và cho em những lời khuyên quý báu, giúp em giúp em giải quyết các vấn đề gặp phải trong quá trình nghiên cứu đề tài

Bên cạnh đó, em cũng xin gửi lời cảm ơn đến chị Phạm Thị Thanh Huyền, chị

Nguyễn Thị Kim Chi - kỹ thuật viên khoa Công nghệ sinh học, chị Trần Thị Minh Thu,

chị Đỗ Thị Huyền Thương - học viên cao học khoá 27, bạn Hà Kiều Oanh, Vũ Quỳnh

Mai, Nguyễn Thị Hoài, Đặng Ngọc Tuyết, Lưu Thị Thơ, Nguyễn Thị Như Quỳnh, Lê Thanh Huyền, Đặng Thị Lành, Nguyễn Ngọc Ánh- sinh viên nghiên cứu khoá 74, cùng

các em khoá 75, 76 bộ môn Công nghệ sinh học Dược đã luôn đồng hành, giúp đỡ em trong thời gian làm khoá luận

Em cũng xin gửi lời cảm ơn tới Ban Giám Hiệu cùng toàn thể các Thầy Cô trường

Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện cho em tham gia nghiên cứu khoa học,

trang bị cho em những kiến thức quý báu trong suốt 5 năm học

Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất tới gia đình, người thân và bạn

bè đã luôn động viên, giúp đỡ vào tạo động lực cho em trong suốt quá trình học tập

của mình Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 03 tháng 06 năm 2024

Sinh viên

Nguyễn Thu Phương

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về Probiotic 2

1.1.1 Khái niệm Probiotic 2

1.1.2 Lợi ích của Probiotic đối với sức khỏe con người và cơ chế hoạt động của probiotic 2

1.1.3 Vi sinh vật probiotic 3

1.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sống sót của vi sinh vật probiotic 3

1.2 Loài Lactobacillus acidophilus 4

1.3 Tổng quan về vi nang 5

1.3.1 Khái niệm về vi nang 5

1.3.2 Vi nang probiotic 6

1.4 Nguyên liệu tạo vi nang probiotic 7

1.4.1 Một số tiêu chí lựa chọn vật liệu tạo vi nang 7

1.4.2 Alginat 8

1.4.3 Carrageenan 9

1.4.4 Tinh bột 11

1.5 Một số hướng ứng dụng của Carrageenan hiện nay 11

1.6 Một số nghiên cứu tạo vi nang từ Carrageenan 12

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2.1 Nguyên liệu và thiết bị 14

2.1.1 Vi sinh vật 14

2.2.2 Hóa chất, thiết bị và dụng cụ 14

2.1.3 Các môi trường sử dụng trong nghiên cứu 15

2.1.4 Các dung dịch sử dụng trong nghiên cứu 16

2.2 Nội dung nghiên cứu 16

2.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ Carragenan và Alginat tới đặc tính của vi nang.16 2.2.2 Đánh giá khả năng sống sót của L acidophilus trong vi nang Alginat – Carrageenan trong dịch tiêu hóa mô phỏng 16

2.3 Phương pháp nghiên cứu 16

2.3.1 Phương pháp tiệt khuẩn 16

2.3.2 Phương pháp nuôi cấy thu hỗn dịch tế bào 17

2.3.3 Phương pháp nhỏ giọt đông tụ tạo vi nang phối hợp Alginat và Carrageenan 17 2.3.4 Phương pháp đông khô 18

2.3.5 Phương pháp xác định hàm ẩm 18

2.3.6 Phương pháp phá hạt vi nang xác định số lượng VSV 18

2.3.7 Phương pháp pha loãng liên tục xác định số lượng VSV 18

2.3.8 Phương pháp đánh giá độ rã của vi nang trong môi trường pH dịch tiêu hoá 19

2.3.9 Phương pháp đánh giá khả năng sống sót của vi sinh vật được bảo vệ và giải phóng trong môi trường pH dịch tiêu hóa 20

2.3.10 Phương pháp đánh giá khả năng sống sót của vi sinh vật qua dịch dạ dày và dịch ruột mô phỏng 20

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, BÀN LUẬN 22

3.1 Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ Carragenan và Alginat tới đặc tính của vi nang 22

3.2 Đánh giá khả năng sống sót của L acidophilus trong vi nang Alginat – Carrageenan trong dịch tiêu hóa mô phỏng 27

3.2.1 Đánh giá độ rã của vi nang trong môi trường pH dịch tiêu hóa 27

3.2.2 Đánh giá khả năng sống sót của VSV được bảo vệ và giải phóng trong các môi trường pH dịch tiêu hóa 30

3.3.3 Đánh giá khả năng sống sót của VSV trong vi nang ở môi trường dịch dạ dày và dịch ruột mô phỏng 32

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

Ký hiệu Chú giải tiếng Anh Chú giải tiếng Việt

FAO

Food and Agriculture Organization of the United Nations

Tổ chức lương thực và nông nghiệp Liên Hiệp Quốc

phẩm Hoa Kỳ

ISAPP

International Scientific Association for Probiotics and Prebiotics

Hiệp hội khoa học quốc tế về Probiotic và Prebiotic

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1: Nguyên liệu và hóa chất sử dụng 14

