lê thị thu hương sàng lọc tác dụng ức chế enzym tyrosinase in vitro của một số dược liệu

ENZYM TYROSINASE IN VITRO CỦA

LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin phép được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới ThS Nguyễn Thị Phượng - khoa Dược lý – Sinh hóa, Viện Dược liệu, cô là người đã trực

tiếp hướng dẫn, giúp đỡ, dìu dắt em xuyên suốt trong quá trình thực hiện đề tài khóa luận tốt nghiệp

Tiếp đến em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS Hoàng Thị tuyết Nhung – bộ môn Hóa đại cương -Vô cơ, cô đã giúp đỡ em rất nhiều trong suốt quá trình hoàn thành đề

tài khóa luận tốt nghiệp

Em xin cảm ơn TS Hà Vân Oanh bộ môn Dược học Cổ truyền trường Đại học

Dược Hà Nội Cô đã tạo điều kiện cho phép em được tiếp cận tham gia nghiên cứu khoa học, cảm ơn sự động viên và quan tâm sát sao của cô trong quá trình em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

Em cũng xin chân thành cảm ơn PGS.TS Nguyễn Thu Hằng - bộ môn Dược liệu

đã tạo điều kiện tối đa về cơ sở vật chất cho em hoàn thành việc nghiên cứu thực nghiệm của đề tài khóa luận tốt nghiệp

Em xin trân trọng gửi lời cảm ơn đến Ban Giám đốc Viện Dược liệu, cô PGS.TS Phạm Thị Nguyệt Hằng-trưởng khoa Dược lý-Sinh hóa, các anh chị cán bộ khoa Dược

lý- Sinh hóa đã tạo điều kiện và giúp đỡ cho em trong suốt quá trình thực hiện nghiên cứu

Em cũng xin được gửi lời cảm ơn chân thành đến CN Nguyễn Văn Hiệp, DS Lều Khánh Duy, CN Nguyễn Linh Chi đã nhiệt tình hỗ trợ, đóng góp ý kiến giúp em

hoàn thành khóa luận này Em xin cảm ơn Viện dược liệu đã tài trợ kinh phí để em thực hiện đề tài này thông qua đề tài cơ sở “Sàng lọc tác dụng ức chế enzym tyrosinase invitro của một số dược liệu Việt Nam”

Cuối cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè đã luôn bên cạnh động viên, quan tâm và là chỗ dựa vững chắc khi em gặp khó khăn trong học tập và cuộc sống

Em xin chân thành cảm ơn!

MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VÀ KÝ HIỆU VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về tyrosinase 2

1.1.1 Enzym tyrosinase và con đường hình thành hắc tố melanin 2

1.1.1.1 Cấu trúc và đặc tính sinh hóa của enzym tyrosinase 2

1.1.1.2 Rối loạn sắc tố da và quá trình hình thành hắc tố melanin 4

1.1.2 Vai trò và các chất ức chế enzym tyrosinase 6

1.1.3 Các nghiên cứu đánh giá tác dụng ức chế TYR invitro từ dược liệu 9

1.2 Tổng quan về các dược liệu tiềm năng ức chế TYR trong nghiên cứu 10

1.2.1 Tổng quan về Cốt khí củ (Reynoutria japonica – Polygonaceae) 10

1.2.2.4 Hoài sơn và các nghiên cứu về tác dụng của nó 12

1.2.3 Tổng quan về Nho (Vitis vinifera - Vitaceae) 13

1.2.3.1 Thực vật học 13

1.2.3.2 Thành phần hóa học 13

1.2.3.3 Tác dụng 14

1.2.3.4 Nho và tác dụng ức chế enzym tyrosinase 14

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1 Đối tượng nghiên cứu 15

2.2 Nguyên vật liệu, thiết bị 18

2.2.1 Hóa chất và dung môi 18

2.2.2 Dụng cụ, thiết bị nghiên cứu 18

2.3 Nội dung nghiên cứu 19

2.4 Phương pháp nghiên cứu 19

2.4.1 Phương pháp chiết xuất dược liệu 19

2.4.2 Phương pháp sàng lọc tác dụng ức chế hoạt tính TYR 19

2.4.2.1 Chuẩn bị dung dịch đệm Kali phosphat 0,05M pH 6.8 19

2.4.2.2 Chuẩn bị mẫu thử 19

2.4.2.3 Chuẩn bị cơ chất L-tyrosin 20

2.4.2.4 Chuẩn bị enzym tyrosinase 20

2.4.2.5 Cách tiến hành khảo sát khả năng ức chế enzym tyrosinase in vitro 20

2.4.3 Phương pháp xác định giá trị IC50 của các mẫu dược liệu tiềm năng nhất 21 2.5 Phương pháp phân tích và xử lý số liệu 22

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ 23

3.1 Kết quả chiết xuất cao dược liệu 23

3.2 Kết quả sàng lọc các mẫu cao chiết có khả năng ức chế hoạt tính enzym tyrosinase 25

3.3 Kết quả giá trị IC50 của các cao chiết tiềm năng ức chế enzym tyrosinase 28

DANH MỤC CÁC CHỮ VÀ KÝ HIỆU VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1: Danh mục các dược liệu được đưa vào nghiên cứu sàng lọc dược liệu có tác

dụng ức chế TYR 15

Bảng 2.2: Thành phần phản ứng trong thí nghiệm sàng lọc ức chế TYR 20 Bảng 3.1: Kết quả chiết xuất cao các dược liệu được đưa vào nghiên cứu sàng lọc dược

liệu có tác dụng ức chế enzym tyrosinase 23

Bảng 3.2: Khả năng ức chế enzym tyrosinase của các cao chiết ở nồng độ 200

µg/mL 25

Bảng 3.3: Bảng dãy nồng độ và phần trăm ức chế tương ứng của các mẫu cao chiết 28 Bảng 3.4: Giá trị IC50 của các cao chiết tiềm năng 32

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Cấu trúc không gian của enzym tyrosinase 3

