TỔNG QUAN
Hoạt tính kháng tế bào ung thư của các dẫn chất chất 2H-chromen
Các dẫn chất 2H-chromen hay còn gọi là 2H-benzopyran là một nhóm hợp chất hữu cơ hệ dị vòng với cấu trúc đơn giản, gồm một vòng pyran liên kết với một vòng benzen Khung chromen có mặt trong nhiều các hợp chất tự nhiên khác nhau và có hoạt tính sinh học cao Các dẫn chất chromen đã được chứng minh có nhiều đặc tính dược lý đa dạng, bao gồm: kháng virus [15], [16], chống ung thư [13], [44], chống viêm [16], Trong đó, deguelin là một rotenoid tự nhiên cho thấy tác dụng chống tăng sinh, chống di căn và gây chết tế bào theo chương trình (apoptosis) mạnh mẽ trên các tế bào biểu mô phế quản ác tính của người và nhiều tế bào ung thư khác nhau mà ít gây độc tế bào đối với các tế bào bình thường [29]
Protein Hsp90 là chaperone có vai trò điều hòa sự hình thành và ổn định của các protein truyền tín hiệu (vai trò sinh lý) [14], [42] Trong các tế bào ung thư, Hsp90 thúc đẩy sự tiến triển và di căn của khối u nhờ tác động lên nhiều protein truyền tín hiệu như STAT3, HER2, HIF-1a [14], [31] Các nghiên cứu về cơ chế chỉ ra rằng deguelin can thiệp vào chức năng của Hsp90 bằng cách ức chế liên kết ATP, gây phân hủy yếu tố phiên mã HIF-1α, cho thấy deguelin là một chất dẫn đường tiềm năng trong việc điều trị ung thư, nhất là đối với ung thư phổi [36] Tuy nhiên, trên thực tế deguelin đã được báo cáo gây ra các triệu chứng giống hội chứng Parkinson thông qua thoái hóa con đường dopaminergic và ức chế phức hợp I của ty thể (của neuron thần kinh) chuột [9].
Vì vậy, nhóm nghiên cứu của Kim phát triển các dẫn chất tương tự deguelin để giảm bớt độc tính này như: SH-1242 được tạo ra bằng cách cắt các vòng B và C, còn
L80 được tạo ra bằng cách cắt vòng C của deguelin [26] (Sơ đồ 1.1) Cả hai chất này đều thể hiện hoạt tính kháng tế bào ung thư trên nhiều dòng tế bào khác nhau Nhóm nghiên cứu của Lee và cộng sự đã chỉ ra rằng, SH-1242 liên kết với tiểu phân gắn ATP ở đầu C của Hsp90, làm gián đoạn khả năng tương tác của chất này với các co-chaperon và protein đích, đồng thời kích hoạt sự phân hủy của các protein đích mà không ảnh hưởng đến sự biểu hiện của Hsp90 [30] Trong khi đó, L80 có tác dụng ức chế khả năng sống, hình thành cụm tế bào, hình thành mạch máu, di căn và xâm lấn của các dòng tế bào ung thư biểu mô phổi không phải tế bào nhỏ (NSCLC) và ung thư vú bộ ba âm tính (TNBC) [14], đồng thời gây độc tính tối thiểu cho các tế bào bình thường [26]
Sơ đồ 1.1 Phát triển các hợp chất mới từ deguelin
Năm 2012, Chang và cộng sự đã trình bày nghiên cứu liên quan đến cấu trúc - tác dụng sinh học của các hợp chất phát triển từ khung deguelin Trong đó, hợp chất SH-
1242 thể hiện hoạt tính tốt, với IC50 là 0,14 μM trên dòng tế bào H1299, gần như ngang bằng với deguelin Đáng chú ý, việc loại bỏ nhóm thế 5-methoxy trong khung 2,2- dimethyl-2H-chromen của SH-1242 (hình thành hợp chất (1)) làm giảm đáng kể hoạt tính (IC50 hợp chất (1) = 1 μM trên cùng dòng tế bào, Hình 1.1) Điều này cho thấy phần cấu trúc 5-methoxy-2,2-dimethyl-2H-chromen trên khung deguelin ban đầu rất quan trọng đối với hoạt tính ức chế Hsp90, từ đó đem lại tác dụng kháng tế bào ung thư tốt [11]
Hình 1.1 So sánh IC 50 của SH-1242 và hợp chất (1)
Novobiocin, một kháng sinh coumarin có nguồn gốc từ xạ khuẩn Streptomyces niveus, đã được chứng minh là có hoạt tính ức chế Hsp90 Tuy nhiên, IC50 của novobiocin được ghi nhận lên tới 700 μM, khiến chất này khó sử dụng trong lâm sàng [34] Hợp chất NCT-50 được phát triển từ khung novobiocin-deguelin, sau đó được nhóm nghiên cứu của Nguyễn Công Trường công bố như một chất chống ung thư nhắm tới đích Hsp90 với độc tính giảm trên gan và mắt ở cả thử nghiệm in vitro và in vivo Kết quả nghiên cứu cho thấy, giá trị IC50 của NCT-50 gần tương đương với deguelin trên dòng tế bào ung thư phổi H1299 và vượt trội hơn trên dòng tế bào A549 (Hình 1.2) [22] Cơ chế tác dụng của NCT-50 là gây chết tế bào theo chương trình (apoptosis) ở các tế NSCLC, đồng thời ức chế sự biểu hiện và hoạt động của một số protein phụ thuộc Hsp90, bao gồm yếu tố phiên mã HIF-1α mà không gây độc tính đến các tế bào bình
4 thường [22] Ngoài ra, NCT-50 còn ức chế khả năng tạo mạch của các tế bào NSCLC, hạn chế sự phát triển và di căn của khối u nguyên phát Do đó chất này có tiềm năng trong việc khắc phục tình trạng kháng các loại thuốc hiện đang được sử dụng để điều trị ở các bệnh nhân mắc NSCLC như: paclitaxel, cisplatin hoặc pemetrexed [22]
Hình 1.2 Thiết kế cấu trúc NCT-50 từ novobiocin và deguelin
Một hợp chất khác phát triển từ khung deguelin là NCT-58 (Hình 1.3), được nhóm nghiên cứu của Park và cộng sự công bố vào năm 2021 Khi khảo sát tác dụng của NCT-
58 phụ thuộc vào liều dùng (0,1-20 μM trong 72 giờ), kết quả cho thấy chất này làm giảm khả năng sống của tế bào ung thư biểu mô tuyến vú HER2 dương tính BT474 và SKBR3 [39] Nghiên cứu trước đây của Kim chỉ ra rằng tỉ lệ kiểu hình CD44 high /CD24 low cao là dấu hiệu của sự kháng trastuzumab Khi xử lý các tế bào JIMT1 kháng trastuzumab bằng NCT-58, thu được kết quả tỉ lệ CD44 high /CD24 low giảm đáng kể, đồng thời ức chế sự hình thành khối u ở tuyến vú Bằng cách phân tích chu kỳ tế bào, nhóm nghiên cứu của Park và cộng sự xác định NCT-58 không ảnh hưởng đến tế bào biểu mô tuyến vú bình thường của người (MCF-10A) [39]
Hình 1.3 Công thức cấu tạo của NCT-58
NCT-547 là hoạt chất được tối ưu hóa cấu trúc từ deguelin và L-80 (Hình 1.4) Nhóm nghiên cứu của Park và cộng sự thực hiện đánh giá tác dụng của NCT-547 lên khả năng gây chết tế bào theo chương trình ở các dòng tế bào ung thư vú HER2 dương tính, bao gồm các dòng nhạy cảm với trastuzumab (BT474 và SKBR3) và các dòng kháng trastuzumab (JIMT-1 và MDA-MB-453) Kết quả cho thấy NCT-547 gây ra hiện tượng apoptosis trên tất cả các dòng tế bào này, kèm theo sự tích lũy tế bào ở pha sub- G1 và sự hoạt hóa enzym caspase-3 và caspase-7 [38] Ngoài ra, NCT-547 còn làm giảm sự có mặt của các phức hợp HER2/HER3 và HER2/EGFR, cũng như ngăn chặn sự tương tác giữa Hsp90 và HER2 trong các dòng tế bào BT474 và JIMT-1 [38]
Hình 1.4 Thiết kế cấu trúc NCT-547 từ deguelin và L80
Như vậy, cả NCT-58 và NCT-547 đều có khả năng làm giảm đáng kể kích thước khối u trong thử nghiệm in vivo Trong đó, NCT-58 được báo cáo là có ảnh hưởng tối thiểu đến tế bào bình thường còn NCT-547 hiện không ghi nhận các ảnh hưởng độc hại nào trong phân tích chức năng gan và thận ban đầu.
Hoạt tính kháng tế bào ung thư của các dẫn chất Anthranilamid (2- aminobenzamid)
Anthranilamid (2-aminobenzamid) là hợp chất hữu cơ có cấu trúc hóa học gồm vòng benzen và nhóm amino ở vị trí ortho so với nhóm chức amid chính (-CONH2)
PTK787 (N-(4-clorophenyl)-4-(pyridin-4-ylmethyl)phthalazin-1-amin, Hình 1.5) là một chất ức chế tyrosine kinase mạnh và chọn lọc của thụ thể yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu - 1, 2, 3 (VEGFR - 1, 2, 3), thụ thể yếu tố tăng trưởng có nguồn gốc tiểu cầu (PDGFR) và thụ thể yếu tố tăng trưởng tế bào gốc (SCFR, còn gọi là C-Kit) PTK787
6 được đánh giá có hoạt tính chống khối u tốt, và đã được thử nghiệm lâm sàng trong điều trị ung thư vú, ung thư đại trực tràng, và các bệnh ung thư khác [7], [21]
Năm 2003, Furet và cộng sự cho rằng phần anthranilamid có liên kết hydro nội phân tử mạnh giữa H của nhóm amin và O của nhóm amid, từ đó tạo thành một vòng sáu cạnh giả tương tự với vòng phthalazin của PTK787 [19] Như vậy, dựa trên cấu trúc của PTK787, các nhà nghiên cứu đã tổng hợp một loạt các dẫn chất anthranilamid với kỳ vọng chúng có hoạt tính kháng tế bào ung thư tương tự PTK787 [23], [32]
Hình 1.5 Các dẫn chất anthranilamid tiềm năng trong điều trị ung thư
Hai chất dẫn đường có chứa khung anthranilamid là AAL993 (2-((4-pyridyl) methyl)amino-N-(3-(trifluoromethyl)phenyl)benzamid, Hình 1.5) và CI-1040 (2-((2- cloro-4-iodophenyl)amino)-N-(cyclopropylmethoxy)-3,4- difluorobenzamid, Hình 1.5) Trong đó, AAL993 là một chất có đặc tính chống khối u mạnh, sinh khả dụng qua đường uống cao, ức chế chọn lọc và mạnh mẽ các VEGFR [33] còn CI-1040 là chất ức chế MEK1/2 đầu tiên được đưa vào thử nghiệm lâm sàng, với khả năng kháng lại tế bào ung thư ở cả môi trường in vitro và in vivo [4] Khung anthranilamid có trong các cấu trúc này được coi là nguyên nhân tạo ra các đặc tính kháng ung thư mạnh [24]
Năm 2013, nhóm nghiên cứu của Liu và cộng sự đã tổng hợp và thử hoạt tính sinh học của một loạt các dẫn chất anthranilamid mới, trong đó có các chất (2a-d) (Hình 1.6) [32] Các chất này được đánh giá về hoạt tính kháng tế bào ung thư trên thông qua ức chế VEGFR-2 trên dòng tế bào ung thư ruột kết (HCT-116) và dòng tế bào ung thư biểu mô tuyến vú (MDA-MB-231) trong điều kiện in vitro
Hình 1.6 Giá trị IC 50 của một số dẫn chất có khung anthranilamid
Kết quả cho thấy các dẫn chất trên có tác dụng kháng tế bào ung thư mạnh và chọn lọc thông qua con đường ức chế VEGFR-2 Trong đó, hợp chất (2c) có hoạt tính rõ rệt nhất trên cả hai dòng tế bào với giá trị IC50 là 14,60 μmol/L (HCT 116) và 13,86 μmol/L (MDA-MB-231) (Hình 1.6) [32] Tác động của (2c) đối với quá trình chết tế bào theo chương trình (apoptosis) và chu kỳ tế bào đã được nghiên cứu bằng kỹ thuật đếm tế bào dòng chảy Hợp chất (2c) ngăn chặn tế bào từ pha S sang pha G2-M, tạo ra sự tích lũy ở các pha G1 và S trong tế bào HCT-116 Kết quả này cho thấy rằng hợp chất (2c) có thể làm rối loạn quá trình nhân đôi của DNA trong tế bào ung thư.
