lê anh thư tổng hợp và thử tác dụng kháng tế bào ung thư của một số dẫn chất n 2 carbamoylphenyl 5 methoxy 2 2 dimethyl2h chromen 6 carboxamid

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

––––––––––

LÊ ANH THƯ

TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG KHÁNG TẾ BÀO UNG THƯ

CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT

N-(2-CARBAMOYLPHENYL)- 5-METHOXY-2,2-DIMETHYL- 2H-CHROMEN-6-CARBOXAMID

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2024

CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT

N-(2-CARBAMOYLPHENYL)- 5-METHOXY-2,2-DIMETHYL- 2H-CHROMEN-6-CARBOXAMID

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2024

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và gửi lời cảm ơn chân thành tới

cô PGS TS Đinh Thị Thanh Hải và thầy TS Nguyễn Công Trường đã luôn đồng

hành cùng tôi vượt qua bao khó khăn, luôn quan tâm, động viên, tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành khóa luận này

Tôi vô cùng biết ơn và xin chân thành cảm ơn cô ThS Nguyễn Nữ Huyền My đã

tận tình dìu dắt, hướng dẫn, động viên, khích lệ, cho tôi những kinh nghiệm quý báu trong công việc

Chân thành cảm ơn các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên, các bạn và các em tại Bộ môn Hóa Hữu cơ đã luôn tạo điều kiện để tôi được thực hiện và hoàn thành khóa luận tại bộ môn

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình, bạn bè, các thành viên tổ 11 và Đội Cộng tác viên Đoàn Thanh niên đã luôn sát cánh, quan tâm và tiếp thêm ngọn lửa tinh thần trong thời gian vừa qua

Mặc dù đã cố gắng hết sức cũng như được tạo mọi điều kiện, song do thời gian nghiên cứu chưa nhiều, kiến thức bản thân còn hạn chế nên chắc chắn khóa luận này còn nhiều thiếu sót Rất mong nhận được những đóng góp quý báu của thầy cô và các bạn để khóa luận được hoàn thiện hơn

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 1 tháng 6 năm 2024

Sinh viên

Lê Anh Thư

MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮTDANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼDANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Hoạt tính kháng tế bào ung thư của các dẫn chất chất 2H-chromen 2

1.2 Hoạt tính kháng tế bào ung thư của các dẫn chất Anthranilamid aminobenzamid) 5

(2-1.3 Định hướng thiết kế cấu trúc 7

1.4 Các phản ứng liên quan đến tổng hợp các dẫn chất 5-methoxy-2,2-dimethyl-2H-chromen-6-carboxamid 9

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 14

2.1.1 Nguyên vật liệu, hóa chất, dung môi 14

2.1.2 Thiết bị thí nghiệm 15

2.2 Nội dung nghiên cứu 15

2.2.1 Tổng hợp hóa học các dẫn chất dimethyl-2H-chromen-6-carboxamid 15

N-(2-carbamoylphenyl)-5-methoxy-2,2-2.2.2 Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư của các dẫn chất tổng hợp được 16

2.3 Phương pháp nghiên cứu 16

2.3.1 Phương pháp tổng hợp chromen-6-carboxamid 16

N-(2-carbamoylphenyl)-5-methoxy-2,2-dimethyl-2H-2.3.2 Phương pháp tinh chế và xác định cấu trúc 16

2.3.3 Phương pháp thử hoạt tính kháng tế bào ung thư 16

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 19

3.1.5 Tổng hợp các dẫn chất

N-(2-carbamoylphenyl)-5-methoxy-2,2-dimethyl-2H-chromen-6-carboxamid (VIa-b) 26

3.2 Kiểm tra độ tinh khiết và khẳng định cấu trúc 28

3.2.1 Kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm 28

4.2.2 Phản ứng tổng hợp 5-cloro-2-nitrobenzamid 35

4.2.3 Phản ứng tổng hợp các dẫn chất 2-amino-5-(cyclicamino)benzamid 36

4.2.4 Phản ứng tổng hợp các dẫn chất dimethyl-2H-chromen-6-carboxamid 37

N-(2-carbamoylphenyl)-5-methoxy-2,2-4.3 Về khẳng định cấu trúc các hợp chất tổng hợp được 38

4.3.1 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR) 38

4.3.2 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon-13 (13C-NMR) 40

4.3.3 Phổ hồng ngoại (IR) 42

4.3.4 Phổ khối lượng (MS) 43

4.4 Về thử hoạt tính kháng tế bào ung thư 43

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

13C-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13

(Carbon 13 nuclear magnetic resonance)

1H-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton

(Proton nuclear magnetic resonance)

HCT-116 Dòng tế bào ung thư ruột kết

(High performance liquid chromatography)

Lead compound Chất dẫn đường

m/z Tỷ số giữa khối lượng và điện tích của các ion

MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium

(Mass spectrometry)

(Non-small cell lung cancer)

PDGFR Thụ thể yếu tố tăng trưởng có nguồn gốc tiểu cầu

(Platelet-derived growth factor receptor)

SCFR Thụ thể yếu tố tăng trưởng tế bào gốc

(Stem cell factor receptor)

(Thin layer chromatography)

(Triple negative breast cancer)

to

(Vascular endothelial growth factor)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Danh mục các dung môi, hóa chất 14

Bảng 3.1 Kết quả tổng hợp các dẫn chất dimethyl-2H-chromen-6-carboxamid (VIa-b) 28

N-(2-carbamoylphenyl)-5-methoxy-2,2-Bảng 3.2 Giá trị Rf của các dẫn chất (VIa-b) 28

Bảng 3.3 Giá trị nhiệt độ nóng chảy (tonc) của các dẫn chất (VIa-b) 29

Bảng 3.4 Số liệu phổ 1H-NMR của các dẫn chất (VIa-b) 30

Bảng 3.5 Số liệu phổ 13C-NMR của các dẫn chất (VIa-b) 31

Bảng 3.6 Số liệu phổ hồng ngoại IR của các dẫn chất (VIa-b) 32

Bảng 3.7 Số liệu phổ khối lượng MS của các dẫn chất (VIa-b) 32

Bảng 3.8 Kết quả thử hoạt tính kháng tế bào ung thư của các dẫn chất (VIa-b) 33

Bảng 4.1 Khảo sát thời gian phản ứng methyl hóa trong các dung môi khác nhau 35

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Hình 1.1 So sánh IC50 của SH-1242 và hợp chất (1) 3