Bảng 2.2: Thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 15

Bảng 2.3: Các dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu 15

Bảng 2.4: Thành phần của môi trường MRS lỏng 15

Bảng 2.5: Các dung dịch sử dụng trong nghiên cứu 16

Bảng 3.1: Tỷ lệ phối hợp nồng độ Carrageenan, Alginat, Tinh bột 22

Bảng 3.2: Số lượng Lactobacillus acidophilus trong ba mẫu vi nang sau đông khô 23

Bảng 3.3: Hàm ẩm các mẫu vi nang sau khi đông khô 23

Bảng 3.4: Số lượng VSV sống sót trong 3 mẫu vi nang CA-1, CA-2, CA-3 trong thời gian bảo quản 24

Bảng 3.5: Kết quả thử độ rã các mẫu vi nang carrageenan-alginat trong môi trường pH dịch tiêu hoá 28

Bảng 3.6: Số lượng VSV sống sót được bảo vệ qua môi trường pH dạ dày và môi trường pH ruột non 31

Bảng 3.7: Số lượng VSV sống sót được giải phóng tại pH đại tràng 31

Bảng 3.8: Số lượng VSV sống sót được bảo vệ trong vi nang CA-3 ở môi trường SGF và SIF 33

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Vi khuẩn Lactobacillus acidophilus [52] 5

Hình 1.2: Các mô hình vi nang [4] 6

Hình 1.3: Một số mô hình vi nang probiotic [65] 6

Hình 1.4: Mô hình tạo vi nang probiotic bằng phương pháp tách pha đông tụ [33] 7

Hình 1.5: Cấu trúc hóa học của Alginat [32] 8

Hình 1.6: Mô hình vỉ trứng được tạo thành bởi Alginat và Ca2+ [18] 9

Hình 1.7: Cấu trúc hóa học của 3 loại carrageenan [20] 10

Hình 1.8: Cơ chế tạo gel của carrageenan [45] 10

Hình 3.1: Hình ảnh vi nang CA-1, CA-2, CA-3 sau khi đông khô 23

Hình 3.2: Biểu đồ thể hiện số lượng VSV sống sót trong 3 mẫu vi nang 1, 2, 3 trong thời gian bảo quản 24

CA-Hình 3.3: CA-Hình ảnh các mẫu vi nang sau 2h ủ trong môi trường pH dạ dày 29

Hình 3.4: Hình ảnh các mẫu vi nang sau 4h ủ trong môi trường pH ruột 29

Hình 3.5: Hình ảnh các mẫu vi nang sau 3h ủ trong môi trường pH đại tràng 29

Hình 3.6: Biểu đồ thể hiện số lượng VSV sống sót trong vi nang CA-3 sau khi ủ trong môi trường SGF và SIF 34

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Probiotic là nhóm sản phẩm đang sử dụng phổ biến trong lĩnh vực Dược phẩm với nhiều lợi ích sức khỏe nổi bật: ngăn ngừa nhiễm khuẩn đường ruột, phòng ngừa và điều trị các bệnh tiêu chảy, cải thiện hệ thống miễn dịch, kiểm soát và giảm cholesterol máu, giảm các triệu chứng không dung nạp lactose, phòng ngừa ung thư, [59],[39] Theo Tổ chức Nông lương Liên hợp quốc (FAO) và Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), để đạt được lợi ích sức khỏe tối đa đã được tuyên bố về chế phẩm sinh học, số lượng tế bào vi khuẩn có khả năng sống sót trong cơ thể không được thấp hơn 10⁶–10⁷ CFU/mL hoặc CFU/g [25] Tuy nhiên, số lượng vi sinh vật được đưa vào cơ thể bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như: điều kiện pH thấp trong dạ dày, hoạt động của muối mật và enzyme tiêu hóa Ngoài ra chúng còn ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố trong quá trình sản xuất, bảo quản như: độ pH, nhiệt độ, độ ẩm, nồng độ oxy [60]

Vi nang hóa là quá trình bẫy/bao bọc các tế bào vi sinh vật bằng cách bao phủ chúng bằng các hydrocolloid thích hợp để tách vi sinh vật khỏi môi trường xung quanh và giải phóng chúng ở vị trí thích hợp trong ruột [42] Trong số các nguyên liệu tạo vi nang đã được biết đến, carrageenan là một loại polyme sinh học được tách chiết từ rong biển đỏ, đã được ứng dụng do tính thân thiện với môi trường, tương thích sinh học và độc tính thấp Vi nang kết hợp Alginat – Carrageenan đã được chứng minh là có thể tận dụng khả năng tương thích sinh học rộng, tính linh hoạt, khả năng chịu nhiệt và điều kiện pH thấp [50]

Tiếp nối hướng nghiên cứu về vi nang kết hợp Alginat – Carrageenan, đề tài “Đánh

giá khả năng sống sót của Lactobacillus acidophilus trong vi nang Alginat – Carrageenan” được tiến hành với 2 mục tiêu sau:

1 Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ Carragenan và Alginat tới đặc tính của vi nang