Hình 1.2: Cấu trúc của 3 loại enzym tyrosinase 3

Hình 1.3: Các rối loạn về da 4

Hình 1.4: Sơ đồ quá trình tạo thành melanin trong tế bào hắc tố 5

Hình 3.1: Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của phần trăm ức chế TYR theo nồng độ của các mẫu cao chiết và chất chứng dương acid kojic 30

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Tyrosinase (TYR), còn được gọi là polyphenol oxyase, là một enzym chứa đồng (Cu) với nhiều chức năng, phổ biến ở nhiều sinh vật bao gồm động vật, thực vật và vi sinh vật [18] TYR xúc tác hai bước đầu tiên trong quá trình hình thành hắc tố ở động vật có vú do đó có vai trò rất lớn trong việc điều trị các rối loạn về da như nám, tàn nhang, đốm đen và tăng sắc tố [22] Bên cạnh đó, TYR xúc tác tạo ra các hợp chất quinon làm rau quả bị thâm Do vậy, chất ức chế TYR cũng giúp cải thiện được chất lượng và giá trị dinh dưỡng của thực phẩm Sự tăng sắc tố trên da người cũng như hiện tượng hóa nâu trái cây do enzym đều là những vấn đề không mong muốn và cần có giải pháp xử lý [9]

Hiện nay nhiều sản phẩm làm sáng da, chữa các rối loạn về tăng sắc tố da sử dụng các hoạt chất là các chất ức chế TYR Tuy nhiên, những hoạt chất ức chế TYR như hydroquinon (HQ), arbutin và acid kojic (KA) lại không an toàn đối với sức khỏe con người [13], [53] Do đó, các nhà nghiên cứu đã và đang liên tục tìm kiếm các chất ức chế TYR mới để sử dụng trong công nghiệp thực phẩm và mỹ phẩm [9]

Việt Nam là một quốc gia đang phát triển có đặc điểm đa dạng sinh học phong phú Nền y học cổ truyền của đất nước ta đã đang và sẽ tiếp tục phát triển, đóng vai trò quan trọng trong việc chữa bệnh và cải thiện sức khỏe con người Một vài trong số các dược liệu của nước ta có thể là ứng cử viên sáng giá cho việc phát triển các chất ức chế TYR mới và có khả năng nghiên cứu thành các sản phẩm dược mỹ phẩm có tác dụng làm trắng da hay các chế phẩm giúp bảo quản chất lượng rau củ quả Tuy nhiên, cho đến nay,

có rất ít báo cáo được công bố về hoạt động ức chế TYR invitro của dược liệu Việt Nam

Vì vậy, để tìm kiếm các dược liệu có khả năng ức chế TYR và hướng đến việc khám phá những tiềm năng mới của dược liệu Việt Nam trong điều trị rối loạn sắc tố da, nghiên cứu các sản phẩm làm trắng da hoặc cải thiện chất lượng của một số loại thực

phẩm, chúng tôi đã thực hiện đề tài “Sàng lọc tác dụng ức chế enzym tyrosinase invitro

của một số dược liệu” với hai mục tiêu như sau:

1 Sàng lọc một số mẫu dược liệu để tìm ra các dược liệu có tác dụng ức chế TYR 2 Xác định nồng độ ức chế 50 % hoạt tính enzym tyrosinase (IC50) của các dược

liệu tiềm năng

2

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về tyrosinase

1.1.1 Enzym tyrosinase và con đường hình thành hắc tố melanin

1.1.1.1 Cấu trúc và đặc tính sinh hóa của enzym tyrosinase

Enzym tyrosinase, còn được gọi là polyphenol oxyase, là một enzym chứa đồng (Cu) với nhiều chức năng, phổ biến ở nhiều sinh vật bao gồm động vật, thực vật và vi sinh vật [18]

TYR chỉ được sản xuất bởi các tế bào melanocyt Sau khi được sản xuất và xử lý trong lưới nội chất và bộ máy golgi, nó được chuyển thành melanosom [60] Oxy phân tử được tích hợp vào trung tâm phân tử để tạo thành oxy-tyrosinase hoạt động Tại vị trí hoạt động, hai ion đồng tương tác với dioxygen tạo thành chất trung gian có tính phản ứng cao, tham gia trực tiếp vào quá trình hydroxyl hóa monophenol thành diphenol (hoạt tính monophenolase) và oxy hóa o-diphenol thành o-quinone (hoạt tính diphenolase) [14], [29]

Thuật ngữ tyrosinase được dùng để chỉ ra rằng chất nền điển hình của nó là tyrosin

dù enzym này có ái lực cao hơn với các đồng phân L của cơ chất so với các đồng phân

D tương ứng TYR có nguồn gốc từ Streptomyces glausescens , nấm Neurospora

crassa và Agaricus bisporus thì cho hoạt tính tốt nhất Ở nấm và động vật có xương

sống, TYR xúc tác bước đầu tiên trong quá trình hình thành sắc tố melanin từ tyrosin Ở thực vật, nhiều loại phenolic là cơ chất của TYR Khi các mô bị tổn thương, TYR oxy hóa chúng theo con đường hóa nâu, gây giảm chất lượng và giá trị dinh dưỡng TYR

được chiết xuất từ nấm A bisporus rất tương đồng với TYR của động vật có vú, do đó

nó rất phù hợp làm mô hình cho các nghiên cứu về quá trình hình thành hắc tố Trên thực tế, hầu hết các nghiên cứu về chất ức chế TYR được thực hiện cho đến nay đều sử dụng TYR từ nấm vì loại TYR này có sẵn trên thị trường [9]

Đặc điểm chung quan sát thấy ở TYR từ các nguồn khác nhau đó là liên kết đồng ở trung tâm được bảo tồn [63], [76] Từ quan điểm cấu trúc, hai ion đồng được bao quanh bởi 6 gốc histidin chịu trách nhiệm cho hoạt động xúc tác của TYR [57]

3

Hình 1.1: Cấu trúc không gian của enzym tyrosinase

Trong quá trình hình thành hắc tố melanin, có ba loại TYR (oxy-, met- và deoxytyrosinase, hình 1.2) với các cấu trúc hai ion đồng tại vị trí hoạt động khác nhau

oxy, chứa hai ion đồng (II) liên kết với nhau thông qua một cầu nối, các phối tử hydroxid

