lê đức bảo tiếp tục nghiên cứu chiết xuất phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất từ quả bồ kết

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2024

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:

ThS Phạm Thái Hà Văn HVCH28 Trần Văn Đức

Nơi thực hiện:

Bộ môn Dược học cổ truyền Khoa: DL-DHCT

HÀ NỘI – 2024

LỜI CẢM ƠN

Trước khi trình bày phần nội dung đề tài khóa luận của mình, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến những người trong suốt thời gian qua đã luôn hỗ trợ, động viên và giúp đỡ em hoàn thành một cách tốt nhất khóa luận tốt nghiệp

Trước tiên, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến người thầy đáng kính của em: PGS.TS Nguyễn Mạnh Tuyển – Phó Hiệu trưởng, Trưởng khoa Dược liệu – Dược học cổ truyền, Trưởng Bộ môn Dược học cổ truyền - Trường Đại học Dược Hà Nội Thầy đã không chỉ tạo những điều kiện thuận lợi nhất giúp em hoàn thành khóa luận mà còn hướng dẫn cho em dần hình thành tư duy khoa học, độc lập, tự chủ trong nghiên cứu

Em xin gửi lời cảm ơn đến ThS Phạm Thái Hà Văn và Ds Trần Văn Đức đã chỉ bảo và giúp đỡ em về kiến thức chuyên môn trong quá trình thực hiện đề tài

Cuối cùng, em muốn cảm ơn gia đình, bạn bè, em cảm ơn ThS Lê Hương Giang, Ds Hoàng Khắc Long trong nhóm nghiên cứu tại bộ môn Dược học cổ truyền, anh chị đã luôn theo sát và chia sẻ những kiến thức, kinh nghiệm quý báu để giúp em vượt qua những khó khăn trong quá trình nghiên cứu Em cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến các bạn Trịnh Khánh Ly, Trần Minh Tuấn, Kiều Thế Quang, những người bạn luôn sát cánh, giúp đỡ em trong quá trình làm nghiên cứu khoa học và thực hiện khóa luận tốt nghiệp

Hà Nội ngày 02 tháng 06 năm 2024

Sinh viên Lê Đức Bảo

MỤC LỤC Danh mục ký hiệu chữ viết tắt

Danh mục các bảng Danh mục các hình vẽ

2.2 HÓA CHẤT DUNG MÔI 13

2.3 MÁY MÓC, TRANG THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 13

2.4 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 14

2.5 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2.5.1 Phương pháp chiết xuất cao toàn phần 14

2.5.2 Phương pháp chiết xuất cao phân đoạn 14

2.5.3 Phương pháp phân lập hợp chất 15

CHƯƠNG III THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 18

3.1.CHIẾT CAO TOÀN PHẦN VÀ CÁC CAO PHÂN ĐOẠN TỪ QUẢ BỒ KẾT 18

3.2.KẾT QUẢ PHÂN LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT TỪ PHÂN ĐOẠN N-BUTANOL 19

3.3.XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC HỢP CHẤT PHÂN LẬP ĐƯỢC 21

DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

Ký hiệu, chữ viết tắt

Tiếng Anh Tiếng Việt

13C-NMR Carbon 13 Nuclear Magnetic

Resonance Spectroscopy

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13

1H-NMR Proton Nuclear Magnetic Resonance Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

proton DCM Dichloromethane Dicloromethan EC50 Half maximal effective concentration Liều gây tác dụng trung bình

EtOAc Ethyl acetate Ethyl acetat

GLUT-1 Glucose transporter 1

GSE Gleditsia sinensis Extract Dịch chiết Gleditsia sinensis

HPLC High-performance liquid

chromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

IC50 Half-maximal inhibitory concentration Liều ức chế trung bình

LPS Lipopolysaccharide

MAPK Mitogen-activated protein kinase

MeOH Methanol Methanol NF-κB Nuclear factor kappa-light-chain-

enhancer of activated B cells

Nrf2 Nuclear factor erythroid 2-related

factor 2 RP-C18 Reversed Phase C-18 Pha đảo C-18 TLC Thin layer Chromatography Sắc ký lớp mỏng v:v Volume:Volume Thể tích:thể tích WEGST Water extract Gleditsia sinensis Thorn Dịch chiết nước gai Gleditsia

sinensis

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Một số hợp chất nhóm sterol phân lập từ chi Gleditsia 5

Bảng 1.2 Một số dẫn chất phenolic phân lập từ chi Gleditsia 7

Bảng 3.1 So sánh tín hiệu phổ NMR của hợp chất GB-1 với tài liệu tham khảo 22

Bảng 3.2 So sánh tín hiệu phổ NMR của hợp chất GB-2 với tài liệu tham khảo 24

Bảng 3.3 Một số hợp chất nhóm saponin phân lập từ loài Gleditsia caspica 26

Bảng 3.4 Một số flavonoid phân lập từ chi Gleditsia 30

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Hình 1.1 Loài Gleditsia australis 11

Hình 2.1 Mẫu quả bồ kết - Fructus Gleditsiae 13

Hình 3.1 Quy trình chiết xuất cao toàn phần và cao phân đoạn 18

Hình 3.2 Quy trình phân lập chất từ cao ethyl acetat 19

Hình 3.3 Ảnh chụp TLC hợp chất GB-1 20

Hình 3.4 Ảnh chụp TLC hợp chất GB-2 21

Hình 3.5 Công thức cấu tạo của hợp chất apigenin 23

Hình 3.6 Công thức cấu tạo của hợp chất orientin 25

ĐẶT VẤN ĐỀ

Kể từ khi con người biết sử dụng cây cỏ để làm thuốc, các loài thảo mộc đã đóng vai trò quan trọng trong việc điều trị bệnh cho con người và động vật [5] Trong những năm trở lại đây, phần lớn các thuốc đã được phát triển từ các hợp chất phân lập từ dược liệu, với cơ sở là các y văn và tri thức dân tộc về cây thuốc[5], [11], [34] Vai trò của các sản phẩm có nguồn gốc từ tự nhiên đối với sự phát triển thuốc ngày càng tăng, không chỉ khi các hợp chất có hoạt tính sinh học được sử dụng trực tiếp làm tác nhân trị liệu mà còn khi chúng được sử dụng làm nguyên liệu thô để bán tổng hợp thành dược chất hoặc làm mô hình cơ sở cho việc tạo ra hợp chất có hoạt tính sinh học mới [31], [41] Hơn nữa, ước tính chỉ có khoảng 10% trong số 250.000 loài thực vật trên toàn thế giới đã được nghiên cứu khoa học và có tiềm năng sử dụng trong lĩnh vực chăm sóc sức khỏe [12] Ngoài ra, khoảng 60.000 loài có thể sẽ tuyệt chủng vào năm 2050, vì vậy việc tìm kiếm các hợp chất mới có ích trong phòng và trị bệnh là rất cần thiết [34]

