trần hoàng lân tổng hợp và đánh giá tác dụng kháng tế bào ung thư biểu mô hạ họng của một số dẫn chất thơm mang khung 1 3 dimethyl 6 amino1h indazol

Hiện nay, các phương pháp sàng lọc, điều trị ung thư đã và đang nhận được nhiều sự quan tâm, đầu tư nghiên cứu và phát triển của nhiều tổ chức và các nhà nghiên cứu trên toàn thế giới..

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRẦN HOÀNG LÂN

TỔNG HỢP VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG KHÁNG TẾ BÀO UNG THƯ BIỂU MÔ HẠ

HỌNG CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT THƠM MANG KHUNG 1,3-DIMETHYL-6-AMINO-

1H-INDAZOL

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

HÀ NỘI - 2024

HỌNG CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT THƠM MANG KHUNG 1,3-DIMETHYL-6-AMINO-

Nơi thực hiện

Bộ môn Hóa dược

Khoa Công Nghệ Hóa dược

LỜI CẢM ƠN

Những dòng đầu tiên, tôi xin được dành để gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến với những người trong suốt thời gian qua đã luôn hỗ trợ và động viên tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp của mình một cách tốt nhất

Trước hết tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến người thầy đã hướng dẫn tôi trong

suốt quá trình nghiên cứu và thực hiện đề tài đó là PGS TS Trần Phương Thảo, TS Hoàng Văn Hải Thầy cô đã chỉ bảo, hướng dẫn tận tình, động viên tôi những lúc khó

khăn trong quá trình nghiên cứu và giúp tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các giảng viên, nghiên cứu viên và các anh chị kỹ thuật viên đang công tác tại Khoa Công Nghệ Hóa Dược – Trường Đại học Dược Hà Nội, Khoa Hóa – Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên Hà Nội đã luôn giúp đỡ và tạo

điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện khóa luận này Và đặc biệt là TS Dương Tiến Anh, chị Nguyễn Thị Huế, anh Trương Cao Minh, anh Lê Thiên Bảo Long, em Lê Quốc Tiến và các anh, chị, bạn và em trong nhóm sinh viên nghiên cứu khoa học của

PGS TS Trần Phương Thảo Sự đồng hành, sẻ chia và động viên của mọi người chính là nguồn động lực đối với tôi trong suốt quãng thời gian làm thực nghiệm

Cuối cùng, tôi xin được gửi lời cảm ơn đặc biệt nhất tới gia đình Bố, Mẹ, Anh và Em đã luôn đồng hành trong suốt quãng đường tôi đã bước đi, đó là điều vô cùng quý giá đối với bản thân tôi Sự cổ vũ, tin tưởng đã tiếp thêm nguồn động lực to lớn để tôi có thể vững bước trên quãng đường tiếp theo của đời mình Cảm ơn Bố, cảm ơn Mẹ, cảm ơn Anh, Em

Hà Nội, ngày 03 tháng 06 năm 2024

Sinh viên

Trần Hoàng Lân

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ, KÝ HIỆU VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

TỔNG QUAN 2

1.1 UNG THƯ 2

1.1.1 Giới thiệu về ung thư 2

1.1.2 Ung thư biểu mô tế bào vảy vùng đầu và cổ 2

1.1.3 Vi môi trường khối u trong HNSCC 4

1.2 TỔNG QUAN VỀ INDOLEAMIN 2,3-DIOXYGENASE 1 4

1.2.1 Giới thiệu về Indoleamine 2,3-dioxygenase 1 4

1.2.2 Cấu trúc IDO1 5

1.2.3 Mối liên quan giữa IDO1 và HNSCC 7

1.3 CÁC CHẤT ỨC CHẾ IDO1 9

1.3.1 Cấu trúc các chất ức chế IDO1 9

1.3.2 Chất ức chế IDO1 mang khung indazol 11

NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2.1 NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ 14

2.1.1 Hóa chất 14

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ 15

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 15

2.2.1 Tổng hợp hóa học 15

2.2.2 Khẳng định cấu trúc của các chất tổng hợp được 15

2.2.3 Đánh giá tác dụng kháng tế bào ung thư biểu mô hạ họng (FaDu) 15

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.3.1 Tổng hợp hóa học 16

2.3.2 Khẳng định cấu trúc 16

2.3.3 Đánh giá tác dụng kháng tế bào ung thư FaDu 17

THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 18

3.1 HÓA HỌC 18

3.1.1 Tổng hợp hóa học 18

4.2.2 Phổ khối phân giải cao (HR-MS) 33

4.2.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR) 34

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

CAF Nguyên bào sợi liên quan đến ung thư (Cancerassociated fibroblasts)

HR-MS Phổ khối phân giải cao (High resolution Mass Spectrometry)

IHC Hóa mô miễn dịch (Immunohistochemistry)

PD-L1 Phối tử chết theo chương trình 1 (Programmed Death Ligand 1)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Các nguyên liệu sử dụng trong tổng hợp hóa dược 14

Bảng 3.1 Chỉ số hóa lý và hiệu suất tổng hợp các hợp chất IVa-d 24

Bảng 3.2 Giá trị Rf và nhiệt độ nóng chảy (Tonc) của các dẫn chất IVa-d 24

Bảng 3.3 Kết quả phân tích phổ IR của các dẫn chất IVa-d 25

Bảng 3.4 Kết quả phân tích phổ HR-MS của các dẫn chất IVa-d 26

Bảng 3.5 Kết quả phân tích phổ 1H-NMR của các dẫn chất IVa-d 26

Bảng 3.6 Kết quả phân tích phổ 13C-NMR của các dẫn chất IVa-d 27

Bảng 3.7 Kết quả khả năng ức chế tế bào FaDu của các dẫn chất IVa-d 28

Bảng 3.8 Kết quả thử hoạt tính kháng tế bào ung thư của các dẫn chất IVa-d 29

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Hình 1.1 Tỷ lệ mắc bệnh HNSCC trên toàn thế giới 3

Hình 1.2 Con đường chuyển hóa Tryptophan 5

Hình 1.3 Cấu trúc IDO1 và vị trí các "Pocket" 6

Hình 1.4 Minh họa cấu trúc pharmacophore từ mô phỏng docking 10

Hình 1.5 Cấu trúc 1 số chất ức chế IDO1 có tương tác với các “pocket” (“pocket” A: xanh lam, “pocket” B: cam, “pocket” C: vàng, “pocket” D: xanh tím) 10

Hình 1.6 Các đồng phân của vòng indazol 11

Hình 1.7 Cấu trúc TQ1, TQ2, TQ3 12

Hình 1.8 Cấu trúc TQ4 12

Hình 4.1 Phổ IR chất IVc 32

Hình 4.2 Phổ khối phân giải cao HR-MS chất IVd 33

Hình 4.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton chất IVa 34

Hình 4.4 Phổ cộng hưởng từ carbon chất IVd 35

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 3.1 Quy trình tổng hợp chung 18

Sơ đồ 3.2 Quy trình tổng hợp chất II 18

Sơ đồ 3.3 Quy trình tổng hợp chất III 19

Sơ đồ 3.4 Quy trình tổng hợp chất IVa 20

Sơ đồ 3.5 Quy trình tổng hợp chất IVb 21

Sơ đồ 3.6 Quy trình tổng hợp chất IVc 22

Sơ đồ 3.7 Quy trình tổng hợp chất IVd 23

Sơ đồ 4.1 Cơ chế đề xuất cho phản ứng N-alkyl hóa 30

Sơ đồ 4.2 Cơ chế đề xuất cho phản ứng khử nhóm nitro thơm 31

Sơ đồ 4.3 Cơ chế đề xuất cho phản ứng amin hóa khử 32

ĐẶT VẤN ĐỀ

Theo thống kê của GLOBOCAN 2022, thế giới có gần 20 triệu ca mắc ung thư mới và gần 9,7 triệu ca tử vong do ung thư Gánh nặng ung thư trên toàn cầu được dự đoán là 35 triệu ca trong năm 2050, thậm chí có thể gia tăng hơn nữa do tăng các yếu tố nguy cơ liên quan đến toàn cầu hóa và phát triển kinh tế Chính vì vậy, việc tìm ra các giải pháp dự phòng và điều trị ung thư trở nên cấp thiết hơn bao giờ hết [5]