Hình 1.2 Thiết kế cấu trúc NCT-50 từ novobiocin và deguelin 4

Hình 1.3 Công thức cấu tạo của NCT-58 5

Hình 1.4 Thiết kế cấu trúc NCT-547 từ deguelin và L80 5

Hình 1.5 Các dẫn chất anthranilamid tiềm năng trong điều trị ung thư 6

Hình 1.6 Giá trị IC50 của một số dẫn chất có khung anthranilamid 7

Hình 1.7 Định hướng thiết kế cấu trúc từ khung 5-methoxy-2,2-dimethyl-2H-chromen 8

Hình 1.8 Định hướng thiết kế cấu trúc từ khung anthranilamid 9

Hình 1.9 Thiết kế cấu trúc chất cần nghiên cứu 9

Hình 4.1 Phổ 1H-NMR của hợp chất VIb 39

Hình 4.2 Phổ 13C-NMR của hợp chất VIb 41

Hình 4.3 Phổ hồng ngoại IR của hợp chất VIa 42

Hình 4.4 Phổ khối lượng MS của hợp chất VIa 43

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 1.1 Phát triển các hợp chất mới từ deguelin 3

Sơ đồ 1.2 Tổng hợp dẫn chất 2H-chromen bởi Sartori 10

Sơ đồ 1.3 Tổng hợp dẫn chất 2H-chromen bởi Larock 10

Sơ đồ 1.4 Tổng hợp dẫn chất 2,2-dimethyl-2H-chromen bởi Prado 11

Sơ đồ 1.5 Tổng hợp dẫn chất 2,2-dimethyl-2H-chromen theo phương pháp chiếu xạ vi sóng 11

Sơ đồ 1.6 Tổng hợp dẫn chất 2,2-dimethyl-2H-chromen bởi Tee 12

Sơ đồ 1.7 Tổng hợp amid sử dụng xúc tác B(OCH2CF3)3 12

Sơ đồ 1.8 Tổng hợp amid sử dụng DCC hoặc EDC xúc tác HOBt 13

Sơ đồ 3.1 Quy trình tổng hợp các dẫn chất dimethyl-2H-chromen-6-carboxamid (VIa-b) 19

N-(2-carbamoylphenyl)-5-methoxy-2,2-Sơ đồ 3.2 Quy trình tổng hợp acid 5-methoxy-2,2-dimethyl-2H-chromen-6-carboxylic (Vd) 19

Sơ đồ 3.3 Quy trình tổng hợp 5-cloro-2-nitrobenzamid (II) 20

Sơ đồ 3.4 Quy trình tổng hợp các dẫn chất IIIa-b 21

Sơ đồ 3.5 Quy trình tổng hợp các dẫn chất IVa-b 22

Sơ đồ 3.6 Quy trình tổng hợp chất Vb 23

Sơ đồ 3.7 Quy trình tổng hợp chất Vc 24

Sơ đồ 3.8 Quy trình tổng hợp chất Vd 25

Sơ đồ 3.9 Quy trình tổng hợp chất VIa 26

Sơ đồ 3.10 Quy trình tổng hợp chất VIb 27

Sơ đồ 4.1 Cơ chế phản ứng đóng vòng tạo khung 2H-chromen 34

Sơ đồ 4.2 Cơ chế phản ứng methyl hóa theo phản ứng Williamson ether 35

Sơ đồ 4.3 Cơ chế phản ứng tạo acyl clorid từ acid carboxylic và SOCl2 36

Sơ đồ 4.4 Cơ chế phản ứng tổng hợp amid từ amin và acyl clorid tương ứng 36

Sơ đồ 4.5 Cơ chế phản ứng thế SNAr để tổng hợp IIIa-b 37

Sơ đồ 4.6 Cơ chế phản ứng tạo amid từ acid carboxylic và amin tương ứng 38

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ung thư vẫn luôn là mối quan tâm và là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên thế giới Theo ước tính GLOBOCAN (2022) từ Cơ quan Nghiên cứu Ung thư Quốc tế (IARC), mỗi năm ghi nhận thêm khoảng 20 triệu ca mắc mới và 10 triệu ca tử vong do ung thư Trong đó, ung thư phổi là nguyên nhân hàng đầu gây bệnh và tử vong do ung thư (12.4% và 18.7% trên tổng số ca) [10] Tại Việt Nam, năm 2020, tỉ lệ mắc mới đã tăng lên 9 bậc (xếp thứ 91/185 quốc gia) và tỉ lệ tử vong do ung thư tăng 6 bậc (xếp thứ 50/185 quốc gia) so với ghi nhận năm 2018 [1]

Các phương pháp điều trị bệnh ung thư bao gồm: phẫu thuật, xạ trị, hóa trị, liệu pháp điều trị đích và liệu pháp miễn dịch [17]… Trong đó, hóa trị liệu đóng vai trò quan trọng, là lựa chọn đầu tay cho các bệnh nhân ung thư ở giai đoạn tiến triển, khi phẫu thuật và/hoặc xạ trị không thể được chỉ định [5]

Các dẫn chất chromen là các hợp chất dị vòng chứa oxy với khung cấu trúc đơn giản nhưng có nhiều tiềm năng trong nghiên cứu điều trị ung thư Những hợp chất có cấu trúc khung chromen được tìm thấy nhiều trong tự nhiên dưới dạng alkaloid, tocopherol, flavon và anthocyanin [13], [25] Trong những năm qua, nhiều dẫn chất chromen tự nhiên có tác dụng điều trị ung thư đã được phân lập từ các nguồn thực vật và biển như tephrosin (ung thư phổi), calanon (ung thư bạch cầu và ung thư cổ tử cung), seselin (ung thư da) [13]

Tiếp nối hướng nghiên cứu tiềm năng của chromen, với định hướng phát triển thêm

các dẫn chất 2H-chromen và tìm hiểu mối liên quan giữa cấu trúc và hoạt tính kháng tế

bào ung thư của dãy chất này, khóa luận: “Tổng hợp và thử tác dụng kháng tế bào ung

thư của một số dẫn chất

N-(2-carbamoylphenyl)-5-methoxy-2,2-dimethyl-2H-chromen-6-carboxamid” được tiến hành với 2 mục tiêu sau:

1 Tổng hợp được một số dẫn chất dimethyl-2H-chromen-6-carboxamid

N-(2-carbamoylphenyl)-5-methoxy-2,2-2 Thử hoạt tính gây độc tế bào của các dẫn chất tổng hợp được trên một số dòng tế bào ung thư

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Hoạt tính kháng tế bào ung thư của các dẫn chất chất 2H-chromen