2 Đánh giá khả năng sống sót của L acidophilus trong vi nang Alginat – Carrageenan

trong dịch tiêu hóa mô phỏng

2

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về Probiotic

1.1.1 Khái niệm Probiotic

Thuật ngữ “probiotic” có nguồn gốc từ tiếng Hy Lạp có nghĩa là “dành cho cuộc sống” và có nhiều ý nghĩa khác nhau trong nhiều năm qua Nó được Lilley và Stillwell sử dụng lần đầu tiên vào năm 1965 để mô tả “Các chất do một vi sinh vật tiết ra nhằm kích thích sự phát triển của một vi sinh vật khác” Đến năm 1974, Parker sử dụng định nghĩa “Các sinh vật và chất góp phần cân bằng vi khuẩn đường ruột” Định nghĩa này liên quan đến việc sử dụng men vi sinh đối với hệ vi sinh vật đường ruột nhưng thể hiện ý nghĩa rộng bao gồm cả kháng sinh [27] Định nghĩa về probiotic đã được sửa và thay đổi nhiều lần Đến năm 1989, Fuller đã định nghĩa lại probiotic là “Một chất bổ sung thức ăn có chứa vi sinh vật sống có ảnh hưởng có lợi đến vật chủ bằng cách cải thiện sự cân bằng vi khuẩn đường ruột của vật chủ” [25]

Hiện nay, định nghĩa khoa học được chấp nhận rộng rãi nhất do Tổ chức Nông lương Liên hợp quốc (FAO) và Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) đưa ra vào năm 2002 như sau: “Probiotic là các vi sinh vật sống khi được sử dụng với số lượng thích hợp sẽ mang lại lợi ích sức khỏe cho vật chủ” [24] Định nghĩa này được duy trì bởi Hiệp hội Khoa học Quốc tế về Probiotic và Prebiotic (ISAPP) vào năm 2013 [39]

1.1.2 Lợi ích của Probiotic đối với sức khỏe con người và cơ chế hoạt động của probiotic

Probiotic đã được sử dụng phổ biến trong nhiều thập kỉ bởi những lợi ích mà chúng mang lại đối với sức khỏe con người như: phòng ngừa và điều trị các bệnh tiêu chảy (tiêu chảy cấp tính ở trẻ sơ sinh, tiêu chảy liên quan đến kháng sinh, ), kiểm soát bệnh viêm ruột, phòng ngừa nhiễm trùng toàn thân, điều hòa miễn dịch, phòng ngừa và điều trị dị ứng, phòng ngừa ung thư, hạ cholesterol máu và giảm các triệu chứng không dung nạp lactose Trong những năm gần đây, probiotic đã được nghiên cứu rộng rãi như một lựa chọn điều trị cho nhiều bệnh khác nhau như béo phì, tiểu đường, ung thư, nhiễm virus gây suy giảm miễn dịch ở người, hội chứng ruột kích thích [59]

Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng, tác dụng có lợi của probiotic dựa trên 4 cơ chế sau: (i) Đối kháng thông qua việc sản xuất các chất kháng khuẩn [39] như bacteriocin, acid

lactic, hydro peroxide [52] (ii) Cạnh tranh với các vi sinh vật có hại về vị trí bám dính và các chất dinh dưỡng [39] (iii) Tác dụng lên hệ miễn dịch của vật chủ: Probiotic đã được chứng minh là cải thiện chức năng hàng rào miễn dịch của ruột và làm giảm bớt phản ứng viêm ruột theo cơ

1.1.3 Vi sinh vật probiotic

Các sản phẩm probiotic có thể chứa một hoặc nhiều chủng vi sinh vật được chọn lọc

chủ yếu thuộc các chi Lactobacillus, Bifidobacteria, và Lactococcus, Streptococcus,

Enterococcus Ngoài ra, các chủng vi khuẩn Gram dương thuộc chi Bacillus và một số

chủng nấm men thuộc chi Saccharomyces cũng được sử dụng phổ biến trong các sản phẩm

probiotic [39] Các chủng vi sinh vật probiotic phải đáp ứng một số tiêu chí về chức năng và an toàn để được coi là chế phẩm sinh học Tại Hoa Kỳ, vi sinh vật được sử dụng cho mục đích tiêu dùng phải có chứng nhận GRAS (Nhóm được công nhận là an toàn), do Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm (FDA) quy định [39] Các tiêu chí về chức năng bao gồm khả năng hoạt động, phát triển trong hệ tiêu hóa và cải thiện sức khỏe của vật chủ Để đảm bảo yêu cầu này, các chủng vi sinh vật probiotic phải được phân lập từ hệ tiêu hóa của người hoặc động vật Sau khi phân lập và nhận dạng, vi sinh vật phải tiến hành các thử nghiệm chức năng in vitro và sau đó là in vivo, theo hướng dẫn của FAO/WHO Các xét nghiệm in vitro chính được sử dụng để sàng lọc probiotic như sau [40]:

- Khả năng kháng acid dạ dày, khả năng kháng acid mật - Bám dính vào chất nhầy và/hoặc tế bào biểu mô của người - Có hoạt tính kháng khuẩn chống lại vi khuẩn hoặc nấm có khả năng gây bệnh - Có khả năng làm giảm sự bám dính của mầm bệnh trên bề mặt