Việt Nam là quốc gia nằm ở vùng khí hậu nhiệt đới ẩm gió mùa, có sự phân hóa phức tạp với nhiều kiểu khí hậu, do đó đất nước ta có nhiều điều kiện tự nhiên thuận lợi để phát triển thảm thực vật phong phú và đa dạng Tài nguyên cây thuốc là nguồn tài nguyên vô cùng quý giá của đất nước ta, cung cấp nguyên liệu cho nền y học cổ truyền nước nhà Khoảng 80% dân số ở các nước đang phát triển với dân số khoảng 3,5 đến 4 tỉ người trên thế giới có nhu cầu chăm sóc sức khoẻ ban đầu phụ thuộc vào nền y học cổ truyền Phần lớn trong số đó phụ thuộc vào nguồn dược liệu hoặc các chất chiết xuất từ dược liệu

Trong dân gian, cây bồ kết đã được sử dụng như một vị thuốc, xuất hiện trong các cuốn sách đông y kinh điển như Thần Nông bản thảo, Thang Dịch Bản Thảo, Đường Bản Thảo, Bồ kết được dùng trong trường hợp mắc phong, mất ý thức, viêm họng, hen suyễn, mụn nhọt, Tuy đã xuất hiện trong nhiều y thư và những tìm hiểu về chi

Gleditsia cũng khá đáng kể [39], [51] nhưng những nghiên cứu về thành phần hóa học

của bồ kết Việt Nam (Gleditsia australis Hemsl.) còn khá ít [14] Vì vậy, nhằm mục đi

sâu vào nghiên cứu làm rõ thành phần hóa học của cây bồ kết để có thêm tri thức và nâng cao giá trị sử dụng cây thuốc đồng thời hướng tới chuẩn hóa dược liệu, đề tài “Tiếp tục nghiên cứu chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất từ quả bồ kết” được thiết lập với mục tiêu:

- Chiết xuất, phân lập được 1-2 hợp chất từ cao phân đoạn n-butanol của quả bồ kết - Xác định cấu trúc của các hợp chất chất phân lập được

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về chi Gleditisa

1.1.1 Vị trí phân loài

Chi Gleditsia được phân loại như sau:

Giới (Kingdom) - Thực vật (Planta) Ngành (Phylum) - Ngọc lan (Magnoliophyta) Lớp (Class) - Ngọc lan (Magnoliophyta) Phân lớp (Subclass) - Hoa hồng (Rosidae) Bộ (Order) - Đậu (Fabales)

Họ (Family) - Đậu (Fabaceae)

Phân họ (Sub-family) - Vang (Caesalpinioideae) Chi (Genus) - Bồ kết (Gleditsia) [2], [3], [47]

1.1.2 Đặc điểm thực vật

Theo thực vật chí Trung Quốc mô tả: bồ kết là cây gỗ hay cây bụi, lá rụng sớm Thân và cành thường có gai đơn hoặc phân nhánh Lá mọc so le, thường thành cụm; cuống lá và lá chét lông chim có rãnh; lá chét nhiều, mọc gần đối hoặc so le, đáy xiên hoặc gần đối xứng, mép lá răng cưa hoặc khía tai bèo, hiếm khi nguyên Hoa mọc ở nách lá, hiếm khi ở đầu cành, mọc thành chùm hoa, hiếm khi là chùy hoa Hoa lưỡng tính hoặc đơn tính khác gốc, màu lục nhạt hoặc trắng ánh xanh lục Đế hoa hình chuông, bên ngoài có lông tơ Đài hoa 3-5 thùy; các thùy gần bằng nhau Cánh hoa 3-5, hơi không đều nhau, dài gần bằng hoặc dài hơn một chút so với các thùy của đài hoa Nhị hoa 6-10, thò ra ngoài, có lông quăn từ giữa trở xuống; bao phấn đính lưng Bầu nhụy không cuống hay có cuống ngắn; noãn 1 đến nhiều; vòi nhụy ngắn; đầu nhụy ở đỉnh Quả đậu hình trứng hoặc elip, phẳng hoặc gần thuôn tròn [47]

1.1.3 Đặc điểm thực vật một số loài thuộc chi Gleditsia

Gleditsia rolfei Vidal y Soler.: Đại mộc nhỏ, nhánh có bì khẩu tròn trắng; gai

chẻ hai, ngay, dài Lá dài 20cm, 10 cặp, bầu dục, bất xứng, dài 3 – 7cm, gân phụ 9 – 11 cặp, bìa có rang tròn, đầu tà Chùm ngoài nách lá, dài 12 cm; lá đài mặt trong có long; cánh hoa 5, cao 4mm; tiều nhụy Hoa cái có tiểu nhụy lép Quả dẹp đen, dài 20cm, rộng 1.5cm; hạt 15 – 20 [2]

Gleditsia pachycarpa Bal ex Gagn.: Đại mộc; nhánh có gai Lá dài 20 – 25cm;

thứ diệp mọc xen, dài 3.5 – 5.5cm, bất xứng, hơi cong, đầu tà tròn, bìa có răng tà, gân phụ 11 – 15 cặp, có lông mịn Quả dẹt, đen, dài đến 30cm, rộng 4.5cm Hạt đến 40, nâu [4]

Gleditsia australis Hemsl ex Forb & Hemsl.: Đại mộc 8m, có gai to, cứng,

chia nhánh Lá kép 2 lần, mang 3 – 4 cặp thứ diệp; tam diệp 6 – 8 cặp, có lông ở mặt trên, đầu tròn hay lõm Cánh hoa đầy lông mặt trong; tiểu nhụy rời, 10 ở hoa đực, 5 ở hoa lưỡng tính Quả dẹt, mỏng, cứng, nâu đen; hạt 10 – 12 [2]