Hiện nay, các phương pháp sàng lọc, điều trị ung thư đã và đang nhận được nhiều sự quan tâm, đầu tư nghiên cứu và phát triển của nhiều tổ chức và các nhà nghiên cứu trên toàn thế giới Trong các phương pháp điều trị ung thư, có thể kể đến như phẫu thuật, hóa trị, xạ trị, liệu pháp nhắm trúng đích, liệu pháp hormon, đặc biệt liệu pháp miễn dịch đang được đặc biệt quan tâm do các liệu pháp này có nhiều lợi thế hơn so với các phương pháp truyền thống [39] Việc sàng lọc các phân tử nhỏ có hoạt tính sinh học mạnh mẽ không chỉ có nhiều giá trị trong việc nâng cao chất lượng hóa trị liệu, mà còn có thể mở ra con đường mới cho phương pháp điều trị bằng liệu pháp miễn dịch Đặc biệt khi tình trạng kháng thuốc xuất hiện ngày càng phổ biến thì việc nghiên cứu và phát triển các dẫn chất tiềm năng mới có hoạt tính kháng tế bào ung thư trở nên cấp thiết hơn

Indazol là một dị vòng có ứng dụng rộng rãi trong ngành công nghiệp dược phẩm Trong nhiều nghiên cứu, các dẫn chất mang khung indazol được chứng minh có hoạt tính kháng tế bào ung thư tốt và có triển vọng trong điều trị ung thư [7]

Trên cơ sở đó, với định hướng sàng lọc các hợp chất chứa khung indazol có hoạt tính kháng tế bào ung thư, cũng như tiếp nối các nghiên cứu của nhóm để làm phong phú thêm cơ sở dữ liệu về những hợp chất khung indazol có hoạt tính sinh học, đề tài

“Tổng hợp và đánh giá tác dụng kháng tế bào ung thư biểu mô hạ họng của một số

dẫn chất thơm mang khung 1,3-dimethyl-6-amino-1H-indazol” được tiến hành với

2 mục tiêu:

1 Tổng hợp 3-5 dẫn chất thơm mang khung 1,3-dimethyl-6-amino-1H-indazol

2 Đánh giá tác dụng kháng tế bào ung thư biểu mô hạ họng (FaDu) của các dẫn chất tổng hợp được

TỔNG QUAN

1.1 UNG THƯ

1.1.1 Giới thiệu về ung thư

Ung thư là một trong những nguyên nhân gây tử vong hàng đầu và làm giảm tuổi thọ ở mọi quốc gia trên toàn thế giới Theo thống kê của tổ chức Y tế Thế giới (WHO) năm 2019, ung thư là nguyên nhân hàng đầu hoặc thứ hai dẫn đến tử vong trước tuổi 70 ở 112 trong tổng số 183 nước Thống kê của GLOBOCAN 2022 đã chỉ ra rằng có gần 20 triệu ca mắc ung thư mới và gần 9,7 triệu ca tử vong do ung thư vào năm 2022 Gánh nặng ung thư trên toàn thế giới được dự đoán là 28,4 triệu ca trong năm 2040, tăng 47% so với năm 2020 thậm chí có thể gia tăng hơn do tăng các yếu tố nguy cơ liên quan toàn cầu hóa và phát triển kinh tế Ở Việt Nam, ước tính số ca mắc mới trong năm 2018 là 164 671 ca (0,17% dân số) và số ca tử vong là 114 871 ca (0,12% dân số, cả hai thống kê này đều đã tăng gấp 3 lần so với 30 năm trước đó [42]

Sự ra đời của thuốc chống ung thư gây độc tế bào, hay phương pháp hóa trị liệu để điều trị khối u huyết học và khối u rắn là một bước đột phá đầu tiên trong lĩnh vực nghiên cứu về thuốc điều trị ung thư Kể từ đó số lượng các nghiên cứu trong lĩnh vực này được tăng theo cấp số nhân Bước đột phá thứ hai diễn ra đầu những năm 80 dựa trên các nghiên cứu sinh học phân tử và tế bào để phát triển các thuốc điều trị đặc hiệu cho một số đích phân tử liên quan đến quá trình tân sinh tạo ra liệu pháp điều trị nhắm trúng đích Cả hóa trị liệu và điều trị đích đều giúp cải thiện đáng kể thời gian sống sót, chất lượng sống của bệnh nhân ung thư và một số còn giúp làm thuyên giảm khối u Tiếp sau đó là sự ra đời của kháng thể đơn dòng và các chất ức chế điểm kiểm soát miễn dịch để điều trị khối u tiến triển hoặc di căn mà các liệu pháp điều trị trước đó không hiệu quả Ngày nay, các phương pháp điều trị ung thư mới và tiên tiến đang được tập trung phát triển với những kết quả cận lâm sàng đầy hứa hẹn Trong tương lai gần, các phương pháp này được kỳ vọng sẽ tạo ra một cuộc cách mạng mới trong lĩnh vực điều trị ung thư [32]

1.1.2 Ung thư biểu mô tế bào vảy vùng đầu và cổ

Ung thư biểu mô tế bào vảy vùng đầu và cổ (Head and neck squamous cell carcinoma-HNSCC) phát triển từ biểu mô niêm mạc trong khoang miệng, hầu họng và thanh quản và là những khối u ác tính phổ biến nhất phát sinh ở đầu và cổ Gánh nặng của HNSCC khác nhau giữa các quốc gia/khu vực và nhìn chung có liên quan đến việc tiếp xúc với các chất gây ung thư có nguồn gốc từ thuốc lá và tiêu thụ quá nhiều đồ uống có cồn [27]

HNSCC là bệnh ung thư phổ biến thứ sáu trên toàn thế giới, với 890.000 ca mắc mới và 450.000 ca tử vong trong năm 2018 [11] Tỷ lệ mắc HNSCC tiếp tục tăng và được dự đoán sẽ tăng 30% (tức là 1,08 triệu trường hợp mới hàng năm) vào năm 2030

[11] Tỷ lệ mắc HNSCC cao ở các khu vực như Đông Nam Á và Úc có liên quan đến việc tiêu thụ các sản phẩm có chứa chất gây ung thư, trong khi tỷ lệ nhiễm virus papilloma ở người (Human papilloma viruss-HPV) ngày càng tăng dẫn tới việc tăng tỷ lệ mắc HNSCC ở Mỹ và Tây Âu [21, 26, 38] Nhìn chung, nam giới có nguy cơ mắc HNSCC cao gấp hai đến bốn lần so với nữ giới Bên cạnh đó, độ tuổi trung bình được chẩn đoán đối với HNSCC không liên quan đến virus là 66 tuổi [58]

Hình 1.1 Tỷ lệ mắc bệnh HNSCC trên toàn thế giới [27]

Các nghiên cứu dịch tễ học đã chỉ ra rằng nhiều yếu tố nguy cơ khác nhau gây nên bệnh HNSCC Cơ quan Nghiên cứu Ung thư Quốc tế (IARC) của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) phân loại những yếu tố nguy cơ này bao gồm: sử dụng thuốc lá, uống rượu, tiếp xúc với các chất ô nhiễm môi trường và nhiễm các tác nhân như HPV hoặc EBV Mức độ phổ biến khác nhau của bệnh HNSCC liên quan đến khía cạnh địa lý, văn hóa và thói quen Cụ thể hơn khi xét về yếu tố địa lý, nơi tiêu thụ thuốc lá và rượu cao là những nơi có nguy cơ cao dễ mắc bệnh liên quan đến HNSCC [27] Đáng lưu ý rằng những người sử dụng nhiều cả thuốc lá và rượu có nguy cơ phát triển bệnh HNSCC cao hơn gấp 35 lần những người không sử dụng [4] Trong một số nước Châu Á-Thái Bình Dương, có thể kể đến như Ấn Độ và Trung Quốc, ung thư ở vùng khoang miệng có liên quan đến việc “phong tục” nhai trầu (bao gồm sử dụng các thành phẩm từ hạt cau, lá trầu, vôi tôi) [62] Ảnh hưởng của thuốc lá điện tử đối với nguy cơ mắc bệnh HNSCC vẫn còn chưa được hiểu rõ, tuy nhiên điều đó sẽ được làm sáng tỏ trong những năm tiếp theo Tiếp xúc với các chất ô nhiễm gây ung thư trong không khí bao gồm các hóa chất vô cơ, hữu cơ và hạt bụi cũng là một yếu tố nguy cơ mắc bệnh HNSCC, đặc biệt là ở những khu vực đang phát triển có tình trạng ô nhiễm không khí ngày càng trầm trọng Một số yếu tố nguy cơ khác có thể nhắc đến bao gồm như lão hóa, vệ sinh răng miệng kém và chế độ ăn thiếu rau [13, 18] Về tác nhân truyền nhiễm, bệnh truyền nhiễm với