Định hướng thiết kế cấu trúc
Dựa vào phần lý thuyết đã trình bày ở trên, nhóm nghiên cứu của chúng tôi thấy rằng phần cấu trúc 5-methoxy-2,2-dimethyl-2H-chromen có tác dụng ức chế đầu C của Hsp90, từ đó đem lại tác dụng kháng tế bào ung thư tốt (SH-1242, NCT-50, NCT-58,
Hình 1.7 Định hướng thiết kế cấu trúc từ khung 5-methoxy-2,2-dimethyl-2H-chromen
Bên cạnh đó, khung anthranilamid cũng được chứng minh là phần cấu trúc mang dược tính tiềm năng trong việc kháng tế bào ung thư ruột kết và ung thư biểu mô tuyến vú [23], [24], [32] (Hình 1.8)
Hình 1.8 Định hướng thiết kế cấu trúc từ khung anthranilamid
Tiếp nối các nghiên cứu trước đây, nhóm chúng tôi thiết kế các công thức mới bằng việc lai hóa giữa hai phần mang dược tính là 5-methoxy-2,2-dimethyl-2H-chromen và khung anthranilamid (Hình 1.9) Đồng thời, gắn thêm các nhóm morpholin-4-yl và 4-methylpiperazin-1-yl trên khung cấu trúc anthranilamid với kỳ vọng làm tăng khả năng ức chế tế bào ung thư và hạn chế ảnh hưởng đến các tế bào bình thường
Hình 1.9 Thiết kế cấu trúc chất cần nghiên cứu
Các phản ứng liên quan đến tổng hợp các dẫn chất N-(2-carbamoylphenyl)- 5-methoxy-2,2-dimethyl-2H-chromen-6-carboxamid
1.4.1 Một số phương pháp tổng hợp các dẫn chất 2,2-dimethyl- 2 H-chromen
1.4.1.1 Phản ứng tổng hợp 2H-chromen từ phenoxid và các hợp chất carbonyl α-β không bão hòa
Năm 1978, nhóm nghiên cứu của Sartori và cộng sự đã thực hiện phản ứng tổng hợp các dẫn chất của 2,2-dimethyl-2H-chromen bằng cách đun hồi lưu dung dịch toluen
10 chứa phenoxid kim loại và hợp chất carbonyl α-β không bão hòa (Sơ đồ 1.2) Sản phẩm thu được là các dẫn chất chromen với hiệu suất tốt và độ chọn lọc cao [41]
Sơ đồ 1.2 Tổng hợp dẫn chất 2H-chromen bởi Sartori
Khi lựa chọn phenoxid kim loại, ngoài titan (IV) và magie thì thiếc (IV) và nhôm cũng có thể sử dụng vì khả năng phản ứng chọn lọc cao trong các dung môi ít phân cực Ngược lại, các muối kiềm và dung môi cation (DMF, glyme) khiến hiệu suất của quá trình tổng hợp thấp (2-3% so với > 60%) [41]
1.4.1.2 Phản ứng tổng hợp 2H-chromen bằng xúc tác Pd của o-allylic phenol
Nhóm nghiên cứu của Larock và công sự vào năm 1997 đã sử dụng nhiều loại hợp chất của Pd để làm xúc tác cho quá trình tổng hợp các dẫn chất của 2H-chromen Trong khi PdCl2/MeOH tạo ra hỗn hợp sản phẩm gồm ete vòng 5 và 6 cạnh với hiệu suất thấp, thì việc sử dụng Pd(OAc)2 hoặc Pd(dba)2 lại giúp hiệu suất được cải thiện đáng kể Điều kiện tối ưu cho quá trình tạo vòng của 2-allylphenol (0,5 mmol) là: đun nóng
5 mol% Pd(dba)2 và KHCO3 (0,55 mmol) trong DMSO/nước (10 mL) theo tỷ lệ 9:1 trong 3 ngày ở nhiệt độ 60°C khi có khí O2 (Sơ đồ 1.3) Việc lựa chọn chất xúc tác Pd trong môi trường base và hệ dung môi DMSO là rất quan trọng để hình thành chọn lọc 2H-chromen với hiệu suất cao
Sơ đồ 1.3 Tổng hợp dẫn chất 2H-chromen bởi Larock
Khi sử dụng nguyên liệu ban đầu là các ortho-allylic phenol khác nhau, sẽ thu được các dẫn chất 2H-chromen với các hiệu suất khác nhau (Ví dụ đối với 2,2-dimethyl- 2H-chromen, hiệu suất 72%) [28]
1.4.1.3 Phản ứng ngưng tụ của salicylaldehyd và 2-methylpropen
Năm 2006, nghiên cứu của Prado và cộng sự đã tổng hợp được các dẫn chất 2,2- dimethyl-2H-chromen bằng phương pháp sử dụng ytterbium triflat (Yb(OTf)₃) làm xúc tác cho phản ứng giữa salicylaldehyd, trimethyl orthofomat và 2-methylpropen ở nhiệt độ phòng [40] Quá trình này tạo ra hai sản phẩm có thể phân lập được (Sơ đồ 1.4): ˗ Hợp chất (3a) (hiệu suất 27%): tạo thành do phản ứng cộng hợp [2 + 4], xúc tác bởi acid Lewis
11 ˗ Hợp chất (3b) (hiệu suất 14%): tạo thành từ phản ứng carbonyl-en, sau đó thêm methanol vào liên kết đôi
Cả hai hợp chất trung gian (3a) và (3b) được đun hồi lưu lại trong toluen cùng một lượng xúc tác nhỏ acid p-toluenesulfonic, tạo thành sản phẩm 2,2-dimethyl-2H- chromen
Sơ đồ 1.4 Tổng hợp dẫn chất 2,2-dimethyl-2H-chromen bởi Prado
1.4.1.4 Phản ứng từ phenol và 3-metyl-2-butenal bằng chiếu xạ vi sóng
Nhóm nghiên cứu của Adler vào năm 2009 đã đưa ra phương pháp hiệu quả để tổng hợp 2,2-dimethyl-2H-chromen bằng một bước duy nhất từ 2 nguyên liệu ban đầu là phenol và 3-metyl-2-butenal Quy trình này sử dụng chiếu xạ ở mức 300 W trong CDCl3, môi trường phản ứng trung tính, không cần bổ sung chất xúc tác, tạo ra sự hình thành chọn lọc chromen
Phản ứng này được cho là tạo ra chất trung gian ortho-quinon methid trước, sau đó trải qua quá trình vòng hóa 6π nội phân tử để tạo ra sản phẩm chromen cuối cùng như
Sơ đồ 1.5 Tổng hợp dẫn chất 2,2-dimethyl-2H-chromen theo phương pháp chiếu xạ vi sóng
12 Nghiên cứu cũng chỉ ra một xu hướng là khi tăng số lượng nhóm đẩy điện tử trên phenol sẽ làm tăng hiệu quả của phương pháp này (có thể lên đến 89%) [3]
1.4.1.5 Phản ứng ngưng tụ của o-halophenol với 2-methylbut-3-en-2-ol
Năm 2015, nhóm nghiên cứu của Tee và cộng sự đã tổng hợp các dẫn chất 2,2- dimethyl-2H-chromen bằng phản ứng ngưng tụ o-halophenol với 2-methylbut-3-en-2- ol (Sơ đồ 1.6) Phản ứng này có thể tạo ra sản phẩm phụ theo phản ứng ghép đôi Heck (sản phẩm (4)) và làm giảm hiệu suất của 2,2-dimethyl-2H-chromen Tuy nhiên, nhóm nghiên cứu đã nâng hiệu suất của sản phẩm mong muốn bằng cách sử dụng xúc tác của Pd(II) và thúc đẩy bằng SiO2, thực hiện phản ứng trong điều kiện một bình (one-pot condition) Hiệu suất của phản ứng có thể đạt tới 76-80% [43]
Sơ đồ 1.6 Tổng hợp dẫn chất 2,2-dimethyl-2H-chromen bởi Tee
1.4.2 Một số phương pháp tổng hợp amid trực tiếp từ acid carboxylic và amin tương ứng
Dẫn chất acid cacboxylic là acid hữu cơ mạnh, khi tiếp xúc với amin (tác nhân base) sẽ xảy ra phản ứng acid – base đầu tiên Sự proton hóa làm cho đặc tính nucleophil của amin giảm mạnh vì không còn cặp electron tự do Đồng thời, acid carboxylic chuyển thành anion carboxylat sẽ làm yếu đi tác nhân electrophil và phản ứng amid hóa gần như không xảy ra [12]
Do đó, đã có nhiều nghiên cứu về các phương pháp mới để tăng tốc độ phản ứng cũng như nâng cao hiệu suất cho phản ứng amid hóa trực tiếp từ acid carboxylic và amin
Phản ứng amid hóa sử dụng xúc tác B(OCH2CF3)3 (Sơ đồ 1.7): hiệu suất có thể lên đến 91% [27].