(I) với cách sắp xếp phối hợp tương tự như dạng met, nhưng không có cầu hydroxid TYR thu được sau khi tinh chế (tức là dạng nghỉ của enzym) chính là hỗn hợp của 85 %

Hình 1.2: Cấu trúc của 3 loại enzym tyrosinase

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng hoạt tính xúc tác tối đa của TYR được quan sát thấy ở pH 7 và khoảng 50 % mức hoạt tính xúc tác tối đa được quan sát thấy ở pH từ 5 đến 8,

4

enzym TYR tương đối không ổn định ở pH thấp và ở nhiệt độ cao [25] TYR được biết đến như một enzyme chủ chốt trong bước kiểm soát quá trình hình thành hắc tố [53]

1.1.1.2 Rối loạn sắc tố da và quá trình hình thành hắc tố melanin

Melanin, một sắc tố chính trong da của động vật có vú, được biết đến có tác dụng bảo vệ da khỏi tác hại của tia cực tím, stress oxy hoá và tổn thương DNA Sự tích tụ hoặc sản xuất quá mức melanin có thể gây ra các vấn đề về thẩm mỹ cũng như các bệnh nghiêm trọng liên quan đến chứng tăng sắc tố

Melanin giúp điều chỉnh màu da, giảm sắc tố là tình trạng bệnh lý khi cơ thể sản xuất ít melanin hơn; mặt khác, tăng sắc tố là sự gia tăng tổng hợp melanin [58], [67] Do vậy, màu da của một người có thể thay đổi, trở nên trắng sáng hơn (giảm sắc tố), như trong hình 1.3: A, B; hoặc sẫm màu hơn (tăng sắc tố), như trong hình 1.3: C, D

Hình 1.3: Các rối loạn về da

Các bệnh liên quan đến tăng sắc tố da bao gồm nám, tàn nhang, đốm nắng, tăng sắc tố sau viêm và đốm đồi mồi Tăng sắc tố sau viêm xuất hiện ở nhiều tình trạng da, bao gồm mụn trứng cá, chàm và viêm da tiếp xúc [51] Nguyên nhân thường gặp nhất của chứng tăng sắc tố là do tiếp xúc với ánh nắng mặt trời - tác nhân kích thích sản xuất melanin [70]

❖ Các phương pháp có thể dùng để điều trị tăng sắc tố da bao gồm:

+ Sử dụng thuốc điều trị: Thuốc uống và kem bôi: Thuốc uống có tác dụng mạnh hơn các loại kem bôi và không cần phải bôi thường xuyên Tuy nhiên, thuốc uống khá đắt tiền và gây ra nhiều tác dụng phụ hơn so với các liệu pháp bôi tại chỗ [8]

5

+ Sử dụng các dược liệu thiên nhiên: Các hợp chất có nguồn gốc từ thảo dược giúp cải thiện độ sáng của da đang được quan tâm vì chúng được cho là an toàn và tốt cho sức khỏe hơn các sản phẩm tổng hợp hoàn toàn [30] Các kem bôi da, thực phẩm chức năng hỗ trợ làm sáng da đã và đang ngày càng trở nên phổ biến trong chăm sóc sắc đẹp + Sử dụng công nghệ hiện đại: liệu pháp laser đã và đang được ưa chuộng trong việc điều trị các vấn đề về sắc tố da [70]

❖ Quá trình hình thành hắc tố

Bước đầu tiên của quá trình hình thành hắc tố melanin là sự oxy hóa tyrosin thành dopaquinon, phản ứng này được xúc tác bởi TYR Đây là bước giới hạn tốc độ trong quá trình tổng hợp melanin vì các phản ứng còn lại của chuỗi phản ứng có thể diễn ra một cách tự nhiên ở giá trị pH sinh lý [19] Tiếp theo, Dopaquinon được chuyển thành dopa và dopachrom thông qua quá trình oxy hóa tự động Dopa cũng là cơ chất của TYR bởi vì TYR oxy hóa dopa trở lại thành dopaquinon Thông qua một vài phản ứng hóa học, dopachrom biến đổi tạo ra dihydroxyindole (DHI) và axit dihydroxyindole-2-carboxylic (DHICA) Cuối cùng, eumelanin được hình thành thông qua một loạt các phản ứng oxy hóa từ DHI và acid DHICA

Nếu có mặt của cystein hoặc glutathion, dopaquinon được chuyển thành cysteinyldopa hoặc glutathionyldopa, sau đó tạo ra pheomelanin Ngoài eumelanin và pheomelanin, các “melanin” khác được gọi là allomelanin [9]

Hình 1.4: Sơ đồ quá trình tạo thành melanin trong tế bào hắc tố

6

Các chất ức chế tổng hợp melanin được sử dụng tại chỗ để điều trị chứng tăng sắc tố cục bộ ở người [72], các chất này có tầm quan trọng rất lớn trong việc phát triển các sản phẩm dược phẩm, mỹ phẩm và công nghiệp thực phẩm [79]

1.1.2 Vai trò và các chất ức chế enzym tyrosinase

❖ Vai trò của ức chế TYR

TYR có tầm quan trọng rất lớn trong việc điều trị các rối loạn về da như nám, tàn nhang, đốm đen và tăng sắc tố [22] Bởi vì trong con đường sinh tổng hợp melanin, TYR xúc tác hai bước đầu tiên có tốc độ giới hạn, do đó việc ức chế enzym này cũng có thể ngăn chặn sự tích tụ của các chất trung gian phản ứng [68]

Ở thực vật, TYR xúc tác tạo ra các hợp chất quinon làm rau quả bị thâm Không chỉ ảnh hưởng tới màu sắc mùi vị của hoa quả mà các hợp chất quinon sinh ra còn có thể làm giảm hoặc mất giá trị dinh dưỡng, dẫn đến việc không sử dụng được gây lãng phí nguồn thực phẩm [69] Ức chế TYR cũng có tác dụng trong điều trị các bệnh thoái hóa thần kinh như bệnh Parkinson Việc sản xuất quá nhiều TYR được cho là có thể dẫn đến sự gia tăng dopamin nội bào, tạo ra một lượng lớn melanin và do đó gây chết tế bào [21]