Gleditsia sinensis Lam.: Cây gỗ to, cao tới 12m, thân thẳng có vỏ nhẵn và rất

nhiều gai to, cứng, phân nhánh, dải 10 – 25cm Lá kép, mọc so le, một lần lông chim, lá chét có 6 – 8 đôi mọc so le, hình mác, bó vầ hơi có lông ở mặt trên, nhạt hơn và nhăn ở mặt dưới, đầu lá chét nhọn, gốc lệch Cụm hoa mọc thành chùm ở kẽ lá, nhiều cụm dài 10 – 15cm, hoa màu vàng, tràng 5 cánh, hoa đực có 10 nhị và không có bầu, hoa lưỡng tính có 5 nhị, bầu trên có nhiều lông, đựng nhiều noãn Quả dẹt, cong, dài 15 – 20cm, phồng ở chỗ có hạt Có từ 15 – 20 hạt, khi chính có màu mâu đen [26]

1.1.4 Phân bố

Trên thế giới, phần lớn các loài thuộc chi Gleditsia được tìm thấy ở vùng Đông

Nam Á, Bắc Mỹ, Đông – Nam Mỹ và phía Nam Caucasus [16], [40], [47]

Theo nghiên cứu của Gordon và các cộng sự năm 1966, chi Gleditsia có tổng cộng 13 loài Trong số này, 8 loài phân bố ở khu vực Đông Á gồm: Gleditsia australis,

Gleditsia delavayi, Gleditsia fera, Gleditsia japonica, Gleditsia macracantha, Gleditsia microphylla, Gleditsia rolfei và Gleditsia sinensis; 2 loài xuất hiện ở Đông Bắc Mỹ là Gleditsia aquatica và Gleditsia triacanthos; 1 loài sinh sống ở Nam Mỹ là Gleditsia amorphoides; 1 loài ở phía Nam bờ biển Caspian là Gleditsia caspica; và 1 loài ở vùng

Đông Bắc Ấn Độ là Gleditsia assamica [15]

Theo Huxley và cộng sự (1992) và theo Thực vật chí Trung Quốc có 14 loài thuộc

chi Gleditsia gồm: Gleditsia australis, Gleditsia delavayi, Gleditsia fera, Gleditsia

japonica, Gleditsia macracantha, Gleditsia microphylla, Gleditsia rolfei, and Gleditsia sinensis, Gleditsia aquatica, Gleditsia triacanthos, Gleditsia amorphoides, Gleditsia caspica và Gleditsia assamica [16], [47]

Ở Việt Nam cây bồ kết mọc hoang và được trồng nhiều tại nhiều tỉnh miền bắc nước ta Riêng đảo Cát Bà (Hải Phòng ) có tới 40.000 cây, hàng năm cho tới 40 tấn bồ kết [3]

Các loài được tìm thấy ở Việt Nam là: Gleditsia rolfei Vidal y Soler (tạo giác),

Gleditsia pachycarpa Bal ex Gagn (bồ kết quả dày) và Gleditsia australis Hemsl, ex

Forb, & Hemsl (chùm kết, bồ kết, tạo giác, bồ kết quả nhỏ) [2]

Bồ kết là loại cây gỗ lớn, mọc nhanh, ưa sáng, thường mọc ở rừng thứ sinh, đôi khi thấy cả ở vùng rừng núi đá vôi Cây ra hoa và quả hàng năm, nhưng tỷ lệ quả phụ thuộc thời tiết Bồ kết rụng lá vào mùa đông, lá non lại vào cuối mùa xuân năm sau Cây

trồng bằng hạt, sau 4 năm ra hoa và quả đầu tiên, các năm sau sẽ ra nhiều hơn Bồ kết có khả năng tái sinh chồi sau khi chặt [3], [4]

1.1.5 Thành phần hóa học

Nghiên cứu thành phần hóa học của các loài trong chi Gleditsia trên thế giới còn hạn chế, các nghiên cứu mới chỉ tập trung chủ yếu vào loài G japonica Miq và G

sinensis Lam

Tới 2018, hơn 60 hợp chất bao gồm triterpen, sterol, flavonoid, alkaloid, phenolic

và các dẫn chất của chi này đã được phân lập từ Gleditsia japonica Miq., Gleditsia

sinensis Lam., Gleditsia caspica Desf và Gleditsia triacanthos L Trong số các hợp chất

này, triterpenoid saponin là thành phần chính của các loài Gleditsia [51]

1.1.5.1 Saponin và sterol

Các loài Gleditsia rất giàu triterpen, đặc biệt là triterpenoid saponin, và những

saponin này có thể là marker thích hợp cho chi này Đặc điểm cấu trúc của triterpen được ghi nhận như sau: các triterpen này có thể được chia thành hai loại chính dựa vào cấu trúc khung cơ bản của chúng đó là các hợp chất loại oleanane và loại lupane được

tìm thấy trong chi Gleditsia [51]

Năm 1999, Zhizhen Zhang và các cộng sự đã phân lập ra 4 triterpenoid saponin

có khung oleanan từ loài Gleditsia sinensis là gleditsiosid A, gleditsiosid B, gleditsiosid

C, gleditsiosid D, các chất này đều là các chất rắn vô định hình [53] Đồng thời cũng trong năm này ông và cộng sự cũng phân lập được các triterpen saponin: gleditsiosid E, F, H, I, J, K, O, P, Q; gleditsia saponin C', gleditsia saponin E' [54], [55], [56]

Năm 2005, Lim JC và cộng sự đã phân lập được 1 triterpenoid và 4 steroid tử

gai của Gleditsia sinensis Lam trong đó triterpenoid C-friedours-7-en-3-on lần đầu tiên

được phát hiện trong tự nhiên [28] và những chất này cũng được Li WH và cộng sự phân lập sau đó 2 năm [27]

Năm 2010, khi nghiên cứu về quả loài G caspica Desf., nhóm nghiên cứu tại đại

học Shizuoka (Nhật Bản) đã phân lập và xác định cấu trúc 11 bisdesmosidic triterpenoid saponin có cấu trúc tương tự như trên, tuy nhiên một số glucoside triterpenoid lại chứa ba acid monoterpenic tại các gốc đường Nhóm này được đặt tên là caspicaosid [32], [29]