Sơ đồ 1.7 Tổng hợp amid sử dụng xúc tác B(OCH 2 CF 3 ) 3
Phản ứng amid hóa sử dụng DCC hoặc EDC, xúc tác HOBt (Sơ đồ 1.8):
DCC và EDC đều là carbodiimid (RN=C=NR) giúp phản ứng acid – base ban đầu không xảy ra và làm cho acid cacboxylic dễ bị tấn công bởi tác nhân nucleophil để tạo amid (R’ – CONH2) [35]
13 HOBt có vai trò là một nucleophil chọn lọc, giúp phản ứng amid hóa xảy ra nhanh hơn Đồng thời, hạn chế việc tạo thành sản phẩm phụ N-acylurea, dẫn đến nâng cao cả hiệu suất lẫn chất lượng của quá trình tổng hợp [35]
Sơ đồ 1.8 Tổng hợp amid sử dụng DCC hoặc EDC xúc tác HOBt
NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nguyên vật liệu, thiết bị
Khi thực hiện khóa luận này, chúng tôi đã sử dụng một số dụng cụ, thiết bị, dung môi và hóa chất của phòng thí nghiệm Bộ môn Hóa Hữu cơ, Trường Đại học Dược Hà Nội
2.1.1 Nguyên vật liệu, hóa chất, dung môi
Các nguyên liệu, hóa chất và dung môi sử dụng trong quá trình thực nghiệm có xuất xứ từ các hãng Sigma-Aldrich (Mỹ) và các công ty hóa chất như Merck (Đức), Trung Quốc, Việt Nam… Các hóa chất này được sử dụng trực tiếp, không qua tinh chế thêm và đưa ra ở Bảng 2.1
Bảng 2.1 Danh mục các dung môi, hóa chất
STT Dung môi, hóa chất Nguồn gốc
STT Dung môi, hóa chất Nguồn gốc
23 Bản mỏng silica gel Merck
2.1.2 Thiết bị thí nghiệm ˗ Dụng cụ thủy tinh: cốc có mỏ (100 mL, 250 mL, 500 mL), bình cầu (50 mL, 100 mL, 250 mL, 500 mL), ống sinh hàn, phễu, bình lọc hút, phễu Buchner, bình nón, bình chiết, pipet Pasteur,… ˗ Máy cô quay chân không Buchi Rotavapor R-200 (Thụy Sĩ) ˗ Máy siêu âm Ultrasonic LC 60 H (Đức) ˗ Tủ sấy Heraeus (Đức) ˗ Máy khuấy từ gia nhiệt IKA – RTC Basic (Đức) ˗ Cân kỹ thuật Sartorius (Đức) ˗ Cân phân tích (Trung Quốc) ˗ Buồng soi UV bước sóng 254nm Spectroline (Mỹ) ˗ Cột chạy sắc ký ˗ Bản mỏng silica gel 60 F254 (Merck) ˗ Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân ( 1 H-NMR và 13 C-NMR) Bruker Avance III
HD 600 MHz và 125 MHz của hãng Bruker BioSpin (Thụy Sĩ) tại Viện Hóa Học – Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam ˗ Máy đo phổ khối 1100 Series LC – MSD – Trap – SL của hãng Agilent tại Viện Hóa Học – Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam ˗ Máy đo phổ hồng ngoại FT – IR Affinity-IS-Shimadzu (Nhật Bản) tại Khoa Hóa Học – Trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội ˗ Máy đo nhiệt độ nóng chảy MPA 120 (Mỹ) tại Bộ môn Hóa Hữu cơ – Trường Đại học Dược Hà Nội.
Nội dung nghiên cứu
2.2.1 Tổng hợp hóa học các dẫn chất N-(2-carbamoylphenyl)-5-methoxy-2,2- dimethyl- 2 H-chromen-6-carboxamid ˗ Tổng hợp 2 dẫn chất N-(2-carbamoylphenyl)-5-methoxy-2,2-dimethyl-2H- chromen-6-carboxamid:
N-(2-carbamoyl-4-(4-methylpiperazin-1-yl)phenyl)-5-methoxy-2,2-dimethyl-
N-(2-carbamoyl-4-morpholinophenyl)-5-methoxy-2,2-dimethyl-2H-chromen-
2.2.2 Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư của các dẫn chất tổng hợp được
Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư của 2 chất tổng hợp được trên 2 dòng tế bào ung thư: A549: ung thư phổi; MCF-7: ung thư vú.
Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Phương pháp tổng hợp N-(2-carbamoylphenyl)-5-methoxy-2,2-dimethyl- 2 H- chromen-6-carboxamid ˗ Sử dụng các phương pháp tổng hợp hữu cơ kinh điển và hiện đại để tổng hợp 2 dẫn chất dự kiến (VIa-b) ˗ Dùng sắc ký lớp mỏng để theo dõi phản ứng và đánh giá sơ bộ độ tinh khiết của sản phẩm
2.3.2 Phương pháp tinh chế và xác định cấu trúc ˗ Tinh chế các dẫn chất tổng hợp được bằng phương pháp sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng và phương pháp kết tinh lại ˗ Xác định cấu trúc của hai sản phẩm cuối cùng bằng các phương pháp phổ: phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton ( 1 H-NMR) và carbon-13 ( 13 C-NMR) [2]
2.3.3 Phương pháp thử hoạt tính kháng tế bào ung thư
Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư của các dẫn chất tổng hợp được (VIa-b) theo phương pháp MTT trên 2 dòng tế bào ung thư: A549: ung thư phổi; MCF-7: ung thư vú tại Phòng Hóa Sinh Ứng Dụng, Viện Hóa Học, Viện Hàn Lâm Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam
2.3.3.1 Nguyên tắc ˗ Tiến hành theo phương pháp in vitro để đánh giá khả năng sống sót của tế bào ung thư ˗ Hoạt tính gây độc tế bào được thực hiện dựa trên phương pháp MTT lần đầu tiên được mô tả bởi tác giả Tim Mosman (1983) [20] ˗ Phương pháp này đánh giá khả năng sống sót của tế bào qua khả năng khử MTT (màu vàng) thành một phức hợp formazan (màu tím) bởi hoạt động của enzym dehydrogenase trong ty thể ˗ Sản phẩm formazan được hòa tan bằng DMSO và đo mật độ quang (OD) ở bước sóng 540 nm Giá trị thể hiện hoạt tính là IC50 (nồng độ chất thử ức chế 50% khả năng sống của tế bào)
2.3.3.2 Chuẩn bị thí nghiệm ˗ Các dòng tế bào thử nghiệm: có nguồn gốc từ Bảo tàng giống chuẩn Hoa Kỳ (ATCC) gồm:
Dòng ung thư phổi A549 (CCL – 185 TM )
Dòng ung thư vú MCF-7 (HTB – 22 TM ) ˗ Các dòng tế bào được lưu giữ trong nitơ lỏng, hoạt hóa và duy trì trong các môi trường dinh dưỡng như DMEM (Dulbeccos Modified Eagle Medium) hoặc MEME (Minimum Esental Medium with Eagle salt) có bổ sung 7-10% FBS (Fetal Bovine Serum) và một số thành phần thiết yếu khác Tế bào được nuôi trong các điều kiện tiêu chuẩn (5% CO2, độ ẩm 98%, nhiệt độ 37 0 C, vô trùng tuyệt đối) và được cấy chuyển 1-
2 lần trước khi thí nghiệm Tế bào phát triển ở pha log (logarithmic – pha có vi khuẩn sinh trưởng và phát triển mạnh theo cấp lũy thừa) sẽ được sử dụng để thử độc tính
2.3.3.3 Tiến hành thí nghiệm ˗ Trypsin hóa tế bào thí nghiệm để làm rời tế bào và đếm trong buồng đếm tế bào Sau đó, pha tế bào bằng môi trường sạch và điều chỉnh mật độ cho phù hợp với thí nghiệm (khoảng 3-5x10 4 tế bào/mL tùy theo từng dòng tế bào) ˗ Mẫu thử: Hòa tan mẫu thử bằng dung môi DMSO với nồng độ ban đầu là 20 mg/mL Tiến hành pha loãng 2 bước trên đĩa 96 giếng thành 5 dãy nồng độ từ cao xuống thấp lần lượt là 2560, 640, 160, 40 và 10 àg/mL Nồng độ chất thử trong đĩa thử nghiệm tương ứng là 128, 32, 8, 2 và 0.5 àg/mL Chất tham chiếu Ellipticin pha trong DMSO với nồng độ 0,01mM ˗ Lấy vào mỗi giếng 10 àL chất thử đó chuẩn bị ở trờn và 190 àL dung dịch tế bào Đối chứng dương của thí nghiệm là môi trường có chứa tế bào, đối chứng âm chỉ có môi trường nuôi cấy ˗ Đĩa thí nghiệm được ủ ở điều kiện tiêu chuẩn trong 72 giờ Mỗi giếng thí nghiệm được tiếp tục ủ với 10 àL MTT (5 mg/mL) trong 4h Sau khi loại bỏ mụi trường, tinh thể formaran được hũa tan bằng 100 àL DMSO 100% ˗ Kết quả thí nghiệm được xác định bằng giá trị OD đo ở bước sóng 540 nm trên máy quang phổ Biotek Thí nghiệm được lặp lại 3 lần
2.3.3.4 Xử lý kết quả thực nghiệm ˗ Phương pháp xử lý số liệu: Giá trị IC50 được xác định thông qua giá trị% ức chế tế bào phát triển và phần mềm máy tính Rawdata ˗ % ức chế tế bào = ODchứng (+) – ODmẫu thử
18 ˗ IC50 = HighConc- (HighInh%−50) 𝑥 (HighConc− LowConc)
(Trong đó, HighConc/LowConc: chất thử ở nồng độ cao/chất thử thấp ở nồng độ thấp; HighInh%/LowInh%:% ức chế ở nồng độ cao/% ức chế ở nồng độ thấp) ˗ Kết quả thí nghiệm là giá trị trung bình của 3 lần lặp lại thí nghiệm ± độ lệch chuẩn (SD)
THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
Kết quả thực nghiệm
Quy trình tổng hợp các dẫn chất N-(2-carbamoylphenyl)-5-methoxy-2,2-dimethyl- 2H-chromen-6-carboxamid được tiến hành theo Sơ đồ 3.1:
Sơ đồ 3.1 Quy trình tổng hợp các dẫn chất N-(2-carbamoylphenyl)-5-methoxy-2,2- dimethyl-2H-chromen-6-carboxamid (VIa-b)
Quy trình tổng hợp acid 5-methoxy-2,2-dimethyl-2H-chromen-6-carboxylic được tiến hành theo Sơ đồ 3.2:
