Hiện nay, các phương pháp sàng lọc, điều trị ung thư đã và đang nhận được nhiều sự quan tâm, đầu tư nghiên cứu và phát triển của nhiều tổ chức và các nhà nghiên cứu trên toàn thế giới..
UNG THƯ
Giới thiệu về ung thư
Ung thư là một trong những nguyên nhân gây tử vong hàng đầu và làm giảm tuổi thọ ở mọi quốc gia trên toàn thế giới Theo thống kê của tổ chức Y tế Thế giới (WHO) năm 2019, ung thư là nguyên nhân hàng đầu hoặc thứ hai dẫn đến tử vong trước tuổi 70 ở 112 trong tổng số 183 nước Thống kê của GLOBOCAN 2022 đã chỉ ra rằng có gần
20 triệu ca mắc ung thư mới và gần 9,7 triệu ca tử vong do ung thư vào năm 2022 Gánh nặng ung thư trên toàn thế giới được dự đoán là 28,4 triệu ca trong năm 2040, tăng 47% so với năm 2020 thậm chí có thể gia tăng hơn do tăng các yếu tố nguy cơ liên quan toàn cầu hóa và phát triển kinh tế Ở Việt Nam, ước tính số ca mắc mới trong năm 2018 là
164 671 ca (0,17% dân số) và số ca tử vong là 114 871 ca (0,12% dân số, cả hai thống kê này đều đã tăng gấp 3 lần so với 30 năm trước đó [42]
Sự ra đời của thuốc chống ung thư gây độc tế bào, hay phương pháp hóa trị liệu để điều trị khối u huyết học và khối u rắn là một bước đột phá đầu tiên trong lĩnh vực nghiên cứu về thuốc điều trị ung thư Kể từ đó số lượng các nghiên cứu trong lĩnh vực này được tăng theo cấp số nhân Bước đột phá thứ hai diễn ra đầu những năm 80 dựa trên các nghiên cứu sinh học phân tử và tế bào để phát triển các thuốc điều trị đặc hiệu cho một số đích phân tử liên quan đến quá trình tân sinh tạo ra liệu pháp điều trị nhắm trúng đích Cả hóa trị liệu và điều trị đích đều giúp cải thiện đáng kể thời gian sống sót, chất lượng sống của bệnh nhân ung thư và một số còn giúp làm thuyên giảm khối u Tiếp sau đó là sự ra đời của kháng thể đơn dòng và các chất ức chế điểm kiểm soát miễn dịch để điều trị khối u tiến triển hoặc di căn mà các liệu pháp điều trị trước đó không hiệu quả Ngày nay, các phương pháp điều trị ung thư mới và tiên tiến đang được tập trung phát triển với những kết quả cận lâm sàng đầy hứa hẹn Trong tương lai gần, các phương pháp này được kỳ vọng sẽ tạo ra một cuộc cách mạng mới trong lĩnh vực điều trị ung thư [32].
Ung thư biểu mô tế bào vảy vùng đầu và cổ
Ung thư biểu mô tế bào vảy vùng đầu và cổ (Head and neck squamous cell carcinoma-HNSCC) phát triển từ biểu mô niêm mạc trong khoang miệng, hầu họng và thanh quản và là những khối u ác tính phổ biến nhất phát sinh ở đầu và cổ Gánh nặng của HNSCC khác nhau giữa các quốc gia/khu vực và nhìn chung có liên quan đến việc tiếp xúc với các chất gây ung thư có nguồn gốc từ thuốc lá và tiêu thụ quá nhiều đồ uống có cồn [27]
HNSCC là bệnh ung thư phổ biến thứ sáu trên toàn thế giới, với 890.000 ca mắc mới và 450.000 ca tử vong trong năm 2018 [11] Tỷ lệ mắc HNSCC tiếp tục tăng và được dự đoán sẽ tăng 30% (tức là 1,08 triệu trường hợp mới hàng năm) vào năm 2030
[11] Tỷ lệ mắc HNSCC cao ở các khu vực như Đông Nam Á và Úc có liên quan đến việc tiêu thụ các sản phẩm có chứa chất gây ung thư, trong khi tỷ lệ nhiễm virus papilloma ở người (Human papilloma viruss-HPV) ngày càng tăng dẫn tới việc tăng tỷ lệ mắc HNSCC ở Mỹ và Tây Âu [21, 26, 38] Nhìn chung, nam giới có nguy cơ mắc HNSCC cao gấp hai đến bốn lần so với nữ giới Bên cạnh đó, độ tuổi trung bình được chẩn đoán đối với HNSCC không liên quan đến virus là 66 tuổi [58]
Hình 1.1 Tỷ lệ mắc bệnh HNSCC trên toàn thế giới [27]
Các nghiên cứu dịch tễ học đã chỉ ra rằng nhiều yếu tố nguy cơ khác nhau gây nên bệnh HNSCC Cơ quan Nghiên cứu Ung thư Quốc tế (IARC) của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) phân loại những yếu tố nguy cơ này bao gồm: sử dụng thuốc lá, uống rượu, tiếp xúc với các chất ô nhiễm môi trường và nhiễm các tác nhân như HPV hoặc EBV Mức độ phổ biến khác nhau của bệnh HNSCC liên quan đến khía cạnh địa lý, văn hóa và thói quen Cụ thể hơn khi xét về yếu tố địa lý, nơi tiêu thụ thuốc lá và rượu cao là những nơi có nguy cơ cao dễ mắc bệnh liên quan đến HNSCC [27] Đáng lưu ý rằng những người sử dụng nhiều cả thuốc lá và rượu có nguy cơ phát triển bệnh HNSCC cao hơn gấp 35 lần những người không sử dụng [4] Trong một số nước Châu Á-Thái Bình Dương, có thể kể đến như Ấn Độ và Trung Quốc, ung thư ở vùng khoang miệng có liên quan đến việc “phong tục” nhai trầu (bao gồm sử dụng các thành phẩm từ hạt cau, lá trầu, vôi tôi) [62] Ảnh hưởng của thuốc lá điện tử đối với nguy cơ mắc bệnh HNSCC vẫn còn chưa được hiểu rõ, tuy nhiên điều đó sẽ được làm sáng tỏ trong những năm tiếp theo Tiếp xúc với các chất ô nhiễm gây ung thư trong không khí bao gồm các hóa chất vô cơ, hữu cơ và hạt bụi cũng là một yếu tố nguy cơ mắc bệnh HNSCC, đặc biệt là ở những khu vực đang phát triển có tình trạng ô nhiễm không khí ngày càng trầm trọng Một số yếu tố nguy cơ khác có thể nhắc đến bao gồm như lão hóa, vệ sinh răng miệng kém và chế độ ăn thiếu rau [13, 18] Về tác nhân truyền nhiễm, bệnh truyền nhiễm với
HPV và EBV (Epstein-Barr Virus) là các yếu tố nguy cơ căn nguyên đã được biết đến đối với HNSCC phát sinh từ vùng hầu họng và vòm họng [22, 53]
Ngoài ra, yếu tố di truyền cũng góp phần gây ra nguy cơ mắc bệnh HNSCC Những người mắc bệnh thiếu máu Fanconi, một bệnh di truyền hiếm gặp, khả năng sửa chữa ADN bị suy giảm (do đột biến ở bất kỳ gen nào trong số 22 gen FANC), có nguy cơ phát triển HNSCC cao gấp tới 500-700 lần [55].