Sterol thu được từ chi Gleditsia được phân thành hai loại: lanostane và lupine Li WH và cộng sự đã phân lập được 4-lupane sterol: betulic acid, alphitolic acid, 3-Otrans-

p-coumaroyl alphitolic acid và 2-hydroxypyracrenic acid [27] Ngoài ra, vào năm 2005,

khi tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính sinh học, Lim và cộng sự đã tìm thấy một vài hợp chất lanostan từ gai của Gleditsia sinensis [26]

Bảng 1.1 Một số hợp chất nhóm sterol phân lập từ chi Gleditsia

Tên hợp chất Công thức cấu tạo

Acid betulinic [27]

Acid aphiltolic [27]

Stigmast-4-ene-3,6-dion

[28]

Stigmast-3,6-dion

[28]

Stigmasterol [28]

β-sitosterol

[28]

1.1.5.2 Flavonoid

Có khoảng 13 hợp chất flavonoid đã được phân lập và xác định cấu trúc Nhóm

flavonoid lớn nhất được tìm thấy trong chi Gleditsia là flavon [51] Năm 2007, ba flavon đã được phân lập và xác định từ Gleditsia sinensis bởi Zhou và

cộng sự [58]

Đến 2014, Mohammed và cộng sự đã phân lập 8 flavon glycosid và 2 flavon

aglycone từ dịch chiết ethanol của lá Gleditsia triacanthos [33]

1.1.5.3 Alcaloid

Các alcaloid tương đối hiếm ở các loài Gleditsia và chỉ có bốn hợp chất thuộc

nhóm này được báo cáo trong chi này [51]

Vào năm 2010, Kajimoto và cộng sự đã phân lập được một loại isoguanine

glucoside mới từ hạt của Gleditsia japonica và hợp chất này được xác định là

saikachinoside A[19] Trong một nghiên cứu khác, quá trình phân lập theo định hướng

tác dụng sinh học của dịch chiết từ hạt Gleditsia japonica đã tạo ra một loại glucoside

alkaloid purine mới được chỉ định là locustosid A cũng vào năm 2010 [18]

Ngoài ra, vào năm 2014, Lee và các cộng sự đã phân lập được cytochalasin H, sử dụng phương pháp phân đoạn theo hướng tác dụng sinh học Cấu trúc đã được xác định bằng phân tích tinh thể học tia X [24]

Các cuộc điều tra trên đã phát hiện ra tiềm năng xuất hiện của các alkaloid trong chi này Việc nghiên cứu thông qua hướng tác dụng sinh học của cây cũng là một hướng

nghiên cứu tiềm năng đối với nhóm chất này trong chi Gleditsia

1.1.5.4 Một số dẫn chất phenolic

Những hợp chất phenolic được phân lập từ chi Gleditsia với mục đích tìm kiếm

thành phần có tác dụng kháng khuẩn [59] Vào năm 2007, Zhou và cộng sự đã phân lập được hai glycoside acid ellagic được

xác định là methylellagic acid-4′-(5′′-acetyl)-α-L-arabinofuranosid và acid methylellagic-4′-O-α-L-rhamnopyranosid , được phân lập từ Gleditsia sinensis [59]

3-O-Ngoài ra, Zhou và cộng sự cũng đã phân lập được hai dẫn chất acid phenolic từ

gai của G sinensis và xác định chúng là ethyl gallat và acid caffeic cùng năm [58]

Bảng 1.2 Một số dẫn chất phenolic phân lập từ chi Gleditsia

Tên hợp chất Công thức hóa học

3-O-methylellagic acid-4′-(5′′-acetyl)-α-

1.1.6 Tác dụng và công dụng

1.1.6.1 Tác dụng dược lý

Các cây thuộc chi Gleditsia là các vị thuốc cổ truyền có nhiều công dụng Nhiều

nhà nghiên cứu đã điều tra tác dụng dược lý của nó trong các y văn cổ và đã xác nhận tiềm năng chữa bệnh của một số loài theo phương pháp hiện đại Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học cho thấy các nhóm chất được chiết xuất hoặc các hợp chất có hoạt tính của chi này thể hiện nhiều tác dụng sinh học trên lâm sàng như chống tăng sinh khối u, chống viêm, hạ lipid máu, phòng ngừa HIV, chống dị ứng, kháng khuẩn, kháng nấm, giảm đau và chống oxy hóa [51]

1.1.6.1.1 Chống tăng sinh các khối u

Năm 2002, Chow và cộng sự đã tiến hành một nghiên cứu về khả năng ức chế

của dịch chiết quả của G sinensis (GSE) đối với các dòng tế bào ung thư khác nhau

Kết quả cho thấy GSE có khả năng ức chế sự tăng trưởng đáng kể Ngoài ra, thử nghiệm cũng chỉ ra rằng GSE gây mất khả năng tái tạo của bốn dòng tế bào ung thư cố định này Các nhà nghiên cứu đã tiến hành điều tra cơ chế hoạt động và phát hiện rằng GSE (20μg/mL) có thể gây ra sự hình thành oligonucleosomal DNA từ đó gây ly giải tế bào ung thư [10]

Năm 2003, ông và cộng sự tiếp tục nghiên cứu tác dụng trên khối u của cao chiết

Gleditsia sinensis (GSE) Lần này nghiên cứu chỉ ra rằng GSE có khả năng ức chế sự

phát triển tế bào ung thư tủy xương mạn tính K562 và tủy xương cấp tính HL-60 với mức liều lần lượt là 18 ± 1,6 ug/ml và 12 ± 1,3 ng/ml Thực nghiệm tạo khuẩn lạc cũng cho thấy GSE có tác dụng ức chế tái sinh đối với 2 dòng tế bào ung thư trên Ngoài ra, nghiên cứu còn chỉ ra GSE gây chết tế bào ung thư bạch cầu Như vậy, các kết quả này đã đưa ra bằng chứng về việc sử dụng GSE như một tác nhân hóa trị liệu để điều trị cho bệnh nhân ung thư bạch cầu cấp tính và mạn tính [8], [9]

Năm 2016, các nhà khoa học tại Đại học quốc gia Incheon (Hàn Quốc) tiếp tục

thực hiện nghiên cứu về tác dụng chống ung thư của cao chiết loài G.sinensis L., thực

hiện trên tế bào ung thư tuyến tiền liệt PC3 Kết quả cho thấy rằng cao chiết nước gai