Sơ đồ 3.2 Quy trình tổng hợp acid 5-methoxy-2,2-dimethyl-2H-chromen-6-carboxylic
Chất Công thức cấu tạo
Quá trình tổng hợp được tiến hành qua 5 giai đoạn sau:
Giai đoạn 1: Tổng hợp 5-cloro-2-nitrobenzamid (II)
Giai đoạn 2: Tổng hợp các dẫn chất của 5-cyclicamino-2-nitrobenzamid (IIIa-b) Giai đoạn 3: Tổng hợp các dẫn chất 2-amino-5-(cyclicamino)benzamid (IVa-b) Giai đoạn 4: Phản ứng tổng hợp Acid 5-methoxy-2,2-dimethyl-2H-chromen-6- carboxylic (Vd)
Giai đoạn 5: Phản ứng tổng hợp các dẫn chất N-(2-carbamoylphenyl)-5-methoxy-
3.1.1 Tổng hợp 5-cloro-2-nitrobenzamid (II)
Sơ đồ 3.3 Quy trình tổng hợp 5-cloro-2-nitrobenzamid (II)
Bình cầu đáy tròn 500 mL, bình gạn 100 mL, phễu Buchner, ống sinh hàn hồi lưu, nhiệt kế, máy khuấy từ gia nhiệt, máy cô quay chân không
Tiến hành phản ứng: ˗ Thêm 3 g acid 5-cloro-2-nitrobenzoic (I) và 20 mL thionyl clorid vào bình cầu, kết hợp dùng máy khuấy từ để khuấy đều ˗ Đun hồi lưu hỗn hợp ở 50 o C, kết hợp khuấy từ
21 ˗ Phản ứng này kết thúc sau khoảng 3-4 h, loại bỏ thionyl clorid dư bằng máy cô quay dưới áp suất giảm ˗ Sau đó, thêm vào bình cầu 15 mL dicloromethan để hòa tan acyl clorid Ngâm bình cầu chứa hỗn hợp trên vào bát nước đá lạnh, rót nhanh lượng NH4OH dư tới khi hết khói trắng Sau khi phản ứng kết thúc, cho khoảng 10 mL nước cất vào hỗn hợp, xuất hiện kết tủa trắng ˗ Lọc thu tủa trên phễu Buchner, thu được 2,47 g tủa trắng Phần dịch lọc được chiết 3 lần với EtOAc, gộp chung dịch chiết các lần Làm khan dịch chiết EtOAc bằng
Na2SO4 và đem cất quay dung môi, thu được thêm 0,23 g tủa trắng Như vậy, tổng thu được 2,70 g chất II
Kết quả: ˗ Cảm quan: chất rắn màu trắng ˗ Khối lượng sản phẩm: 2,70 g ˗ Hiệu suất: 90,3% ˗ SKLM: R f = 0,56 (bản mỏng silica gel 60 F254, hệ dung môi MeOH : DCM = 1 : 19 v/v)
3.1.2 Tổng hợp các dẫn chất 5-cyclicamino-2-nitrobenzamid (IIIa-b)
Sơ đồ 3.4 Quy trình tổng hợp các dẫn chất IIIa-b
Bình cầu đáy tròn 100 mL, nhiệt kế, nút cao su, máy khuấy từ gia nhiệt, máy cô quay chân không, phễu Buchner, bình gạn 100 mL
Tiến hành phản ứng: ˗ Thực hiện hai quy trình phản ứng riêng biệt để tổng hợp hai chất IIIa và IIIb, hai quy trình đó tuân theo thứ tự các bước như ở dưới ˗ Cho 500 mg 5-cloro-2-nitrobenzamid (2,5 mmol) (II) vào bình cầu đáy tròn, dùng 5 mL dung môi DMF để hòa tan II Sau đó, thêm 3 đương lượng amin R2NH tương ứng (7,5 mmol) Bịt kín bình cầu bằng nút cao su Đun hỗn hợp ở khoảng 90 o C kết hợp khuấy từ
22 ˗ Theo dõi phản ứng mỗi 2 giờ bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi khai triển MeOH : DCM (1 : 19 v/v) ˗ Phản ứng kết thúc sau khoảng 13 giờ, để nguội bình phản ứng, thêm nước cất vào bình cầu, kết tủa xuất hiện Lọc thu tủa trên phễu Buchner ˗ Phần dịch lọc đem chiết với EtOAc nhiều lần, thu lấy pha dung môi hữu cơ, gộp dịch chiết chung của các lần ˗ Tiến hành làm khan dịch chiết bằng Na2SO4 và đem cất loại dung môi, thu được chất rắn màu vàng Gộp 2 phần tủa sau khi lọc qua phễu Buchner và tủa sau khi cô quay sẽ được sản phẩm IIIa-b
Chất IIIa ˗ Cảm quan: chất rắn màu vàng ˗ Khối lượng sản phẩm: 0,54 g ˗ Hiệu suất: 82,4% ˗ SKLM: R f = 0,48 (bản mỏng silica gel 60 F254, hệ dung môi MeOH : DCM = 1 : 19 v/v)
Chất IIIb ˗ Cảm quan: chất rắn màu vàng ˗ Khối lượng sản phẩm: 0,57 g ˗ Hiệu suất: 90,8% ˗ SKLM: R f = 0,46 (bản mỏng silica gel 60 F254, hệ dung môi MeOH : DCM = 1 : 19 v/v)
3.1.3 Tổng hợp các dẫn chất 2-amino-5-(cyclicamino)benzamid (IVa-b)
Sơ đồ 3.5 Quy trình tổng hợp các dẫn chất IVa-b
Bình cầu đáy tròn 100 mL, máy khuấy từ gia nhiệt, máy cô quay chân không, nhiệt kế, bình gạn 100 mL
Tiến hành phản ứng: ˗ Thực hiện hai quy trình phản ứng riêng biệt để tổng hợp hai chất IVa và IVb, hai quy trình đó tuân theo thứ tự các bước như ở dưới
23 ˗ Cho 400 mg chất IIIa-b hòa tan trong Ethanol, 1,85 g SnCl2.2H2O, 2 giọt HCl đặc vào bình cầu 2 cổ đáy tròn, thêm con khuấy từ Đun hồi lưu hỗn hợp phản ứng ở khoảng 60 o C ˗ Theo dõi phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi khai triển MeOH : DCM (1 : 49 v/v) ˗ Phản ứng kết thúc sau khoảng 5 giờ, làm nguội hỗn hợp phản ứng, thêm 10 mL nước cất và điều chỉnh pH-11 bằng dung dịch NaOH 20%, sau đó chiết với EtOAc 4-5 lần Thu lấy pha dung môi hữu cơ và gộp chung dịch chiết, làm khan nước bằng
Na2SO4 và đem cất quay ở áp suất giảm để loại dung môi ˗ Tinh chế sản phẩm bằng sắc ký cột với hệ dung môi MeOH : DCM (tăng dần tỉ lệ từ 1 : 49 đến 1 : 19 và đến 1 : 9 v/v), cất quay loại dung môi và thu được sản phẩm
Chất IVa ˗ Cảm quan: chất rắn màu trắng ˗ Khối lượng sản phẩm: 0,20 g ˗ Hiệu suất: 55,4% ˗ SKLM: R f = 0,20 (bản mỏng silica gel 60 F254, hệ dung môi MeOH : DCM = 1 : 49 v/v)
Chất IVb ˗ Cảm quan: chất rắn màu vàng nâu ˗ Khối lượng sản phẩm: 0,18 g ˗ Hiệu suất: 51,8% ˗ SKLM: R f = 0,18 (bản mỏng silica gel 60 F254, hệ dung môi MeOH : DCM = 1 : 49 v/v)
3.1.4 Tổng hợp acid 5-methoxy-2,2-dimethyl- 2 H-chromen-6-carboxylic (Vd)
3.1.4.1 Tổng hợp chất trung gian 5-hydroxy-2,2-dimethyl-2H-chromen-6-carbadehyd (Vb)
Sơ đồ 3.6 Quy trình tổng hợp chất Vb
Bình cầu đáy tròn 500 mL, ống sinh hàn hồi lưu, nhiệt kế, máy khuấy từ gia nhiệt, máy cô quay chân không, bình gạn 500 mL
Tiến hành phản ứng: ˗ Cho vào bình cầu đáy tròn 500 mL: con khuấy từ, 2 g 2,4-dihydroxybenzaldehyd (Va) Sau đó, tiếp tục thêm 2 g 3-methylbut-2-enal, 3,20 g CaCl2.2H2O, 10 mL TEA Dùng 45 mL ethanol để hòa tan hỗn hợp đó, nối bình phản ứng với ống hồi lưu Đun hồi lưu ở khoảng 95 o C, kết hợp khuấy từ ˗ Theo dõi phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi khai triển EtOAc: n- hexan (1 : 19 v/v) ˗ Phản ứng kết thúc sau khoảng 2 giờ, để nguội bình phản ứng, dùng dung dịch HCl 10% để điều chỉnh pH của hỗn hợp đó tới khoảng 3 – 4 Chiết bằng EtOAc 4 lần, thu lấy pha dung môi hữu cơ và gộp chung dịch chiết các lần Làm khan dịch chiết bằng
Na2SO4 và đem cô quay loại dung môi ˗ Tinh chế bằng sắc ký cột với hệ dung môi EtOAc: n-hexan (1 : 19 v/v), cất quay loại dung môi dưới áp suất giảm, thu được sản phẩm Vb
Kết quả: ˗ Cảm quan: chất rắn màu trắng ˗ Khối lượng sản phẩm: 1,92 g ˗ Hiệu suất: 65,2% ˗ SKLM: R f = 0,58 (bản mỏng silica gel 60 F254, hệ dung môi EtOAc: n-hexan 1 : 19 v/v)
3.1.4.2 Tổng hợp chất trung gian 5-methoxy-2,2-dimethyl-2H-chromen-6-carbadehyd (Vc)
Sơ đồ 3.7 Quy trình tổng hợp chất Vc
Bình cầu đáy tròn 100 ml, ống sinh hàn hồi lưu, nhiệt kế, máy khuấy từ gia nhiệt, máy cô quay chân không, bình gạn 500 mL
Tiến hành phản ứng: ˗ Hỗn hợp phản ứng gồm 1,2 g chất Vb được hòa tan bằng 10 mL dung môi DMF trong bình cầu đáy tròn Sau đó, thêm vào tiếp 2,64 g K2CO3 và 0,80 mL CH3I, lắp bình cầu vào ống sinh hàn Đun hồi lưu hỗn hợp phản ứng ở khoảng 50 0 C ˗ Theo dõi phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi khai triển EtOAc : n- hexan (1 : 19 v/v)
25 ˗ Phản ứng kết thúc sau khoảng 8 giờ, để nguội bình phản ứng Chiết thu sản phẩm với EtOAc 4 lần, thu lấy pha dung môi hữu cơ, gộp chung dịch chiết các lần Làm khan dịch chiết bằng Na2SO4 và đem cất quay loại dung môi ˗ Tinh chế bằng sắc ký cột với hệ dung môi EtOAc: n-hexan (1 : 19 v/v), cất quay loại dung môi dưới áp suất giảm, thu được sản phẩm Vc
Kết quả: ˗ Cảm quan: chất lỏng màu nâu vàng ˗ Khối lượng sản phẩm: 1,09 g ˗ Hiệu suất: 85,3% ˗ SKLM: R f = 0,38 (bản mỏng silica gel 60 F254, hệ dung môi EtOAc: n-hexan 1 : 19 v/v)
3.1.4.3 Tổng hợp acid 5-methoxy-2,2-dimethyl-2H-chromen-6-carboxylic (Vd) từ (Vc)
Sơ đồ 3.8 Quy trình tổng hợp chất Vd
Bình cầu đáy tròn 100 mL, ống sinh hàn, nhiệt kế, máy khuấy từ gia nhiệt, máy cô quay chân không, phễu Buchner