Vậy nên các chất ức chế TYR có vai trò rất quan trọng trong mỹ phẩm, dược phẩm và công nghiệp thực phẩm Cho đến nay, mặc dù có nhiều chất ức chế TYR nhưng chỉ có một số ít được bán trên thị trường là an toàn [10] Vì vậy, việc tìm kiếm các chất ức chế TYR mới có ý nghĩa quan trọng trong việc điều trị tăng sắc tố, phát triển các chất làm trắng da và sử dụng làm chất bảo quản trong công nghiệp thực phẩm [59]

❖ Các chất ức chế TYR

Do cấu trúc, chức năng của enzym đã được xác định rõ ràng, việc ức chế TYR là mục tiêu chính để điều trị tình trạng tăng sắc tố [42] Hầu hết các loại mỹ phẩm hoặc chất làm sáng da có bán trên thị trường đều có thành phần là chất ức chế TYR Các chất ức chế melanin nhắm vào đích TYR có thể ức chế đặc hiệu sự hình thành hắc tố trong tế bào mà không gây ra tác dụng phụ bởi vì TYR chỉ được sản xuất bởi các tế bào hắc tố

❖ Các chất ức chế TYR phổ biến

Nhiều chất ức chế TYR như hydroquinon (HQ), arbutin, axit kojic (KA), axit azelaic, axit L -ascorbic, axit ellagic, axit tranexamic đã được sử dụng làm chất làm trắng da, tuy nhiên chúng đều có một số hạn chế nhất định [57]

+ Hydroquinone (HQ) là thành phần phổ biến nhất và được sử dụng thường xuyên trong các chất làm trắng da Tuy nhiên, HQ cho là nguyên nhân chính gây kích ứng da, ngoài ra HQ còn gây đột biến tế bào động vật có vú và gây độc tế bào hắc tố [37]

7

+ Arbutin và axit kojic (KA) là những chất ức chế TYR thường được sử dụng trong các sản phẩm mỹ phẩm để làm trắng da Về mặt lâm sàng, các chất khử sắc tố này cũng được áp dụng để điều trị chứng tăng sắc tố Arbutin và KA có nguồn gốc tự nhiên và có hiệu quả vừa phải, do đó chúng được ưa chuộng sử dụng để thay thế cho HQ [37] Tuy nhiên, ở nồng độ điều trị KA có thể gây mẫn cảm cho da và arbutin có khả năng gây độc tế bào [53]

+ Acid L-ascorbic nhạy cảm với nhiệt độ nên dễ bị phân huỷ Acid ellagic không hoà tan trong nước do đó sinh khả dụng kém Do đó nhu cầu tìm chất ức chế TYR từ thiên nhiên an toàn, ít gây tác dụng không mong muốn là rất lớn [84]

❖ Các nguồn chất ức chế TYR tự nhiên

Chất ức chế hoạt tính TYR có trong thực vật, vi khuẩn và nấm Các nhà nghiên cứu cho rằng các hợp chất từ thiên nhiên ít độc tính và sinh khả dụng cao Một số các nhóm hợp chất từ thực vật có tác dụng ức chế TYR như sau [84]:

• Flavonoid Trong số các hợp chất polyphenol, một số dẫn xuất flavonoid là chất ức chế tyrosinase mạnh, được tìm thấy chủ yếu trong dược liệu, trái cây [43] Nhiều dược liệu chứa flavonoid đã được phân lập các hoạt chất và đánh giá hoạt tính ức chế TYR như:

Morus yunnanensis, Arakta cultivar, Tibouchina semidecandra, Maackia faurie, Pleurotus ostreatus, Potentilla bifurca, Alpinia officinarum, Morus lhou, Garcinia subelliptica, Artocapus altilis, Myrsine africana, Pulsatilla cernua, Salvia miltiorrhiza-Carthamus tinctorius [84]

• Flavon và dihydroflavon: Các hợp chất flavon ức chế TYR được biết đến nhiều nhất là luteolin, apigenin, baicalein, chrysin Nobiletin và tangeretin là các flavon polymethoxyl hoá Trong các nghiên cứu khác, một dẫn xuất của flavone cụ thể là 7,8,4-trihydroxyflavon ức chế hoạt tính diphenolase của TYR với giá trị IC50 là 10,31 ± 0,41 mM [64]

• Flavonol: Myricetin, kaempferol, quercetin, morin, isorhamnetin, galangin là những flavonols phổ biến nhất có tác dụng ức chế TYR [24]

• Isoflavon: Isoflavon như daidzein, genistein, glycitein và glycosid của chúng chủ yếu có trong dược liệu Park và cộng sự đã chỉ ra các dẫn xuất o-dihydroxyisoflavon tự nhiên với nhóm thế hydroxyl ở vòng thơm isoflavon của đậu nành lên men Hàn Quốc ức chế TYR

8

Hai dẫn xuất 7,8,4’-trihydroxyisoflavone và 7,3’,4’-trihydroxyisoflavon ức chế TYR với giá trị IC50 lần lượt là 11,21± 0,8 mM và 5,23 ± 0,6 mM [56]

• Flavanon: Một số flavanon như naringenin, hesperetin, eriodictyol và glycosid của chúng, flavononol (taxifolin) được tìm thấy trong trái cây họ cam quýt và dược liệu có tác dụng ức chế TYR Trong một nghiên của Chiari và cộng sự đã chứng minh 6-isoprenoid phân

lập từ Dalea elegans ức chế TYR Steppogenin là một flavanon tự nhiên phân lập từ

Morus alba ức chế TYR mạnh với giá trị IC50 là 0,98 ± 0,01mM [82] • Flavanol và flavan-3,4-diol

Flavanol như catechin, epicatechin, epi-gallocatechin, epicatechin gallate, epigallocatechin gallate đã những chất phổ biến trong dược liệu và thực vật bậc cao là

nguồn ức chế TYR mạnh Hợp chất catechin được phân liệp từ Distylium racemosum

ức chế TYR với giá trị IC50 là 30,2 mg/mL cao hơn chất đối chứng dương là arbutin [38] • Anthocyanidins