- Có hoạt tính hydrolase muối mật, tăng cường khả năng sống sót trong các chế phẩm sinh học

1.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sống sót của vi sinh vật probiotic

Theo định nghĩa của WHO và FAO, probiotic chỉ phát huy được tác dụng có lợi khi đưa vào cơ thể với số lượng tối thiểu 6 – 7 log CFU/g [25], [55] Do đó, khả năng tồn tại của probiotic và lượng VSV trong các sản phẩm probiotic là những yếu tố quan trọng nhất khi xem xét tác dụng của chúng trong ruột [54] Tuy nhiên, do các yếu tố bất lợi trong quá

Trong quá trình sử dụng, vi sinh vật probiotic bị ảnh hưởng bởi các tác động bất lợi ở đường tiêu hóa, đặc biệt là trong dạ dày và ruột non Thông thường, vi khuẩn có lợi được tối ưu hóa để tồn tại ở điều kiện pH trong ruột người, thường là khoảng pH 6 - 7 Tuy nhiên, dịch dạ dày thường có tính acid cao (pH 1 - 3) gây ảnh hưởng đến sự tồn tại của nhiều loại VSV probiotic Nồng độ acid cao trong dạ dày làm tăng nồng độ H+ nội bào và giảm hoạt động của enzyme glycolytic bên trong vi khuẩn gây ảnh hưởng đến hoạt động của bơm proton F1F0-ATPase – bơm đóng vai trò quan trọng đối với sự sống của vi khuẩn dưới điều kiện acid Các điều kiện có thể bất lợi khác trong dạ dày bao gồm nồng độ ion cao, hoạt động của enzyme (pepsin), và sự nhào trộn cơ học, đã được chứng minh là ảnh hưởng đến khả năng sống còn của một số vi khuẩn có lợi [60] Quá trình tiêu hóa tại dạ dày kéo dài từ 5-120 phút, sau đó vi sinh vật sẽ đến ruột non Tại ruột non, các enzyme tiêu hóa và acid mật tác động tiêu cực đến khả năng tồn tại của probiotic Dịch ruột có chứa pancreatin, là một tập hợp các enzyme bao gồm trypsin, amylase, lipase và nuclease Một số nghiên cứu cho rằng pancreatin có thể có tác động tiêu cực lên tế bào probiotic nhưng cho đến nay cơ chế hoạt động của nó vẫn chưa rõ ràng [40] Acid mật có chức năng chính là thúc đẩy quá trình tiêu hóa và hấp thu lipid tại ruột non Tuy nhiên, acid mật cũng thể hiện đặc tính kháng khuẩn, hoạt động như chất tẩy rửa phá vỡ màng tế bào, cũng như các tác nhân gây tổn hại ADN Một số vi sinh vật probiotic có khả năng tổng hợp các hydrolase muối mật (BSH), giúp thủy phân acid mật thành acid mật không liên hợp và glycine Tuy nhiên, cách thức mà probiotic tương tác với acid mật trong cơ thể vẫn chưa rõ ràng Do đó, sự hiện diện của nồng độ acid mật cao trong ruột non, đặc biệt là sau khi ăn một bữa ăn nhiều chất béo, có thể làm giảm khả năng tồn tại của nhiều loại VSV probiotic [60]

1.2 Loài Lactobacillus acidophilus

Lactobacillus acidophilus thuộc họ Lactobacillaceae, chi Lactobacillus, nhóm vi

khuẩn lactic (LAB), tồn tại trong đường tiêu hóa, âm đạo của người và động vật [7] L

acidophilus ban đầu được phân lập từ phân trẻ sơ sinh vào năm 1900 và được đặt tên chính

5

thức là Lactobacillus acidophilus Sau đó, các đặc điểm và chức năng sinh học của chúng đã được nghiên cứu L acidophilus được chia thành nhiều chủng, bao gồm L acidophilus

LA-1, LA-5, NCFM và ATCC 4356, DDS-1 [28]

Đặc điểm hình thái: Lactobacillus acidophilus là trực khuẩn hình que, thuộc nhóm vi

khuẩn Gram dương, kích thước khoảng 0,6-0,9 x 1,5-6,0 μm, thường tồn tại dưới dạng đơn lẻ, xếp đôi hoặc chuỗi ngắn, không sinh bào tử, không di động, phản ứng catalase âm tính [20]

a Ảnh dưới kính hiển vi điện tử b Ảnh dưới kính hiển vi thường

Hình 1.1: Vi khuẩn Lactobacillus acidophilus [51]

Điều kiện nuôi cấy: Kỵ khí không bắt buộc; nhiệt độ phát triển tối ưu là 37-42oC, có thể phát triển ở nhiệt độ cao tới 45oC [20], không phát triển ở nhiệt độ dưới 20oC [28]; độ pH tối ưu là 5,5-6,0 và sự tăng trưởng dừng lại ở pH dưới 4,0 [20]