HPV và EBV (Epstein-Barr Virus) là các yếu tố nguy cơ căn nguyên đã được biết đến đối với HNSCC phát sinh từ vùng hầu họng và vòm họng [22, 53]

Ngoài ra, yếu tố di truyền cũng góp phần gây ra nguy cơ mắc bệnh HNSCC Những người mắc bệnh thiếu máu Fanconi, một bệnh di truyền hiếm gặp, khả năng sửa chữa ADN bị suy giảm (do đột biến ở bất kỳ gen nào trong số 22 gen FANC), có nguy cơ phát triển HNSCC cao gấp tới 500-700 lần [55]

1.1.3 Vi môi trường khối u trong HNSCC

Vi môi trường khối u (Tumour microenvironment-TME) trong HNSCC là sự kết hợp phức tạp và không đồng nhất của tế bào khối u và tế bào cơ địa, bao gồm các tế bào nội mô, nguyên bào sợi liên quan đến ung thư (Cancerassociated fibroblasts-CAFs) và tế bào miễn dịch [30] Các tế bào khối u và CAFs tạo ra các yếu tố tăng trưởng, ví dụ như VEGF, thu nhận các tế bào nội mô, kích thích cho quá trình tạo mạch máu mới và cung cấp oxy và chất dinh dưỡng cho khối u Đổi lại, tế bào nội mô tiết ra các yếu tố hỗ trợ sự tồn tại và làm mới của tế bào gốc ung thư CAFs đóng vai trò quan trọng trong sự tiến triển HNSCC CAFs tiết ra một loạt các yếu tố tăng trưởng (như EGF, VEGF và HGF), cytokin (như IL-6) và chemokin thúc đẩy tăng trưởng tế bào khối u, hình thành mạch máu và thu thập các tế bào ức chế miễn dịch [6, 41] Vi môi trường mô khối u đầu và cổ là nơi có hoạt động miễn dịch mạnh mẽ, thúc đẩy sự phát triển trong liệu pháp miễn dịch đang được áp dụng cho HNSCC [27]

Năm 2021, nhóm nghiên cứu của Lin và cộng sự đã có nghiên cứu về vai trò của Indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO) trong ung thư biểu mô tế bào vảy vùng đầu và cổ [36] Những bằng chứng thống kê hiện tại cho thấy một giả thuyết rằng IDO là một phần không thể thiếu đối với khả năng miễn dịch TME trên HNSCC trong trường hợp dương tính HPV Dựa trên các mô hình mô phỏng các nghiên cứu về dòng tế bào cho thấy rằng sự biểu hiện khác biệt của IDO và đáp ứng được dự đoán với liệu pháp miễn dịch, trong đó sự khác biệt về IDO như một dấu ấn sinh học (biomarker) có thể liên quan đến giai đoạn bệnh, vị trí khối u, loại mô hoặc sự khác biệt về gen giữa các bệnh nhân [36] Chính vì vậy, một trong những phương pháp mới có thể tác động đến HNSCC là thông qua ức chế con đường chuyển hóa bởi IDO

1.2 TỔNG QUAN VỀ INDOLEAMIN 2,3-DIOXYGENASE 1 1.2.1 Giới thiệu về Indoleamine 2,3-dioxygenase 1

Indoleamine 2,3-dioxygenase 1 (IDO1) là enzym chứa nhân hem có liên quan nhiều đến quá trình miễn dịch, xúc tác cho phản ứng đầu tiên giới hạn tốc độ quá trình chuyển hóa Tryptophan (Trp) trong con đường Kynurenin (KP) IDO1 xúc tác cho quá

trình chuyển hóa acid amin thiết yếu trong cơ thể Trp thành sản phẩm

N-formylkynurenin theo cơ chế một phân tử O2 tấn công vào nối đôi ở vị trí 2,3 của vòng indol Các bước tiếp theo là một chuỗi các phản ứng xúc tác bởi các enzym khác nhau

tạo ra các chất chuyển hóa có hoạt tính liên quan đến đáp ứng miễn dịch như hydroxykynurenin, acid anthranilic, acid kynurenic, acid 3-hydroxyanthranilic, acid

3-quinolinic và acid picolinic (Hình 1.2) Sản phẩm cuối cùng được tạo thành là NAD+

và ATP – hai nhân tố quan trọng cung cấp nguyên liệu cho quá trình trao đổi chất của tế bào [25]

Hình 1.2 Con đường chuyển hóa Tryptophan [25]

Trong cơ thể người, quá trình chuyển hóa Trp với phản ứng mở vòng nhân indol bắt đầu với 3 enzym: IDO1, IDO2 và Tryptophan-2,3-dioxygenase (TDO) IDO2 và TDO cho thấy mức độ biểu hiện thấp hơn nhiều so với IDO1, điều này hạn chế đáng kể hoạt động của 2 enzym trên TDO chỉ được biểu hiện ở gan, chịu trách nhiệm cho chức năng chuyển hóa và kiểm soát nồng độ Trp trong máu IDO1 có biểu hiện chủ yếu cảm ứng ở hầu hết các mô, đóng vai trò chính trong điều hòa miễn dịch và kiểm soát ngược các đáp ứng miễn dịch IDO1 làm giảm Trp một cách đáng kể trong vi môi trường, do đó làm suy yếu các phản ứng miễn dịch qua trung gian tế bào T IDO1 biểu hiện ở các khối u ở người và đang đóng một vai trò nhất định trong khả năng kháng miễn dịch của khối u, điều này đã thúc đẩy những nỗ lực nghiên cứu và phát triển thuốc nhằm tìm ra các chất ức chế IDO1 trong điều trị ung thư [25, 54]

1.2.2 Cấu trúc IDO1

IDO1 là enzym chứa nhân hem bao gồm 403 acid amin, chia thành 2 vùng riêng

biệt bao gồm vùng lớn và vùng nhỏ (Hình 1.3) Vùng lớn là vùng xoắn bao gồm 13

chuỗi xoắn α và 2 chuỗi xoắn 310 Bốn chuỗi xoắn dài trong vùng lớn gồm G, I, Q, S được xếp song song với nhân hem và có tương tác kỵ nước với xoắn kế bên “Pocket” gắn nhân hem được tạo bởi bốn chuỗi xoắn trên và các chuỗi khác như K-L, N Chuỗi phụ của xoắn K-L và N cũng có góp phần vào tương tác hem-protein và liên kết hai vùng lớn và nhỏ Vùng nhỏ của enzym được hình thành bởi 6 chuỗi xoắn α, 2 mảng ngắn β và 3 chuỗi xoắn 310 Vùng nhỏ và chuỗi lặp dài (acid amin 250-267) kết nối hai vùng và bao trùm phần trên của “pocket” hem Các vùng tương tác được hình thành bởi

sự kết hợp các liên kết kỵ nước, liên kết cầu muối, hoặc liên kết hydro trung gian của chuỗi phụ các acid amin [52]

Hình 1.3 Cấu trúc IDO1 và vị trí các "Pocket" [46]

Nhóm nghiên cứu của Röhrig và cộng sự đã chỉ ra rằng vùng trung tâm hoạt động xung quanh nhân hem được xác định bao gồm 4 “pocket” “Pocket” A là một “pocket” thân dầu ở phía trên so với nhân hem, với Ser167 đóng vai trò là một thành phần liên kết hydro [46] Kích thước và khả năng liên kết của nó phụ thuộc vào hình dạng của acid amin 261-265 “Pocket” A là “pocket” quan trọng, rất cần thiết cho liên kết với các chất ức chế “Pocket” B nằm ở vị trí lối vào vùng trung tâm hoạt động và chỉ có khả năng liên kết khi vòng lặp JK (acid amin 360-380) ở trạng thái mở Các đột biến của Phe226, Phe227, Arg231 đã làm giảm đáng kể hoạt động của enzym, từ đó ủng hộ giả thuyết các phần dư này của “pocket” B ảnh hưởng trực tiếp tới sự nhận biết cơ chất thông qua tương tác π-π và tương tác kỵ nước “Pocket” C bao gồm khu vực bề mặt ở lối vào của trung tâm hoạt động, trong đó có cả vòng lặp JK trạng thái đóng và đã được cho rằng có tương tác với một số chất ức chế dựa trên mô phỏng docking [16] Tuy nhiên, trong một nghiên cứu của Serafini và cộng sự về cấu trúc không gian của “pocket” C, hay còn được gọi là “Sa*site”, có rất ít tương tác của Lys238 với các phối tử ngoại trừ trường hợp tương tác yếu của linrodostat và cơ chất L-Trp sau quá trình quang phân [49, 50] “Pocket” D là một vùng trung tâm nhỏ ở vị trí phía gần của nhân hem được kích hoạt sang trạng thái mở bởi sự thay đổi của Phe270 Có hai loại cấu trúc IDO1 đã