Tiến hành phản ứng: ˗ Thêm 1 g Vc vào bình phản ứng có con khuấy từ, sau đó lần lượt thêm 0,14 g NaH2PO4.2H2O, 0,63 g NaClO2, và khoảng 50 giọt H2O2 Phản ứng được thực hiện ở
0 0 C, kết hợp khuấy từ ˗ Theo dõi tiến trình phản ứng bằng TLC với hệ dung môi khai triển EtOAc : n- hexan (1 : 19 v/v) ˗ Sau khi phản ứng kết thúc, để nguội, ngâm bình cầu chứa hỗn hợp vào bát nước đá Thêm nước cất lạnh vào hỗn hợp, xuất hiện tủa trắng ˗ Lọc thu tủa trên phễu Buchner, rửa tủa nhiều lần với nước cất lạnh và ethanol 96% lạnh Dịch lọc được đem chiết với EtOAc 4 lần, thu lấy pha dung môi hữu cơ, gộp chung dịch chiết các lần Làm khan dịch chiết bằng Na2SO4 và đem cất quay loại dung môi ˗ Tinh chế bằng sắc ký cột với hệ dung môi EtOAc: n-hexan (1 : 19 v/v), cất quay loại dung môi dưới áp suất giảm, thu được tủa trắng
Kết quả: ˗ Cảm quan: chất rắn màu trắng ˗ Khối lượng sản phẩm: 0,93 g ˗ Hiệu suất: 86,6% ˗ SKLM: R f = 0,58 (bản mỏng silica gel 60 F254, hệ dung môi EtOAc: n-hexan 1 : 19 v/v)
3.1.5 Tổng hợp các dẫn chất N-(2-carbamoylphenyl)-5-methoxy-2,2-dimethyl- 2 H- chromen-6-carboxamid (VIa-b)
3.1.5.1 Tổng hợp N-(2-carbamoyl-4-(4-methylpiperazin-1-yl)phenyl)-5-methoxy-2,2- dimethyl-2H-chromen-6-carboxamid (VIa)
Sơ đồ 3.9 Quy trình tổng hợp chất VIa
Bình cầu đáy tròn 50 mL, ống sinh hàn, nhiệt kế, máy khuấy từ gia nhiệt, máy cô quay chân không
Tiến hành phản ứng: ˗ Hòa tan hoàn hoàn 40 mg amin IVa bằng dung môi DMF Thêm lần lượt 1,5 đương lượng EDC.HCl (50 mg), 1,5 đương lượng HoBt (35 mg), 3 giọt TEA và lắc đều để hỗn hợp tan hoàn toàn trong DMF, cuối cùng bổ sung thêm 45 mg acid Vd vào bình phản ứng Phản ứng được thực hiện ở nhiệt độ phòng, kết hợp khuấy từ, để qua đêm ˗ Theo dõi phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi MeOH : DCM (1 : 20 v/v) ˗ Sau khi phản ứng kết thúc, chiết hỗn hợp sau phản ứng bằng EtOAc 4 lần Thu lấy pha dung môi hữu cơ, gộp chung dịch chiết các lần Làm khan dịch chiết bằng
Kiểm tra độ tinh khiết và khẳng định cấu trúc
3.2.1 Kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm
3.2.1.1 Sắc ký lớp mỏng ˗ Kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm sau tổng hợp và tinh chế bằng sắc ký lớp mỏng (bản mỏng silica gel 60 F254) ˗ Hũa tan VIa-b bằng DCM, chấm 2-6 àL lờn bản mỏng, sấy khụ ˗ Triển khai sắc ký với hệ dung môi MeOH : DCM với các tỉ lệ khác nhau ˗ Sau khi chạy sắc ký, sấy khô, quan sát bản mỏng dưới buồng soi UV ở bước sóng
254 nm, thấy chỉ có 1 vết gọn, rõ ràng, không thấy các vết nhòe, không thấy xuất hiện các vết khác Giá trị Rf được ghi lại ở Bảng 3.2
Bảng 3.2 Giá trị R f của các dẫn chất (VIa-b)
Ký hiệu Công thức cấu tạo R f
Hệ dung môi khai triển sắc ký
3.2.1.2 Đo nhiệt độ nóng chảy
Dụng cụ đo: Máy đo nhiệt độ nóng chảy MPA 20 tại Bộ môn Hóa Hữu cơ – Trường Đại học Dược Hà Nội
Kết quả đo nhiệt độ nóng chảy được ghi lại tại Bảng 3.3:
Bảng 3.3 Giá trị nhiệt độ nóng chảy (t o nc ) của các dẫn chất (VIa-b)
Ký hiệu Công thức cấu tạo Nhiệt độ nóng chảy
Kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm VIa-b bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng và đo nhiệt độ nóng chảy có thể thấy các chất này là tinh khiết (do một chất tinh khiết khi nhiệt độ nóng chảy không chênh lệch nhau quá 2 o C), đủ điều kiện để đo phổ và thử hoạt tính sinh học
3.2.2.1 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton 1 H-NMR
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân ( 1 H-NMR, 13 C-NMR) của các chất VIa-b được đo trên máy Bruker Acance 600MHz với chất chuẩn nội tetramethylsilan (TMS) của hãng Bruker BioSpin (Thụy Sĩ) tại Viện Hóa Học – Viện Hàn Lâm Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam với dung môi sử dụng là DMSO-d 6 Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 H của 2 chất được ghi ở Bảng 3.4 và các Phụ lục 1,5
Dựa vào kết quả phân tích dữ liệu phổ ở Bảng 3.4 cho thấy số lượng proton; độ bội của tín hiệu; độ chuyển dịch hóa học phù hợp với công thức cấu tạo dự kiến
Bảng 3.4 Số liệu phổ 1 H-NMR của các dẫn chất (VIa-b)
Ký hiệu Công thức cấu tạo
1 H-NMR (600MHz, DMSO- d 6 , δppm, J (Hz)
Ghi chú: δ: độ chuyển dịch hóa học ppm, J: hằng số ghép (Hz), s: singlet, d: doublet, dd: doublet of doublet, t: triplet, q: quartet
3.2.2.2 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân ( 13 C-NMR)
Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13 C của 2 chất VIa-b được ghi ở Bảng 3.5 và các Phụ lục 2,6
Bảng 3.5 Số liệu phổ 13 C-NMR của các dẫn chất (VIa-b)
Ký hiệu Công thức cấu tạo 13 C-NMR (125MHz, DMSO- d 6 , δppm
Ghi chú: δ: độ dịch chuyển hóa học ppm
Dựa vào kết quả phân tích dữ liệu phổ thông ở Bảng 3.5 cho thấy số lượng carbon, độ dịch chuyển hóa học của các nguyên tử carbon phù hợp với công thức cấu tạo dự kiến
Phổ hồng ngoại được đo trên Máy FT-IR Affinity-IS-Shimadzu (Nhật Bản) tại Khoa Hóa Học – Trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội Phổ đồ của 2 chất (VIa-b) được trình bày ở các phụ lục Kết quả phân tích số liệu phổ hồng ngoại được ghi ở Bảng 3.6 và các Phụ lục 3,7
Bảng 3.6 Số liệu phổ hồng ngoại IR của các dẫn chất (VIa-b)
Ký hiệu Công thức cấu tạo
Phổ IR (KBr), cm -1 ν NH
Ghi chú: (1): amid; (2): C (sp 3 )-H; (3) C=C-H (sp 2 : nhân thơm, vinyl)
Phổ khối lượng được đo trên Máy đo phổ khối 1100 Series LC – MSD – Trap –
SL của hãng Agilent tại Viện Hóa Học – Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Kết quả đo phổ khối lượng của 2 chất (VIa-b) được trình bày ở các phụ lục Số liệu phổ được ghi tại Bảng 3.7 và các Phụ lục 4,8
Bảng 3.7 Số liệu phổ khối lượng MS của các dẫn chất (VIa-b)
Ký hiệu Công thức cấu tạo CTPT M
Qua dữ liệu phân tích phổ ở Bảng 3.7 và phổ đồ, ta thấy các phổ đồ đều có đỉnh phân tử với cường độ mạnh và số khối bằng với số khối dự kiến Như vậy, có thể khẳng định các chất tổng hợp có khối lượng phân tử đúng như dự kiến
Thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư
Thử hoạt tính gây độc tế bào trên 2 dòng tế bào được tiến hành tại Phòng Hóa sinh ứng dụng – Viện Hóa Học – Viện Hàn Lâm Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam Tại phòng Hóa sinh ứng dụng (Viện Hóa Học), 2 hợp chất VIa-b đã được thử hoạt tính gây độc tế bào trên 2 dòng tế bào ung thư người theo phương pháp MTT Hai dòng tế bào ung thư được sử dụng là: A549: ung thư phổi; MCF-7: ung thư vú Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của 2 dẫn chất tổng hợp được trình bày ở Bảng 3.8 và Phụ lục 9:
Bảng 3.8 Kết quả thử hoạt tính kháng tế bào ung thư của các dẫn chất (VIa-b)
Tên mẫu Ký hiệu Công thức cấu tạo
IC 50 àg/mL (àM) A549 MCF-7
BÀN LUẬN
Về việc lựa chọn hai dẫn chất VIa và VIb để tổng hợp và nghiên cứu
Dựa vào nghiên cứu trước đây của Chang và cộng sự, phần cấu trúc 5-methoxy- 2,2-dimethyl-2H-chromen có tác dụng ức chế hoạt động của Hsp90, từ đó đem lại tác dụng kháng tế bào ung thư tốt [11] Bên cạnh đó, khung anthranilamid cũng được chứng minh là phần cấu trúc mang dược tính tiềm năng trong việc kháng tế bào ung thư ruột kết và ung thư biểu mô tuyến vú [23], [24], [32]
Tiếp nối các nghiên cứu trước đây của Nguyễn Công Trường và cộng sự, chúng tôi thiết kế các công thức bằng việc lai hóa giữa hai phần mang dược tính là 5-methoxy- 2,2-dimethyl-2H-chromen và khung anthranilamid, đồng thời thêm các nhóm thế ở các vị trị khác nhau Nhóm nghiên cứu kỳ vọng hai chất VIa và VIb có tác dụng kháng tế bào ung thư tốt trên các dòng tế bào ung thư phổi không phải tế bào nhỏ (A549) và ung thư vú (MCF-7), đồng thời không gây ảnh hưởng đến các tế bào bình thường.