Anthocyanidins bao gồm anthocyanidins (cyanidin, delphinidin, malvidin, peonidin, pelargonidin) và glycosise của chúng được phân bố trong các loại rau thơm Có mối liên hệ đáng kể giữa hàm lượng anthocyanin và hoạt động ức chế TYR [28]

• Curcuminoids Hai hợp chất phenolic cụ thể là curcumin và desmethoxycurcumin đã được phân lập

từ dịch chiết methanolic từ trái cây Artocapus altilis cho thấy hoạt động ức chế TYR

mạnh hơn chất đối chứng dương là KA [54] • Coumarins:

Một số dẫn xuất của coumarin như 3-aryl và 3-heteroarylcoumarins 80, esculetin, coumarinolignoid, 8’-epi-cleomiscosin282, umbelliferone, phenyl coumarins, hydroxycoumarins ức chế TYR Gần đây, trong một nghiên cứu cho thấy trans-N-

coumaroyltyramine và cis-N coumaroyltyramine phân lập từ Humulus japonicus ức

chế TYR giá trị IC50 lần lượt là 40,6 mM và 36,4 mM [78] • Chalcon và dihydrochalcon:

Chalcones (butein, phloretin, sappan-chalcon, carthamin) hoặc 2propen-1 là một trong những loại flavonoid quan trọng nhất [24] Dựa trên các báo cáo, một số chalcon tự nhiên, tổng hợp và dẫn xuất của chúng đã được xác định là những chất làm giảm sắc tố mạnh và ức chế TYR

2,3-diphenyl-• Lignan:

9

Lignan là những cấu trúc phức tạp và đa dạng được hình thành từ ba tiền chất chính

Cho đến nay, lignans và lignan glycosid được phân lập từ Castanea henryi,

Marrubiumvelutinum và Marrubium cylleneum, Pinellia ternate và Crataegus pinnatifida đã được báo cáo về hoạt tính ức chế TYR Tuy nhiên, hoạt tính ức chế của

chất này ở mức độ trung bình [84] Các nghiên cứu đã công bố chứng minh được rằng dược liệu là một nguồn tiềm năng ức chế TYR Việt Nam là quốc gia có nguồn tài nguyên dược liệu phong phú Việt Nam hiện có hơn 4000 loài cây thuốc trong đó có nhiều loài dược liệu quý được thế giới công nhận Do đó tiềm năng sử dụng dược liệu trong các sản phẩm làm đẹp, mỹ phẩm ở Việt Nam là rất lớn và cần được khai thác

❖ Mối quan hệ giữa chất chống oxy hóa và chất ức chế hoạt tính TYR

Khi tiếp xúc với bức xạ cực tím, da người tạo ra rất nhiều loại oxy phản ứng (ROS), từ đó kích hoạt nhiều phản ứng sinh học Việc tăng nồng độ ROS sẽ kích hoạt TYR bằng cách huy động hormon kích thích α-melanocyt trong lớp biểu bì và cuối cùng kích thích các tế bào melanocytes sản xuất melanin Trong khi đó, con đường Keap1-Nrf2/ARE loại bỏ ROS được kích hoạt khi nồng độ ROS tăng lên và các hợp chất chống oxy hóa tạo điều kiện cho sự phân ly của Nrf2 [74]

Ngoài ra, nghiên cứu của Yan Wang và cộng sự (2018) [74] đã chỉ ra rằng hoạt tính của TYR bị ức chế rất mạnh khi phối hợp giữa chất chống oxy hóa mạnh và chất ức chế TYR mạnh Tuy nhiên, tác dụng hiệp đồng này chỉ được quan sát thấy khi L-DOPA được sử dụng làm cơ chất

Bên cạnh đó, có rất nhiều nhóm chất chống oxy hóa đã được nghiên cứu là có tác dụng ức chế TYR như Vitamin C, các hợp chất phelonic (đặc biệt là flavonoid) Do vậy, giả thuyết được đặt ra rằng những dược liệu có tác dụng chống oxy hóa có thể có khả năng ức chế hoạt tính của TYR, đây cũng chính là một trong các cơ sở để chọn dược liệu đưa vào nghiên cứu

1.1.3 Các nghiên cứu đánh giá tác dụng ức chế TYR invitro từ dược liệu

Có nhiều mô hình khác nhau được sử dụng để đánh giá tác dụng ức chế TYR của dược liệu, trong đó đối tượng nghiên cứu có thể là các mẫu cao chiết trong cồn [52] hoặc các tinh dầu [6] Các cao gốc sẽ được pha loãng trong dung môi là DMSO hoặc nước, dung môi thường được sử dụng hơn cả là DMSO Thí nghiệm được thực hiện trong môi trường pH từ 6-7 (môi trường pH enzym thể hiện hoạt tính tốt), đa số các nghiên cứu đều chọn môi trường pH 6,8

Tùy vào phương pháp và điều kiện cụ thể, mỗi phương pháp sẽ có những cách tiến hành khác nhau, tuy nhiên nhìn chung đều gồm: Mẫu dược liệu, dung môi pha loãng

10

mẫu, cơ chất L-tyrosin hoặc L-DOPA, TYR, sau đó đem hỗn hợp đi ủ và đo quang Chẳng hạn như ở nghiên cứu [3] và [33] sau khi mẫu dược liệu, cơ chất và đệm được cho vào giếng sẽ đem hỗn hợp đi ủ ở nhiệt độ thích hợp rồi mới cho TYR vào tiếp tục ủ Trong khi đó, ở nghiên cứu [52] sau khi đã cho các thành phần cần thiết vào giếng, TYR sẽ được thêm ngay sau đó và cho hỗn hợp đi ủ

Nhiệt độ và thời gian ủ cũng có khác nhau giữa các nghiên cứu, một số nghiên cứu mẫu được ủ ở nhiệt độ phòng, chia làm 2 lần ủ (trước và sau khi cho enzym) Trong khi đó, một số nghiên cứu khác thì ủ ở nhiệt độ cố định là 30°C hoặc 37°C, tổng thời gian ủ của các nghiên cứu từ 10-20 phút