Các dẫn chất 2H-chromen hay còn gọi là 2H-benzopyran là một nhóm hợp chất

hữu cơ hệ dị vòng với cấu trúc đơn giản, gồm một vòng pyran liên kết với một vòng benzen Khung chromen có mặt trong nhiều các hợp chất tự nhiên khác nhau và có hoạt tính sinh học cao Các dẫn chất chromen đã được chứng minh có nhiều đặc tính dược lý đa dạng, bao gồm: kháng virus [15], [16], chống ung thư [13], [44], chống viêm [16], Trong đó, deguelin là một rotenoid tự nhiên cho thấy tác dụng chống tăng sinh, chống di căn và gây chết tế bào theo chương trình (apoptosis) mạnh mẽ trên các tế bào biểu mô phế quản ác tính của người và nhiều tế bào ung thư khác nhau mà ít gây độc tế bào đối với các tế bào bình thường [29]

Protein Hsp90 là chaperone có vai trò điều hòa sự hình thành và ổn định của các protein truyền tín hiệu (vai trò sinh lý) [14], [42] Trong các tế bào ung thư, Hsp90 thúc đẩy sự tiến triển và di căn của khối u nhờ tác động lên nhiều protein truyền tín hiệu như STAT3, HER2, HIF-1a [14], [31] Các nghiên cứu về cơ chế chỉ ra rằng deguelin can thiệp vào chức năng của Hsp90 bằng cách ức chế liên kết ATP, gây phân hủy yếu tố phiên mã HIF-1α, cho thấy deguelin là một chất dẫn đường tiềm năng trong việc điều trị ung thư, nhất là đối với ung thư phổi [36] Tuy nhiên, trên thực tế deguelin đã được báo cáo gây ra các triệu chứng giống hội chứng Parkinson thông qua thoái hóa con đường dopaminergic và ức chế phức hợp I của ty thể (của neuron thần kinh) chuột [9]

Vì vậy, nhóm nghiên cứu của Kim phát triển các dẫn chất tương tự deguelin để

giảm bớt độc tính này như: SH-1242 được tạo ra bằng cách cắt các vòng B và C, còn

L80 được tạo ra bằng cách cắt vòng C của deguelin [26] (Sơ đồ 1.1) Cả hai chất này

đều thể hiện hoạt tính kháng tế bào ung thư trên nhiều dòng tế bào khác nhau Nhóm

nghiên cứu của Lee và cộng sự đã chỉ ra rằng, SH-1242 liên kết với tiểu phân gắn ATP

ở đầu C của Hsp90, làm gián đoạn khả năng tương tác của chất này với các co-chaperon và protein đích, đồng thời kích hoạt sự phân hủy của các protein đích mà không ảnh

hưởng đến sự biểu hiện của Hsp90 [30] Trong khi đó, L80 có tác dụng ức chế khả năng

sống, hình thành cụm tế bào, hình thành mạch máu, di căn và xâm lấn của các dòng tế bào ung thư biểu mô phổi không phải tế bào nhỏ (NSCLC) và ung thư vú bộ ba âm tính (TNBC) [14], đồng thời gây độc tính tối thiểu cho các tế bào bình thường [26]

Sơ đồ 1.1 Phát triển các hợp chất mới từ deguelin

Năm 2012, Chang và cộng sự đã trình bày nghiên cứu liên quan đến cấu trúc - tác

dụng sinh học của các hợp chất phát triển từ khung deguelin Trong đó, hợp chất

SH-1242 thể hiện hoạt tính tốt, với IC50 là 0,14 μM trên dòng tế bào H1299, gần như ngang bằng với deguelin Đáng chú ý, việc loại bỏ nhóm thế 5-methoxy trong khung 2,2-

dimethyl-2H-chromen của SH-1242 (hình thành hợp chất (1)) làm giảm đáng kể hoạt

tính (IC50 hợp chất (1) = 1 μM trên cùng dòng tế bào, Hình 1.1) Điều này cho thấy phần

cấu trúc 5-methoxy-2,2-dimethyl-2H-chromen trên khung deguelin ban đầu rất quan

trọng đối với hoạt tính ức chế Hsp90, từ đó đem lại tác dụng kháng tế bào ung thư tốt [11]

Hình 1.1 So sánh IC50 của SH-1242 và hợp chất (1)

Novobiocin, một kháng sinh coumarin có nguồn gốc từ xạ khuẩn Streptomyces niveus, đã được chứng minh là có hoạt tính ức chế Hsp90 Tuy nhiên, IC50 của novobiocin được ghi nhận lên tới 700 μM, khiến chất này khó sử dụng trong lâm sàng

[34] Hợp chất NCT-50 được phát triển từ khung novobiocin-deguelin, sau đó được

nhóm nghiên cứu của Nguyễn Công Trường công bố như một chất chống ung thư nhắm

tới đích Hsp90 với độc tính giảm trên gan và mắt ở cả thử nghiệm in vitro và in vivo

Kết quả nghiên cứu cho thấy, giá trị IC50 của NCT-50 gần tương đương với deguelin

trên dòng tế bào ung thư phổi H1299 và vượt trội hơn trên dòng tế bào A549 (Hình 1.2)

[22] Cơ chế tác dụng của NCT-50 là gây chết tế bào theo chương trình (apoptosis) ở

các tế NSCLC, đồng thời ức chế sự biểu hiện và hoạt động của một số protein phụ thuộc Hsp90, bao gồm yếu tố phiên mã HIF-1α mà không gây độc tính đến các tế bào bình

thường [22] Ngoài ra, NCT-50 còn ức chế khả năng tạo mạch của các tế bào NSCLC,

hạn chế sự phát triển và di căn của khối u nguyên phát Do đó chất này có tiềm năng trong việc khắc phục tình trạng kháng các loại thuốc hiện đang được sử dụng để điều trị ở các bệnh nhân mắc NSCLC như: paclitaxel, cisplatin hoặc pemetrexed [22]

Hình 1.2 Thiết kế cấu trúc NCT-50 từ novobiocin và deguelin

Một hợp chất khác phát triển từ khung deguelin là NCT-58 (Hình 1.3), được nhóm nghiên cứu của Park và cộng sự công bố vào năm 2021 Khi khảo sát tác dụng của NCT-