Về tổng hợp hóa học
4.2.1 Phản ứng tổng hợp acid 5-methoxy-2,2-dimethyl- 2 H-chromen-6- carboxylic
Quá trình tổng hợp hợp chất acid 5-methoxy-2,2-dimethyl-2H-chromen-6- carboxylic (Vd) từ 2,4-dihydroxybenzaldehyd tiến hành qua 3 bước theo Sơ đồ 3.2 ˗ Bước 1: Phản ứng đóng vòng tạo khung 2H-chromen ˗ Bước 2: Phản ứng methyl hóa với tác nhân CH3I để chuyển nhóm –OH phenol thành nhóm –OCH3 ˗ Bước 3: Phản ứng oxy hóa nhóm aldehyd để tạo dẫn chất acid carboxylic
Cơ chế của phản ứng tạo khung 2H–chromen ở bước 1 được mô tả ở Sơ đồ 4.1
Sơ đồ 4.1 Cơ chế phản ứng đóng vòng tạo khung 2H-chromen
35 Phản ứng ở bước 1 được thực hiện trong dung môi EtOH, xúc tác CaCl2.2H2O và TEA Trong đó, xúc tác TEA (Et3N) được sử dụng để tạo môi trường base ban đầu, phản ứng với nhóm -OH phenol tạo thành tác nhân nucleophil O - mạnh hơn Bên cạnh đó, dung môi EtOH dùng để hòa tan các nguyên liệu, cung cấp H + theo cơ chế phản ứng trên sơ đồ Vị trí -OH ortho tạo liên kết hydro với nhóm -CHO nên được bền hóa, đồng thời vị trí này bị ảnh hưởng bởi cản trở không gian, nên phản ứng đóng vòng chọn lọc vào nhóm -OH para của 2,4-dihydroxybenzaldehyd Chất xúc tác CaCl2.2H2O có vai trò hút nước, giúp phản ứng xảy ra nhanh hơn và nâng cao hiệu suất của giai đọan đóng vòng tạo chromen Ở giai đoạn 2, phản ứng methyl hóa là phản ứng Williamson ether có cơ chế thế ái nhân SN2, tác nhân CH3I trong dung môi DMF, xúc tác K2CO3 [37]
Phản ứng methyl hóa xảy ra qua bước đầu tiên là tạo ion phenoxid bằng phản ứng của phenol với K2CO3 Ion phenoxid là tác nhân nucleophil mạnh hơn rất nhiều so với phenol, vì vậy việc tạo ion phenoxid giúp phản ứng methyl hóa xảy ra trong thời gian ngắn hơn với hiệu suất cao hơn
Sơ đồ 4.2 Cơ chế phản ứng methyl hóa theo phản ứng Williamson ether
Phản ứng methyl hóa theo Williamson có thể được tiến hành trong các dung môi khác nhau Kết quả nghiên cứu trước đây cho thấy quá trình O-alkyl hóa diễn ra nhanh hơn nhiều trong dung môi aprotic (dung môi không có khả năng cho proton H + , ví dụ DMF, acetonitril,…) so với dung môi protic (dung môi có khả năng cho proton H + , ví dụ nước, ethanol,…) [18] Khi tiến hành thực nghiệm tại bộ môn, chúng tôi có sử dụng cả ba dung môi là DMF, acetonitril và aceton để thực hiện phản ứng ether hóa Kết quả thu được ở Bảng 4.1:
Bảng 4.1 Khảo sát thời gian phản ứng methyl hóa trong các dung môi khác nhau
Dung môi DMF Acetonitril Aceton
Như vậy, chúng tôi cho rằng dung môi DMF là lựa chọn tốt nhất để rút ngắn thời gian phản ứng
4.2.2 Phản ứng tổng hợp 5-cloro-2-nitrobenzamid
Quá trình tổng hợp 5-cloro-2-nitrobenzamid tiến hành theo Sơ đồ 3.3 Cơ chế phản ứng này xảy ra qua 2 giai đoạn:
36 ˗ Giai đoạn 1: Phản ứng thế nhóm -OH trong nhóm carboxyl bằng nhóm -Cl để tạo acyl clorid ˗ Giai đoạn 2: Phản ứng thế để tạo amid từ acyl clorid và amoniac
Cơ chế chi tiết của cả 2 giai đoạn được thể hiện qua Sơ đồ 4.3 và 4.4:
Sơ đồ 4.3 Cơ chế phản ứng tạo acyl clorid từ acid carboxylic và SOCl 2
Sơ đồ 4.4 Cơ chế phản ứng tổng hợp amid từ amin và acyl clorid tương ứng
Phản ứng tạo amid cần trải qua 2 giai đoạn và tạo chất trung gian acyl clorid thay vì phản ứng trực tiếp từ acid carboxylic và amin tương ứng Lý giải cho điều này là khi cho acid carboxylic tiếp xúc với amin, phản ứng acid – base sẽ xảy ra trước tiên, acid carboxylic chuyển thành anion carboxylat, làm yếu đi tác nhân electrophil và phản ứng gần như không xảy ra [12] Vì vậy, để tăng hiệu suất cho quá trình tổng hợp, acid 5- cloro-2-nitrobenzamid tạo chất trung gian acyl clorid bằng tác nhân thionyl clorid, sau đó chất này phản ứng với amoniac để tạo amid
4.2.3 Phản ứng tổng hợp các dẫn chất 2-amino-5-(cyclicamino)benzamid
Quá trình tổng hợp các dẫn chất 2-amino-5-(cyclicamino)benzamid được tiến hành theo Sơ đồ 3.4 và Sơ đồ 3.5
Giai đoạn tổng hợp các dẫn chất 5-(cyclicamino)-2-nitrobenzamid
- Mục đích: Gắn thêm nhóm amin mạch vòng vào hợp chất II
- Cơ chế: SNAr (Sơ đồ 4.5) Đối với các aryl halogenid, cả hai cơ chế SN1 và SN2 đều khó xảy ra do hiệu ứng +M và –I của vòng thơm đối với nguyên tử halogen Dẫn đến nguyên tử halogen liên kết chặt chẽ với vòng thơm và cần nhiều năng lượng để phá vỡ liên kết này (nhiệt độ cao, áp suất cao) Tuy nhiên, khi vòng thơm có các nhóm thế hút electron (đặc biệt ở vị trí ortho và para) sẽ giúp giải tỏa điện tích âm và giảm năng lượng hoạt hóa của phản ứng Khi đó, phản ứng xảy ra ở nhiệt độ thấp hơn và có hiệu suất cao hơn
Sơ đồ 4.5 Cơ chế phản ứng thế S N Ar để tổng hợp IIIa-b
Giai đoạn tổng hợp các dẫn chất 2-amino-5-(cyclicamino)benzamid
SnCl2.2H2O/EtOH là tác nhân khử chọn lọc các hợp chất nitro thơm mà không ảnh hưởng đến các nhóm dễ khử khác như aldehyd, keton, ester, cyano, halogen và O-benzyl [8] Bên cạnh phương pháp này, các tác nhân khử hóa hợp chất nitro thơm khác như:
- Khí H2, xúc tác Pd/C hoặc Ni, dung môi methanol
- Fe hoặc Zn/HCl, dung môi ethanol
Mỗi phương pháp trên đều có các ưu – nhược điểm nhất định Ví dụ, với phương pháp khử sử dụng khí H2: do H2 là chất khí nhẹ, dễ cháy nổ khi tiếp xúc với không khí nên cần đảm bảo an toàn trong quá trình sử dụng… Đối với tác nhân khử SnCl2.2H2O/EtOH mà chúng tôi sử dụng:
+ Ưu điểm: hạn chế được nguy cơ cháy nổ, giá thành thấp hơn so với các tác nhân khử hóa khác
+ Nhược điểm: thời gian phản ứng dài, cần phải đun hồi lưu để tăng tốc độ phản ứng
Trong quá trình thực hiện phản ứng khử bằng tác nhân SnCl2.2H2O/EtOH, sản phẩm khi tạo thành ở dạng muối nên chúng tôi sử dụng dung dịch NaOH điều chỉnh pH về khoảng 10-11 Chất cần tổng hợp chuyển về dạng base, giúp quá trình chiết tách thu sản phẩm thuận lợi hơn với hiệu suất cao hơn
4.2.4 Phản ứng tổng hợp các dẫn chất N-(2-carbamoylphenyl)-5-methoxy-2,2- dimethyl- 2 H-chromen-6-carboxamid
Dẫn chất acid cacboxylic là acid hữu cơ mạnh khi trộn với amin (tác nhân base), phản ứng acid – base xảy ra trước tiên Sự proton hóa làm cho đặc tính nucleophil giảm mạnh vì không còn cặp electron tự do Do đó, một trong các phương pháp nâng cao hiệu suất phản ứng là sử dụng các tác nhân như DCC (N,N'-dicyclohexan carbodiimid) hoặc EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid) Cả hai đều là carbodiimid
38 (RN=C=NR) giúp phản ứng acid – base không xảy ra và làm cho acid cacboxylic dễ bị tấn công bởi tác nhân nucleophil để tạo thành amid (R’ – CONH2) [35]
Cơ chế của phản ứng tổng hợp amid được thực hiện ở Sơ đồ 4.6 Việc sử dụng tác nhân EDC, xúc tác HOBt trong quá trình này giúp phản ứng diễn ra ở nhiệt độ phòng với hiệu suất có thể chấp nhận được
Sơ đồ 4.6 Cơ chế phản ứng tạo amid từ acid carboxylic và amin tương ứng
HOBt có vai trò là một nucleophil chọn lọc, giúp phản ứng amid hóa xảy ra nhanh hơn Đồng thời, hạn chế việc tạo thành sản phẩm phụ N-acylurea, dẫn đến nâng cao cả hiệu suất lẫn chất lượng của quá trình tổng hợp
Trong quá trình thực hiện phản ứng này, nhóm nghiên cứu của tôi gặp khó khăn khi hiệu suất phản ứng tổng hợp chất VIa là 64,9%, trong khi hiệu suất phản ứng tổng hợp chất VIb chỉ đạt 42,2% Điều này có thể lý giải bằng: nguyên tử O của nhóm thế morpholin-4-yl (VIb) hút điện tử mạnh hơn nhóm N-CH3 của nhóm thế 4- methylpiperazin-1-yl (VIa), dẫn đến tính nucleophil của IVb yếu hơn IVa, do đó hiệu suất tạo sản phẩm VIb thấp hơn.