Độ hấp thụ trong hầu hết các nghiên cứu được đo ở bước sóng 470-510 nm Bước sóng được sử dụng phổ biến ở các nghiên cứ trên thế giới là 475 nm, trong khi đó ở Việt Nam thường sử dụng bước sóng 490 nm

Hầu hết trong các nghiên cứu về hoạt tính ức chế TYR, chất đối chứng dương được chọn là KA, tuy nhiên vẫn có một số nghiên cứu dùng HQ làm chất đối chứng dương Tùy vào điều kiện của cơ sở nghiên cứu mà có thể chọn chất chứng dương phù hợp

1.2 Tổng quan về các dược liệu tiềm năng ức chế TYR trong nghiên cứu

1.2.1 Tổng quan về cốt khí củ (Reynoutria japonica – Polygonaceae)

occidentalis), cốt khí thân tím (T.purpurea Pers), cốt khí thân trắng (Tephrosia candida

DC.) và cốt khí dây (Sabia olacifolia) [1], vì vậy cần phân biệt để tránh nhầm lẫn

Cốt khí củ có nguồn gốc ở vùng Đông Á [1] Ở Việt Nam, cây mọc hoang dại ở vùng núi cao, cây ưa ẩm thường mọc thành khóm trong các thung lũng, nơi gần nguồn nước (Sapa) Rễ cốt khí củ thu hoạch quanh năm nhưng tốt nhất vào mùa thu (tháng 8-9), có nơi thu hái vào các tháng 2-3 [1], [2] Cây rụng lá vào mùa đông, ra hoa quả nhiều hàng năm, có khả năng mọc chồi từ thân rễ [1] Đào về, cắt bỏ rễ con, rửa sạch đất cát cắt thành từng mẫu ngắn dài không đều hoặc thái mỏng, phơi hay sấy khô Vị thuốc mặt ngoài màu nâu vàng, khi bẻ hay cắt ngang có màu vàng, mùi không rõ, vị hơi đắng [2] Y học cổ truyền dùng cốt khí củ thay hoàng cầm với tên hoàng cầm nam [1]

11

1.2.1.2 Thành phần hóa học

➢ Rễ cốt khí củ chứa các chất thuộc nhóm: • Anthranoid: Physcion, emodin, emodin-8-O-β-glycosid, chrysaphanol, rhein,

falacinol, citreosein, questin, questinol • Stilben: Resveratrol, polydatin

• Quinon: 2-methoxy-6-acrtyl-7-methyljuglon • Phenol: Acid protocatechuic

• Các thành phần khác: catechin, 7-hydroxy-4-methoxy-5-mrthyl-coumarin; torachrysin-8-O-D-glycosid [1]

• Ngoài ra còn có tanin [2] và các nguyên tố Cu, Fe, Mn, Zn, K [1]

1.2.1.3 Tác dụng

Cốt khí củ có tác dụng chống viêm trên các mô hình gây viêm thực nghiệm: gây phù chân chuột bằng kaolin và dextran, gây rỉ dịch màng phổi bằng tinh dầu thông, gây u hạt dưới da bằng amidan, gây viêm dị ứng và viêm đa khớp bằng vaccin B.C.G Cốt khí củ có ảnh hưởng ức chế tác dụng gây co thắt cơ trơn ruột cô lập của histamin và acetylcholin

Rễ cây cốt khí củ có vị ngọt đắng, tính mát, trong dân gian Việt Nam củ cốt khí là một vị thuốc dùng chữa tế thấp, do bị ngã, bị thương mà tổn thương đau đớn, còn là một vị thuốc thu liễm cầm máu [2], [1] Ngoài ra, còn dùng để trị kinh nguyệt bế tắc, bụng chướng, đắt rắt buốt, mụn nhọt

1.2.1.4 Cốt khí củ và tác dụng ức chế enzym tyrosinase

Khả năng chống oxy hóa và gây độc tế bào của cốt khí củ được đánh giá thông qua nghiên cứu của Khuda Fazli và cộng sự [34] Nghiên cứu đã cung cấp cái nhìn sâu sắc

về việc sử dụng cao chiết rễ cây R japonica như một nguồn chất chống oxy hóa tự nhiên

tiềm năng và có thể có tầm quan trọng lớn như một tác nhân trị liệu trong việc cải thiện hoặc ngăn ngừa các bệnh liên quan đến stress oxy hóa

Vào năm 2020 nghiên cứu của Y Wen và cộng sự được công bố [75], kết quả của nghiên cứu đã chỉ ra rằng cốt khí củ có tác dụng hấp thụ tia UV và ức chế TYR, cụ thể:

• Độ hấp thụ trung bình của vùng UVB: 0,294 • Độ hấp thụ trung bình của vùng UVA: 0,217 • Phần trăm ức chế hoạt tính TYR của Cốt khí củ ở nồng độ 0,1; 0,5; 1,0 mg/mL

lần lượt là 33,85 ± 3,82; 86,67 ± 1,91; 98,37 ± 2,02

Hoài sơn còn được gọi là sơn dược, khoai mài, củ mài, chính hoài [1], [2] Hoài sơn

(Rhizoma Dioscoreae) là thân rễ của cây củ mài (Dioscorea persimilis) cạo vỏ, sơ bộ

chế biến rồi sấy khô [2] Hoài sơn tốt phải có màu trắng bóng, không vàng, chất củ rắn chắc không xốp, không có vết lỗ chỗ, không bị sâu mọt [1]

Bên cạnh hoài sơn, còn nhiều loài khác cũng cho củ ăn được nhưng không chế biến

thành hoài sơn như: Dioscorea glabra Roxb, D pyrifolia Kunth, D decipiens Hook…

vì vậy nên cần phân biệt rõ ràng các loại cây để tránh nhầm lẫn [1] Cây mọc hoang dại rải rác khắp vùng rừng núi, cây ưa sáng, ưa ẩm và thường chỉ mọc ở đất còn tương đối màu mỡ [1] Cây củ mài là một loại dây leo ở trên mặt đất, có thân củ Củ có thể dài 1 m, đường kính 2-10 cm với nhiều rễ con [2]