Vi môi trường khối u trong HNSCC
Vi môi trường khối u (Tumour microenvironment-TME) trong HNSCC là sự kết hợp phức tạp và không đồng nhất của tế bào khối u và tế bào cơ địa, bao gồm các tế bào nội mô, nguyên bào sợi liên quan đến ung thư (Cancerassociated fibroblasts-CAFs) và tế bào miễn dịch [30] Các tế bào khối u và CAFs tạo ra các yếu tố tăng trưởng, ví dụ như VEGF, thu nhận các tế bào nội mô, kích thích cho quá trình tạo mạch máu mới và cung cấp oxy và chất dinh dưỡng cho khối u Đổi lại, tế bào nội mô tiết ra các yếu tố hỗ trợ sự tồn tại và làm mới của tế bào gốc ung thư CAFs đóng vai trò quan trọng trong sự tiến triển HNSCC CAFs tiết ra một loạt các yếu tố tăng trưởng (như EGF, VEGF và HGF), cytokin (như IL-6) và chemokin thúc đẩy tăng trưởng tế bào khối u, hình thành mạch máu và thu thập các tế bào ức chế miễn dịch [6, 41] Vi môi trường mô khối u đầu và cổ là nơi có hoạt động miễn dịch mạnh mẽ, thúc đẩy sự phát triển trong liệu pháp miễn dịch đang được áp dụng cho HNSCC [27]
Năm 2021, nhóm nghiên cứu của Lin và cộng sự đã có nghiên cứu về vai trò của Indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO) trong ung thư biểu mô tế bào vảy vùng đầu và cổ [36] Những bằng chứng thống kê hiện tại cho thấy một giả thuyết rằng IDO là một phần không thể thiếu đối với khả năng miễn dịch TME trên HNSCC trong trường hợp dương tính HPV Dựa trên các mô hình mô phỏng các nghiên cứu về dòng tế bào cho thấy rằng sự biểu hiện khác biệt của IDO và đáp ứng được dự đoán với liệu pháp miễn dịch, trong đó sự khác biệt về IDO như một dấu ấn sinh học (biomarker) có thể liên quan đến giai đoạn bệnh, vị trí khối u, loại mô hoặc sự khác biệt về gen giữa các bệnh nhân [36] Chính vì vậy, một trong những phương pháp mới có thể tác động đến HNSCC là thông qua ức chế con đường chuyển hóa bởi IDO.
TỔNG QUAN VỀ INDOLEAMIN 2,3-DIOXYGENASE 1
Giới thiệu về Indoleamine 2,3-dioxygenase 1
Indoleamine 2,3-dioxygenase 1 (IDO1) là enzym chứa nhân hem có liên quan nhiều đến quá trình miễn dịch, xúc tác cho phản ứng đầu tiên giới hạn tốc độ quá trình chuyển hóa Tryptophan (Trp) trong con đường Kynurenin (KP) IDO1 xúc tác cho quá trình chuyển hóa acid amin thiết yếu trong cơ thể Trp thành sản phẩm N- formylkynurenin theo cơ chế một phân tử O2 tấn công vào nối đôi ở vị trí 2,3 của vòng indol Các bước tiếp theo là một chuỗi các phản ứng xúc tác bởi các enzym khác nhau tạo ra các chất chuyển hóa có hoạt tính liên quan đến đáp ứng miễn dịch như 3- hydroxykynurenin, acid anthranilic, acid kynurenic, acid 3-hydroxyanthranilic, acid quinolinic và acid picolinic ( Hình 1.2 ) Sản phẩm cuối cùng được tạo thành là NAD+ và ATP – hai nhân tố quan trọng cung cấp nguyên liệu cho quá trình trao đổi chất của tế bào [25]
Hình 1.2 Con đường chuyển hóa Tryptophan [25]
Trong cơ thể người, quá trình chuyển hóa Trp với phản ứng mở vòng nhân indol bắt đầu với 3 enzym: IDO1, IDO2 và Tryptophan-2,3-dioxygenase (TDO) IDO2 và TDO cho thấy mức độ biểu hiện thấp hơn nhiều so với IDO1, điều này hạn chế đáng kể hoạt động của 2 enzym trên TDO chỉ được biểu hiện ở gan, chịu trách nhiệm cho chức năng chuyển hóa và kiểm soát nồng độ Trp trong máu IDO1 có biểu hiện chủ yếu cảm ứng ở hầu hết các mô, đóng vai trò chính trong điều hòa miễn dịch và kiểm soát ngược các đáp ứng miễn dịch IDO1 làm giảm Trp một cách đáng kể trong vi môi trường, do đó làm suy yếu các phản ứng miễn dịch qua trung gian tế bào T IDO1 biểu hiện ở các khối u ở người và đang đóng một vai trò nhất định trong khả năng kháng miễn dịch của khối u, điều này đã thúc đẩy những nỗ lực nghiên cứu và phát triển thuốc nhằm tìm ra các chất ức chế IDO1 trong điều trị ung thư [25, 54].
Cấu trúc IDO1
IDO1 là enzym chứa nhân hem bao gồm 403 acid amin, chia thành 2 vùng riêng biệt bao gồm vùng lớn và vùng nhỏ ( Hình 1.3 ) Vùng lớn là vùng xoắn bao gồm 13 chuỗi xoắn α và 2 chuỗi xoắn 310 Bốn chuỗi xoắn dài trong vùng lớn gồm G, I, Q, S được xếp song song với nhân hem và có tương tác kỵ nước với xoắn kế bên “Pocket” gắn nhân hem được tạo bởi bốn chuỗi xoắn trên và các chuỗi khác như K-L, N Chuỗi phụ của xoắn K-L và N cũng có góp phần vào tương tác hem-protein và liên kết hai vùng lớn và nhỏ Vùng nhỏ của enzym được hình thành bởi 6 chuỗi xoắn α, 2 mảng ngắn β và 3 chuỗi xoắn 310 Vùng nhỏ và chuỗi lặp dài (acid amin 250-267) kết nối hai vùng và bao trùm phần trên của “pocket” hem Các vùng tương tác được hình thành bởi sự kết hợp các liên kết kỵ nước, liên kết cầu muối, hoặc liên kết hydro trung gian của chuỗi phụ các acid amin [52]
Hình 1.3 Cấu trúc IDO1 và vị trí các "Pocket" [46]
Nhóm nghiên cứu của Röhrig và cộng sự đã chỉ ra rằng vùng trung tâm hoạt động xung quanh nhân hem được xác định bao gồm 4 “pocket” “Pocket” A là một “pocket” thân dầu ở phía trên so với nhân hem, với Ser167 đóng vai trò là một thành phần liên kết hydro [46] Kích thước và khả năng liên kết của nó phụ thuộc vào hình dạng của acid amin 261-265 “Pocket” A là “pocket” quan trọng, rất cần thiết cho liên kết với các chất ức chế “Pocket” B nằm ở vị trí lối vào vùng trung tâm hoạt động và chỉ có khả năng liên kết khi vòng lặp JK (acid amin 360-380) ở trạng thái mở Các đột biến của Phe226, Phe227, Arg231 đã làm giảm đáng kể hoạt động của enzym, từ đó ủng hộ giả thuyết các phần dư này của “pocket” B ảnh hưởng trực tiếp tới sự nhận biết cơ chất thông qua tương tác π-π và tương tác kỵ nước “Pocket” C bao gồm khu vực bề mặt ở lối vào của trung tâm hoạt động, trong đó có cả vòng lặp JK trạng thái đóng và đã được cho rằng có tương tác với một số chất ức chế dựa trên mô phỏng docking [16] Tuy nhiên, trong một nghiên cứu của Serafini và cộng sự về cấu trúc không gian của “pocket”
C, hay còn được gọi là “Sa*site”, có rất ít tương tác của Lys238 với các phối tử ngoại trừ trường hợp tương tác yếu của linrodostat và cơ chất L-Trp sau quá trình quang phân [49, 50] “Pocket” D là một vùng trung tâm nhỏ ở vị trí phía gần của nhân hem được kích hoạt sang trạng thái mở bởi sự thay đổi của Phe270 Có hai loại cấu trúc IDO1 đã được phân tích, đó là holo-IDO1 và apo-IDO1 Trong holo-IDO1, “pocket” D được phân lập ra khỏi các trung tâm hoạt động bởi nhân hem và hoạt động như một vị trí trung tâm liên kết thứ cấp cho các phối tử có cấu trúc nhỏ Đối với apo-IDO1, “pocket” D được kết nối với các “pocket” khác do sự vắng mặt nhân hem “Pocket” này còn là một vị trí liên kết với chất ức chế và được gọi là “Si*site” Röhrig đã xác định thêm “pocket gắn nhân hem” ( Hình 1.3 ), chuỗi phụ của các acid amin His346, Val170, Phe214 và Ile217 Các chuỗi này tương tác với cofactor nhân hem trong holo-IDO1 và với phân nửa trung tâm phối tử trong apo-IDO1 Tất cả các đặc điểm trên đã cung cấp cơ sở cho thiết kế cho các chất ức chế IDO1 [46, 52].