58 phụ thuộc vào liều dùng (0,1-20 μM trong 72 giờ), kết quả cho thấy chất này làm

giảm khả năng sống của tế bào ung thư biểu mô tuyến vú HER2 dương tính BT474 và SKBR3 [39] Nghiên cứu trước đây của Kim chỉ ra rằng tỉ lệ kiểu hình CD44high/CD24low

cao là dấu hiệu của sự kháng trastuzumab Khi xử lý các tế bào JIMT1 kháng

trastuzumab bằng NCT-58, thu được kết quả tỉ lệ CD44high/CD24low giảm đáng kể, đồng thời ức chế sự hình thành khối u ở tuyến vú Bằng cách phân tích chu kỳ tế bào, nhóm

nghiên cứu của Park và cộng sự xác định NCT-58 không ảnh hưởng đến tế bào biểu mô

tuyến vú bình thường của người (MCF-10A) [39]

Hình 1.3 Công thức cấu tạo của NCT-58

NCT-547 là hoạt chất được tối ưu hóa cấu trúc từ deguelin và L-80 (Hình 1.4)

Nhóm nghiên cứu của Park và cộng sự thực hiện đánh giá tác dụng của NCT-547 lên

khả năng gây chết tế bào theo chương trình ở các dòng tế bào ung thư vú HER2 dương tính, bao gồm các dòng nhạy cảm với trastuzumab (BT474 và SKBR3) và các dòng

kháng trastuzumab (JIMT-1 và MDA-MB-453) Kết quả cho thấy NCT-547 gây ra hiện

tượng apoptosis trên tất cả các dòng tế bào này, kèm theo sự tích lũy tế bào ở pha

sub-G1 và sự hoạt hóa enzym caspase-3 và caspase-7 [38] Ngoài ra, NCT-547 còn làm giảm

sự có mặt của các phức hợp HER2/HER3 và HER2/EGFR, cũng như ngăn chặn sự tương tác giữa Hsp90 và HER2 trong các dòng tế bào BT474 và JIMT-1 [38]

Hình 1.4 Thiết kế cấu trúc NCT-547 từ deguelin và L80

Như vậy, cả NCT-58 và NCT-547 đều có khả năng làm giảm đáng kể kích thước

khối u trong thử nghiệm in vivo Trong đó, NCT-58 được báo cáo là có ảnh hưởng tối

thiểu đến tế bào bình thường còn NCT-547 hiện không ghi nhận các ảnh hưởng độc hại

nào trong phân tích chức năng gan và thận ban đầu

1.2 Hoạt tính kháng tế bào ung thư của các dẫn chất Anthranilamid aminobenzamid)

(2-Anthranilamid (2-aminobenzamid) là hợp chất hữu cơ có cấu trúc hóa học gồm vòng benzen và nhóm amino ở vị trí ortho so với nhóm chức amid chính (-CONH2)

được đánh giá có hoạt tính chống khối u tốt, và đã được thử nghiệm lâm sàng trong điều trị ung thư vú, ung thư đại trực tràng, và các bệnh ung thư khác [7], [21]

Năm 2003, Furet và cộng sự cho rằng phần anthranilamid có liên kết hydro nội phân tử mạnh giữa H của nhóm amin và O của nhóm amid, từ đó tạo thành một vòng

sáu cạnh giả tương tự với vòng phthalazin của PTK787 [19] Như vậy, dựa trên cấu trúc

của PTK787, các nhà nghiên cứu đã tổng hợp một loạt các dẫn chất anthranilamid với kỳ vọng chúng có hoạt tính kháng tế bào ung thư tương tự PTK787 [23], [32]

Hình 1.5 Các dẫn chất anthranilamid tiềm năng trong điều trị ung thư

Hai chất dẫn đường có chứa khung anthranilamid là AAL993 (2-((4-pyridyl)

methyl)amino-N-(3-(trifluoromethyl)phenyl)benzamid, Hình 1.5) và CI-1040

(2-((2-cloro-4-iodophenyl)amino)-N-(cyclopropylmethoxy)-3,4- difluorobenzamid, Hình

1.5) Trong đó, AAL993 là một chất có đặc tính chống khối u mạnh, sinh khả dụng qua đường uống cao, ức chế chọn lọc và mạnh mẽ các VEGFR [33] còn CI-1040 là chất ức

chế MEK1/2 đầu tiên được đưa vào thử nghiệm lâm sàng, với khả năng kháng lại tế bào

ung thư ở cả môi trường in vitro và in vivo [4] Khung anthranilamid có trong các cấu

trúc này được coi là nguyên nhân tạo ra các đặc tính kháng ung thư mạnh [24] Năm 2013, nhóm nghiên cứu của Liu và cộng sự đã tổng hợp và thử hoạt tính sinh

học của một loạt các dẫn chất anthranilamid mới, trong đó có các chất (2a-d) (Hình 1.6)

[32] Các chất này được đánh giá về hoạt tính kháng tế bào ung thư trên thông qua ức chế VEGFR-2 trên dòng tế bào ung thư ruột kết (HCT-116) và dòng tế bào ung thư biểu

mô tuyến vú (MDA-MB-231) trong điều kiện in vitro

Hình 1.6 Giá trị IC50 của một số dẫn chất có khung anthranilamid

Kết quả cho thấy các dẫn chất trên có tác dụng kháng tế bào ung thư mạnh và chọn

lọc thông qua con đường ức chế VEGFR-2 Trong đó, hợp chất (2c) có hoạt tính rõ rệt

nhất trên cả hai dòng tế bào với giá trị IC50 là 14,60 μmol/L (HCT 116) và 13,86 μmol/L

(MDA-MB-231) (Hình 1.6) [32] Tác động của (2c) đối với quá trình chết tế bào theo

chương trình (apoptosis) và chu kỳ tế bào đã được nghiên cứu bằng kỹ thuật đếm tế bào

dòng chảy Hợp chất (2c) ngăn chặn tế bào từ pha S sang pha G2-M, tạo ra sự tích lũy ở các pha G1 và S trong tế bào HCT-116 Kết quả này cho thấy rằng hợp chất (2c) có

thể làm rối loạn quá trình nhân đôi của DNA trong tế bào ung thư

1.3 Định hướng thiết kế cấu trúc

Dựa vào phần lý thuyết đã trình bày ở trên, nhóm nghiên cứu của chúng tôi thấy rằng phần cấu trúc 5-methoxy-2,2-dimethyl-2H-chromen có tác dụng ức chế đầu C của

Hsp90, từ đó đem lại tác dụng kháng tế bào ung thư tốt (SH-1242, NCT-50, NCT-58,

NCT-547) [11] (Hình 1.7)

Hình 1.7 Định hướng thiết kế cấu trúc từ khung 5-methoxy-2,2-dimethyl-2H-chromen

Bên cạnh đó, khung anthranilamid cũng được chứng minh là phần cấu trúc mang dược tính tiềm năng trong việc kháng tế bào ung thư ruột kết và ung thư biểu mô tuyến vú [23], [24], [32] (Hình 1.8)