1.2.2.2 Thành phần hóa học

Hoài sơn chủ yếu chứa tinh bột Ngoài ra, củ còn chứa mucin là một loại protein nhớt, allantoin, các acid amin arginin, cholin và men maltase Về phương diện lương thực, củ mài chứa 63,25 % tinh bột, 0,45 % chất béo, 6,75 % chất đạm, là nguồn dự trữ quý, có giá trị dinh dưỡng cao đứng sau gạo và ngô [1], [2]

Theo tài liệu Trung Quốc, hoài sơn có 16 % chất bột, chất nhầy, cholin, 16 acid amin, các men oxy hóa, vitamin C Trong chất nhầy có acid phytic [1] Ngoài ra có tìm thấy

trong một số giống dioscorea chất saponin nhân sterol [2]

1.2.2.3 Tác dụng

Một số tác giả đã nghiên cứu tác dụng tăng trọng lượng cơ thể, tăng đồng hóa và tác dụng nội tiết hướng sinh dục của hoài sơn Trong y học cổ truyền, hoài sơn có vị ngọt, tính bình, vào các kinh phế, tỳ, vị, thận Đây là một vị thuốc bổ, chữa tỳ vị hư nhược, ăn uống kém tiêu, viêm ruột kinh niên, tiêu chảy lâu ngày không khỏi, phế hư ho hen, bệnh tiểu đường, di tinh, di niệu, bạch đới [1]

1.2.2.4 Hoài sơn và các nghiên cứu về tác dụng của nó

Hiện nay chưa có nghiên cứu nào về tác dụng ức chế TYR của hoài sơn Tuy nhiên nhiều nghiên cứu đã báo cáo các đặc tính chống oxy hóa có trong cao chiết và các phần

phân lập từ các bộ phận khác nhau của Dioscorea spp Phần lớn các kết quả được công

13

bố thu được từ các nghiên cứu về củ/thân rễ thực vật, trong khi các báo cáo về lá thì khá ít

Một số nghiên cứu được báo cáo đã phân tích kỹ hơn về khả năng thu dọn gốc tự do

và các hoạt tính chống oxy hóa khác của Dioscorea bằng cách nghiên cứu thành phần

hóa học được phân lập bằng các dung môi và phương pháp khác nhau của các dịch chiết tổng và dịch chiết phân đoạn [4] Nhìn chung, chiết xuất từ lá có chất chống oxy hóa mạnh hơn các chế phẩm từ thân rễ hoặc rễ Hơn nữa, một số nghiên cứu đã chứng minh rằng vỏ củ có chứa nhiều chất chống oxy hóa hơn phần thịt của nó

Khả năng chống oxy hóa của các bộ phận khác nhau của Dioscorea có thể liên quan

đến thành phần hóa học thực vật của chúng Saponin steroid, phenanthren và anthocyanin là thành phần quan trọng trong củ, trong khi axit phenolic và flavonoid là chất chống oxy hóa chính được tìm thấy trong lá [4] Do có đặc tính chống oxy hóa tốt nên hoài sơn cũng là một dược liệu có tiềm năng trong việc ức chế hoạt tính TYR

1.2.3 Tổng quan về Nho (Vitis vinifera - Vitaceae)

1.2.3.1 Thực vật học

Nho là cây leo, sống lâu năm, dài hàng mét Thân cành mảnh, có vỏ ngoài màu lục

sau chuyển màu xám nâu, thường bong ra từng mảng mỏng, Chi Vitis.L có khoảng 60

loài trên thế giới, đều là dây leo, phần lớn rụng lá vào mùa đông hay mùa khô Hiện nay cây được trồng rải rác khắp các địa phương, từ vùng đồng bằng đến ven biển [1]

Cây nho ưa ánh sáng, ưa nắng, chịu được nhiệt độ cao nhưng sợ độ ẩm cao, nhiều mưa Ở Việt Nam, nho được trồng ở khắp nơi, song chỉ có vùng Ninh Thuận là thích hợp nhất

1.2.3.2 Thành phần hóa học

• Vitamin: Quả nho có chứa nhiều loại vitamin: 100 g quả chính chứa caroten 2 µg, vitamin B 0,07, riboflavin 0,19, niacin 0,7 và vitamin C 1,0mg Quả có chứa nhiều bioflavonoid (vitamin P)

• Enzym: Quả chứa invertase, nhiều hơn trong quả chưa chín, 75 % enzym toàn phần có trong quả chín dưới dạng hòa tan Pectin methyl esterase có ở vỏ nhiều hơn ở thịt và có hoạt tính tăng dần khi quả chín Quả và lá chứa catalase, acid ascorbic, oxidase, peroxidase và polyphenol oxydase

• Carbohydrat: Đa phần đường là glucose và fructose • Các hợp chất nitơ: Quả có chứa nhiều acid amin, alanin, acid γ-aminobutyric,

acid glutamic, prolin, serin và threonin Arginin và prolin có nhiều nhất khi quả chín

14

• Acid hữu cơ: Quả có nhiều acid tartric và acid malic (chiếm 90 % so với các acid toàn phần), ít acid citric Acid p.courmarin và acid cafein có ở dạn ester, kết hợp với anthocyanin

• Hợp chất phenol: Các hợp chất phenol gồm chủ yếu các sắc tố và tanin Quả có các màu đỏ, lơ, tía và đen do có anthocyan Sắc tố màu đỏ và oenin, màu vàng do các hợp chất flavonoid (quercetin, quercitrin), sắc tố màu đỏ hoặc đen là mono glycosid Vỏ quả chứa quercitin, kaempferol và myricetin dưới dạng glycosid, quercetin còn có dưới dạng glucuronosid

• Ngoài ra còn có sáp, lipid và cá thành phần khác [1]

1.2.3.3 Tác dụng

Các flavonoid chứa trong cây nho có tác dụng làm giảm tính thấm mao mạch, chống

viêm, làm giảm phù Procyanidin chiết xuất từ nho đã được nghiên cứu invitro về tác

dụng chống đột biến Hoạt tính này một phần có thể do tác dụng chống oxy hóa của procyanidin