Mối liên quan giữa IDO1 và HNSCC
IDO1 không được biểu hiện ở hầu hết các mô ở người trưởng thành trong điều kiện sinh lý nhưng được biểu hiện ở nhiều loại tế bào ung thư trong vi môi trường khối u (TME), bao gồm tế bào đuôi gai (DC), tế bào nội mô, tế bào ức chế dòng tủy Hầu hết các loại ung thư đều có nồng độ biểu hiện IDO1 cao, tương ứng với khả năng sống sót, tiên lượng thấp Bên cạnh vai trò trong ức chế miễn dịch, IDO1 còn góp phần vào quá trình phát triển ung thư bằng cách thúc đẩy quá trình viêm các mạch máu mới phát triển, tương tác với các chất ức chế và điều chỉnh hệ sinh vật đường ruột [37, 51]
IDO1 đóng vai trò quan trọng trong khả năng miễn dịch của TME thông qua chuyển hóa Trp Khả năng của IDO1 tăng lên trong TME của nhiều bệnh ung thư và biểu hiện của nó được xem như là một chỉ số tiên lượng tiêu cực trong khối u ác tính
Do vai trò quan trọng của IDO trong khả năng miễn dịch TME khiến IDO trở thành một
“trạm” kiểm tra miễn dịch có thể khai thác để cải thiện hiệu quả điều trị [36]
1.2.3.1 Vai trò của IDO trên HNSCC
Trong những năm vừa qua, một số các nhà khoa học trên thế giới đã thực hiện các nghiên cứu về IDO trong các dòng tế bào HNSCC [36] Năm 2015, nhóm nghiêm cứu của Liang và cộng sự đã chỉ ra rằng biểu hiện IDO có tác động đáng kể lên các dòng tế bào ung thư biểu mô vảy khoang miệng như HSC-3, SCC-4 [35] Bates và cộng sự đã dự đoán được nồng độ IDO trên dòng tế bào SCC-4 lên đến 17,29% cao hơn so với SCC-15 và SCC-25 Đến năm 2018, nghiên cứu đã chỉ ra rằng dòng tế bào SCC-15 (là dòng tế bào duy nhất có nguồn gốc từ giai đoạn T4 của HNSCC) tạo ra nhiều IDO hơn đáng kể so với bất kỳ tế bào nào trong 6 dòng tế bào ung thư biểu mô vảy khoang miệng khác (SCC4, SCC25, UM-SCC19, UM-SCC 84, UM-SCC 92 và UM-SCC 99) [2, 3] Nghiên cứu cũng chỉ ra hoạt động của IDO có thể gây cản trở quá trình chuyển hóa của khối u [2, 3]
Năm 2020, Riess và cộng sự nghiên cứu phân tích toàn diện về trạng thái biểu hiện của gen thuộc con đường chuyển hóa kynurenin (KP) HNSCC được chọn lấy làm đối tượng nghiên cứu điển hình cho các cơ chế trốn thoát miễn dịch tự phát Kết quả cho thấy IDO1 có biểu hiện không đồng nhất giữa các dòng tế bào HNSCC khác nhau Riess đã dùng chất ức chế kinase phụ thuộc cyclin, Dinaciclib được sử dụng để ngăn chặn hoạt động của IDO, làm giảm quá trình chuyển hóa Trp thông qua con đường kynurenin trong các dòng tế bào HNSCC Mặc dù biểu hiện IDO1 thấp nhưng có thể tác động đến khi điều trị bằng IFNγ đối với các tế bào HNSCC [44]
Al-Samadi và cộng sự cho thấy việc sử dụng các chất ức chế IDO1 trong thử nghiệm in vitro chip 3D vi lỏng (3D microfluidic chip) với tế bào HSC-3 gây ra sự dịch chuyển tế bào miễn dịch đến các tế bào gây ung thư Do đó, việc thay đổi vi môi trường khối u TME từ “lạnh” (dạng bất hoạt) thành “nóng” (dạng hoạt động) có thể nâng cao hiệu quả của các thuốc trị liệu miễn dịch khác khi kết hợp với các chất ức chế IDO1 [1]
Như vậy có thể nhận thấy được một phần về vai trò của IDO1 trong khả năng tác động lên các dòng tế bào ung thư HNSCC
1.2.3.2 Nghiên cứu hóa mô miễn dịch về IDO trên HNSCC
Hóa mô miễn dịch (Immunohistochemistry-IHC), việc sử dụng kháng thể đơn dòng và đa dòng để phát hiện các kháng nguyên cụ thể trong các mô, là một công cụ mạnh mẽ trong chẩn đoán bệnh học IHC là một ứng dụng quan trọng của kháng thể đơn dòng và đa dòng để xác định sự phân bố mô kháng nguyên liên quan đến sức khỏe và bệnh tật IHC được sử dụng rộng rãi để chẩn đoán các bệnh ung thư bởi vì các kháng nguyên khối u cụ thể được biểu hiện mới hoặc điều chỉnh trong một số bệnh ung thư IHC đóng một vai trò quan trọng trong bệnh lý, đặc biệt là trong các chuyên khoa về bệnh lý ung thư [9]
Phần lớn các nghiên cứu về IHC khối u được thực hiện trên các khối mô cố định bằng formalin và paraffin Các nghiên cứu trong nhóm này được thiết kế theo phương pháp phân tích hồi cứu, không sử dụng các phương pháp thu thập mô mới hoặc phân tích hoạt động của IDO trong mô Các nghiên cứu về mô được lấy từ môi dưới, khoang miệng, lưới, amidan và thanh quản Dòng kháng thể đơn dòng IDO 10.1 được sử dụng rộng rãi nhất Vết nhuộm màu của IDO thường được quan sát thấy ở mặt trước xâm lấn của khối u và có sự tương quan với khả năng sống sót kém của bệnh nhân [33, 48, 61]
Trong một nghiên cứu dự đoán khả năng sống sót của Wang và cộng sự, sự gia tăng biểu hiện IDO đã được thấy ở những người không đáp ứng lâm sàng với liệu pháp Nimotuzumab (thụ thể chống yếu tố tăng trưởng biểu bì), cho thấy IDO có thể là một dấu ấn sinh học về tình trạng miễn dịch trong TME trong quá trình điều trị ở bệnh nhân ung thư tế bào vảy [56]
1.2.3.3 Thử nghiệm lâm sàng các chất ức chế IDO trên HNSCC
Các thử nghiệm lâm sàng với kết quả đã được công bố về IDO ở HNSCC đều ở giai đoạn đầu (pha I và II) và đánh giá các chất ức chế IDO1 kết hợp với chất ức chế PD-1/PD-L1 [15, 19, 20, 40] Tất cả các bệnh nhân HNSCC tham gia vào các thử nghiệm đã công bố đều mắc bệnh di căn hoặc tái phát tiến triển Các thử nghiệm cho thấy kết quả đáp ứng khách quan (34-55%) và tỷ lệ kiểm soát bệnh (62-70%) đối với Epacadostat (chất ức chế IDO1) kết hợp với các chất ức chế PD-1 [15, 19] Hồ sơ an toàn về liệu pháp kết hợp của các chất IDO1 và PD-1 phù hợp với các báo cáo trước đó của mỗi chất ức chế điểm trạm kiểm tra dưới dạng trị liệu đơn Tác dụng phụ liên quan đến điều trị phổ biến nhất với trạm kiểm tra miễn dịch là mệt mỏi (22-33%) [20, 28]
Các thử nghiệm lâm sàng đã cho thấy việc sử dụng các chất ức chế IDO1 kết hợp với các phương pháp điều trị khác làm tăng hiệu quả điều trị bệnh HNSCC
1.2.3.4 Nghiên cứu phiên mã gen IDO trên HNSCC
IDO được biểu hiện mạnh mẽ ở các HNSCC dương tính với HPV ở người và tương quan với biểu hiện kháng nguyên HPV E7 [29] IDO1 được biểu hiện quá mức trong các khối u ở những người mắc bệnh HNSCC Các bằng chứng gen cho thấy IDO1 cùng PD-L1 biểu hiện quá mức trên HNSCC so với IDO1 ở mô đầu và cổ bình thường [12, 34, 59] Nồng độ IDO đo được trong quá trình điều trị tăng đáng kể, gấp 3,6 lần biểu hiện ở tế bào máu đơn nhân ngoại vi (PBMC) trong quá trình xạ trị cho bệnh nhân mắc HNSCC giai đoạn III-IV [47] Khi điều trị bằng hóa trị, nồng độ mRNA IDO1 tương quan với khả năng sống sót kém và sự giảm biểu hiện kết hợp giữa IDO1 và PD- L1 sau điều trị có liên quan đến khả năng sống sót tốt hơn [10]
Các nghiên cứu trên đã đưa ra một mối tương quan giữa nồng độ biểu hiện IDO1 trên các bệnh nhân đã mắc bệnh HNSCC, từ đó, việc nghiên cứu sâu về sự ức chế IDO1 trên HNSCC là một hướng đi mới có thể mang đến hiệu quả điều trị Phát triển chất ức chế IDO1 hứa hẹn mở ra một cơ hội mới cho hướng điều trị bệnh HNSCC.