Về khẳng định cấu trúc các hợp chất tổng hợp được
4.3.1 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton ( 1 H-NMR)
Phổ đồ 1 H-NMR cho thấy sự trùng khớp các tín hiệu đặc trưng về tổng số proton của hai dẫn chất VIa-b dựa trên đường cong phân tích phổ đồ với số nguyên tử H trong công thức phân tử, cường độ các đỉnh và hằng số tương tác J (Hz) đã được trình bày ở Bảng 3.4, Phụ lục 1 và Phụ lục 5
Dưới đây là phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 H-NMR minh họa của chất VIb
Hình 4.1 Phổ 1 H-NMR của hợp chất VIb
40 Hợp chất VIb được đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 H-NMR trong dung môi DMSO-d 6 , do đó trên phổ đồ xuất hiện các đỉnh với cường độ δ = 3,30 ppm của nước và δ = 2,50 ppm của DMSO
Dựa trên công thức cấu tạo dự kiến của hợp chất VIb, có 4H ở vị trí 13, 4H ở vị trí 14, 6H ở vị trí 1, 3H ở vị trí 6 tương đương nhau Các H còn lại không tương đương nhau
H7 là proton của nhóm –NH amid, không bị ảnh hưởng bởi H nào khác nên cho mũi đơn, nhưng bị ảnh hưởng của hiệu ứng hút điện tử mạnh đồng thời từ nguyên tử N và nhóm carbonyl nên độ dịch chuyển hóa học lớn δ = 11,63 ppm
Với H11 và H12, do hiệu ứng –M của nhóm C=O làm cho cặp điện tử tự do trên nguyên tử N dịch chuyển dần về phía nhóm C=O, Nsp 3 dần chuyển thành Nsp 2 Vì vậy
2 nguyên tử H11 và H12 không tương đương nhau và cho 2 mũi đơn tại δ = 7,56 ppm và δ = 8,14 ppm
H1 có 6 proton tương đương và H1 gần như không chịu ảnh hưởng của các nhóm xung quanh, vì vậy đỉnh của H1 trên phổ đồ cho 1 mũi đơn tại δ = 1,42 ppm
Với hợp chất VIb, proton H13 và H14 đều có 4H tương đương nhau, trong đó H14 gắn trực tiếp với nguyên tử O có độ âm điện cao hơn nguyên tử N gắn trực tiếp với H13, do đó hút electron mạnh hơn, làm giảm chắn mạnh mẽ hơn nên H14 xuất hiện ở vùng từ trường thấp hơn với δ cao hơn so với H13 Cả hai proton này đều có số mũi là mũi ba (triplet)
Trong vùng cộng hưởng nhân thơm có 5 proton là H4, H5, H8, H9, H10 Trong đó, H9 có mũi đôi của mũi đôi (doublet of doublet), còn số mũi xuất hiện của H4, H5, H8 và H10 đều là mũi đôi (doublet) Xác định trên phổ đồ, ta có: proton H4: δ = 7,66 ppm, J = 8,4 Hz; proton H5: δ = 6,68 ppm, J = 9,0 Hz; proton H8: δ = 7,20 ppm, J = 3,0 Hz; proton H9: δ = 7,11 ppm, J = 9,0 và 3,0 Hz; proton H10: δ = 8,43 ppm, J = 9,0 Hz Các tín hiệu đặc trưng như độ dịch chuyển hóa học δ ppm, độ bội, hằng số tương tác J (Hz) và cường độ các đỉnh trên phổ đồ 1 H-NMR cho thấy phù hợp với công thức cấu tạo dự kiến của hai chất tổng hợp được
4.3.2 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon-13 ( 13 C-NMR)
Trên phổ đồ 13 C-NMR cho thấy số nguyên tử carbon và độ dịch chuyển hóa học δ ppm của các vị trí carbon trong công thức của 2 chất đem đo (Bảng 3.5 và Phụ lục 2,6) Kết quả phổ đồ đã thể hiện đủ tín hiệu carbon trong công thức
Dưới đây là phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13 C-NMR minh họa của chất VIb
Hình 4.2 Phổ 13 C-NMR của hợp chất VIb
Phổ đồ 13 C-NMR của VIb thể hiện rõ nét, đủ 21 tín hiệu tương ứng với 21 loại carbon có trong công thức: ˗ Các chất được đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13 C-NMR trong dung môi DMSO, tần số máy 125MHz, nên xuất hiện thêm đỉnh tại δ = 39,50 ppm của DMSO ˗ Trong công thức cấu tạo dự kiến của VIb có 2 nhóm C=O amid, tuy nhiên C19 có δ lớn hơn C12 vì nhóm –NH2 liên kết với C19=O của amid không bị hút electron từ vòng thơm giống C12 (δC19 = 170,46 ppm; δC12 = 162,52 ppm) ˗ Các C của vòng thơm, Csp 2 xuất hiện ở vùng từ trường 112 – 156 ppm, đủ 14 tín hiệu Có sự chênh lệch giữa các δ của các C này do sự ảnh hưởng khác nhau của các nhóm chức liên kết với nhân thơm hoặc Csp 2 ˗ Các nhóm tín hiệu của Csp 3 gồm C1, C2, C11, C20, và C21 Trong đó:
C1 có giá trị δ nhỏ nhất (δC1 = 27,54 ppm) vì C1 gần như không bị ảnh hưởng bởi các yếu tố gây dịch chuyển
δC20 = 48,70 ppm; vì C20 liên kết với nguyên tử N có độ âm điện nhỏ hơn nguyên tử O liên kết với C2, C11 và C21, dẫn đến bị giảm chắn yếu hơn và δ thấp hơn
Phổ hồng ngoại cho phép phân tích được các dải hấp thụ đặc trưng của dao động hóa trị và dao động biến dạng của các nhóm chức và các liên kết điển hình trong cấu trúc phân tử của các chất
Dưới đây là phổ hồng ngoại IR minh họa của chất VIa
Hình 4.3 Phổ hồng ngoại IR của hợp chất VIa
Liên kết N-H thường có dải hấp thụ tại 3300 – 3500 cm -1 nên có thể xác định 2 dải hấp thụ 3565 cm -1 và 3357 cm -1 phù hợp với dao động hóa trị của nhóm N-H trong công thức VIa dự kiến
Dải hấp thụ của liên kết C (sp 2 )-H xuất hiện tại số sóng trung bình là 3173 cm -1 , còn dải hấp thụ của liên kết C=C vòng thơm, vinyl xuất hiện tại số sóng trung bình 1597 và 1518 cm -1 Trong khi đó, liên kết C (sp 3 )-H có dao động hóa trị trung bình ở 2974 và
Liên kết C=O xuất hiện dao động hóa trị tại 1679 và 1638 cm -1 với cường độ mạnh, tuy nhiên thông thường nhóm carbonyl thường xuất hiện ở dải hấp thụ 1715 cm -1
43 Nguyên nhân có thể là do liên kết C=O còn liên hợp với nhóm amin làm tăng độ phân cực (xu hướng trở thành liên kết đơn), do đó làm giảm số sóng
Cả 2 chất đều được tiến hành đo phổ MS theo chế độ phun mù điện tử ESI Trên phổ đồ, tôi nhận thấy 2 chất đều xuất hiện đỉnh có cường độ mạnh nhất với m/z tương ứng với giá trị [M+H] +
Ví dụ đối với hợp chất VIa có CTPT là C25H30N4O4 tương ứng M = 450,54 Trên phổ đồ của chất VIa, xuất hiện đỉnh [M+H] + có cường độ lớn nhất, có m/z là 451,5 Như vậy, kết quả này có thể kết luận dẫn chất VIa có khối lượng phân tử giống như dự kiến
Hình 4.4 Phổ khối lượng MS của hợp chất VIa
Về thử hoạt tính kháng tế bào ung thư
Viện nghiên cứu Ung thư Quốc gia (NCI) Hoa Kỳ đã phân loại hoạt tính gây độc tế bào của một hợp chất theo nồng độ ức chế tối đa 50% (IC50), bao gồm bốn nhóm: 20 àg/mL (cú hoạt tớnh); >20–100 àg/mL (hoạt tớnh trung bỡnh); >100–1000 àg/mL (hoạt tớnh thấp); và >1000 àg/mL (khụng cú hoạt tớnh) [6]
Sử dụng phương pháp MTT để thử hoạt tính kháng tế bào ung thư trên 2 dòng tế bào gồm: A549: ung thư phổi; MCF-7: ung thư vú Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư đã được trình bày ở Bảng 3.8 và Phụ lục 9 cho thấy: ˗ Cả hai chất VIa và VIb có hoạt tính gây độc tế bào thấp trên cả 2 dòng tế bào A549 và MCF-7 so với chất đối chứng dương Ellipticin
44 ˗ Giữa hai chất VIa và VIb thì VIb có tác dụng gây độc tế bào tốt hơn trên dòng tế bào ung thư phổi A549 với giỏ trị IC50 (àg/mL) là 118,13 Điều này cú thể đưa ra gợi ý rằng hoạt tính kháng tế bào ung thư phụ thuộc vào nhóm thế gắn với vòng phenyl trong công thức cấu tạo, cụ thể là vòng morpholin giúp có tác dụng gây độc tế bào ung thư tốt hơn so với vòng piperazin
Khi so sánh các dẫn chất tổng hợp được với kết quả nghiên cứu trước đây của Nguyễn Công Trường và cộng sự thì cả VIa và VIb đều có hoạt tính gây độc tế bào ung thư phổi (A549) thấp hơn so với NCT-50 [22] Như vậy, khung cấu trúc amin ban đầu có thể ảnh hưởng đáng kể đến hoạt tính kháng tế bào ung thư
Tuy nhiên, số lượng dòng tế bào ung thư thử nghiệm còn ít và số lượng chất nghiên cứu liên quan đến cấu trúc – tác dụng còn hạn chế, do đó chúng tôi chưa có đủ cơ sở để kết luận về các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính gây độc tế bào Trong tương lai có thể thực hiện các nghiên cứu thay thế các nhóm thế trên khung amin để kết luận vai trò của tiểu phần này trong hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các dẫn chất N-(2- carbamoylphenyl)-5-methoxy-2,2-dimethyl-2H-chromen-6-carboxamid
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Từ kết quả của nghiên cứu đã trình bày trong khóa luận tốt nghiệp, tôi đã rút ra được một số kết luận như sau:
1.1 Tổng hợp hóa học và khẳng định cấu trúc ˗ Đã tổng hợp được 2 dẫn chất N-(2-carbamoylphenyl)-5-methoxy-2,2-dimethyl- 2H-chromen-6-carboxamid (VIa-b) Cả 2 chất đều là các chất mới, chưa thấy công bố trong các tài liệu tham khảo:
N-(2-carbamoyl-4-(4-methylpiperazin-1-yl)phenyl)-5-methoxy-2,2-dimethyl-
N-(2-carbamoyl-4-morpholinophenyl)-5-methoxy-2,2-dimethyl-2H-chromen-
6-carboxamid (VIb) ˗ Các chất tổng hợp được đều được kiểm tra độ tinh khiết bằng sắc ký lớp mỏng, đo nhiệt độ nóng chảy, xác định cấu trúc bằng các phổ hồng ngoại (IR), phổ cộng hưởng từ hạt nhân ( 1 H-NMR, 13 C-NMR), phổ khối lượng (MS) và cho kết quả đúng như dự kiến
1.2 Hoạt tính kháng tế bào ung thư Đã thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư của 2 dẫn chất tổng hợp được với 2 dòng tế bào ung thư: ung thư phổi (A549) và ung thư vú (MCF-7) Kết quả cho thấy các dẫn chất đều có hoạt tính gây độc tế bào ung thư ở mức thấp