Cơ chế tác dụng của L acidophilus trong đường ruột chủ yếu thông qua việc điều hòa

sự cân bằng của hệ vi vi sinh vật bằng cách giảm độ pH trong ruột và sản xuất các chất chuyển hóa, chủ yếu là acid hữu cơ và hydroperoxid [29], [28] Độ pH tối ưu của nhiều vi khuẩn gây bệnh đường ruột là trung tính hoặc hơi kiềm, vì vậy acid lactic được tạo ra bởi

quá trình trao đổi chất của L acidophilus có thể làm giảm độ pH, ức chế sự phát triển và sinh sản của vi khuẩn gây bệnh L acidophilus còn có khả năng cạnh tranh với vi sinh vật

gây bệnh về chất dinh dưỡng và vị trí bám dính trên thành ruột, từ đó ức chế hoạt động của

chúng [28] Ngoài ra, L acidophilus còn sinh ra các bacteriocin chẳng hạn như lactacin B

có hoạt tính diệt khuẩn hoặc kìm khuẩn từ đó giúp phòng ngừa nhiễm khuẩn đường ruột [29]

1.3 Tổng quan về vi nang

1.3.1 Khái niệm về vi nang

Vi nang (microcapsule) là những tiểu phân hình cầu hoặc không xác định, kích thước từ 1 tới 5000 µm (trong thực tế thường điều chế vi nang trong khoảng 100 – 2000 µm) [4] Vi nang được cấu tạo bởi hai phần: phần nhân gồm một hoặc hai dược chất (ít khi gồm nhiều dược chất) Dược chất có thể ở trạng thái rắn, lỏng hoặc dưới dạng một nhũ tương,

6

hỗn dịch, có thể có thêm các chất phụ nhằm mục đích ổn định hoặc điều chỉnh tốc độ giải phóng dược chất Phần vỏ vi nang thường là các hợp chất cao phân tử có nguồn gốc thiên nhiên hoặc tổng hợp [3]

Hình 1.2: Các mô hình vi nang [4]

1.3.2 Vi nang probiotic

Vi nang hóa probiotic là một trong những phương pháp cố định tế bào được sử dụng rộng rãi hiện nay, trong đó chất được bẫy là các tế bào VSV sống; phần vỏ là các polymer có nguồn gốc tự nhiên như gelatin, alginat, chitosan, cellulose hoặc có nguồn gốc nhân tạo như polyamid, polystyren, polyacrylat, polyacrylamid, polyester, polyethylen glycon tạo nên màng mỏng, bề dày từ 0,1 đến 200,0 μm [3]

Hình 1.3: Một số mô hình vi nang probiotic [63]

Hiện nay, có rất nhiều phương pháp được sử dụng để tạo vi nang probiotic: phương pháp tách pha đông tụ, phương pháp nhũ tương hóa, phương pháp phun sấy, phương pháp phun điện, [22], [53], [38] Phương pháp vi nang hóa được đánh giá là có hiệu quả do duy

7

trì được độ ổn định của probiotic trong quá trình bảo quản, bảo vệ chúng khỏi các tác động bất lợi ở hệ tiêu hóa trên, giải phóng chúng ở ruột và phát huy khả năng bám dính bề mặt niêm mạc [60]

Phương pháp tách pha đông tụ là một phương pháp đơn giản và được sử dụng rộng rãi cho chế phẩm sinh học [58] do chi phí thấp, thao tác nhẹ nhàng, giảm tổn hại đến vi sinh vật và khả năng sống sót của vi sinh vật tương đối cao Quy trình được thực hiện bằng cách thêm các tế bào vi sinh vật vào dung dịch hydrocolloid và nhỏ giọt qua máy phun hoặc kim Sau đó, các giọt rơi tự do vào dung dịch đông tụ để tạo thành các mạng ba chiều, trong đó các tế bào bị giữ lại bởi các polymer Thông thường, đường kính của hạt tạo thành lớn hơn so với phương pháp nhũ tương hóa trong cùng điều kiện Đường kính hạt có thể được điều chỉnh bằng cách thay đổi các thông số như loại polymer, độ nhớt và nồng độ của dung dịch polymer cũng như khoảng cách giữa kim và dung dịch đông tụ [63]

Hình 1.4: Mô hình tạo vi nang probiotic bằng phương pháp tách pha đông tụ [32] 1.4 Nguyên liệu tạo vi nang probiotic

1.4.1 Một số tiêu chí lựa chọn vật liệu tạo vi nang

Việc lựa chọn vật liệu tạo vi nang là rất quan trọng bởi nó quyết định hiệu quả bảo vệ và duy trì độ ổn định cho sự tồn tại của vi sinh vật Do vậy, vật liệu tạo vi nang lý tưởng cần đáp ứng một số tiêu chí như sau [63]:

- Bảo vệ vi sinh vật trong quá trình sản xuất - Bảo vệ vi sinh vật khỏi các bất lợi từ môi trường - Khả năng định hình tốt

- Giải phóng chậm hoặc giải phóng có kiểm soát trong các điều kiện cụ thể - Có khả năng tương thích sinh học, không độc hại