CÁC CHẤT ỨC CHẾ IDO1
Cấu trúc các chất ức chế IDO1
Năm 2010, Röhrig và cộng sự đã có nghiên cứu in silico của các chất ức chế IDO1 đưa ra mô hình cấu trúc lý tưởng của chất IDO1 cần có [45] Họ đã dựa trên quan sát hình học và docking phối tử và đưa ra kết luận rằng các chất ức chế cần có những đặc điểm như sau trong cấu trúc:
1 Một hệ thống vòng thơm, ít nhất 2 vòng để liên kết vào “pocket” A
2 Một nguyên tử có cặp điện tử electron tự do có thể liên kết với sắt trong nhân hem, ví dụ như oxy, nitơ hoặc lưu huỳnh
3 Một nhóm có thể hình thành tương tác Van der Waals với “pocket” B
4 Các nhóm có thể hình thành liên kết hydro với Ser167, Gly262, Ala264 và Arg231 (có thể là nhóm mang điện tích âm hình thành cầu muối) hoặc với 7- propionat của nhân hem (có thể là nhóm mang điện tích dương hình thành cầu muối) [45]
Hình 1.4 Minh họa cấu trúc pharmacophore từ mô phỏng docking [45]
Hầu hết tất cả có chất ức chế IDO đều có đặc điểm đầu tiên Các chất ức chế IDO là dẫn chất của Trp như dẫn chất (6) không có đặc điểm số 2 ở trên Đặc điểm 3 và 4 thường được quan sát thấy hơn ở phối tử cồng kềnh hơn như dẫn chất (15), (16), (17) ( Hình 1.5 ) [45] Một số dẫn chất như (18) có khung cấu trúc như Linrodostat xuất hiện tương tác với “pocket” D.
Hình 1.5 Cấu trúc 1 số chất ức chế IDO1 có tương tác với các “pocket” (“pocket” A: xanh lam, “pocket” B: cam, “pocket” C: vàng, “pocket” D: xanh tím) [46]
Chất ức chế IDO1 mang khung indazol
Indazol được định nghĩa lần đầu tiên bởi Emil Fisher là “vòng pyrazol ngưng tụ với vòng benzen” Bên cạnh đó, indazol, là một đẳng cấu sinh học của nhân vòng indol trong Trp, được sử dụng làm khung cấu trúc cho thiết kế các chất ức chế IDO1 Sự đa dạng của cấu trúc, trong đó 2 nguyên tử nitơ hỗ biễn và hình thành nên 2 dạng đồng phân, trong đó đồng phân 1H-indazol thường chiếm ưu thế hơn đồng phân còn lại do bền hơn về mặt nhiệt động học Từ đó cho thấy rằng các dẫn chất 1H-indazol sẽ chiếm tỷ lệ cao hơn trong các phản ứng tổng hợp hóa học [14, 63]
Hình 1.6 Các đồng phân của vòng indazol
Indazol là một hệ dị vòng có ý nghĩa quan trọng trong ngành công nhiệp dược phẩm Các tính chất sinh học của các dẫn chất indazol có ứng dụng rộng trong thiết kế thuốc mới [14] Các dẫn chất mang khung indazol có thể ứng dụng làm thuốc điều trị nhiều bệnh khác nhau như nhiễm khuẩn, rối loạn thoái hóa thần kinh và đặc biệt là ung thư Hầu hết chúng là chất ức chế thụ thể tyrosin kinase hoặc serin/threonin kinase (aurora kinase, cyclin-dependent kinase) [8]
1.3.2.2 Chất ức chế IDO1 mang khung indazol
Năm 2016, Wang và cộng sự đã tổng hợp các dãy các chất mang khung 1H- indazol có nhóm thế ở vị trí 4 và 6 có tiềm năng ức chế IDO1 Thí nghiệm của Wang đã đưa ra kết quả rằng dẫn chất TQ1 cú khả năng ức chế IDO1 tốt nhất với giỏ trị 5,3 àM Nghiên cứu docking phân tử của TQ1 đã chỉ ra 2 vị trí nguyên tử nitơ trong nhân 1H- indazol có tương tác với sắt của nhân hem Nhóm thế halogen ở vị trí số 6 làm tăng tương tác kỵ nước với Tyr126, Phe164, Leu234 và Phe163 của “pocket” A Nghiên cứu về mối liên quan cấu trúc-tác dụng cho thấy sự có mặt của halogen ở vị trí số 6 đóng vai trò quan trọng trong tương tác với trung tâm hoạt động Kết quả nghiên cứu của Wang và cộng sự đã khẳng định khung cấu trúc 1H-indazol là một khung cấu trúc tiềm năng ức chế IDO1 trong nghiên cứu phát triển sau này [43]
Tiếp tục với kết quả của Wang, năm 2019, Yang và cộng sự đã tiếp tục lựa chọn chất TQ1 để tối ưu và phát triển ra một dãy dẫn chất thế ở vị trí 4 và 6 trên nhân 1H- indazol Các chất này sau đó được thử hoạt tính ức chế không chỉ trên IDO1 mà còn hướng tới đích TDO Kết quả chỉ ra rằng, trong số 38 chất được nghiên cứu, dẫn chất
TQ2 cú khả năng ức chế kộp IDO1 và TDO, với giỏ trị IC50 lần lượt là 0,74 àM và 2,93 àM Hơn nữa, TQ2 cũn thể hiện hoạt tớnh khỏng ung thư in vivo và trong mụ hỡnh ghộp xenograft CT26 [60]
Năm 2021, Yu và cộng sự đã nghiên cứu các dãy dẫn chất mang khung 1H- indazol thế ở vị trí số 3 và 6 với các nhóm thế thân dầu Kết quả cho thấy dẫn chất TQ3 cú giỏ trị IC50 trờn tế bào 4T1, HepG2, và MCF-7 lần lượt là 0,23 àM, 0,80 àM và 0,34 àM Bờn cạnh đú, nghiờn cứu cũng chỉ ra khi khụng cú nhúm thế hoặc nhúm thế quỏ cồng kềnh trên vòng piperazin sẽ làm giảm khả năng ức chế tế bào ung thư [57]
Hình 1.7 Cấu trúc TQ1, TQ2, TQ3
Năm 2020, nhóm nghiên cứu của PGS TS Trần Phương Thảo đã tổng hợp được một dãy các dẫn chất mang khung 6-amino-1H-indazol và thử nghiệm trên các dòng tế bào ung thư Trong nghiên cứu, có dẫn chất TQ4 có khả năng ức chế IDO1 tốt, không những thế mà còn có khả năng kháng tế bào HTC116 (dòng tế bào mà IDO1 đã được chứng minh cú biểu hiện cao) với giỏ trị IC50 = 0,4 ± 0,3 àM [23] Kết quả nghiờn cứu chỉ ra sự có mặt của nhóm methyl ở vị trí C3 trên vòng indazol có thể làm tăng khả năng kháng dòng tế bào ung thư đại trực tràng HCT116 so với các chất không có nhóm thể ở vị trí đó Bên cạnh đó, khi chuyển nhóm methyl từ N1 sang N2 thì làm giảm khả năng ức chế tế bào của hầu hết các dẫn chất
Trong số 16 dẫn chất được nhóm nghiên cứu của PGS TS Trần Phương Thảo báo cáo, cấu trúc của TQ4 cho kết quả ức chế IDO1 tốt nhất được giải thích dựa trên mô phỏng docking phân tử Cụ thể: TQ4 có nhóm methyl ở vị trí C3 có tương tác với Ser263, vị trí N2 không nhóm thế hình thành liên kết hydro với Ser167 và vòng flurophenyl tạo tương tác π-π với Phe226 Bên cạnh đó, TQ4 còn nhiều tương tác với các acid amin khác tại trung tâm hoạt động của IDO1 như Tyr126, Phe163, Phe164, Phe227, Arg231 và His346 [23]