G sinensis L (WEGST) nồng độ 100 ng/ml gây suy giảm đáng kể các tế bào PC3 Bên

cạnh đó, việc sử dụng WEGST đường uống còn có tác dụng ức chế một phần việc hình thành khối u invivo bằng cách gây chết tế bào PC3 [38]

1.1.6.1.2 Kháng khuẩn và kháng nấm

Năm 2007, Zhou và cộng sự đã thực hiện nghiên cứu cho thấy cắn chiết ethanol

của gai G sinensis cho thấy hoạt tính ức chế đáng kể đối với Bacillus subtilis và

Xanthomonas vesicatoria dựa trên kích thước vùng ức chế 9,5 và 9,2 mm, bằng cách so

sánh với streptomycin (đường kính vùng ức chế 21,5 và 13,8 mm tương ứng) Trong số các phân đoạn chiết xuất ethanol, phân đoạn acetidin thể hiện tác dụng ức chế rõ rệt hơn

đối với Bacillus subtilis và Xanthomonas vesicatoria với đường kính vùng ức chế là

14,5 và 11,3 mm, và nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) là 1,25 và 5 mg/mL Do đó, việc phân lập và làm sáng tỏ thêm, các hợp chất kháng khuẩn đã được tiến hành phân lập bằng sắc ký cột và bảy hợp chất đã được tách ra Trong số các hợp chất này, hợp chất

số 47, 48 và 63 được đánh giá hoạt tính kháng khuẩn đối với Bacillus subtilis (MIC 0,5; 0,5; 0,125 mg/mL) và Xanthomonas vesicatoria (MIC 0,75; 0,75; 0,125 mg/mL) Những

dữ liệu này được so sánh với đối chứng dương với giá trị MIC là 0,078 và 0,010 mg/mL và cho thấy khả năng kháng khuẩn đáng kể của cách chất được phân lập [59]

Cũng vào năm 2007, họ đã thử khả năng kháng nấm của dịch chiết phân đoạn

ethyl acetate từ dịch chiết ethanol của gai Gleditsia sinensis đã tạo ra hai glycoside acid

ellagic Hai hợp chất này đã được thử nghiệm khả năng chống lại sự nảy mầm của bào

tử nấm Magnaporthe grisea Kết quả là hợp chất số 59 và 60 có hoạt tính ức chế khiêm

tốn với giá trị IC50 lần lượt là 13,56 và 16,14 μg/mL [58] 1.1.6.1.3 Phòng ngừa HIV

Năm 1995, Konoshima phân lập được 1 hợp chất từ Gleditsia triacanthos, hợp

chất này đã được đánh giá hoạt tính kháng HIV chống lại sự nhân lên của HIV trong tế bào H-9 Hợp chất này thể hiện hoạt tính kháng HIV đáng kể với giá trị EC50 là 1,1 μM [22]

Năm 2007 Li và cộng sự đã thử nghiệm một hợp chất chống lại sự sao chép của HIV-1 trong tế bào C8166 và phát hiện ra rằng hợp chất này có hoạt tính chống HIV mạnh (EC50 < 0,064 μg/mL) [27]

1.1.6.1.4 Tác dụng chống viêm

Năm 2012, Choi và các cộng sự đã làm nghiên cứu đối với vỏ quả của Gleditsia

sinensis Nghiên cứu cho thấy chất chiết được có tác dụng tăng cường kích thích biểu

hiện của các gen Nrf2, tạo ra các emzym có tác dụng chống viêm bao gồm cysteine ligase và NAD (P) H dehydrogenase [quinone] 1 [7]

Glutamate-Năm 2014, Kim và các cộng sự đã làm nghiên cứu đối với vỏ quả của Gleditsia

sinensis Nghiên cứu cho thấy chất chiết được từ vỏ quả có tác dụng làm giảm tình trạng

viêm phổi do Lipopolysaccharid gây ra trên chuột nhờ kích thích các gen Nrf2 [21] Năm 2002, Dai và các cộng sự đã nghiên cứu tác dụng của dịch chiết ethanol 70% của

quả cây Gleditsia sinensis Nghiên cứu cho thấy dịch chiết có tác dụng ức chế đối với

tình trạng viêm cấp tính bằng cách làm giảm tác dụng gây viêm của các chất háo học trung gian như serotonin [13]

1.1.6.2 Công dụng trong dân gian

Trong dân gian thường sử dụng ba bộ phận của cây Bồ kết để làm thuốc:

Quả bồ kết (đại tạo giác - Fructus Gleditsiae), là quả chín khô hoặc quả giả được

phơi sấy khô Khi dùng phải bỏ hạt, dùng sống hoặc tẩm nước cho mềm, sấy khô Có khi đốt thành than, tán bột Công năng: Khai khiếu, tiêu đờm, tán kết, tiêu thũng Chủ trị: Trúng phong cấn răng, đàm thịnh, quan khiếu không thông, họng đau tê đờm trướng ngại, ho suyễn khó khạc đờm, đại tiện táo kết Dùng ngoài trị nhọt độc sưng tấy

Gai bồ kết (tạo thích, tạo giác thích - Spina Gleditsiae), là gai hái ở thân cây bồ

kết, đem về phơi hay sấy khô hoặc thái mỏng rồi phơi hay sấy khô Công năng: Tiêu thũng, trừ độc, trừ mủ, sát trùng Chủ trị: Nhọt độc sơ khởi hoặc làm mủ không vỡ Dùng ngoài điều trị ngửa, lở, hủi

Hạt bồ kết (tạo giác tử - Semen Gleditsiae), là hạt lấy ở quả bồ kết chín đã phơi

hay sấy khô Công năng: tiêu thũng, nhuận tràng Chủ trị: Thông đại tiện, bí kết, chữa mụn nhọt [1], [2], [3]