được phân tích, đó là holo-IDO1 và apo-IDO1 Trong holo-IDO1, “pocket” D được phân lập ra khỏi các trung tâm hoạt động bởi nhân hem và hoạt động như một vị trí trung tâm liên kết thứ cấp cho các phối tử có cấu trúc nhỏ Đối với apo-IDO1, “pocket” D được kết nối với các “pocket” khác do sự vắng mặt nhân hem “Pocket” này còn là một vị trí liên kết với chất ức chế và được gọi là “Si*site” Röhrig đã xác định thêm “pocket gắn

nhân hem” (Hình 1.3), chuỗi phụ của các acid amin His346, Val170, Phe214 và Ile217

Các chuỗi này tương tác với cofactor nhân hem trong holo-IDO1 và với phân nửa trung tâm phối tử trong apo-IDO1 Tất cả các đặc điểm trên đã cung cấp cơ sở cho thiết kế cho các chất ức chế IDO1 [46, 52]

1.2.3 Mối liên quan giữa IDO1 và HNSCC

IDO1 không được biểu hiện ở hầu hết các mô ở người trưởng thành trong điều kiện sinh lý nhưng được biểu hiện ở nhiều loại tế bào ung thư trong vi môi trường khối u (TME), bao gồm tế bào đuôi gai (DC), tế bào nội mô, tế bào ức chế dòng tủy Hầu hết các loại ung thư đều có nồng độ biểu hiện IDO1 cao, tương ứng với khả năng sống sót, tiên lượng thấp Bên cạnh vai trò trong ức chế miễn dịch, IDO1 còn góp phần vào quá trình phát triển ung thư bằng cách thúc đẩy quá trình viêm các mạch máu mới phát triển, tương tác với các chất ức chế và điều chỉnh hệ sinh vật đường ruột [37, 51]

IDO1 đóng vai trò quan trọng trong khả năng miễn dịch của TME thông qua chuyển hóa Trp Khả năng của IDO1 tăng lên trong TME của nhiều bệnh ung thư và biểu hiện của nó được xem như là một chỉ số tiên lượng tiêu cực trong khối u ác tính Do vai trò quan trọng của IDO trong khả năng miễn dịch TME khiến IDO trở thành một “trạm” kiểm tra miễn dịch có thể khai thác để cải thiện hiệu quả điều trị [36]

1.2.3.1 Vai trò của IDO trên HNSCC

Trong những năm vừa qua, một số các nhà khoa học trên thế giới đã thực hiện các nghiên cứu về IDO trong các dòng tế bào HNSCC [36] Năm 2015, nhóm nghiêm cứu của Liang và cộng sự đã chỉ ra rằng biểu hiện IDO có tác động đáng kể lên các dòng tế bào ung thư biểu mô vảy khoang miệng như HSC-3, SCC-4 [35] Bates và cộng sự đã dự đoán được nồng độ IDO trên dòng tế bào SCC-4 lên đến 17,29% cao hơn so với SCC-15 và SCC-25 Đến năm 2018, nghiên cứu đã chỉ ra rằng dòng tế bào SCC-15 (là dòng tế bào duy nhất có nguồn gốc từ giai đoạn T4 của HNSCC) tạo ra nhiều IDO hơn đáng kể so với bất kỳ tế bào nào trong 6 dòng tế bào ung thư biểu mô vảy khoang miệng khác (SCC4, SCC25, UM-SCC19, UM-SCC 84, UM-SCC 92 và UM-SCC 99) [2, 3] Nghiên cứu cũng chỉ ra hoạt động của IDO có thể gây cản trở quá trình chuyển hóa của khối u [2, 3]

Năm 2020, Riess và cộng sự nghiên cứu phân tích toàn diện về trạng thái biểu hiện của gen thuộc con đường chuyển hóa kynurenin (KP) HNSCC được chọn lấy làm đối tượng nghiên cứu điển hình cho các cơ chế trốn thoát miễn dịch tự phát Kết quả cho

thấy IDO1 có biểu hiện không đồng nhất giữa các dòng tế bào HNSCC khác nhau Riess đã dùng chất ức chế kinase phụ thuộc cyclin, Dinaciclib được sử dụng để ngăn chặn hoạt động của IDO, làm giảm quá trình chuyển hóa Trp thông qua con đường kynurenin trong các dòng tế bào HNSCC Mặc dù biểu hiện IDO1 thấp nhưng có thể tác động đến khi điều trị bằng IFNγ đối với các tế bào HNSCC [44]

Al-Samadi và cộng sự cho thấy việc sử dụng các chất ức chế IDO1 trong thử

nghiệm in vitro chip 3D vi lỏng (3D microfluidic chip) với tế bào HSC-3 gây ra sự dịch

chuyển tế bào miễn dịch đến các tế bào gây ung thư Do đó, việc thay đổi vi môi trường khối u TME từ “lạnh” (dạng bất hoạt) thành “nóng” (dạng hoạt động) có thể nâng cao hiệu quả của các thuốc trị liệu miễn dịch khác khi kết hợp với các chất ức chế IDO1 [1] Như vậy có thể nhận thấy được một phần về vai trò của IDO1 trong khả năng tác

động lên các dòng tế bào ung thư HNSCC

1.2.3.2 Nghiên cứu hóa mô miễn dịch về IDO trên HNSCC

Hóa mô miễn dịch (Immunohistochemistry-IHC), việc sử dụng kháng thể đơn dòng và đa dòng để phát hiện các kháng nguyên cụ thể trong các mô, là một công cụ mạnh mẽ trong chẩn đoán bệnh học IHC là một ứng dụng quan trọng của kháng thể đơn dòng và đa dòng để xác định sự phân bố mô kháng nguyên liên quan đến sức khỏe và bệnh tật IHC được sử dụng rộng rãi để chẩn đoán các bệnh ung thư bởi vì các kháng nguyên khối u cụ thể được biểu hiện mới hoặc điều chỉnh trong một số bệnh ung thư IHC đóng một vai trò quan trọng trong bệnh lý, đặc biệt là trong các chuyên khoa về bệnh lý ung thư [9]

Phần lớn các nghiên cứu về IHC khối u được thực hiện trên các khối mô cố định bằng formalin và paraffin Các nghiên cứu trong nhóm này được thiết kế theo phương pháp phân tích hồi cứu, không sử dụng các phương pháp thu thập mô mới hoặc phân tích hoạt động của IDO trong mô Các nghiên cứu về mô được lấy từ môi dưới, khoang miệng, lưới, amidan và thanh quản Dòng kháng thể đơn dòng IDO 10.1 được sử dụng rộng rãi nhất Vết nhuộm màu của IDO thường được quan sát thấy ở mặt trước xâm lấn của khối u và có sự tương quan với khả năng sống sót kém của bệnh nhân [33, 48, 61] Trong một nghiên cứu dự đoán khả năng sống sót của Wang và cộng sự, sự gia tăng biểu hiện IDO đã được thấy ở những người không đáp ứng lâm sàng với liệu pháp Nimotuzumab (thụ thể chống yếu tố tăng trưởng biểu bì), cho thấy IDO có thể là một dấu ấn sinh học về tình trạng miễn dịch trong TME trong quá trình điều trị ở bệnh nhân ung thư tế bào vảy [56]

1.2.3.3 Thử nghiệm lâm sàng các chất ức chế IDO trên HNSCC

Các thử nghiệm lâm sàng với kết quả đã được công bố về IDO ở HNSCC đều ở giai đoạn đầu (pha I và II) và đánh giá các chất ức chế IDO1 kết hợp với chất ức chế PD-1/PD-L1 [15, 19, 20, 40] Tất cả các bệnh nhân HNSCC tham gia vào các thử nghiệm