Tiếp tục hướng nghiên cứu trên, dựa vào cấu trúc của dẫn chất TQ4 và mối liên quan giữa IDO1 và HNSCC, nhóm đã tiếp tục tiến hành tổng hợp và đánh giá tác dụng kháng tế bào ung thư biểu mô hạ họng các dẫn chất mang khung 1,3-dimethyl-6-amino-1H-indazol
NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ
Hóa chất
Các dung môi, hóa chất dùng trong tổng hợp và tinh chế các chất mục tiêu trong nghiên cứu chủ yếu có nguồn gốc xuất xứ từ Trung Quốc, Merck (Đức), AKSci (Mỹ), Việt Nam Các hóa chất này được sử dụng trực tiếp không qua tinh chế và được trình bày trong bảng dưới đây:
Bảng 2.1 Các nguyên liệu sử dụng trong tổng hợp hóa dược
TT Tên nguyên liệu Nguồn gốc – Xuất xứ
1 3-Methyl-6-nitro-1H-indazol Trung Quốc
7 Na2SO4 Khan Trung Quốc
18 Ethyl acetat (EA) Trung Quốc
20 Bản mỏng silica gel 60 F254 Merck - Đức
Thiết bị, dụng cụ
- Dụng cụ thủy tinh: bình cầu đáy tròn một cổ dung tích 50 ml, bình cầu đáy tròn một cổ dung tích 100 ml, sinh hàn, micropipet, cốc thủy tinh, bình chiết dung tích 125 ml, bình nón dung tích 100 ml, phễu lọc, ống đong, pipet Pasteur
- Máy khuấy từ gia nhiệt IKA-RTC (Đức)
- Cân kỹ thuật điện tử Shimadzu (Nhật Bản)
- Bơm hút chân không DIVAC.1.21 (Mỹ)
- Máy cất quay Buchi R-210 (Thụy Sĩ)
- Đèn tử ngoại với hai bước sóng 254 nm và 365 nm
- Sắc ký lớp mỏng (TLC): được tiến hành trên bản mỏng silica gel 60 F254 (Merck)
- Bình triển khai sắc ký
- Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân Bruker Avance 500 MHz hãng Bruker BioSpin (Thụy Sĩ) tại khoa Hóa – Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội
- Máy đo nhiệt độ nóng chảy nhiệt điện Electrothermal digital tại Bộ môn Hóa Dược – Trường Đại học Dược Hà Nội
- Máy đo phổ khối lượng Agilent 6530 Accurate-Mass QTOF LC/MS (United States) – Viện Hóa Sinh Biển – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
- Máy đo phổ hồng ngoại FTIR Affinity – IS – Shimadzu (Nhật Bản) tại Khoa Hóa Học – Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội.
NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
Tổng hợp hóa học
- Tổng hợp 4 dẫn chất thơm mang khung 1,3-dimethyl-6-amino-1H-indazol + 2-(((1,3-Dimethyl-1H-indazol-6-yl)amino)methyl)-5-methoxyphenol (IVa) + 5-(((1,3-Dimethyl-1H-indazol-6-yl)amino)methyl)-2-methoxyphenol (IVb) + 1,3-Dimethyl-N-(2,3,4-trimethoxybenzyl)-1H-indazol-6-amin (IVc)
+ 1,3-Dimethyl-N-(3,4,5-trimethoxybenzyl)-1H-indazol-6-amin (IVd)
- Kiểm tra độ tinh khiết của các dẫn chất tổng hợp được.
Khẳng định cấu trúc của các chất tổng hợp được
Các dẫn chất mục tiêu sau khi được tổng hợp, tinh chế được khẳng định cấu trúc thông qua các phương pháp phổ.
Đánh giá tác dụng kháng tế bào ung thư biểu mô hạ họng (FaDu)
Các dẫn chất mục tiêu sau khi được tổng hợp, tinh chế và khẳng định cấu trúc được thử tác dụng kháng tế bào ung thư biểu mô hạ họng FaDu.
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Tổng hợp hóa học
- Dựa trên những nguyên tắc cơ bản của hóa học hữu cơ để tổng hợp các dẫn chất có cấu trúc như dự kiến Các phản ứng đã sử dụng bao gồm:
+ Phản ứng N-alkyl hóa với tác nhân alkyl hóa là một alkyl halogenid có mặt xúc tác K2CO3 trong dung môi DMF
+ Phản ứng khử hóa nhóm nitro thơm với H2 xúc tác Pd/C trong hỗn hợp dung môi MeOH
+ Phản ứng amin hóa khử giữa amin và các dẫn chất benzaldehyd với xúc tác là NaBH3CN trong môi trường acid trong dung môi MeOH
- Các phản ứng được theo dõi bằng sắc ký lớp mỏng, pha tĩnh là bản mỏng silica gel 60 F254, quan sát bản mỏng dưới đèn tử ngoại bước sóng 254 nm
- Hỗn hợp sau phản ứng được tinh chế bằng các kỹ thuật phù hợp với từng giai đoạn, bao gồm các kỹ thuật chiết phân bố lỏng - lỏng và sắc ký cột
2.3.1.2 Kiểm tra độ tinh khiết
Các chất sau khi tinh chế được kiểm tra độ tinh khiết bằng hai phương pháp:
+ Pha tĩnh: bản mỏng silica gel 60 F254 được hoạt hóa ở 110 o C trong 30 phút + Pha động: hệ dung môi EA:n-hexan tỷ lệ 1:1 và 1:2, DCM:MeOH = 15:1 + Quan sát bản mỏng dưới đèn tử ngoại bước sóng 254 nm
- Nhiệt độ nóng chảy: xác định bằng máy đo nhiệt độ nóng chảy MPA (Mỹ).
Khẳng định cấu trúc
Các dẫn chất sau khi được tổng hợp, tinh chế và đánh giá là tinh khiết được khẳng định cấu trúc bằng các phương pháp phổ hiện đại, bao gồm: phổ hồng ngoại (IR), phổ khối phân giải cao (HR-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton và carbon ( 1 H-NMR và 13 C-NMR):
Phổ hồng ngoại (IR): ghi bằng máy FTIR Affinity - 1S - Shimadzu tại Khoa Hóa học - trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội, với kỹ thuật viên nén KBr, quét phổ trong vùng 4000-400 cm -1 Mẫu sau khi sấy khô ở dạng rắn được phân tán trong KBr đã sấy khô với tỷ lệ 1:200, sử dụng áp lực cao nén hỗn hợp thành dạng film mỏng, đồng thời hút chân không để loại bỏ hơi ẩm Phổ được ghi ở độ phân giải 4 cm -1
Máy đo phổ khối lượng phân giải cao Agilent 6530 Accurate-Mass QTOF LC/MS (United States) – Viện Hóa Sinh Biển – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam hoạt động theo phương pháp ion hóa phun bụi điện tử ESI, dung môi hòa tan là MeOH hoặc MeCN Tùy theo phương thức bẫy ion ESI (+) hoặc ESI (-) mà ion trên phổ ghi nhận được là dương hay âm
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân ( 1 H-NMR và 13 C-NMR): được ghi bằng máy Bruker Avance 500 MHz tại Khoa Hóa học - trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội, phổ 1 H-NMR đo ở tần số 500 MHz, phổ 13 C-NMR đo ở tần số
125 MHz Độ dịch chuyển hóa học (δ) được biểu thị bằng đơn vị phần triệu (ppm), lấy mốc là pic của chất chuẩn nội tetramethylsilan (TMS), nhiệt độ ghi phổ khoảng 300K, dung môi CDCl3.