1.2 Tổng quan về loài Gleditisa australis

1.2.1 Đặc điểm thực vật

Theo thực vật chí Trung Quốc mô tả bồ kết quả nhỏ: Cây gỗ, cao 3-20 m Cành màu nâu xám, có gai cứng Gai màu nâu tím, hình nón, dài 3-5 cm, phân nhánh Lá hình lông chim hoặc lông chim kép (2-6 cặp), 10-18 cm; cuống lá khoảng 1mm; lá chét 5-9 đôi, hình elip xiên đến thuôn dài (2,5-4 × 1-2 cm), phía dưới nhẵn, gân lá hình mạng, mờ, mép có răng cưa, đỉnh tròn Hoa màu xanh nhạt hoặc trắng xanh; cuống 1-2,5 mm Hoa đực: đường kính 4-5 mm, cụm hoa mọc thành chùm, hoa có lông; lá đài 5, hình mác, bên ngoài dày đặc lông; cánh hoa 5, hình elip, dày khoảng 2 mm, có nhiều lông Hoa lưỡng tính: đường kính 7-9 mm; cụm hoa đực bề mặt nhẵn; thùy đài hoa 5 hoặc 6, hình mác, khoảng 3mm, có lông Tràng hoa màu nâu nhạt có lông tơ; tràng hoa 5 hoặc 6, hình elip, mặt ngoài có lông Nhị 5, chưa bung ra Bầu nhụy không cuống, màu nâu nhạt Quả họ đậu có cuống, màu nâu đen khi khô (6-12 × 1-2,5 cm), thẳng hoặc hơi cong, dạng van, các hạt nổi lên rõ rệt Hạt 5-12, màu nâu đậm đến nâu đen, hơi dẹt, hình elip đến thuôn dài, 7-11 × 4-5 mm, nhẵn [47]

1.2.2 Đặc điểm dược liệu từ Gleditsia australis

Gai bồ kết: Gai phân nhánh, các gai chính to hơn và thường mang 1 đến 2 nhánh gai nhỏ Gai chính hình nón dải, chiều dài từ 3 cm đến 15 cm, đường kính từ 0,3 cm đến

1 cm; gai nhánh dài từ 1 cm đến 6 cm, đỉnh nhọn Mặt ngoài màu nâu đến nâu tía Thể chất cứng, khó bẻ gãy Dược liệu đã thái lát: Các lát thường thon về phía đỉnh (ngọn) bên trong có phần gỗ màu trắng hơi vàng, phần tủy màu hơi nâu đỏ; chất giòn, dễ bẻ gãy [1]

Quả bồ kết: Quả dẹt và hơi cong, dài 5 cm đến 11 cm, rộng 1,5 cm đến 2 cm Mặt ngoài nâu phủ chất sáp màu trắng tro, lấm tấm như bột, lau sạch có màu sáng bống, dễ thấy các bướu và tuyên nhỏ, các vết nứt dạng vân lưới Đỉnh quả có gốc vòi nhụy tồn tại dạng mò chim, gốc quả có vết sẹo của cuống quả Chất cứng, giòn, dễ gẫy Mặt gẫy màu vàng nâu đến lục nhạt, giữa xốp hoặc chứa hạt Mùi hăng nhẹ, vị ngọt sau hơi cay [1]

Hình 1.1 Loài Gleditsia australis [47]

1.2.4 Thành phần hóa học

Năm 1961, Giáo sư Đỗ Tất lợi cùng các cộng sự đã chiết được chất saponin tinh khiết với hiệu suất 10% Chất saponin này không mùi, vị nhạt, gây hắt hơi mạnh Từ chất saponin này, họ đã thuỷ phân và kết tinh được chất sapogenin có tinh thể hình kim tụ thành hình ngôi sao, không tan trong nước, tan trong ether, cồn, clhorofom, độ nóng chảy 298-301 độ C Hiệu suất sapongenin từ quả bồ kết là 3%

Năm 1929 một tác giả Nhật Bản chiết từ bồ kết cùng loài nhưng mọc ở Nhật Bản được chất saponin cấu tạo triterpen và gọi là gleditsapogenin và glucose ngoài ra còn có arabinose

Năm 1963, Bùi Đình Sang có chiết được từ bồ kết Việt Nam Saponin, men peroxydase và 2 chất khác có tinh thể chưa xác định được tính chất

Năm 1969, Ngô Thị Bích Hải đã chiết được từ quả bồ kết Việt Nam 8 chất flavonoid và 7 hợp chất triterpene 5 trong 8 chất flavonoid đã được rút ra dưới dạng tinh khiết và xác định là luteolin, saponaretin, vitexin, homoorientin và orientin [3]

+ Chữa chứng tức ngực ở phụ nữ [3]

CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng

Quả Bồ Kết (Gletditsia australis) Việt Nam được thu hái ở xã Cần Kiệm, huyện

Thạch Thất, thành phố Hà Nội vào tháng 8/2022 Thu hái quả chín, phơi khô và được đóng gói bảo quản ở phòng thí nghiệm bộ môn Dược học cổ truyền - Khoa Dược liệu Dược cổ truyền - Trường Đại học Dược Hà Nội để làm thực nghiệm

Hình 2.1 Mẫu quả bồ kết - Fructus Gleditsiae

2.2 Hóa chất dung môi

- Dung môi công nghiệp: n-hexan, dicloromethan (DCM), methanol (MeOH), ethanol (EtOH), ethyl acetat (EtOAc), aceton, nước (H2O), n-butanol, H2SO4 đặc,…

- Bản mỏng tráng sẵn pha thường silicagel F254 (Merck), pha đảo RP-18 F254, chất hấp phụ silicagel pha thường (cỡ hạt 0,040 – 0,063 mm, Merck), silicagel pha đảo (75 pm YMC Co., Ltd, Nhật)

2.3 Máy móc, trang thiết bị nghiên cứu

- Máy đo phổ cộng hưởng hạt nhân (NMR) của Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học Việt Nam: Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer (Billerica, Massachusetts, Hoa Kỳ) - Bể siêu âm VEVOR Ultrasonic Cleaner 10L (Ruianshisuikangxieyeshanghang) - Máy cất quay Rotavapor R-124, Rotavapor R-210 (Buchi, Switzerland, Thụy Sŷ) - Máy cất quay chân không Rotavapor R-220 Pro 20L (Buchi, Thụy Sỹ),

- Bếp cách thủy Memmert WNB14 (Đức) - Tủ sấy Binder FD 115 (Đức), Memmert UF110 (Đức)

- Cân kỹ thuật Ohaus PA2102 (Mỹ), cân phân tích Precisa XT 220A (Precisa, Thụy Sĩ) - Đèn tử ngoại VL-6.LC hai bước sóng 254 nm và 366 nm (Vilber, Pháp)

- Các dụng cụ thủy tinh dùng trong phòng thí nghiệm như: Cột sắc ký, bình gạn, bình nón, cốc có mỏ, phễu lọc, ống nghiệm, ống đong, pipet, đũa thủy tinh, mao quản,