Hình 1.8 Định hướng thiết kế cấu trúc từ khung anthranilamid

Tiếp nối các nghiên cứu trước đây, nhóm chúng tôi thiết kế các công thức mới

bằng việc lai hóa giữa hai phần mang dược tính là 5-methoxy-2,2-dimethyl-2H-chromen

và khung anthranilamid (Hình 1.9) Đồng thời, gắn thêm các nhóm morpholin-4-yl và 4-methylpiperazin-1-yl trên khung cấu trúc anthranilamid với kỳ vọng làm tăng khả năng ức chế tế bào ung thư và hạn chế ảnh hưởng đến các tế bào bình thường

Hình 1.9 Thiết kế cấu trúc chất cần nghiên cứu

1.4 Các phản ứng liên quan đến tổng hợp các dẫn chất methoxy-2,2-dimethyl-2H-chromen-6-carboxamid

N-(2-carbamoylphenyl)-5-1.4.1 Một số phương pháp tổng hợp các dẫn chất 2,2-dimethyl-2H-chromen

1.4.1.1 Phản ứng tổng hợp 2H-chromen từ phenoxid và các hợp chất carbonyl α-β không bão hòa

Năm 1978, nhóm nghiên cứu của Sartori và cộng sự đã thực hiện phản ứng tổng

hợp các dẫn chất của 2,2-dimethyl-2H-chromen bằng cách đun hồi lưu dung dịch toluen

chứa phenoxid kim loại và hợp chất carbonyl α-β không bão hòa (Sơ đồ 1.2) Sản phẩm thu được là các dẫn chất chromen với hiệu suất tốt và độ chọn lọc cao [41]

Sơ đồ 1.2 Tổng hợp dẫn chất 2H-chromen bởi Sartori

Khi lựa chọn phenoxid kim loại, ngoài titan (IV) và magie thì thiếc (IV) và nhôm cũng có thể sử dụng vì khả năng phản ứng chọn lọc cao trong các dung môi ít phân cực Ngược lại, các muối kiềm và dung môi cation (DMF, glyme) khiến hiệu suất của quá trình tổng hợp thấp (2-3% so với > 60%) [41]

1.4.1.2 Phản ứng tổng hợp 2H-chromen bằng xúc tác Pd của o-allylic phenol

Nhóm nghiên cứu của Larock và công sự vào năm 1997 đã sử dụng nhiều loại hợp

chất của Pd để làm xúc tác cho quá trình tổng hợp các dẫn chất của 2H-chromen Trong

khi PdCl2/MeOH tạo ra hỗn hợp sản phẩm gồm ete vòng 5 và 6 cạnh với hiệu suất thấp, thì việc sử dụng Pd(OAc)2 hoặc Pd(dba)2 lại giúp hiệu suất được cải thiện đáng kể

Điều kiện tối ưu cho quá trình tạo vòng của 2-allylphenol (0,5 mmol) là: đun nóng 5 mol% Pd(dba)2 và KHCO3 (0,55 mmol) trong DMSO/nước (10 mL) theo tỷ lệ 9:1 trong 3 ngày ở nhiệt độ 60°C khi có khí O2 (Sơ đồ 1.3) Việc lựa chọn chất xúc tác Pd trong môi trường base và hệ dung môi DMSO là rất quan trọng để hình thành chọn lọc

2H-chromen với hiệu suất cao

Sơ đồ 1.3 Tổng hợp dẫn chất 2H-chromen bởi Larock Khi sử dụng nguyên liệu ban đầu là các ortho-allylic phenol khác nhau, sẽ thu được các dẫn chất 2H-chromen với các hiệu suất khác nhau (Ví dụ đối với 2,2-dimethyl-2H-chromen, hiệu suất 72%) [28]

1.4.1.3 Phản ứng ngưng tụ của salicylaldehyd và 2-methylpropen

Năm 2006, nghiên cứu của Prado và cộng sự đã tổng hợp được các dẫn chất

2,2-dimethyl-2H-chromen bằng phương pháp sử dụng ytterbium triflat (Yb(OTf)₃) làm xúc

tác cho phản ứng giữa salicylaldehyd, trimethyl orthofomat và 2-methylpropen ở nhiệt độ phòng [40] Quá trình này tạo ra hai sản phẩm có thể phân lập được (Sơ đồ 1.4):

˗ Hợp chất (3a) (hiệu suất 27%): tạo thành do phản ứng cộng hợp [2 + 4], xúc tác

bởi acid Lewis

˗ Hợp chất (3b) (hiệu suất 14%): tạo thành từ phản ứng carbonyl-en, sau đó thêm

methanol vào liên kết đôi

Cả hai hợp chất trung gian (3a) và (3b) được đun hồi lưu lại trong toluen cùng một

lượng xúc tác nhỏ acid p-toluenesulfonic, tạo thành sản phẩm

2,2-dimethyl-2H-chromen

Sơ đồ 1.4 Tổng hợp dẫn chất 2,2-dimethyl-2H-chromen bởi Prado 1.4.1.4 Phản ứng từ phenol và 3-metyl-2-butenal bằng chiếu xạ vi sóng

Nhóm nghiên cứu của Adler vào năm 2009 đã đưa ra phương pháp hiệu quả để

tổng hợp 2,2-dimethyl-2H-chromen bằng một bước duy nhất từ 2 nguyên liệu ban đầu

là phenol và 3-metyl-2-butenal Quy trình này sử dụng chiếu xạ ở mức 300 W trong CDCl3, môi trường phản ứng trung tính, không cần bổ sung chất xúc tác, tạo ra sự hình thành chọn lọc chromen

Phản ứng này được cho là tạo ra chất trung gian ortho-quinon methid trước, sau đó trải qua quá trình vòng hóa 6π nội phân tử để tạo ra sản phẩm chromen cuối cùng như Sơ đồ 1.5

Sơ đồ 1.5 Tổng hợp dẫn chất 2,2-dimethyl-2H-chromen theo phương pháp chiếu xạ vi

sóng

Nghiên cứu cũng chỉ ra một xu hướng là khi tăng số lượng nhóm đẩy điện tử trên phenol sẽ làm tăng hiệu quả của phương pháp này (có thể lên đến 89%) [3]