Đánh giá tác dụng kháng tế bào ung thư FaDu
Các dẫn chất mục tiêu sau khi được tổng hợp, tinh chế và khẳng định cấu trúc được thử hoạt tính kháng tế bào FaDu
Sử dụng phương pháp MTT, đo độ hấp thụ màu của dung dịch ở bước sóng nhất định (thường là từ 500-600nm) Từ đó suy ra số lượng tế bào ung thư sống sót
2.3.3.2 Nguyên liệu và thuốc thử
3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) và dimethylsulfoxide (DMSO) được nhập từ Sigma Aldrich (St Louis, MO, USA) DMEM, MEM, RPMI 1640, 10 % huyết thanh bào thai bò (FBS), 0,05 % trypsin acid ethylen diamin tetra acetic (EDTA) và antibiotic–antimycotic được mua từ Welgen (Daegu, Hàn Quốc)
Nuôi cấy tế bào: Các tế bào FaDu được nuôi cấy trong MEM, được bổ sung 10% FBS và 1% amoxicillin và streptomycin Các tế bào (2x10 5 tế bào/ml) được ủ qua đêm để đạt được độ thích hợp 80 % trước khi xử lý các hợp chất
Các tế bào (2x10 4 /giếng) được gieo vào đĩa 96 giếng được ủ trong 24 giờ để đạt được độ thích hợp khoảng 80 % Sau khi xử lý với các nồng độ hợp chất khác nhau trong 24 giờ, mụi trường được thay thế bằng 200 àl dung dịch MTT (0,5 mg/ml) Cỏc tế bào được ủ tiếp trong 4 giờ ở 37 o C cho đến khi xuất hiện kết tủa màu tím của tinh thể formazan Sau đú tỏch loại mụi trường, hũa tinh thể formazan vào 200 àl DMSO Độ hấp thụ của dung dịch thu được đo ở bước sóng 540 nm bằng Máy quang kế vi bản MultiskanTM FC (ThermoFisher, Waltham, MA, USA)
Giá trị IC50 của các chất được tính toán bằng phần mềm Table Curve 2.0 sau 3 lần thí nghiệm độc lập dựa trên % tế bào FaDu sống sót sau khi thử nghiệm ở các nồng độ chất khỏc nhau: 5 àM, 10 àM, 20 àM, 40 àM
THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
HÓA HỌC
Tổng hợp hóa học
Quá trình tổng hợp các chất IVa-d trong khóa luận được trình bày theo quy trình chung như sau:
Sơ đồ 3.1 Quy trình tổng hợp chung
3.1.1.1 Tổng hợp 1,3-dimethyl-6-nitro-1H-indazol (II)
Hợp chất trung gian 1,3-dimethyl-6-nitro-1H-indazol (II) được tổng hợp thông qua phản ứng N-alkyl hóa hợp chất 3-methyl-6-nitro-1H-indazol (I) với tác nhân là CH3I theo sơ đồ sau:
Sơ đồ 3.2 Quy trình tổng hợp chất II
- Hòa tan 0,708 g (4 mmol) chất I vào 20 ml DMF khan trong bình cầu đáy tròn dung tích 100 ml, sau đó thêm 1,106 g (8 mmol, 2,0 đương lượng) K2CO3
- Khuấy hỗn hợp trong bình phản ứng khoảng 30 phút ở 60℃
- Thêm 0,5 ml (8 mmol, 2,0 đương lượng) CH3I vào bình phản ứng, tiếp tục khuấy hỗn hợp ở 60℃ trong vòng 4 giờ
- Theo dõi phản ứng bằng TLC với pha động là EA:n-hexan (1:1)
- Làm nguội bình phản ứng tới nhiệt độ phòng
- Phân tán khối phản ứng vào 25 mL nước cất
- Chiết thu sản phẩm bằng dung môi EA (3 lần, mỗi lần 40 mL), gộp dịch chiết của
- Lắc dịch chiết với dung dịch NaCl bão hòa, sau đó loại nước bằng Na2SO4 khan
- Tinh chế sản phẩm bằng sắc kí cột với hệ dung môi EA:n-hexan = 1:2
- Cất quay chân không ở 70℃ loại dung môi
- Sấy khô trong tủ sấy chân không thu được 0,400 g sản phẩm II
- Cảm quan: Chất rắn màu trắng
- Rf = 0,56 (TLC, silica gel 60 F254, hệ dung môi EA:n-hexan = 1:1)
3.1.1.2 Tổng hợp 1,3-dimethyl-6-amino - 1H-indazol (III)
Tổng hợp chất trung gian 1,3-dimethyl-6-amino-1H-indazol (III) từ hợp chất II bằng phản ứng hydrogen hóa theo sơ đồ sau:
Sơ đồ 3.3 Quy trình tổng hợp chất III
- Hòa tan 0,382 g (2 mmol) chất II vào 10 ml MeOH trong bình phản ứng Sau đó thêm từ từ 50 mg 10% Pd/C Lắp bình phản ứng vào thiết bị hydrogen hóa
- Khí H2 được tạo thành trong máy sinh khí hydro và sau đó chuyển vào thiết bị hydrogen hóa
- Đuổi không khí khỏi bình phản ứng bằng cách sục khí H2 từ thiết bị hydrogen hóa vào bình phản ứng liên tục nhiều lần
- Thêm khí H2 vào bình phản ứng đến áp suất 3,5 bar Hỗn hợp được hydro hóa ở nhiệt độ phòng trong vòng 4 giờ
- Theo dõi phản ứng bằng TLC với pha động EA:n-hexan = 1:1
- Lọc khối phản ứng qua Celite, rửa bằng MeOH
- Cô quay đuổi dung môi ở 55 o C
- Sấy khô trong tủ hút chân không thu được 0,276 g sản phẩm III
- Cảm quan: Chất rắn màu nâu
- Rf = 0,37 (TLC, silica gel 60 F254, hệ dung môi EA:n-hexan = 1:1)
3.1.1.3 Tổng hợp các dẫn chất 1,3-dimethyl-6-amino-1H-indazol
Các dẫn chất 1,3-dimethyl-6-amino-1H-indazol (IVa-d) được tổng hợp bằng phản ứng amin hóa khử giữa chất III với các benzaldehyd, sử dụng tác nhân khử là NaBH3CN a) Tổng hợp chất IVa
Tổng hợp 2-(((1,3-Dimethyl-1H-indazol-6-yl)amino)methyl)-5-methoxyphenol (IVa) từ nguyên liệu III và 2-hydroxy-4-methoxybenzaldehyd theo sơ đồ sau:
Sơ đồ 3.4 Quy trình tổng hợp chất IVa
- Hòa tan 0,161 g (1 mmol) chất III và 0,152 g (1 mmol, 1,0 đương lượng) 2- hydroxy-4-methoxybenzaldehyd vào hỗn hợp dung môi gồm 0,28 mL (5 mmol, 5,0 đương lượng) AcOH và 10,0 mL MeOH trong bình cầu đáy tròn dung tích 100 mL
- Khuấy hỗn hợp trong bình ở nhiệt độ phòng trong 5 phút, sau đó thêm 0,314 g (5 mmol, 5,0 đương lượng) NaBH3CN
- Khuấy hỗn hợp ở 40 o C trong 4 giờ
- Theo dõi phản ứng bằng TLC với pha động là EA:n-hexan = 1:1
- Pha loãng khối phản ứng với 25,0 mL DCM
- Chiết với dung dịch Na2CO3 và DCM (3 lần, mỗi lần 30,0 mL), gộp pha dung môi hữu cơ của cả 3 lần chiết
- Lắc với NaCl bão hòa, sau đó làm khan bằng Na2SO4 khan
- Tinh chế sản phẩm bằng sắc kí cột với hệ dung môi EA:n-hexan (tỷ lệ 1:5 đến 1:1)
- Cất quay chân không ở 50 o C loại dung môi
- Sấy khô trong tủ sấy chân không thu được 0,207 g sản phẩm IVa
- Cảm quan: Chất rắn màu trắng