1.4.2 Alginat

Alginat là một polysaccharide có nguồn gốc tự nhiên được chiết xuất từ tảo nâu [59], được nghiên cứu và sử dụng rộng rãi cho nhiều ứng dụng y sinh, do tính tương thích sinh học, độc tính thấp, chi phí thấp và sự tạo gel bằng cách liên kết với các cation hóa trị hai [36]

Alginat bao gồm hai đơn vị monosaccharide: β-D-mannuronic (M) và α-L-guluronic (G) liên kết với nhau bằng liên kết 1-4-glycosid [43] Bằng phản ứng thủy phân một phần trong môi trường acid, phân tử alginat có thể được tách thành ba phần liên tiếp: manuronics (MMMMM), glucuronics (GGGGG) và hỗn hợp các phần manuronic với glucuronics (MGMGMG) [26] Alginat chiết xuất từ các nguồn khác nhau dẫn đến sự khác nhau về hàm lượng M và G cũng như độ dài của mỗi khối [36]

Hình 1.5: Cấu trúc hóa học của Alginat [31]

Phương pháp để điều chế hydrogel từ dung dịch alginat là kết hợp với các cation hóa trị hai (Ca2+, Ba2+) tạo nên mô hình dạng “vỉ trứng” Tuy nhiên, chỉ các khối G của alginat được cho là có tham gia liên kết ngang liên phân tử với các cation hóa trị hai (ví dụ Ca2+) để tạo thành hydrogel [36] Vì vậy alginat có hàm lượng G cao sẽ tạo thành gel cứng, xốp hơn và duy trì được tính toàn vẹn trong thời gian dài hơn Ngược lại, alginat có hàm lượng M cao tạo thành gel mềm và ít xốp hơn, dễ phân hủy theo thời gian [59]

9

Hình 1.6: Mô hình vỉ trứng được tạo thành bởi Alginat và Ca2+ [17]

Để hòa tan alginat trong nước, cần phải tăng nhiệt độ từ 60°C đến 80°C Gel alginat không hòa tan trong môi trường acid và có khả năng chịu được pH thấp hơn 2, vì vậy vi nang alginat có khả năng bảo vệ probiotic trước điều kiện acid môi trường [30]

Hiện nay, alginat được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như: công nghệ sinh học, kỹ thuật sinh học, y sinh, ứng dụng lâm sàng, công nghiệp dược phẩm, công nghiệp hóa chất, dệt may, thực phẩm, [34]

Mặc dù natri alginat thích hợp để đóng gói nhưng hạt thu được khá xốp và nhạy cảm với môi trường pH cao (pH ruột) ảnh hưởng đến cả sự giải phóng và bảo vệ vi sinh vật [52] [23] Do vậy alginat thường được kết hợp với các vật liệu khác để thu được vi nang có cấu trúc ổn định nhất [35]

1.4.3 Carrageenan

Carrageenan là một polysaccharide có trọng lượng phân tử cao được chiết xuất từ rong biển đỏ, được hình thành bởi đơn vị xen kẽ của D-galactose và 3,6-anhydro-galactose bằng các liên kết: α-1,3-glycosid và β-1,4-glycosid Carrageenan chứa từ 15% đến 40% hàm lượng ester-sulphate, vì vậy nó là một polysaccharide anion Carrageenan có thể được phân thành sáu dạng cơ bản tùy thuộc vào hàm lượng sunfat, nguồn chiết xuất và độ hòa tan của chúng: kappa (κ-), iota (ɩ-), lamda (λ-), mu (μ-), nu (ν-), beta (β-), và Theta (θ-) carrageenan Trong đó, 3 loại carrageenan quan trọng nhất được áp dụng trong lĩnh vực dược phẩm và thương mại là κ-carrageenan, ɩ-carrageenan và λ-carrageenan [44]

10

Hình 1.7: Cấu trúc hóa học của 3 loại carrageenan [19]

Độ tan của carrageenan bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố khác nhau, chẳng hạn như nhiệt độ, pH, sự có mặt của các chất hòa tan khác, loại carrageenan (nhóm sunfat) và các cation liên kết với chúng (như K+ , Ca2+ ) [44]

Khả năng tạo gel là một trong những đặc tính quan trọng nhất đối với ứng dụng dược phẩm của carrageenan Carrageenan có khả năng tạo gel ở nồng độ thấp (nhỏ hơn 0,5%) [13] Trong 3 loại carrageenan, κ- và ι-carrageenan có khả năng tạo gel, trong khi λ-carrageenan không có khả năng tạo gel [45] Ở dạng gel, các mạch polysaccharid xoắn vòng như lò xo và cũng có thể xoắn với nhau tạo thành khung xương không gian ba chiều vững chắc, bên trong có khả năng chứa VSV [13] κ-carrageenan do tạo thành gel cứng và giòn với ion kali, trong khi ion canxi kém hiệu quả tạo gel hơn, tuy nhiên, sự kết hợp của cả hai ion sẽ tạo ra một loại gel mạnh ι-carrageenan kết hợp tốt nhất với các ion canxi tạo ra gel mềm và dẻo với độ ổn định trong quá trình đông lạnh [44] Sự tạo gel của carrageenan được tạo ra bởi sự thay đổi nhiệt độ Carrageenan sẽ được hòa tan khi tăng đến nhiệt độ từ 60°C đến 80°C và quá trình tạo gel xảy ra bằng cách làm lạnh đến nhiệt độ phòng [30]