Với kết quả đã đạt được, chúng tôi xin có một số đề xuất như sau: ˗ Tiếp tục nghiên cứu, tổng hợp các dẫn chất N-(2-carbamoylphenyl)-5-methoxy- 2,2-dimethyl-2H-chromen-6-carboxamid bằng cách thay các nhóm thế gắn với khung anthranilamid nhằm tìm kiếm các chất có hoạt tính kháng tế bào ung thư tốt hơn trong dãy này ˗ Tiếp tục thử hoạt tính gây độc tế bào của các dẫn chất tổng hợp được trên các dòng tế bào ung thư khác nhau
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
1 Bộ Y tế (2021), "Tình hình ung thư tại Việt Nam", Retrieved, 2024, from https://moh.gov.vn/hoat-dong-cua-dia-phuong/-
/asset_publisher/gHbla8vOQDuS/content/tinh-hinh-ung-thu-tai-viet-nam
2 Nguyễn Đình Thành (2011), Cơ sở các phương pháp phổ ứng dụng trong hóa học
(Dùng cho sinh viên, học viên cao học và nghiên cứu sinh ngành Hoá học), NXB
Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội, tr 567-666
3 Adler M.J., Baldwin S.W (2009), "Direct, regioselective synthesis of 2,2-dimethyl- 2H-chromenes Total syntheses of octandrenolone and precocenes I and II",
4 Allen L.F., Sebolt-Leopold J., et al (2003), "CI-1040 (PD184352), a targeted signal transduction inhibitor of MEK (MAPKK)", Seminars in oncology, 30, pp 105-116
5 Anand U., et al (2023), "Cancer chemotherapy and beyond: Current status, drug candidates, associated risks and progress in targeted therapeutics", Genes & Diseases, 10(4), pp 1367-1401
6 Baharum Z., Akim A.M., et al (2014), "In vitro antioxidant and antiproliferative activities of methanolic plant part extracts of Theobroma cacao", Molecules, 19(11), pp 18317-18331
7 Banerjee S., A'Hern R., et al (2010), "Biological evidence for dual antiangiogenic- antiaromatase activity of the VEGFR inhibitor PTK787/ZK222584 in vivo",
8 Bellamy F.D., Ou K (1984), "Selective reduction of aromatic nitro compounds with stannous chloride in non acidic and non aqueous medium", Tetrahedron Letters,
9 Boyd J., Han A (2016), "Deguelin and its role in chronic diseases", Drug Discovery from Mother Nature, pp 363-375
10 Bray F., et al (2021), "Global cancer statistics 2022: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries", CA: a cancer journal for clinicians, pp
11 Chang D., An, H., et al (2012), "Design, synthesis, and biological evaluation of novel deguelin-based heat shock protein 90 (HSP90) inhibitors targeting proliferation and angiogenesis", Journal of medicinal chemistry, 55(24), pp 10863-
12 Charville H (2012), Direct amide formation between carboxylic acids and amines: mechanism and development of novel catalytic solutions, Durham University
13 Chaudhary A., Singh K., et al (2022), "Chromenes-a novel class of heterocyclic compounds: Recent advancements and future directions", Mini Reviews in Medicinal Chemistry, 22(21), pp 2736-2751
14 Cho T.M., Kim J.Y., et al (2019), "C-terminal HSP90 inhibitor L80 elicits anti- metastatic effects in triple-negative breast cancer via STAT3 inhibition", Cancer letters, 447, pp 141-153
15 Conti C., Desideri N (2009), "Synthesis and antirhinovirus activity of new 3-benzyl chromene and chroman derivatives", Bioorganic & medicinal chemistry, 17(10), pp 3720-3727
16 Costa M., Dias T., et al (2016), "Biological importance of structurally diversified chromenes", European journal of medicinal chemistry, 123, pp 487-507
17 Debela D.T., et al (2021), "New approaches and procedures for cancer treatment: Current perspectives", SAGE open medicine, 9, pp 20503121211034366
18 Diamanti A., Ganase Z., et al (2021), "Mechanism, kinetics and selectivity of a Williamson ether synthesis: elucidation under different reaction conditions",
19 Furet P., Bold G., et al (2003), "Identification of a new chemical class of potent angiogenesis inhibitors based on conformational considerations and database searching", Bioorganic & medicinal chemistry letters, 13(18), pp 2967-2971
20 Ghasemi M., Turnbull T., et al (2021), "The MTT assay: utility, limitations, pitfalls, and interpretation in bulk and single-cell analysis", International journal of molecular sciences, 22(23), pp 12827
21 Giatromanolaki A., Koukourakis M.I., et al (2012), "Vascular density analysis in colorectal cancer patients treated with vatalanib (PTK787/ZK222584) in the randomised CONFIRM trials", British journal of cancer, 107(7), pp 1044-1050
22 Hyun S.Y., Le H.T., et al (2018), "Development of a novel Hsp90 inhibitor NCT-
50 as a potential anticancer agent for the treatment of non-small cell lung cancer",
23 Ihmaid S., Ahmed H.E.A., et al (2018), "The design and development of potent small molecules as anticancer agents targeting EGFR TK and tubulin polymerization", International Journal of Molecular Sciences, 19(2), pp 408
24 Kamal A., Bharathi E.V., et al (2010), "Synthesis, anticancer activity and apoptosis inducing ability of anthranilamide-PBD conjugates", Bioorganic & medicinal chemistry letters, 20(11), pp 3310-3313
25 Katiyar M.K., Dhakad G.K., et al (2022), "Synthetic strategies and pharmacological activities of chromene and its derivatives: An overview", Journal of Molecular Structure, 1263, pp 133012
26 Kim H.S., Hong M., et al (2016), "Synthesis and biological evaluation of C-ring truncated deguelin derivatives as heat shock protein 90 (HSP90) inhibitors",
27 Lanigan R.M., Starkov P., et al (2013), "Direct synthesis of amides from carboxylic acids and amines using B (OCH2CF3) 3", The Journal of organic chemistry, 78(9), pp 4512-4523
28 Larock R.C, Wei L., et al (1998), "Synthesis of 2H-1-benzopyrans by Pd-catalyzed cyclization of o-allylic phenols", Synlett, 1998(05), pp 522-524
29 Lee H.J (2004), "Molecular mechanisms of deguelin-induced apoptosis in transformed human bronchial epithelial cells", Biochemical pharmacology, 68(6), pp 1119-1124
30 Lee S.C., Min H.Y., et al (2016), "Deguelin analogue SH-1242 inhibits Hsp90 activity and exerts potent anticancer efficacy with limited neurotoxicity", Cancer research, 76(3), pp 686-699
31 Li Z.N., Luo Y (2023), "HSP90 inhibitors and cancer: Prospects for use in targeted therapies", Oncology Reports, 49(1), pp 1-13
32 Liu J., Liang W., et al (2013), "Synthesis and biological evaluation of novel anthranilamide derivatives as anticancer agents", Drug Discoveries & Therapeutics, 7(4), pp 144-152
33 Manley P.W., Furet P., et al (2002), "Anthranilic acid amides: a novel class of antiangiogenic VEGF receptor kinase inhibitors", Journal of medicinal chemistry, 45(26), pp 5687-5693
34 Marcu M.G., et al (2000), "The heat shock protein 90 antagonist novobiocin interacts with a previously unrecognized ATP-binding domain in the carboxyl terminus of the chaperone", Journal of Biological Chemistry, 275(47), pp 37181-
35 Montalbetti C., Falque V (2005), "Amide bond formation and peptide coupling",
36 Oh S.H., Woo J.K., et al (2007), "Structural basis for depletion of heat shock protein
90 client proteins by deguelin", Journal of the National Cancer Institute, 99(12), pp 949-961
37 Ouellette R.J., Rawn J.D (2018), Organic chemistry: structure, mechanism, synthesis, Academic Press, pp
38 Park J.M., Kim Y.J., et al (2020), "A novel HSP90 inhibitor targeting the C- terminal domain attenuates trastuzumab resistance in HER2-positive breast cancer",
39 Park S., Kim Y.J., et al (2021), "The C-terminal HSP90 inhibitor NCT-58 kills trastuzumab-resistant breast cancer stem-like cells", Cell death discovery, 7(1), pp
40 Prado et al (2006), "A simple two steps ytterbium triflate‐catalysed preparation of
2, 2‐dimethyl‐2h‐chromenes from salicylaldehydes and 2‐methylpropene", Journal of heterocyclic chemistry, 43(6), pp 1605-1608
41 Sartori G., Casiraghi G., et al (1979), "General synthesis of 2H-benzo [b] pyrans (chrom-3-enes) from metal phenoxides and alpha., beta.-unsaturated carbonyl compounds", The Journal of Organic Chemistry, 44(5), pp 803-805
42 Schopf F.H., Biebl M.M., et al (2017), "The HSP90 chaperone machinery", Nature reviews Molecular cell biology, 18(6), pp 345-360
43 Tee J.T., Yaeghoobi M., et al (2015), "Efficient One-Pot Synthesis of 2, 2- Dimethyl-2 H-chromenes via Pd (II)-Catalyzed Coupling and SiO2-Promoted Condensation of o-Halophenols with 2-Methyl-3-buten-2-ol", Synthetic Communications, 45(16), pp 1920-1927
44 Zhi Qiang D., Shi J.B., et al (2014), "Novel 2 H-chromen derivatives: design, synthesis and anticancer activity", RSC Advances, 4(11), pp 5607-5617.