- Rf = 0,54 (TLC, silica gel 60 F254, hệ dung môi DCM:MeOH = 15:1)
- Khẳng định cấu trúc bằng phổ IR, HR-MS, 1 H-NMR, 13 C-NMR Kết quả được trình bày cụ thể ở phần phụ lục b) Tổng hợp chất IVb
Tổng hợp 5-(((1,3-Dimethyl-1H-indazol-6-yl)amino)methyl)-2-methoxyphenol (IVb) từ nguyên liệu III và 3-hydroxy-4-methoxybenzaldehyd theo sơ đồ sau:
Sơ đồ 3.5 Quy trình tổng hợp chất IVb
- Hòa tan 0,161 g (1 mmol) chất III và 0,152 g (1 mmol, 1,0 đương lượng) 3- hydroxy-4-methoxybenzaldehyd vào hỗn hợp dung môi gồm 0,28 mL (5 mmol, 5,0 đương lượng) AcOH và 10,0 mL MeOH trong bình cầu đáy tròn dung tích 100 mL
- Khuấy hỗn hợp trong bình ở nhiệt độ phòng trong 5 phút, sau đó thêm 0,314 g (5 mmol, 5,0 đương lượng) NaBH3CN
- Khuấy hỗn hợp ở 40 o C trong 4 giờ
- Theo dõi phản ứng bằng TLC với pha động là EA:n-hexan = 1:1
- Pha loãng khối phản ứng với 25,0 mL DCM
- Chiết với dung dịch Na2CO3 và DCM (3 lần, mỗi lần 30,0 mL), gộp pha dung môi hữu cơ của cả 3 lần chiết
- Lắc với NaCl bão hòa, sau đó làm khan bằng Na2SO4 khan
- Tinh chế sản phẩm bằng sắc kí cột với hệ dung môi EA:n-hexan (tỷ lệ 1:5 đến 1:1)
- Cất quay chân không ở 50 o C loại dung môi
- Sấy khô trong tủ sấy chân không thu được 0,201 g sản phẩm IVb
- Cảm quan: Chất rắn màu trắng
- Rf = 0,56 (TLC, silica gel 60 F254, hệ dung môi DCM:MeOH = 15:1)
- Khẳng định cấu trúc bằng phổ IR, HR-MS, 1 H-NMR, 13 C-NMR Kết quả được trình bày cụ thể ở phần phụ lục c) Tổng hợp chất IVc
Tổng hợp 1,3-Dimethyl-N-(2,3,4-trimethoxybenzyl)-1H-indazol-6-amin (IVc) từ nguyên liệu III và 2,3,4-trimethoxybenzaldehyd theo sơ đồ sau:
Sơ đồ 3.6 Quy trình tổng hợp chất IVc
- Hòa tan 0,161 g (1 mmol) chất III và 0,196 g (1 mmol, 1,0 đương lượng) 2,3,4- trimethoxybenzaldehyd vào hỗn hợp dung môi gồm 0,28 mL (5 mmol, 5,0 đương lượng) AcOH và 10,0 mL MeOH trong bình cầu đáy tròn dung tích 100 mL
- Khuấy hỗn hợp trong bình ở nhiệt độ phòng trong 5 phút, sau đó thêm 0,314 g (5 mmol, 5,0 đương lượng) NaBH3CN
- Khuấy hỗn hợp ở 40 o C trong 4 giờ
- Theo dõi phản ứng bằng TLC với pha động là EA:n-hexan = 1:1
- Pha loãng khối phản ứng với 25,0 mL DCM
- Chiết với dung dịch Na2CO3 và DCM (3 lần, mỗi lần 30,0 mL), gộp pha dung môi hữu cơ của cả 3 lần chiết
- Lắc với NaCl bão hòa, sau đó làm khan bằng Na2SO4 khan
- Tinh chế sản phẩm bằng sắc kí cột với hệ dung môi EA:n-hexan (tỷ lệ 1:5 đến 1:1)
- Cất quay chân không ở 50 o C loại dung môi
- Sấy khô trong tủ sấy chân không thu được 0,259 g sản phẩm IVc
- Cảm quan: Chất rắn màu trắng
- Rf = 0,61 (TLC, silica gel 60 F254, hệ dung môi DCM:MeOH = 15:1)
- Khẳng định cấu trúc bằng phổ IR, HR-MS, 1 H-NMR, 13 C-NMR Kết quả được trình bày cụ thể ở phần phụ lục d) Tổng hợp chất IVd
Tổng hợp 1,3-Dimethyl-N-(3,4,5-trimethoxybenzyl)-1H-indazol-6-amin (IVd) từ nguyên liệu III và 3,4,5-trimethoxybenzaldehyd theo sơ đồ sau:
Sơ đồ 3.7 Quy trình tổng hợp chất IVd
Tiến hành và xử lý phản ứng
- Hòa tan 0,161 g (1 mmol) chất III và 0,196 g (1 mmol, 1,0 đương lượng) 3,4,5- trimethoxybenzaldehyd vào hỗn hợp dung môi gồm 0,28 mL (5 mmol, 5,0 đương lượng) AcOH và 10,0 mL MeOH trong bình cầu đáy tròn dung tích 100 mL
- Khuấy hỗn hợp trong bình ở nhiệt độ phòng trong 5 phút, sau đó thêm 0,314 g (5 mmol, 5,0 đương lượng) NaBH3CN
- Khuấy hỗn hợp ở 40 o C trong 4 giờ
- Theo dõi phản ứng bằng TLC với pha động là EA:n-hexan = 1:1
- Pha loãng khối phản ứng với 25,0 mL DCM
- Chiết với dung dịch Na2CO3 và DCM (3 lần, mỗi lần 30,0 mL), gộp pha dung môi hữu cơ của cả 3 lần chiết
- Lắc với NaCl bão hòa, sau đó làm khan bằng Na2SO4 khan
- Tinh chế sản phẩm bằng sắc kí cột với hệ dung môi EA:n-hexan (tỷ lệ 1:5 đến 1:1)
- Cất quay chân không ở 50 o C loại dung môi
- Sấy khô trong tủ sấy chân không thu được 0,256 g sản phẩm IVd
- Cảm quan: Chất rắn màu trắng
- Rf = 0,59 (TLC, silica gel 60 F254, hệ dung môi DCM:MeOH = 15:1)
- Khẳng định cấu trúc bằng phổ IR, HR-MS, 1 H-NMR, 13 C-NMR Kết quả được trình bày cụ thể ở phần phụ lục
Hiệu suất tổng hợp và chỉ số hóa lý của các dẫn chất IVa-d được trình bày trong bảng dưới đây:
Bảng 3.1 Chỉ số hóa lý và hiệu suất tổng hợp các hợp chất IVa-d
Thử độ tinh khiết
Các chất mục tiêu sau khi được tổng hợp và tinh chế được kiểm tra độ tinh khiết bằng hai phương pháp đó là phương pháp sắc ký lớp mỏng TLC và phương pháp đo nhiệt độ nóng chảy Các kết quả về hệ số lưu giữ Rf và nhiệt độ nóng chảy (T o nc) của các chất IVa-d được trình bày ở bảng 3.2
Phương pháp sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản nhôm tráng sẵn silica gel
60 F254, hệ dung môi sử dụng trong phương pháp là EA:n-hexan tỷ lệ 1:1 và 1:2, DCM:MeOH tỷ lệ 15:1 tiến hành trong bình khai triển sắc ký và quan sát kết quả dưới ánh sáng tử ngoại có bước sóng 254 nm Kết quả TLC cho thấy các sản phẩm đều cho vết tròn, gọn, rõ và không có vết phụ
3.1.2.2 Đo nhiệt độ nóng chảy
Các dẫn chất IVa-d đều ở thể rắn, được tiến hành xác định nhiệt độ nóng chảy bằng máy đo chuyên dụng Kết quả được trình bày ở bảng 3.2, cho thấy các chất IVa- d đều có nhiệt độ nóng chảy xác định có khoảng dao động nhiệt độ hẹp từ 1-2 o C
Bảng 3.2 Giá trị R f và nhiệt độ nóng chảy (T o nc) của các dẫn chất IVa-d
Dựa trên kết quả xác định Rf và nhiệt độ nóng chảy trên có thể sơ bộ khẳng định tất cả các dẫn chất IVa-d đều tinh khiết và đủ điều kiện để thực hiện các bước khẳng định cấu trúc bằng phương pháp phổ.