1.4.1.5 Phản ứng ngưng tụ của o-halophenol với 2-methylbut-3-en-2-ol

Năm 2015, nhóm nghiên cứu của Tee và cộng sự đã tổng hợp các dẫn chất

2,2-dimethyl-2H-chromen bằng phản ứng ngưng tụ o-halophenol với

2-methylbut-3-en-2-ol (Sơ đồ 1.6) Phản ứng này có thể tạo ra sản phẩm phụ theo phản ứng ghép đôi Heck

(sản phẩm (4)) và làm giảm hiệu suất của 2,2-dimethyl-2H-chromen Tuy nhiên, nhóm

nghiên cứu đã nâng hiệu suất của sản phẩm mong muốn bằng cách sử dụng xúc tác của Pd(II) và thúc đẩy bằng SiO2, thực hiện phản ứng trong điều kiện một bình (one-pot condition) Hiệu suất của phản ứng có thể đạt tới 76-80% [43]

Sơ đồ 1.6 Tổng hợp dẫn chất 2,2-dimethyl-2H-chromen bởi Tee

1.4.2 Một số phương pháp tổng hợp amid trực tiếp từ acid carboxylic và amin tương ứng

Dẫn chất acid cacboxylic là acid hữu cơ mạnh, khi tiếp xúc với amin (tác nhân base) sẽ xảy ra phản ứng acid – base đầu tiên Sự proton hóa làm cho đặc tính nucleophil của amin giảm mạnh vì không còn cặp electron tự do Đồng thời, acid carboxylic chuyển thành anion carboxylat sẽ làm yếu đi tác nhân electrophil và phản ứng amid hóa gần như không xảy ra [12]

Do đó, đã có nhiều nghiên cứu về các phương pháp mới để tăng tốc độ phản ứng cũng như nâng cao hiệu suất cho phản ứng amid hóa trực tiếp từ acid carboxylic và amin

 Phản ứng amid hóa sử dụng xúc tác B(OCH2CF3)3 (Sơ đồ 1.7): hiệu suất có thể lên đến 91% [27]

Sơ đồ 1.7 Tổng hợp amid sử dụng xúc tác B(OCH2CF3)3

 Phản ứng amid hóa sử dụng DCC hoặc EDC, xúc tác HOBt (Sơ đồ 1.8):

DCC và EDC đều là carbodiimid (RN=C=NR) giúp phản ứng acid – base ban đầu không xảy ra và làm cho acid cacboxylic dễ bị tấn công bởi tác nhân nucleophil để tạo amid (R’ – CONH2) [35]

HOBt có vai trò là một nucleophil chọn lọc, giúp phản ứng amid hóa xảy ra nhanh

hơn Đồng thời, hạn chế việc tạo thành sản phẩm phụ N-acylurea, dẫn đến nâng cao cả

hiệu suất lẫn chất lượng của quá trình tổng hợp [35]

Sơ đồ 1.8 Tổng hợp amid sử dụng DCC hoặc EDC xúc tác HOBt

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG

PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị

Khi thực hiện khóa luận này, chúng tôi đã sử dụng một số dụng cụ, thiết bị, dung môi và hóa chất của phòng thí nghiệm Bộ môn Hóa Hữu cơ, Trường Đại học Dược Hà Nội

2.1.1 Nguyên vật liệu, hóa chất, dung môi

Các nguyên liệu, hóa chất và dung môi sử dụng trong quá trình thực nghiệm có xuất xứ từ các hãng Sigma-Aldrich (Mỹ) và các công ty hóa chất như Merck (Đức), Trung Quốc, Việt Nam… Các hóa chất này được sử dụng trực tiếp, không qua tinh chế thêm và đưa ra ở Bảng 2.1

Bảng 2.1 Danh mục các dung môi, hóa chất

STT Dung môi, hóa chất Nguồn gốc

STT Dung môi, hóa chất Nguồn gốc

2.1.2 Thiết bị thí nghiệm

˗ Dụng cụ thủy tinh: cốc có mỏ (100 mL, 250 mL, 500 mL), bình cầu (50 mL, 100 mL, 250 mL, 500 mL), ống sinh hàn, phễu, bình lọc hút, phễu Buchner, bình nón, bình chiết, pipet Pasteur,…

˗ Máy cô quay chân không Buchi Rotavapor R-200 (Thụy Sĩ) ˗ Máy siêu âm Ultrasonic LC 60 H (Đức)

˗ Tủ sấy Heraeus (Đức) ˗ Máy khuấy từ gia nhiệt IKA – RTC Basic (Đức) ˗ Cân kỹ thuật Sartorius (Đức)

˗ Cân phân tích (Trung Quốc) ˗ Buồng soi UV bước sóng 254nm Spectroline (Mỹ) ˗ Cột chạy sắc ký

˗ Bản mỏng silica gel 60 F254 (Merck) ˗ Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR và 13C-NMR) Bruker Avance III HD 600 MHz và 125 MHz của hãng Bruker BioSpin (Thụy Sĩ) tại Viện Hóa Học – Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

˗ Máy đo phổ khối 1100 Series LC – MSD – Trap – SL của hãng Agilent tại Viện Hóa Học – Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

˗ Máy đo phổ hồng ngoại FT – IR Affinity-IS-Shimadzu (Nhật Bản) tại Khoa Hóa Học – Trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội

˗ Máy đo nhiệt độ nóng chảy MPA 120 (Mỹ) tại Bộ môn Hóa Hữu cơ – Trường Đại học Dược Hà Nội

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Tổng hợp hóa học các dẫn chất dimethyl-2H-chromen-6-carboxamid

N-(2-carbamoylphenyl)-5-methoxy-2,2-˗ Tổng hợp 2 dẫn chất chromen-6-carboxamid:

N-(2-carbamoylphenyl)-5-methoxy-2,2-dimethyl-2H-

N-(2-carbamoyl-4-(4-methylpiperazin-1-yl)phenyl)-5-methoxy-2,2-dimethyl-2H-chromen-6-carboxamid (VIa)



N-(2-carbamoyl-4-morpholinophenyl)-5-methoxy-2,2-dimethyl-2H-chromen-6-carboxamid (VIb)

2.2.2 Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư của các dẫn chất tổng hợp được

Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư của 2 chất tổng hợp được trên 2 dòng tế bào ung thư: A549: ung thư phổi; MCF-7: ung thư vú

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp tổng hợp chromen-6-carboxamid

N-(2-carbamoylphenyl)-5-methoxy-2,2-dimethyl-2H-˗ Sử dụng các phương pháp tổng hợp hữu cơ kinh điển và hiện đại để tổng hợp 2

dẫn chất dự kiến (VIa-b)

˗ Dùng sắc ký lớp mỏng để theo dõi phản ứng và đánh giá sơ bộ độ tinh khiết của sản phẩm