Nho được dùng chữa đau lưng, mỏi gối, đái buốt, nôn Trong y học cổ truyền, nho tươi có tác dụng nhuận tràng, bổ dạ dày, lợi tiểu, làm dịu và mát Nho khô cũng có tác dụng làm dịu, nhuận tràng, làm mát và long đờm

1.2.3.4 Nho và tác dụng ức chế enzym tyrosinase

Một nghiên cứu về tác dụng ức chế TYR của nho [46] đã kết luận rằng dịch chiết lá nho (RVLE) có hoạt tính ức chế TYR với giá trị IC50 là 3,84 mg/mL Các thành phần hoạt tính sinh học của dung dịch RVLE chứa acid galic, acid chlorogen, epicatechin, rutin và resveratrol Do đó, dung dịch RVLE có thể được sử dụng trong công thức mỹ phẩm như một chất làm trắng tự nhiên

Một nghiên cứu khác về ứng dụng tiềm năng của chiết xuất từ thân nho (Vitis vinifera

L.) trong ngành công nghiệp mỹ phẩm và dược phẩm đã xác định thành phần phenolic của sáu loại chiết xuất thân nho bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao và đánh giá các hoạt tính sinh học của chúng (chất chống oxy hóa, kháng khuẩn, chống viêm và chống lão hóa) Nghiên cứu đã chứng minh được rằng dịch chiết từ thân nho có tác dụng chống lão hóa bằng cách ức chế hoạt tính của TYR và enzym elastase Vì vậy, nho đã chứng tỏ được tiềm năng sinh học, được các ngành mỹ phẩm, dược phẩm và thực phẩm quan tâm [41]

15

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

Cơ sở dữ liệu để rà soát thông tin và lựa chọn dược liệu đưa vào nghiên cứu:

• Tài liệu chuyên khảo (Thực vật – Dược liệu – Dược cổ truyền): Những cây thuốc

và vị thuốc Việt Nam của Đỗ Tất Lợi, Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam tập I,II (NXB Khoa học và Kỹ thuật), Dược liệu học tập I, II (Bộ Y Tế)

• Các nghiên cứu về hoạt tính ức chế enzym, tác dụng chống oxy hóa hay tác dụng làm sáng da của các dược liệu đã được công bố trên các cơ sở dữ liệu khoa học như Pubmed, Google Scholar, Science Direct, Research Gate

Tiêu chí lựa chọn dược liệu đưa vào nghiên cứu: • Các dược liệu đã được ghi nhận hoặc có một số loài cùng chi đó đã được ghi nhận

có hoạt tính ức chế enzym, tác dụng chống oxy hóa hay tác dụng làm sáng da, đặc biệt là các dược liệu đã được ghi nhận ức chế TYR

• Các dược liệu thông dụng đã được dùng trong các nghiên cứu trước, sẵn có tại Viện Dược liệu

Dựa trên các tri thức sử dụng thuốc được ghi chép lại kết hợp với thông tin về kết quả nghiên cứu được công bố, chúng tôi đã lựa chọn được 30 dược liệu tiềm năng dưới đây để tiến hành nghiên cứu sàng lọc dược liệu có tác dụng ức chế TYR

Bảng 2.1: Danh mục các dược liệu được đưa vào nghiên cứu sàng lọc

dược liệu có tác dụng ức chế TYR

STT

Tên dược

1 Ba kích Morinda officinalis F.C.How

2 Bạch chỉ nam Millettia pulchra Fabaceae Thân rễ Lào Cai [16]

16

STT

Tên dược

Merr Scrophulariaceae

Phần trên

6 Cải cần Corydalis balansae Prain

7 Cát sâm Callerya speciosa (Champ.)

Reynoutria japonica Houtt

11 Củ mài Dioscorea persimilis Prain et

12 Cúc hoa vàng

Chrysanthemum indicum L

dành

Gardenia jasminoides J Ellis

17

STT

Tên dược

đắng

Phyllanthus amarus Schumach

& Thonn Euphorbiaceae

Phần trên

lăng

Polyscias fruticosa (L.) Harms

Fallopia multiflora (Thunb.)

hương

Pogostemon cablin (Blanco)

kỳ

Astragalus membranaceus

24 Hồi Illicium verum Hook.f

phụ Cyperus rotundus Cyperaceae Củ Hà Nội [50]

26 Mỏ quạ Cudrania cochinchinensis

18

STT

Tên dược

[46]

29 Sả chanh Cymbopogon citratus (DC.)

khung

Ligusticum wallichii Franch

2.2 Nguyên vật liệu, thiết bị

2.2.1 Hóa chất và dung môi

Hóa chất và dung môi được dùng trong sàng lọc dược liệu có tác dụng ức chế TYR bao gồm:

• Tyrosinase từ nấm (Sigma-Aldrich) • L-tyrosin (USP – Mỹ)

• Acid kojic (AK Sciencetific – Mỹ) • Monopotassium phosphat (KH2PO4, Sigma-Aldrich); • Dipotassium phosphat (K2HPO4, Sigma-Aldrich) • DMSO (Dimethyl sulfoxid; Fisher - Mỹ)

• Cồn công nghiệp và các hóa chất thông thường khác

2.2.2 Dụng cụ, thiết bị nghiên cứu

Dụng cụ và thiết bị dùng trong sàng lọc dược liệu có tác dụng ức chế TYR bao gồm: Máy đo pH, tủ -80℃ (Sanyo, Nhật Bản), tủ lạnh, máy đo quang ELISA, đĩa 96 giếng có nắp (SPL, Hàn Quốc), đĩa petri nhỏ, máy lắc vortex, pipet đơn kênh, đa kênh (Eppendorf, Đức), pipet tips (Corning, Hoa Kỳ), ống tube 1.5 mL (Corning, Hoa Kỳ), ống falcon 15 mL, 50 mL (Corning, Hoa Kỳ), máy cất nước hai lần (Aquatron, Thụy Điển), máy siêu âm (Hwashin Technology, Hàn Quốc), nồi hấp tiệt trùng (Sturdy, Hoa Kỳ), tủ sấy (Binder, Đức)