đã công bố đều mắc bệnh di căn hoặc tái phát tiến triển Các thử nghiệm cho thấy kết quả đáp ứng khách quan (34-55%) và tỷ lệ kiểm soát bệnh (62-70%) đối với Epacadostat (chất ức chế IDO1) kết hợp với các chất ức chế PD-1 [15, 19] Hồ sơ an toàn về liệu pháp kết hợp của các chất IDO1 và PD-1 phù hợp với các báo cáo trước đó của mỗi chất ức chế điểm trạm kiểm tra dưới dạng trị liệu đơn Tác dụng phụ liên quan đến điều trị phổ biến nhất với trạm kiểm tra miễn dịch là mệt mỏi (22-33%) [20, 28]

Các thử nghiệm lâm sàng đã cho thấy việc sử dụng các chất ức chế IDO1 kết hợp với các phương pháp điều trị khác làm tăng hiệu quả điều trị bệnh HNSCC

1.2.3.4 Nghiên cứu phiên mã gen IDO trên HNSCC

IDO được biểu hiện mạnh mẽ ở các HNSCC dương tính với HPV ở người và tương quan với biểu hiện kháng nguyên HPV E7 [29] IDO1 được biểu hiện quá mức trong các khối u ở những người mắc bệnh HNSCC Các bằng chứng gen cho thấy IDO1 cùng PD-L1 biểu hiện quá mức trên HNSCC so với IDO1 ở mô đầu và cổ bình thường [12, 34, 59] Nồng độ IDO đo được trong quá trình điều trị tăng đáng kể, gấp 3,6 lần biểu hiện ở tế bào máu đơn nhân ngoại vi (PBMC) trong quá trình xạ trị cho bệnh nhân mắc HNSCC giai đoạn III-IV [47] Khi điều trị bằng hóa trị, nồng độ mRNA IDO1 tương quan với khả năng sống sót kém và sự giảm biểu hiện kết hợp giữa IDO1 và PD-L1 sau điều trị có liên quan đến khả năng sống sót tốt hơn [10]

Các nghiên cứu trên đã đưa ra một mối tương quan giữa nồng độ biểu hiện IDO1 trên các bệnh nhân đã mắc bệnh HNSCC, từ đó, việc nghiên cứu sâu về sự ức chế IDO1 trên HNSCC là một hướng đi mới có thể mang đến hiệu quả điều trị Phát triển chất ức chế IDO1 hứa hẹn mở ra một cơ hội mới cho hướng điều trị bệnh HNSCC

1.3 CÁC CHẤT ỨC CHẾ IDO1 1.3.1 Cấu trúc các chất ức chế IDO1

Năm 2010, Röhrig và cộng sự đã có nghiên cứu in silico của các chất ức chế

IDO1 đưa ra mô hình cấu trúc lý tưởng của chất IDO1 cần có [45] Họ đã dựa trên quan sát hình học và docking phối tử và đưa ra kết luận rằng các chất ức chế cần có những đặc điểm như sau trong cấu trúc:

1 Một hệ thống vòng thơm, ít nhất 2 vòng để liên kết vào “pocket” A

2 Một nguyên tử có cặp điện tử electron tự do có thể liên kết với sắt trong nhân

hem, ví dụ như oxy, nitơ hoặc lưu huỳnh

3 Một nhóm có thể hình thành tương tác Van der Waals với “pocket” B

4 Các nhóm có thể hình thành liên kết hydro với Ser167, Gly262, Ala264 và Arg231 (có thể là nhóm mang điện tích âm hình thành cầu muối) hoặc với 7-propionat của nhân hem (có thể là nhóm mang điện tích dương hình thành cầu

muối) [45]

Hình 1.4 Minh họa cấu trúc pharmacophore từ mô phỏng docking [45]

Hầu hết tất cả có chất ức chế IDO đều có đặc điểm đầu tiên Các chất ức chế IDO

là dẫn chất của Trp như dẫn chất (6) không có đặc điểm số 2 ở trên Đặc điểm 3 và 4 thường được quan sát thấy hơn ở phối tử cồng kềnh hơn như dẫn chất (15), (16), (17)

(Hình 1.5) [45] Một số dẫn chất như (18) có khung cấu trúc như Linrodostat xuất hiện

tương tác với “pocket” D

Hình 1.5 Cấu trúc 1 số chất ức chế IDO1 có tương tác với các “pocket” (“pocket” A: xanh lam, “pocket” B: cam, “pocket” C: vàng, “pocket” D: xanh tím) [46]

1.3.2 Chất ức chế IDO1 mang khung indazol 1.3.2.1 Khung indazol

Indazol được định nghĩa lần đầu tiên bởi Emil Fisher là “vòng pyrazol ngưng tụ với vòng benzen” Bên cạnh đó, indazol, là một đẳng cấu sinh học của nhân vòng indol trong Trp, được sử dụng làm khung cấu trúc cho thiết kế các chất ức chế IDO1 Sự đa dạng của cấu trúc, trong đó 2 nguyên tử nitơ hỗ biễn và hình thành nên 2 dạng đồng

phân, trong đó đồng phân 1H-indazol thường chiếm ưu thế hơn đồng phân còn lại do bền hơn về mặt nhiệt động học Từ đó cho thấy rằng các dẫn chất 1H-indazol sẽ chiếm

tỷ lệ cao hơn trong các phản ứng tổng hợp hóa học [14, 63]

Hình 1.6 Các đồng phân của vòng indazol

Indazol là một hệ dị vòng có ý nghĩa quan trọng trong ngành công nhiệp dược phẩm Các tính chất sinh học của các dẫn chất indazol có ứng dụng rộng trong thiết kế thuốc mới [14] Các dẫn chất mang khung indazol có thể ứng dụng làm thuốc điều trị nhiều bệnh khác nhau như nhiễm khuẩn, rối loạn thoái hóa thần kinh và đặc biệt là ung thư Hầu hết chúng là chất ức chế thụ thể tyrosin kinase hoặc serin/threonin kinase (aurora kinase, cyclin-dependent kinase) [8]

1.3.2.2 Chất ức chế IDO1 mang khung indazol

Năm 2016, Wang và cộng sự đã tổng hợp các dãy các chất mang khung

1H-indazol có nhóm thế ở vị trí 4 và 6 có tiềm năng ức chế IDO1 Thí nghiệm của Wang đã

đưa ra kết quả rằng dẫn chất TQ1 có khả năng ức chế IDO1 tốt nhất với giá trị 5,3 µM

Nghiên cứu docking phân tử của TQ1 đã chỉ ra 2 vị trí nguyên tử nitơ trong nhân

1H-indazol có tương tác với sắt của nhân hem Nhóm thế halogen ở vị trí số 6 làm tăng tương tác kỵ nướcvới Tyr126, Phe164, Leu234 và Phe163 của “pocket” A Nghiên cứu về mối liên quan cấu trúc-tác dụng cho thấy sự có mặt của halogen ở vị trí số 6 đóng vai trò quan trọng trong tương tác với trung tâm hoạt động Kết quả nghiên cứu của Wang

và cộng sự đã khẳng định khung cấu trúc 1H-indazol là một khung cấu trúc tiềm năng

ức chế IDO1 trong nghiên cứu phát triển sau này [43]

Tiếp tục với kết quả của Wang, năm 2019, Yang và cộng sự đã tiếp tục lựa chọn

chất TQ1 để tối ưu và phát triển ra một dãy dẫn chất thế ở vị trí 4 và 6 trên nhân

1H-indazol Các chất này sau đó được thử hoạt tính ức chế không chỉ trên IDO1 mà còn hướng tới đích TDO Kết quả chỉ ra rằng, trong số 38 chất được nghiên cứu, dẫn chất

TQ2 có khả năng ức chế kép IDO1 và TDO, với giá trị IC50 lần lượt là 0,74 µM và 2,93

µM Hơn nữa, TQ2 còn thể hiện hoạt tính kháng ung thư in vivo và trong mô hình ghép

xenograft CT26 [60]

Năm 2021, Yu và cộng sự đã nghiên cứu các dãy dẫn chất mang khung

1H-indazol thế ở vị trí số 3 và 6 với các nhóm thế thân dầu Kết quả cho thấy dẫn chất TQ3

có giá trị IC50 trên tế bào 4T1, HepG2, và MCF-7 lần lượt là 0,23 µM, 0,80 µM và 0,34 µM Bên cạnh đó, nghiên cứu cũng chỉ ra khi không có nhóm thế hoặc nhóm thế quá cồng kềnh trên vòng piperazin sẽ làm giảm khả năng ức chế tế bào ung thư [57]