2.3.2 Phương pháp tinh chế và xác định cấu trúc

˗ Tinh chế các dẫn chất tổng hợp được bằng phương pháp sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng và phương pháp kết tinh lại

˗ Xác định cấu trúc của hai sản phẩm cuối cùng bằng các phương pháp phổ: phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR) và carbon-13 (13C-NMR) [2]

2.3.3 Phương pháp thử hoạt tính kháng tế bào ung thư

Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư của các dẫn chất tổng hợp được (VIa-b) theo

phương pháp MTT trên 2 dòng tế bào ung thư: A549: ung thư phổi; MCF-7: ung thư vú tại Phòng Hóa Sinh Ứng Dụng, Viện Hóa Học, Viện Hàn Lâm Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam

2.3.3.1 Nguyên tắc ˗ Tiến hành theo phương pháp in vitro để đánh giá khả năng sống sót của tế bào

ung thư ˗ Hoạt tính gây độc tế bào được thực hiện dựa trên phương pháp MTT lần đầu tiên được mô tả bởi tác giả Tim Mosman (1983) [20]

˗ Phương pháp này đánh giá khả năng sống sót của tế bào qua khả năng khử MTT (màu vàng) thành một phức hợp formazan (màu tím) bởi hoạt động của enzym dehydrogenase trong ty thể

˗ Sản phẩm formazan được hòa tan bằng DMSO và đo mật độ quang (OD) ở bước sóng 540 nm Giá trị thể hiện hoạt tính là IC50 (nồng độ chất thử ức chế 50% khả năng sống của tế bào)

2.3.3.3 Tiến hành thí nghiệm

˗ Trypsin hóa tế bào thí nghiệm để làm rời tế bào và đếm trong buồng đếm tế bào Sau đó, pha tế bào bằng môi trường sạch và điều chỉnh mật độ cho phù hợp với thí nghiệm (khoảng 3-5x104 tế bào/mL tùy theo từng dòng tế bào)

˗ Mẫu thử: Hòa tan mẫu thử bằng dung môi DMSO với nồng độ ban đầu là 20 mg/mL Tiến hành pha loãng 2 bước trên đĩa 96 giếng thành 5 dãy nồng độ từ cao xuống thấp lần lượt là 2560, 640, 160, 40 và 10 µg/mL Nồng độ chất thử trong đĩa thử nghiệm tương ứng là 128, 32, 8, 2 và 0.5 µg/mL Chất tham chiếu Ellipticin pha trong DMSO với nồng độ 0,01mM

˗ Lấy vào mỗi giếng 10 µL chất thử đã chuẩn bị ở trên và 190 µL dung dịch tế bào Đối chứng dương của thí nghiệm là môi trường có chứa tế bào, đối chứng âm chỉ có môi trường nuôi cấy

˗ Đĩa thí nghiệm được ủ ở điều kiện tiêu chuẩn trong 72 giờ Mỗi giếng thí nghiệm được tiếp tục ủ với 10 µL MTT (5 mg/mL) trong 4h Sau khi loại bỏ môi trường, tinh thể formaran được hòa tan bằng 100 µL DMSO 100%

˗ Kết quả thí nghiệm được xác định bằng giá trị OD đo ở bước sóng 540 nm trên máy quang phổ Biotek Thí nghiệm được lặp lại 3 lần

2.3.3.4 Xử lý kết quả thực nghiệm ˗ Phương pháp xử lý số liệu: Giá trị IC50 được xác định thông qua giá trị% ức chế tế bào phát triển và phần mềm máy tính Rawdata

˗ % ức chế tế bào = ODchứng (+) – ODmẫu thử

ODchứng (+)– ODchứng (−)x100

˗ IC50 = HighConc- (HighInh%−50) 𝑥 (HighConc− LowConc)

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ

3.1 Kết quả thực nghiệm

Quy trình tổng hợp các dẫn chất 2H-chromen-6-carboxamid được tiến hành theo Sơ đồ 3.1:

dimethyl-Sơ đồ 3.1 Quy trình tổng hợp các dẫn chất

N-(2-carbamoylphenyl)-5-methoxy-2,2-dimethyl-2H-chromen-6-carboxamid (VIa-b)

Quy trình tổng hợp acid 5-methoxy-2,2-dimethyl-2H-chromen-6-carboxylic được

tiến hành theo Sơ đồ 3.2:

Sơ đồ 3.2 Quy trình tổng hợp acid 5-methoxy-2,2-dimethyl-2H-chromen-6-carboxylic

(Vd)

Trong đó:

Chất Công thức cấu tạo

VIa

VIb

Quá trình tổng hợp được tiến hành qua 5 giai đoạn sau:

Giai đoạn 1: Tổng hợp 5-cloro-2-nitrobenzamid (II) Giai đoạn 2: Tổng hợp các dẫn chất của 5-cyclicamino-2-nitrobenzamid (IIIa-b) Giai đoạn 3: Tổng hợp các dẫn chất 2-amino-5-(cyclicamino)benzamid (IVa-b)

Giai đoạn 4: Phản ứng tổng hợp Acid

˗ Thêm 3 g acid 5-cloro-2-nitrobenzoic (I) và 20 mL thionyl clorid vào bình cầu,

kết hợp dùng máy khuấy từ để khuấy đều

˗ Đun hồi lưu hỗn hợp ở 50oC, kết hợp khuấy từ

˗ Phản ứng này kết thúc sau khoảng 3-4 h, loại bỏ thionyl clorid dư bằng máy cô

quay dưới áp suất giảm

˗ Sau đó, thêm vào bình cầu 15 mL dicloromethan để hòa tan acyl clorid Ngâm bình cầu chứa hỗn hợp trên vào bát nước đá lạnh, rót nhanh lượng NH4OH dư tới khi hết khói trắng Sau khi phản ứng kết thúc, cho khoảng 10 mL nước cất vào hỗn hợp,

xuất hiện kết tủa trắng

˗ Lọc thu tủa trên phễu Buchner, thu được 2,47 g tủa trắng Phần dịch lọc được chiết 3 lần với EtOAc, gộp chung dịch chiết các lần Làm khan dịch chiết EtOAc bằng Na2SO4 và đem cất quay dung môi, thu được thêm 0,23 g tủa trắng Như vậy, tổng thu

được 2,70 g chất II

 Kết quả:

˗ Cảm quan: chất rắn màu trắng ˗ Khối lượng sản phẩm: 2,70 g ˗ Hiệu suất: 90,3%

˗ SKLM: Rf = 0,56 (bản mỏng silica gel 60 F254, hệ dung môi MeOH : DCM = 1 : 19 v/v)