2.4 Nội dung nghiên cứu

Dùng phương pháp sắc ký cột phân lập các hợp chất từ cao phân đoạn n-butanol

của quả bồ kết và xác định cấu trúc hóa học bằng máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

2.5 Phương pháp nghiên cứu 2.5.1 Phương pháp chiết xuất cao toàn phần

Bước 1: Xử lý nguyên liệu: Dược liệu được làm sạch, cắt nhỏ, sau đó trải đều lên

khay cho vào tủ sấy ở nhiệt độ 65oC, sấy liên tục Trong quá trình sấy, đảo nguyên liệu cứ 1 tiếng một lần cho tới khi kiểm tra độ ẩm nguyên liệu < 10% Sử dụng thuyền tán hoặc máy xay, làm nhỏ nguyên liệu dược liệu đã được sấy khô Phần dược liệu sau khi được nghiền nhỏ/xay thô, chuyển vào các bình thủy tinh dung tích 10L, cho vào lượng dược liệu khoảng 4/5 bình theo thể tích, sau đó bổ sung ethanol 96% sao cho đảm bảo phần dược liệu trong bình đã ngập trong dung môi chiết và để ở nhiệt độ phòng 24 tiếng (ngâm lạnh)

Bước 2: Ngâm nóng và chiết siêu âm nóng: Sau khi các bình đã ngấm dung môi và

mực dung môi thấp hơn mực nguyên liệu trong bình thì bổ sung thêm ethanol đảm bảo dung môi ngập trên dược liệu Ngâm bình nguyên liệu trên vào bếp gia nhiệt, đặt nhiệt độ 45oC và ngâm liên tục trong 24 tiếng Siêu âm: Các bình sau khi ngâm nóng đủ ít nhất 24 tiếng, sẽ được chia nhỏ, sau đó siêu âm 3 lần liên tục, mỗi lần 30 phút, mỗi lần siêu âm cách nhau 30 phút Ngay sau lần siêu âm cuối, bình sẽ được mang lọc nóng thu dịch lọc, phần bã dược liệu thì cho lại vào bình ngâm và bổ sung ethanol 96% vừa đủ cho ngập dược liệu

Bước 3: Lặp lại bước 2 thêm 2 lần Dịch chiết thu được của 3 lần chiết siêu âm được

gộp lại, cô quay thu hồi dung môi, cắn thu được sau cô quay là cao toàn phần

2.5.2 Phương pháp chiết xuất cao phân đoạn Bước 1: Xác định khối lượng cao tổng bằng cân kỹ thuật

Bước 2: Chiết lần lượt 3 phân đoạn n-hexan → ethyl acetat → n-butanol

- Bình chiết 2 lít dùng chiết tối đa 200 gram cao tổng, khối lượng cao tổng lớn hơn thì phân chia nhiều lần

- Cho khoảng 30ml nước cất vào bình chiết, sau đó cho cao vào bình chiết, bổ sung nước cất vào bình chiết sao cho lượng cao và nước cất khoảng 1,5 lít

- Bổ sung 500 ml dung môi chiết, lẩn lượt chiết lỏng - lỏng bằng các dung môi sau: hexan → ethyl acetat → n-butanol

n Lắc liên tục trong khoảng 15n 20 phút - Để lắng trong khoảng 4-8 tiếng hoặc cho tới khi lớp trên trong suốt - Mở khóa, thu dịch chiết nước riêng Lấy lớp trên đem cô quay thu hồi dung môi được cắn phân đoạn Lớp nước dưới tiếp tục cho lại vào bình chiết

- Thực hiện 3 lần với mỗi loại dung môi chiết Cắn từng phân đoạn được gộp riêng

2.5.3 Phương pháp phân lập hợp chất

2.5.3.1 Phân lập bằng sắc ký cột

Các phân đoạn được phân lập bằng sắc ký cột silica gel pha thường (Merck), sắc ký cột silica gel pha đảo RP-18 Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn 60 GF254 (Merck), RP-18 (Merck) Sắc ký lớp mỏng dùng để theo dõi vết các chất từ các phân đoạn Sắc ký đồ được quan sát dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm và 366 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% trong ethanol

Nguyên tắc: Sắc ký cột hấp phụ dựa trên sự phân bố khác nhau của các thành phần trong mẫu với hai pha không trộn lẫn, trong đó pha động là chất rửa giải, pha tĩnh là chất hấp phụ dạng bột mịn được nhồi trong cột thủy tinh Có thể triển khai liên tục với các hệ dung môi khác nhau có độ phân cực thay đổi từ yếu đến mạnh Chất nhồi cột là silica gel pha thường hoặc silica gel pha đảo

Cột thủy tinh: chọn cột thủy tinh thành dày thích hợp, chiều dài cột gấp khoảng 3 lần thể tích silica gel cần thiết cho quá trình phân lập

Với silicagel pha thường

- Chuẩn bị cột: Chọn cột thủy tinh có đường kính thích hợp Cột được rửa sạch, tráng bằng MeOH, để khô tự nhiên Lót bông ở đáy cột và cố định chắc chắn lên giá theo phương thẳng đứng

- Nhồi cột: Cân lượng silicagel phù hợp (tối thiểu lượng silicagel gấp khoảng 3-5 lần lượng mẫu) cho vào cốc có mỏ sạch Chuẩn bị một cốc có mỏ to khác khoảng 1000ml chứa dung môi rửa giải, cho từng lớp silicagel vào cốc chứa dung môi trên, vừa cho vừa khuấy để silicagel trương nở đều, hết silicagel khuấy tiếp cho bớt bọt Dùng pipet (10ml) hút hỗn dịch trên đưa lên cột đã chuẩn bị (mở khóa cột), chú ý tưới lên thành cột và tưới

đều xung quanh cột đồng thời gõ đều vào dưới cột để silicagel được trải đều trong cột Rót tiếp dung môi rửa giải để dội sạch silicagel dính trên thành cột và để ổn định 24h Cần chú ý lọ hứng bên dưới xem silicagel có bị chảy ra không, không chảy ra là được, nếu chảy ra xem lại bông lót Giữ lại một ít dung môi để cột không bị khô trước khi khóa cột và chuẩn bị đưa mẫu lên cột