Hình 1.7 Cấu trúc TQ1, TQ2, TQ3

Năm 2020, nhóm nghiên cứu của PGS TS Trần Phương Thảo đã tổng hợp được

một dãy các dẫn chất mang khung 6-amino-1H-indazol và thử nghiệm trên các dòng tế

bào ung thư Trong nghiên cứu, có dẫn chất TQ4 có khả năng ức chế IDO1 tốt, không

những thế mà còn có khả năng kháng tế bào HTC116 (dòng tế bào mà IDO1 đã được chứng minh có biểu hiện cao) với giá trị IC50 = 0,4 ± 0,3 µM [23] Kết quả nghiên cứu chỉ ra sự có mặt của nhóm methyl ở vị trí C3 trên vòng indazol có thể làm tăng khả năng kháng dòng tế bào ung thư đại trực tràng HCT116 so với các chất không có nhóm thể ở vị trí đó Bên cạnh đó, khi chuyển nhóm methyl từ N1 sang N2 thì làm giảm khả năng ức chế tế bào của hầu hết các dẫn chất

Hình 1.8 Cấu trúc TQ4

Trong số 16 dẫn chất được nhóm nghiên cứu của PGS TS Trần Phương Thảo

báo cáo, cấu trúc của TQ4 cho kết quả ức chế IDO1 tốt nhất được giải thích dựa trên mô phỏng docking phân tử Cụ thể: TQ4 có nhóm methyl ở vị trí C3 có tương tác với

Ser263, vị trí N2 không nhóm thế hình thành liên kết hydro với Ser167 và vòng

flurophenyl tạo tương tác π-π với Phe226 Bên cạnh đó, TQ4 còn nhiều tương tác với

các acid amin khác tại trung tâm hoạt động của IDO1 như Tyr126, Phe163, Phe164, Phe227, Arg231 và His346 [23]

Tiếp tục hướng nghiên cứu trên, dựa vào cấu trúc của dẫn chất TQ4 và mối liên quan giữa IDO1 và HNSCC, nhóm đã tiếp tục tiến hành tổng hợp và đánh giá tác dụng

kháng tế bào ung thư biểu mô hạ họng các dẫn chất mang khung

1,3-dimethyl-6-amino-1H-indazol

NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ 2.1.1 Hóa chất

Các dung môi, hóa chất dùng trong tổng hợp và tinh chế các chất mục tiêu trong nghiên cứu chủ yếu có nguồn gốc xuất xứ từ Trung Quốc, Merck (Đức), AKSci (Mỹ), Việt Nam Các hóa chất này được sử dụng trực tiếp không qua tinh chế và được trình bày trong bảng dưới đây:

Bảng 2.1 Các nguyên liệu sử dụng trong tổng hợp hóa dược

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ

- Dụng cụ thủy tinh: bình cầu đáy tròn một cổ dung tích 50 ml, bình cầu đáy tròn một cổ dung tích 100 ml, sinh hàn, micropipet, cốc thủy tinh, bình chiết dung tích 125 ml, bình nón dung tích 100 ml, phễu lọc, ống đong, pipet Pasteur

- Máy khuấy từ gia nhiệt IKA-RTC (Đức) - Cân kỹ thuật điện tử Shimadzu (Nhật Bản) - Bơm hút chân không DIVAC.1.21 (Mỹ) - Tủ sấy Memmer (Đức)

- Máy cất quay Buchi R-210 (Thụy Sĩ)

- Đèn tử ngoại với hai bước sóng 254 nm và 365 nm

- Sắc ký lớp mỏng (TLC): được tiến hành trên bản mỏng silica gel 60 F254 (Merck) - Bình triển khai sắc ký

- Cột chạy sắc ký

- Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân Bruker Avance 500 MHz hãng Bruker BioSpin (Thụy Sĩ) tại khoa Hóa – Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội

- Máy đo nhiệt độ nóng chảy nhiệt điện Electrothermal digital tại Bộ môn Hóa Dược – Trường Đại học Dược Hà Nội

- Máy đo phổ khối lượng Agilent 6530 Accurate-Mass QTOF LC/MS (United States) – Viện Hóa Sinh Biển – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

- Máy đo phổ hồng ngoại FTIR Affinity – IS – Shimadzu (Nhật Bản) tại Khoa Hóa Học – Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU2.2.1 Tổng hợp hóa học

- Tổng hợp 4 dẫn chất thơm mang khung 1,3-dimethyl-6-amino-1H-indazol

+ 2-(((1,3-Dimethyl-1H-indazol-6-yl)amino)methyl)-5-methoxyphenol (IVa) + 5-(((1,3-Dimethyl-1H-indazol-6-yl)amino)methyl)-2-methoxyphenol (IVb) + 1,3-Dimethyl-N-(2,3,4-trimethoxybenzyl)-1H-indazol-6-amin (IVc)

+ 1,3-Dimethyl-N-(3,4,5-trimethoxybenzyl)-1H-indazol-6-amin (IVd)

- Kiểm tra độ tinh khiết của các dẫn chất tổng hợp được

2.2.2 Khẳng định cấu trúc của các chất tổng hợp được

Các dẫn chất mục tiêu sau khi được tổng hợp, tinh chế được khẳng định cấu trúc thông qua các phương pháp phổ

2.2.3 Đánh giá tác dụng kháng tế bào ung thư biểu mô hạ họng (FaDu)

Các dẫn chất mục tiêu sau khi được tổng hợp, tinh chế và khẳng định cấu trúc được thử tác dụng kháng tế bào ung thư biểu mô hạ họng FaDu

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1 Tổng hợp hóa học

2.3.1.1 Tổng hợp

- Dựa trên những nguyên tắc cơ bản của hóa học hữu cơ để tổng hợp các dẫn chất có cấu trúc như dự kiến Các phản ứng đã sử dụng bao gồm:

+ Phản ứng N-alkyl hóa với tác nhân alkyl hóa là một alkyl halogenid có mặt xúc

tác K2CO3 trong dung môi DMF

+ Phản ứng khử hóa nhóm nitro thơm với H2 xúc tác Pd/C trong hỗn hợp dung môi MeOH

+ Phản ứng amin hóa khử giữa amin và các dẫn chất benzaldehyd với xúc tác là NaBH3CN trong môi trường acid trong dung môi MeOH

- Các phản ứng được theo dõi bằng sắc ký lớp mỏng, pha tĩnh là bản mỏng silica gel 60 F254, quan sát bản mỏng dưới đèn tử ngoại bước sóng 254 nm

- Hỗn hợp sau phản ứng được tinh chế bằng các kỹ thuật phù hợp với từng giai đoạn, bao gồm các kỹ thuật chiết phân bố lỏng - lỏng và sắc ký cột

2.3.1.2 Kiểm tra độ tinh khiết

Các chất sau khi tinh chế được kiểm tra độ tinh khiết bằng hai phương pháp: - Sắc ký lớp mỏng:

+ Pha tĩnh: bản mỏng silica gel 60 F254 được hoạt hóa ở 110oC trong 30 phút

+ Pha động: hệ dung môi EA:n-hexan tỷ lệ 1:1 và 1:2, DCM:MeOH = 15:1

+ Quan sát bản mỏng dưới đèn tử ngoại bước sóng 254 nm

- Nhiệt độ nóng chảy: xác định bằng máy đo nhiệt độ nóng chảy MPA (Mỹ)

2.3.2 Khẳng định cấu trúc

Các dẫn chất sau khi được tổng hợp, tinh chế và đánh giá là tinh khiết được khẳng định cấu trúc bằng các phương pháp phổ hiện đại, bao gồm: phổ hồng ngoại (IR), phổ khối phân giải cao (HR-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton và carbon (1H-NMR và 13C-NMR):

Phổ hồng ngoại (IR): ghi bằng máy FTIR Affinity - 1S - Shimadzu tại Khoa Hóa học - trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội, với kỹ thuật viên nén KBr, quét phổ trong vùng 4000-400 cm-1 Mẫu sau khi sấy khô ở dạng rắn được phân tán trong KBr đã sấy khô với tỷ lệ 1:200, sử dụng áp lực cao nén hỗn hợp thành dạng film mỏng, đồng thời hút chân không để loại bỏ hơi ẩm Phổ được ghi ở độ phân giải 4 cm-1