˗ Thực hiện hai quy trình phản ứng riêng biệt để tổng hợp hai chất IIIa và IIIb,

hai quy trình đó tuân theo thứ tự các bước như ở dưới

˗ Cho 500 mg 5-cloro-2-nitrobenzamid (2,5 mmol) (II) vào bình cầu đáy tròn, dùng 5 mL dung môi DMF để hòa tan II Sau đó, thêm 3 đương lượng amin R2NH tương ứng (7,5 mmol) Bịt kín bình cầu bằng nút cao su Đun hỗn hợp ở khoảng 90oC kết hợp khuấy từ

˗ Theo dõi phản ứng mỗi 2 giờ bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi khai triển MeOH : DCM (1 : 19 v/v)

˗ Phản ứng kết thúc sau khoảng 13 giờ, để nguội bình phản ứng, thêm nước cất vào bình cầu, kết tủa xuất hiện Lọc thu tủa trên phễu Buchner

˗ Phần dịch lọc đem chiết với EtOAc nhiều lần, thu lấy pha dung môi hữu cơ, gộp dịch chiết chung của các lần

˗ Tiến hành làm khan dịch chiết bằng Na2SO4 và đem cất loại dung môi, thu được chất rắn màu vàng Gộp 2 phần tủa sau khi lọc qua phễu Buchner và tủa sau khi cô quay

sẽ được sản phẩm IIIa-b

 Kết quả:

Chất IIIa

˗ Cảm quan: chất rắn màu vàng ˗ Khối lượng sản phẩm: 0,54 g ˗ Hiệu suất: 82,4%

˗ SKLM: Rf = 0,48 (bản mỏng silica gel 60 F254, hệ dung môi MeOH : DCM = 1 : 19 v/v)

Chất IIIb

˗ Cảm quan: chất rắn màu vàng ˗ Khối lượng sản phẩm: 0,57 g ˗ Hiệu suất: 90,8%

˗ SKLM: Rf = 0,46 (bản mỏng silica gel 60 F254, hệ dung môi MeOH : DCM = 1 : 19 v/v)

˗ Thực hiện hai quy trình phản ứng riêng biệt để tổng hợp hai chất IVa và IVb, hai

quy trình đó tuân theo thứ tự các bước như ở dưới

˗ Cho 400 mg chất IIIa-b hòa tan trong Ethanol, 1,85 g SnCl2.2H2O, 2 giọt HCl đặc vào bình cầu 2 cổ đáy tròn, thêm con khuấy từ Đun hồi lưu hỗn hợp phản ứng ở khoảng 60oC

˗ Theo dõi phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi khai triển MeOH : DCM (1 : 49 v/v)

˗ Phản ứng kết thúc sau khoảng 5 giờ, làm nguội hỗn hợp phản ứng, thêm 10 mL nước cất và điều chỉnh pH=10-11 bằng dung dịch NaOH 20%, sau đó chiết với EtOAc 4-5 lần Thu lấy pha dung môi hữu cơ và gộp chung dịch chiết, làm khan nước bằng Na2SO4 và đem cất quay ở áp suất giảm để loại dung môi

˗ Tinh chế sản phẩm bằng sắc ký cột với hệ dung môi MeOH : DCM (tăng dần tỉ lệ từ 1 : 49 đến 1 : 19 và đến 1 : 9 v/v), cất quay loại dung môi và thu được sản phẩm

IVa-b

 Kết quả:

Chất IVa

˗ Cảm quan: chất rắn màu trắng ˗ Khối lượng sản phẩm: 0,20 g ˗ Hiệu suất: 55,4%

˗ SKLM: Rf = 0,20 (bản mỏng silica gel 60 F254, hệ dung môi MeOH : DCM = 1 : 49 v/v)

Chất IVb

˗ Cảm quan: chất rắn màu vàng nâu ˗ Khối lượng sản phẩm: 0,18 g ˗ Hiệu suất: 51,8%

˗ SKLM: Rf = 0,18 (bản mỏng silica gel 60 F254, hệ dung môi MeOH : DCM = 1 : 49 v/v)

Bình cầu đáy tròn 500 mL, ống sinh hàn hồi lưu, nhiệt kế, máy khuấy từ gia nhiệt, máy cô quay chân không, bình gạn 500 mL

 Tiến hành phản ứng:

˗ Cho vào bình cầu đáy tròn 500 mL: con khuấy từ, 2 g 2,4-dihydroxybenzaldehyd

(Va) Sau đó, tiếp tục thêm 2 g 3-methylbut-2-enal, 3,20 g CaCl2.2H2O, 10 mL TEA Dùng 45 mL ethanol để hòa tan hỗn hợp đó, nối bình phản ứng với ống hồi lưu Đun hồi lưu ở khoảng 95oC, kết hợp khuấy từ

˗ Theo dõi phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi khai triển EtOAc: hexan (1 : 19 v/v)

n-˗ Phản ứng kết thúc sau khoảng 2 giờ, để nguội bình phản ứng, dùng dung dịch HCl 10% để điều chỉnh pH của hỗn hợp đó tới khoảng 3 – 4 Chiết bằng EtOAc 4 lần, thu lấy pha dung môi hữu cơ và gộp chung dịch chiết các lần Làm khan dịch chiết bằng Na2SO4 và đem cô quay loại dung môi

˗ Tinh chế bằng sắc ký cột với hệ dung môi EtOAc: n-hexan (1 : 19 v/v), cất quay

loại dung môi dưới áp suất giảm, thu được sản phẩm Vb

 Kết quả:

˗ Cảm quan: chất rắn màu trắng ˗ Khối lượng sản phẩm: 1,92 g ˗ Hiệu suất: 65,2%

˗ SKLM: Rf = 0,58 (bản mỏng silica gel 60 F254, hệ dung môi EtOAc: n-hexan = 1 : 19 v/v)

3.1.4.2 Tổng hợp chất trung gian 5-methoxy-2,2-dimethyl-2H-chromen-6-carbadehyd

˗ Hỗn hợp phản ứng gồm 1,2 g chất Vb được hòa tan bằng 10 mL dung môi DMF

trong bình cầu đáy tròn Sau đó, thêm vào tiếp 2,64 g K2CO3 và 0,80 mL CH3I, lắp bình cầu vào ống sinh hàn Đun hồi lưu hỗn hợp phản ứng ở khoảng 500C

˗ Theo dõi phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi khai triển EtOAc : hexan (1 : 19 v/v)