Hình 1.8: Cơ chế tạo gel của carrageenan [44]

Carrageenan đã được FDA “công nhận chung là an toàn” (GRAS) kể từ năm 1973 [44]

1.4.4 Tinh bột

Tinh bột là một loại polysaccharid tự nhiên, thường được tìm thấy trong các loại đậu, ngũ cốc và các loại cây lấy củ Tinh bột được tạo thành từ các đơn vị D-glucose được liên kết với nhau bằng các liên kết glycosid α-1,4-glycosid và α-1,6-glycosid [62]

Tinh bột là tá dược độn phổ biến vì giá thành rẻ, không độc hại, và có khả năng phân hủy sinh học Việc bổ sung tinh bột có thể làm tăng độ bền cơ học của vi nang và cải thiện khả năng sống sót của vi khuẩn trong quá trình tạo hạt, đông khô và bảo quản Sự phân bố đồng đều của tinh bột tạo ra các hạt đồng nhất với bề mặt nhẵn và tạo ra độ cầu cho hạt sau khi đông khô vì tinh bột có khả năng lấp đầy tất cả các khoảng trống bên trong hạt [59] Vì vậy, tinh bột thường được sử dụng phổ biến làm vật liệu đóng gói probiotic [48], [33]

1.5 Một số hướng ứng dụng của Carrageenan hiện nay

Trong ngành công nghiệp thực phẩm, Carrageenan được sử dụng rộng rãi do những tính chất vật lý đặc biệt: khả năng tạo gel, làm đặc, nhũ hóa và ổn định, nên đã được sử dụng để cải thiện kết cấu của phô mai, bánh pudding, món tráng miệng từ sữa, cũng như chất kết dính và chất ổn định trong ngành chế biến thịt để sản xuất xúc xích, chả, Ngoài các ứng dụng công nghiệp thực phẩm, carrageenan còn được sử dụng trong kem đánh răng, bọt chữa cháy, kem mỹ phẩm, dầu gội và xi đánh giày [37] Trong những năm gần đây, carrageenan ngày càng được sử dụng rộng rãi trong trong nhiều công thức dược phẩm khác nhau, bao gồm: viên nén, thuốc đặt, màng film, pellet, hạt nano, hydrogel, thuốc tiêm, Ngoài ra, các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng carrageenan là nguyên liệu có nhiều tiềm năng trong kỹ thuật mô, nhờ tính tương đồng của chúng với glycosaminoglycans tự nhiên [44]

Carrageenan đã được đưa vào Dược Điển Hoa Kỳ 35- Danh mục thuốc quốc gia 30 S1 (USP35-NF30 S1), Dược điển Anh 2012 (BP2012) và Dược điển Châu Âu 7.0 (EP7.0), điều đó thể hiện rằng carrageenan có tiềm năng được sử dụng như một tá dược dược phẩm [37]

12

Hiện nay, Carrageenan được ứng dụng trong các hệ giải phóng thuốc do ba đặc điểm đặc biệt trong cấu trúc của nó: (i) liên kết glycosid bị phân cắt bởi các enzyme hydrolase, tạo ra khả năng phân hủy sinh học; (ii) các nhóm sunfat trong carrageenan là anion và tăng cường hoạt động của các chất điện ly; (iii) có các nhóm hydroxyl tạo ra các tương tác cần thiết để tạo ra các biến đổi hóa học [44] Các ứng dụng trong hệ giải phóng thuốc có thể kể đến như: polymer trong viên nén giải phóng kéo dài, tá dược tạo cầu trong quá trình sản xuất pellet, chất mang/chất ổn định trong các vi hạt/hạt nano [37]

1.6 Một số nghiên cứu tạo vi nang từ Carrageenan Trên thế giới

Năm 2022, Muhammad Azam và cộng sự đã nghiên cứu tạo vi nang chứa L brevis bằng phương pháp tách pha đông tụ, sử dụng nguyên liệu là hỗn hợp carrageenan - alginat với các nồng độ khác nhau: T0 (0%: 0%) T1 (0,01%:1,5%), T2 (0,02%:1,5%), T3 (0,03%:1,5%), T4 (0,04%:1,5%), T5 (0,05%:1,5% ) và dung dịch CaCl2 Vi nang tạo thành được đánh giá về: (i) hiệu suất bao gói vi sinh vật; (ii) khả năng giải phóng vi sinh vật; (iii) khả năng sống sót của vi sinh vật trong vi nang ở các điều kiện mô phỏng đường tiêu hóa; (iv) độ ổn định bảo quản trong thời gian 0 - 28 ngày Kết quả cho thấy việc bổ sung carrageenan đã cải thiện cấu trúc của hạt và khả năng sống sót của vi sinh vật: T3 có hiệu suất bao gói cao nhất (93,72% ±0,14%); T4 có độ ổn định bảo quản tốt nhất sau 28 ngày (9.78 ± 0.61 CFU/mL); T5 cho tác dụng bảo vệ vi sinh vật tốt nhất trong điều kiện mô phỏng đường tiêu hóa nhưng thời gian giải phóng chậm hơn so với các nồng độ khác [16]