- Chuẩn bị mẫu: Mẫu được hòa tan với một lượng dung môi tối thiểu đến khi tan hoàn toàn (có thể siêu âm để tan tốt hơn), sau đó dải đều từng lớp silicagel, trộn đều đến khi hỗn hợp khô tơi, sấy ở 50oC, thỉnh thoảng dùng đũa thủy tinh đảo đều đến khi thu được bột khô và tơi, nghiền bằng chày cối cho mịn trước khi đưa lên cột

- Nạp mẫu: Xả bớt lượng dung môi còn lại trên cột sau đó đưa từ từ mẫu qua phễu lên cột đồng thời gõ đều bên dưới cột để mẫu được trải đều, tránh vón thành cục và xuất hiện nhiều bọt khí

- Rửa giải: Cho hệ dung môi thích hợp vào cột đã được nạp mẫu, sử dụng pipet tưới đều quanh miệng cột, tránh làm xáo động mẫu vừa nạp Trong quá trình rửa giải liên tục bổ sung dung môi để đảm bảo cột không bị khô

- Thu dịch: hứng dịch rửa giải vào các lọ thủy tinh, ống nghiệm với thể tích phù hợp Theo dõi quá trình rửa giải bằng sắc kí lớp mỏng để gộp các lọ, ống nghiệm có cùng sắc kí đồ Loại bỏ dung môi thu được cắn

- Kiểm tra độ tinh khiết: Các hợp chất phân lập được kiểm tra sơ bộ bằng sắc kí lớp mỏng và đo HPLC So sánh sắc ký đồ của mẫu được rửa giải từ cột được so sánh với sắc ký đồ của cao tổng để kiểm soát Đồng thời chạy TLC nhiều hệ dung môi khác nhau để kiểm tra sự tinh khiết của mẫu

Với silicagel pha đảo

- Chuẩn bị cột: Cột thủy tinh có khóa, rửa sạch, tráng bằng MeOH (đối với cột pha đảo, chỉ sử dụng MeOH chai – có độ tinh khiết cao, tuyệt đối không dùng MeOH can), để khô tự nhiên, cố định trên giá theo phương thẳng đứng, lót bông vào đáy cột (Hạt pha đảo có thể tái sử dụng được)

- Nhồi cột: Cân lượng silicagel pha đảo phù hợp cho vào cốc có mỏ, tạo hỗn dịch với dung môi là MeOH, rót lên cột, mở van cho dung môi chảy xuống, để lắng, tưới thành cột bằng MeOH, để ổn định cột Giữ lại ít dung môi trên cột tránh khô cột (tương tự với cột silicagel pha thường)

- Trước khi tiến hành nạp mẫu, luyện cột với dung môi rửa giải thích hợp với thể tích dung môi gấp 2 lần chiều cao silicagel trên cột

- Nạp mẫu: Mẫu được hòa tan vào lượng tối thiểu MeOH (siêu âm), xả hết dung môi trên cột, đưa mẫu lên cột bằng pipet pasteur cho qua 1 pipet dài khác để hạn chế dính lên thành cột (khóa van) Rửa thành bằng ít MeOH

- Rửa giải: Mở van cho chảy xuống hết bề mặt khô, cho hệ dung môi rửa giải thích hợp (ít) vào cột đã được nạp mẫu => chảy đến khi chất xuống Si thì bổ sung hệ dung môi

rửa giải (nhiều) Trong quá trình rửa giải liên tục bổ sung dung môi để đảm bảo cột không bị khô (nguyên tắc bổ sung dung môi luôn là tưới nhẹ lên thành bình để không xáo động mẫu)

- Thu dịch: Hứng dịch rửa giải vào các lọ thủy tinh hoặc ống nghiệm với thể tích phù hợp Theo dõi quá trình rửa giải bằng sắc ký lớp mỏng để gộp các lọ, ống nghiệm có cùng sắc ký đồ Loại bỏ dung môi thu được cắn

- Kiểm tra độ tinh khiết: Các hợp chất phân lập được kiểm tra sơ bộ bằng sắc kí lớp mỏng và đo HPLC

- Chú ý: dung môi rửa giải pha đảo thường là MeOH: Nước => có nước thì phải siêu âm để đuổi bọt khí trước khi đưa lên cột

- Gộp các lọ: + Cân cốc hoặc lọ sạch khô để đựng, dán nhãn kí hiệu gộp phân đoạn nào của cột nào, khối lượng cốc lọ là bao nhiêu

+ Gộp các lọ có sắc kí đồ giống nhau vào cốc lọ đã dán nhãn trên, tráng lại lọ bằng dung môi (MeOH), đưa vào bếp cách thủy (trong tủ hốt, đặt nhiệt độ 50- 60oC) nếu dịch nhiều thì tiến hành cô bằng máy cô quay thu được cắn

2.5.3.2 Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC)

- Nguyên tắc: Dựa trên cơ chế hấp phụ Chất phân tích được chấm lên bản mỏng sẽ di chuyển trên một lớp chất hấp phụ mịn, theo một chiều nhất định Tùy thuộc vào hệ dung mỗi pha động và khả năng hấp phụ của các thành phần trong chất phân tích sẽ tạo ra các vết sắc ký ở các vị trí khác nhau

- Trong khóa luận, sắc ký lớp mỏng được sử dụng để lựa chọn hệ dung môi pha động trước khi lên cột và theo dõi quá trình rửa giải trong quá trình chạy cột

- Bản mỏng: Thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn silicagel pha thường (TLC-Silicagel 60 F254, Merck) và pha đảo RP-18 F254 (Merck), được hoạt hóa bằng cách sấy ở 110oC trong 30 phút

- Dung môi pha động: Sử dụng hệ dung môi đơn hoặc đa thành phần được trộn với nhau theo một tỷ lệ thích hợp

- Phát hiện các hợp chất bằng cách quan sát sắc ký đồ dưới ánh sáng tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 366 nm hoặc nhúng bản mỏng trong dung dịch acid sulfuric 10% trong ethanol (TT), sấy khô rồi hơ nóng đến khi hiện vết màu

2.5.3.3 Phương pháp xác định cấu trúc phân tử hợp chất

- Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được dựa vào các tính chất lý hóa (trạng thái, màu sắc), phổ cộng hưởng tử hạt nhân (1H-NMR, 13C- NMR), kết hợp so sánh các dữ liệu thu được từ thực nghiệm với các tài liệu đã công bố