Máy đo phổ khối lượng phân giải cao Agilent 6530 Accurate-Mass QTOF LC/MS (United States) – Viện Hóa Sinh Biển – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam hoạt động theo phương pháp ion hóa phun bụi điện tử ESI, dung môi hòa tan là MeOH hoặc MeCN Tùy theo phương thức bẫy ion ESI (+) hoặc ESI (-) mà ion trên

phổ ghi nhận được là dương hay âm

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR và 13C-NMR): được ghi bằng máy Bruker Avance 500 MHz tại Khoa Hóa học - trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội, phổ 1H-NMR đo ở tần số 500 MHz, phổ 13C-NMR đo ở tần số

125 MHz Độ dịch chuyển hóa học (δ) được biểu thị bằng đơn vị phần triệu (ppm), lấy

mốc là pic của chất chuẩn nội tetramethylsilan (TMS), nhiệt độ ghi phổ khoảng 300K, dung môi CDCl3

2.3.3 Đánh giá tác dụng kháng tế bào ung thư FaDu

Các dẫn chất mục tiêu sau khi được tổng hợp, tinh chế và khẳng định cấu trúc được

thử hoạt tính kháng tế bào FaDu

Nuôi cấy tế bào: Các tế bào FaDu được nuôi cấy trong MEM, được bổ sung 10% FBS và 1% amoxicillin và streptomycin Các tế bào (2x105 tế bào/ml) được ủ qua đêm để đạt được độ thích hợp 80 % trước khi xử lý các hợp chất

Phương pháp MTT:

Các tế bào (2x104 /giếng) được gieo vào đĩa 96 giếng được ủ trong 24 giờ để đạt được độ thích hợp khoảng 80 % Sau khi xử lý với các nồng độ hợp chất khác nhau trong 24 giờ, môi trường được thay thế bằng 200 µl dung dịch MTT (0,5 mg/ml) Các tế bào được ủ tiếp trong 4 giờ ở 37oC cho đến khi xuất hiện kết tủa màu tím của tinh thể formazan Sau đó tách loại môi trường, hòa tinh thể formazan vào 200 µl DMSO Độ hấp thụ của dung dịch thu được đo ở bước sóng 540 nm bằng Máy quang kế vi bản MultiskanTM FC (ThermoFisher, Waltham, MA, USA)

Giá trị IC50 của các chất được tính toán bằng phần mềm Table Curve 2.0 sau 3 lần thí nghiệm độc lập dựa trên % tế bào FaDu sống sót sau khi thử nghiệm ở các nồng độ chất khác nhau: 5 µM, 10 µM, 20 µM, 40 µM

THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1 HÓA HỌC

3.1.1 Tổng hợp hóa học

Quá trình tổng hợp các chất IVa-d trong khóa luận được trình bày theo quy trình

chung như sau:

Sơ đồ 3.1 Quy trình tổng hợp chung 3.1.1.1 Tổng hợp 1,3-dimethyl-6-nitro-1H-indazol (II)

Hợp chất trung gian 1,3-dimethyl-6-nitro-1H-indazol (II) được tổng hợp thông qua phản ứng N-alkyl hóa hợp chất 3-methyl-6-nitro-1H-indazol (I) với tác nhân là CH3I theo sơ đồ sau:

Sơ đồ 3.2 Quy trình tổng hợp chất II

 Tiến hành phản ứng

- Hòa tan 0,708 g (4 mmol) chất I vào 20 ml DMF khan trong bình cầu đáy tròn dung

tích 100 ml, sau đó thêm 1,106 g (8 mmol, 2,0 đương lượng) K2CO3 - Khuấy hỗn hợp trong bình phản ứng khoảng 30 phút ở 60℃

- Thêm 0,5 ml (8 mmol, 2,0 đương lượng) CH3I vào bình phản ứng, tiếp tục khuấy hỗn hợp ở 60℃ trong vòng 4 giờ

- Theo dõi phản ứng bằng TLC với pha động là EA:n-hexan (1:1)

- Lắc dịch chiết với dung dịch NaCl bão hòa, sau đó loại nước bằng Na2SO4 khan

- Tinh chế sản phẩm bằng sắc kí cột với hệ dung môi EA:n-hexan = 1:2

- Cất quay chân không ở 70℃ loại dung môi

- Sấy khô trong tủ sấy chân không thu được 0,400 g sản phẩm II  Kết quả

- Cảm quan: Chất rắn màu trắng - Hiệu suất: 52,3%

- Rf = 0,56 (TLC, silica gel 60 F254, hệ dung môi EA:n-hexan = 1:1)

3.1.1.2 Tổng hợp 1,3-dimethyl-6-amino-1H-indazol (III)

Tổng hợp chất trung gian 1,3-dimethyl-6-amino-1H-indazol (III) từ hợp chất II

bằng phản ứng hydrogen hóa theo sơ đồ sau:

Sơ đồ 3.3 Quy trình tổng hợp chất III

 Tiến hành phản ứng

- Hòa tan 0,382 g (2 mmol) chất II vào 10 ml MeOH trong bình phản ứng Sau đó

thêm từ từ 50 mg 10% Pd/C Lắp bình phản ứng vào thiết bị hydrogen hóa

- Khí H2 được tạo thành trong máy sinh khí hydro và sau đó chuyển vào thiết bị hydrogen hóa

- Đuổi không khí khỏi bình phản ứng bằng cách sục khí H2 từ thiết bị hydrogen hóa vào bình phản ứng liên tục nhiều lần

- Thêm khí H2 vào bình phản ứng đến áp suất 3,5 bar Hỗn hợp được hydro hóa ở nhiệt độ phòng trong vòng 4 giờ

- Theo dõi phản ứng bằng TLC với pha động EA:n-hexan = 1:1

- Hiệu suất: 85,6%

- Rf = 0,37 (TLC, silica gel 60 F254, hệ dung môi EA:n-hexan = 1:1)

3.1.1.3 Tổng hợp các dẫn chất 1,3-dimethyl-6-amino-1H-indazol

Các dẫn chất 1,3-dimethyl-6-amino-1H-indazol (IVa-d) được tổng hợp bằng

phản ứng amin hóa khử giữa chất III với các benzaldehyd, sử dụng tác nhân khử là

NaBH3CN

a) Tổng hợp chất IVa

Tổng hợp 2-(((1,3-Dimethyl-1H-indazol-6-yl)amino)methyl)-5-methoxyphenol

(IVa) từ nguyên liệu III và 2-hydroxy-4-methoxybenzaldehyd theo sơ đồ sau:

Sơ đồ 3.4 Quy trình tổng hợp chất IVa

 Tiến hành phản ứng

- Hòa tan 0,161 g (1 mmol) chất III và 0,152 g (1 mmol, 1,0 đương lượng)

2-hydroxy-4-methoxybenzaldehyd vào hỗn hợp dung môi gồm 0,28 mL (5 mmol, 5,0 đương lượng) AcOH và 10,0 mL MeOH trong bình cầu đáy tròn dung tích 100 mL - Khuấy hỗn hợp trong bình ở nhiệt độ phòng trong 5 phút, sau đó thêm 0,314 g (5 mmol, 5,0 đương lượng) NaBH3CN

- Khuấy hỗn hợp ở 40oC trong 4 giờ

- Theo dõi phản ứng bằng TLC với pha động là EA:n-hexan = 1:1

 Xử lý phản ứng

- Pha loãng khối phản ứng với 25,0 mL DCM

- Chiết với dung dịch Na2CO3 và DCM (3 lần, mỗi lần 30,0 mL), gộp pha dung môi hữu cơ của cả 3 lần chiết

- Lắc với NaCl bão hòa, sau đó làm khan bằng Na2SO4 khan

- Tinh chế sản phẩm bằng sắc kí cột với hệ dung môi EA:n-hexan (tỷ lệ 1:5 đến 1:1)

- Cất quay chân không ở 50oC loại dung môi

- Sấy khô trong tủ sấy chân không thu được 0,207 g sản phẩm IVa  Kết quả

- Cảm quan: Chất rắn màu trắng - Hiệu suất: 70,0%

- Tonc = 116,9-118,7oC

- Rf = 0,54 (TLC, silica gel 60 F254, hệ dung môi DCM:MeOH = 15:1)