Năm 2024, Muhammad Saeed và cộng sự đã nghiên cứu tạo vi nang chứa Lactobacillus

acidophilus và Lacticaseibacillus casei bằng phương pháp nhũ tương hoá, sử dụng nguyên

liệu hỗn hợp carrageenan – alginat ở các nồng độ khác nhau: T1 (0%; 2%), T2 (0,5%; 1,5%), T3 (1%; 1%) được nhũ hóa trong dầu hạt cải Vi nang tạo thành được đánh giá về: (i) hiệu suất bao gói vi sinh vật; (ii) khả năng sống sót của vi sinh vật trong vi nang trong môi trường dịch dạ dày mô phỏng, dịch ruột mô phỏng và dung dịch muối mật; (iii) độ ổn định bảo quản trong thời gian 0 - 28 ngày Kết quả cho thấy các vi hạt (T3) đã chứng minh hiệu quả đóng gói cao nhất, đạt mức 95% T3 cũng thể hiện khả năng bảo vệ vi sinh vật tốt nhất với số lượng lần lượt là 8,5, 8,8 và 8,9 log CFU/g sau 80 phút tiếp xúc với dịch dạ dày mô phỏng, dịch ruột mô phỏng và dung dịch muối mật [50]

Tại Việt Nam

Năm 2023, Khổng Thị Ngọc Anh, trường Đại học Dược Hà Nội đã nghiên cứu tạo vi

nang chứa Lactobacillus acidophilus bằng phương pháp tách pha đông tụ Nguyên liệu tạo

vi nang là sự phối hợp Carrageenan và Alginat với các tỷ lệ khác nhau: CA-1 (0,5%;2%),

13

CA-2 (1%;1,5%), CA-3 (1,5%;1%) và được bổ sung tinh bột, sau đó nhỏ vào dung dịch CaCl2 3% Vi nang tạo thành được đánh giá về khả năng bao gói vi sinh vật sau đông khô Kết quả cho thấy cả 3 mẫu được khảo sát đều đáp ứng được yêu cầu về chế phẩm probiotic: số lượng VSV trong các mẫu CA-1, CA-2, CA-3 lần lượt là 6,78; 7,65 và 8,34 log CFU/g [1]

Năm 2023, Bounthavy Phengsavatdy, trường Đại học Dược Hà Nội đã nghiên cứu tạo vi nang carrageenan 1,2% với dung dịch đông tụ là KCl 3% và CaCl2 3% Vi nang tạo thành được khảo sát về độ rã ở pH 1,2; pH 6,8; pH 7,4 Kết quả cho thấy vi nang được tạo bởi dung dịch KCl rã sau 90 phút ở pH 7,4 và phát hiện được VSV giải phóng bằng cách soi trên kính hiểu vi; vi nang tạo ra từ dung dịch CaCl2 gần như rã hết sau 2h ở pH 1,2 [6]

14

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu và thiết bị

15

2.1.2.2 Thiết bị

Bảng 2.2: Thiết bị sử dụng trong nghiên cứu Tên thiết bị Nguồn gốc Tên thiết bị Nguồn gốc

Môi trường MRS thạch: MRS thạch = MRS lỏng + thạch 2% (20g/1000 ml môi trường)

16

2.1.4 Các dung dịch sử dụng trong nghiên cứu

Bảng 2.5: Các dung dịch sử dụng trong nghiên cứu

STT Các dung dịch sử dụng Cách pha chế

1 Dung dịch Calci clorid 3% (kl/tt) Cân 3,00 g CaCl2 hòa tan hoàn toàn trong nước

cất vừa đủ 100 ml 3 Dung dịch Natri citrat 2% (kl/tt) Cân 2,00 g Natri citrat hòa tan hoàn toàn trong

nước cất vừa đủ 100 ml 4 Dung dịch Natri clorid 0,9% (kl/tt) Cân 0,90 g NaCl hòa tan hoàn toàn trong nước

8 Dung dịch pH 7,4 [5]

Hoà tan 0,6 g kali dihydrophosphat, 6,4 g dinatri hydrophosphat và 5,85 g natri clorid trong nước vừa đủ 1000 ml

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ Carragenan và Alginat tới đặc tính của vi nang 2.2.2 Đánh giá khả năng sống sót của L acidophilus trong vi nang Alginat – Carrageenan trong dịch tiêu hóa mô phỏng

- Đánh giá độ rã của vi nang trong môi trường pH dịch tiêu hóa - Đánh giá khả năng sống sót của VSV được bảo vệ và giải phóng trong các môi trường pH dịch tiêu hóa

- Đánh giá khả năng sống sót của VSV trong vi nang ở môi trường dịch dạ dày và dịch ruột mô phỏng

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp tiệt khuẩn [5]

❖ Phương pháp tiệt khuẩn nhiệt ẩm

Tiệt khuẩn dụng cụ và chất lỏng bằng phương pháp tiệt khuẩn nhiệt ẩm Chất lỏng được đựng trong ống nghiệm có nút kín hoặc bình nón đậy kín bằng nút bông không thấm