- Khẳng định cấu trúc bằng phổ IR, HR-MS, 1H-NMR, 13C-NMR Kết quả được trình

bày cụ thể ở phần phụ lục

b) Tổng hợp chất IVb

Tổng hợp 5-(((1,3-Dimethyl-1H-indazol-6-yl)amino)methyl)-2-methoxyphenol

(IVb) từ nguyên liệu III và 3-hydroxy-4-methoxybenzaldehyd theo sơ đồ sau:

Sơ đồ 3.5 Quy trình tổng hợp chất IVb

 Tiến hành phản ứng

- Hòa tan 0,161 g (1 mmol) chất III và 0,152 g (1 mmol, 1,0 đương lượng)

3-hydroxy-4-methoxybenzaldehyd vào hỗn hợp dung môi gồm 0,28 mL (5 mmol, 5,0 đương lượng) AcOH và 10,0 mL MeOH trong bình cầu đáy tròn dung tích 100 mL - Khuấy hỗn hợp trong bình ở nhiệt độ phòng trong 5 phút, sau đó thêm 0,314 g (5 mmol, 5,0 đương lượng) NaBH3CN

- Khuấy hỗn hợp ở 40oC trong 4 giờ

- Theo dõi phản ứng bằng TLC với pha động là EA:n-hexan = 1:1

 Xử lý phản ứng

- Pha loãng khối phản ứng với 25,0 mL DCM

- Chiết với dung dịch Na2CO3 và DCM (3 lần, mỗi lần 30,0 mL), gộp pha dung môi hữu cơ của cả 3 lần chiết

- Lắc với NaCl bão hòa, sau đó làm khan bằng Na2SO4 khan

- Tinh chế sản phẩm bằng sắc kí cột với hệ dung môi EA:n-hexan (tỷ lệ 1:5 đến

1:1)

- Cất quay chân không ở 50oC loại dung môi

- Sấy khô trong tủ sấy chân không thu được 0,201 g sản phẩm IVb  Kết quả

- Cảm quan: Chất rắn màu trắng - Hiệu suất: 67,7%

- Tonc = 114,1-115,7oC

- Rf = 0,56 (TLC, silica gel 60 F254, hệ dung môi DCM:MeOH = 15:1)

- Khẳng định cấu trúc bằng phổ IR, HR-MS, 1H-NMR, 13C-NMR Kết quả được trình

bày cụ thể ở phần phụ lục c) Tổng hợp chất IVc

Tổng hợp 1,3-Dimethyl-N-(2,3,4-trimethoxybenzyl)-1H-indazol-6-amin (IVc)

từ nguyên liệu III và 2,3,4-trimethoxybenzaldehyd theo sơ đồ sau:

Sơ đồ 3.6 Quy trình tổng hợp chất IVc

 Tiến hành phản ứng

- Hòa tan 0,161 g (1 mmol) chất III và 0,196 g (1 mmol, 1,0 đương lượng)

2,3,4-trimethoxybenzaldehyd vào hỗn hợp dung môi gồm 0,28 mL (5 mmol, 5,0 đương lượng) AcOH và 10,0 mL MeOH trong bình cầu đáy tròn dung tích 100 mL - Khuấy hỗn hợp trong bình ở nhiệt độ phòng trong 5 phút, sau đó thêm 0,314 g (5 mmol, 5,0 đương lượng) NaBH3CN

- Khuấy hỗn hợp ở 40oC trong 4 giờ

- Theo dõi phản ứng bằng TLC với pha động là EA:n-hexan = 1:1

 Xử lý phản ứng

- Pha loãng khối phản ứng với 25,0 mL DCM

- Chiết với dung dịch Na2CO3 và DCM (3 lần, mỗi lần 30,0 mL), gộp pha dung môi hữu cơ của cả 3 lần chiết

- Lắc với NaCl bão hòa, sau đó làm khan bằng Na2SO4 khan

- Tinh chế sản phẩm bằng sắc kí cột với hệ dung môi EA:n-hexan (tỷ lệ 1:5 đến

1:1)

- Cất quay chân không ở 50oC loại dung môi

- Sấy khô trong tủ sấy chân không thu được 0,259 g sản phẩm IVc  Kết quả

- Cảm quan: Chất rắn màu trắng - Hiệu suất: 76,0%

- Tonc = 128,0-130,1oC

- Rf = 0,61 (TLC, silica gel 60 F254, hệ dung môi DCM:MeOH = 15:1)

- Khẳng định cấu trúc bằng phổ IR, HR-MS, 1H-NMR, 13C-NMR Kết quả được trình

bày cụ thể ở phần phụ lục d) Tổng hợp chất IVd

Tổng hợp 1,3-Dimethyl-N-(3,4,5-trimethoxybenzyl)-1H-indazol-6-amin (IVd)

từ nguyên liệu III và 3,4,5-trimethoxybenzaldehyd theo sơ đồ sau:

Sơ đồ 3.7 Quy trình tổng hợp chất IVd

 Tiến hành và xử lý phản ứng

- Hòa tan 0,161 g (1 mmol) chất III và 0,196 g (1 mmol, 1,0 đương lượng)

3,4,5-trimethoxybenzaldehyd vào hỗn hợp dung môi gồm 0,28 mL (5 mmol, 5,0 đương lượng) AcOH và 10,0 mL MeOH trong bình cầu đáy tròn dung tích 100 mL - Khuấy hỗn hợp trong bình ở nhiệt độ phòng trong 5 phút, sau đó thêm 0,314 g (5 mmol, 5,0 đương lượng) NaBH3CN

- Khuấy hỗn hợp ở 40oC trong 4 giờ

- Theo dõi phản ứng bằng TLC với pha động là EA:n-hexan = 1:1

 Xử lý phản ứng

- Pha loãng khối phản ứng với 25,0 mL DCM

- Chiết với dung dịch Na2CO3 và DCM (3 lần, mỗi lần 30,0 mL), gộp pha dung môi hữu cơ của cả 3 lần chiết

- Lắc với NaCl bão hòa, sau đó làm khan bằng Na2SO4 khan

- Tinh chế sản phẩm bằng sắc kí cột với hệ dung môi EA:n-hexan (tỷ lệ 1:5 đến

1:1)

- Cất quay chân không ở 50oC loại dung môi

- Sấy khô trong tủ sấy chân không thu được 0,256 g sản phẩm IVd  Kết quả

- Cảm quan: Chất rắn màu trắng - Hiệu suất: 75,3%

- Tonc = 133,3-134,8oC

- Rf = 0,59 (TLC, silica gel 60 F254, hệ dung môi DCM:MeOH = 15:1)

- Khẳng định cấu trúc bằng phổ IR, HR-MS, 1H-NMR, 13C-NMR Kết quả được trình bày cụ thể ở phần phụ lục

Hiệu suất tổng hợp và chỉ số hóa lý của các dẫn chất IVa-d được trình bày trong bảng

dưới đây:

Bảng 3.1 Chỉ số hóa lý và hiệu suất tổng hợp các hợp chất IVa-d

các chất IVa-d được trình bày ở bảng 3.2

3.1.2.2 Đo nhiệt độ nóng chảy

Các dẫn chất IVa-d đều ở thể rắn, được tiến hành xác định nhiệt độ nóng chảy bằng máy đo chuyên dụng Kết quả được trình bày ở bảng 3.2, cho thấy các chất IVa-d đều có nhiệt độ nóng chảy xác định có khoảng dao động nhiệt độ hẹp từ 1-2 oC

Bảng 3.2 Giá trị Rf và nhiệt độ nóng chảy (Tonc) của các dẫn chất IVa-d

Dựa trên kết quả xác định Rf và nhiệt độ nóng chảy trên có thể sơ bộ khẳng định

tất cả các dẫn chất IVa-d đều tinh khiết và đủ điều kiện để thực hiện các bước khẳng

định cấu trúc bằng phương pháp phổ

3.1.3 Khẳng định cấu trúc

Các phương pháp phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng phân giải cao (HR-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR), phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13 (13C-NMR) được sử dụng để khẳng định cấu trúc của các dẫn chất IVa-d đã được tổng

hợp Kết quả ghi phổ và phân tích phổ được trình bày trong bảng dưới đây và phần phụ

Ghi chú:  là dao động hóa trị

Nhận xét: Dựa trên bảng 3.3 và phổ đồ (phụ lục 1-4) có thể sơ bộ nhận ra sự hiện