Khẳng định cấu trúc
Các phương pháp phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng phân giải cao (HR-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton ( 1 H-NMR), phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13 ( 13 C-NMR) được sử dụng để khẳng định cấu trúc của các dẫn chất IVa-d đã được tổng hợp Kết quả ghi phổ và phân tích phổ được trình bày trong bảng dưới đây và phần phụ lục
Kết quả phân tích phổ hồng ngoại (IR) của các dẫn chất IVa-d được trình bày trong bảng 3.3
Bảng 3.3 Kết quả phân tích phổ IR của các dẫn chất IVa-d
Số sóng ứng với các dao động (cm -1 )
Ghi chú: là dao động hóa trị
Nhận xét: Dựa trên bảng 3.3 và phổ đồ (phụ lục 1-4) có thể sơ bộ nhận ra sự hiện diện của các nhóm chức thông qua vị trí, cường độ và hình dạng pic ví dụ như dao động của liên kết N-H amin, C=N Tuy nhiên, các dữ liệu phổ IR này chưa thể cung cấp đầy đủ cơ sở để khẳng định cấu trúc của dẫn chất IVa-d
3.1.3.2 Phổ khối lượng phân giải cao (HR-MS)
Kết quả phân tích phổ khối lượng phân giải cao (HR-MS) của các dẫn chất
IVa-d được trình bày trong bảng 3.4
Bảng 3.4 Kết quả phân tích phổ HR-MS của các dẫn chất IVa-d
R CTPT m/z [M+H] + dự kiến m/z [M+H] + IVa 2-OH-4-OCH3 C17H19N3O2 298,1550 298,1558
Nhận xét: Dựa vào kết quả phổ khối và phụ lục 5-8, có thể thấy được các dẫn chất IVa-d xuất hiện pic m/z [M+H] + đều tương ứng với giá trị m/z dự kiến của các chất
3.1.3.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton ( 1 H-NMR)
Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton ( 1 H-NMR) của các dẫn chất IVa-d được trình bày trong bảng 3.5
Bảng 3.5 Kết quả phân tích phổ 1 H-NMR của các dẫn chất IVa-d
Chất R Số liệu phân tích: 1 H-NMR (500 MHz, CDCl3, ppm): δ
IVa 2-OH-4-OCH3 7,45 (d, J = 8,5 Hz, 1H, H4); 7,10 (d, J = 8,0 Hz, 1H, H6’);
6,62 (dd, J 1 = 8,5 Hz, J 2 = 1,5 Hz, 1H, H5’); 6,60 (s, 1H, H3’); 6,49 (s, 1H, H7); 6,46 (dd, J 1 = 8,5 Hz, J 2 = 2,5 Hz, 1H, H5); 4,42 (s, 2H, NH-CH2); 3,88 (s, 3H, N-CH3); 3,79 (s, 3H, O-
IVb 3-OH-4-OCH3 7,36 (d, J = 8,5 Hz, 1H, H4); 6,98 (s, 1H, H2’); 6,88 (dd, J 1 8,5 Hz, J 2 = 2,0 Hz, 1H, H5’); 6,82 (d, J = 8,5 Hz, 1H, H6’); 6,49 (dd, J 1 = 8,5 Hz, J 2 = 2,0 Hz, 1H, H5); 6,28 (s, 1H, H7); 5,81 (brs, 1H, NH); 4,29 (s, 2H, NH-CH2); 3,88 (s, 3H, N-
Hz, 1H, H5’); 6,37 (s, 1H, H7); 4,35 (s, 2H, NH-CH2); 3,95 (s, 3H, N-CH3); 3,89 (s, 3H, O-CH3); 3,86 (s, 3H, O-CH3); 3,85 (s, 3H, O-CH3); 2,46 (s, 3H, CH3)
J 1 = 8,5 Hz, J 2 = 2,0 Hz, 1H, H5); 6,24 (s, 1H, H7); 4,25 (s, 2H, NH-CH2); 3,79 (s, 3H, N-CH3); 3,78 (s, 9H, 3(O-CH3)); 2,41 (s, 3H, CH3)
Ghi chú: δ: độ dịch chuyển hóa học (ppm); s: mũi đơn (singlet); d: mũi đôi (doublet); t: mũi ba (triplet); dd: mũi chẻ đôi 2 lần (doublet of doublet), m: mũi đa (multiplet), brs: mũi tù
Nhận xét: Dựa vào kết quả phân tích phổ ở bảng 3.5 và phổ đồ của các chất tổng hợp được (phụ lục 9-13) có thể nhận thấy số lượng proton, độ dịch chuyển hóa học, độ bội của pic và các hằng số cộng hưởng phù hợp với các proton trong công thức dự kiến của 4 chất IVa-d
3.1.3.4 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon ( 13 C-NMR)
Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon ( 13 C-NMR) của các dẫn chất IVa-d được trình bày trong bảng 3.6
Bảng 3.6 Kết quả phân tích phổ 13 C-NMR của các dẫn chất IVa-d
Chất R Số liệu phân tích: 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3, ppm): δ
142,33 (C3); 141,20 (C6); 124,64 (C6′); 123,54 (C1′); 120,94 (C4); 116,49 (C3a); 111,25 (C5); 107,29 (C5′); 88,02 (C7); 61,24 (O-CH3); 60,83 (OCH3); 56,03 (O-CH3); 43,40 (CH2); 34,81 (N-CH3); 11,79 (CH3)
137,31 (C4′); 134,67 (C1′); 121,12 (C4); 116,68 (C3a); 111,03 (C5); 104,62 (C2′, C6′); 88,03 (C7); 60,88 (OCH3); 56,18 (2(O-CH3)); 49,06 (CH2); 34,83 (N-CH3); 11,79 (CH3)
Nhận xét : Dựa vào bảng 3.6 và phổ đồ của các chất tổng hợp được (phụ lục 14- 17) có thể nhận thấy xuất hiện các pic và độ dịch chuyển hóa học phù hợp với các nguyên tử carbon trong công thức dự kiến của 4 chất IVa-d.
HOẠT TÍNH SINH HỌC
Kết quả phân tích phổ trên đã khẳng định: các dẫn chất tổng hợp được có cấu trúc đúng như dự kiến ban đầu Trên cơ sở đó, các dẫn chất này đã được sử dụng để thử tác dụng kháng tế bào FaDu
Các dẫn chất IVa-d được đánh giá tác dụng kháng tế bào Kết quả được thể hiện bằng tỷ lệ phần trăm sống sót của tế bào FaDu được trình bày ở bảng 3.7
Bảng 3.7 Kết quả khả năng ức chế tế bào FaDu của các dẫn chất IVa-d
Chất R Khả năng sống sót tế bào (%) trong 24h
FaDu tại nồng độ 20 àM
Nhận xột: ở nồng độ 20 àM, chất IVa hầu như khụng gõy độc tớnh trờn dũng tế bào FaDu, trong đó chất 3 chất còn lại IVb-d đều cho kết quả tốt, với dưới 50% số lượng tế bào còn sống sau 24 giờ Đặc biệt đối với dẫn chất IVb và IVc, khả năng sống sốt của tế bào chỉ còn 7,26% và 7,80%
Sau khi đánh giá sơ bộ khả năng ức chế FaDu, các chất IVa-d tiếp tục được đánh giá trên dòng tế bào FaDu thu được kết quả IC50 với chất chứng dương là Paclitaxel
Bảng 3.8 Kết quả thử hoạt tính kháng tế bào ung thư của các dẫn chất IVa-d
Chất R IC50 trờn dũng tế bào ung thư FaDu (àM)
Nhận xét: Kết quả cho thấy rằng IVa có hoạt tính yếu (không đáng kể), giá trị
IC50 lớn hơn 50 àM Chất IVb so với chất IVa cú cựng nhúm thế nhưng khỏc vị trớ nhúm thế lại cho kết quả tốt hơn với IC50 là 6,19 ± 0,12 àM Tương tự, chất IVc và IVd cũng có cùng nhóm thế nhưng khác vị trí cũng cho kết quả khác nhau, đặc biệt IVc cho kết quả tốt nhất với giỏ trị IC50 là 1,87 ± 0,08 àM
TỔNG HỢP HÓA HỌC
Phản ứng N-alkyl hóa
Chất II được tổng hợp qua phản ứng N-alkyl hóa với tác nhân là CH3I, chất hoạt hóa là K2CO3, trong dung môi DMF, tiến hành ở 60 o C, với cơ chế phản ứng được trình bày ở sơ đồ 4.1 Cặp electron tự do trên nguyên tử N ở vị trí số 1 của khung indazol có tính ái nhân yếu do ảnh hưởng của sự liên hợp tạo thành vòng thơm, do đó khó tham gia phản ứng thế ái nhân Tuy nhiên, do nguyên tử hydro liên kết với nguyên tử N ở vị trí số 1 trong khung indazol có tính acid yếu do đó có thể thêm K2CO3 là một base vào bình phản ứng để tách proton tạo thành dạng anion làm tăng tính ái nhân, giúp phản ứng xảy ra dễ dàng hơn
Tác nhân sử dụng là CH3I là một alkyl halogenid có cấu trúc ít cản trở không gian nên có khả năng alkyl hóa mạnh hơn các tác nhân alkyl hóa khác Bên cạnh đó, nguyên tử I có bán kính nguyên tử lớn nên liên kết C-I kém bền giúp I dễ tách hơn nên phản ứng alkyl hóa xảy ra dễ dàng hơn
Do vòng indazol có 2 dạng hỗ biến với nhau nên khi thực hiện phản ứng alkyl hóa thu được 2 đồng phân với sản phẩm chính là đồng phân N1, sản phẩm phụ là đồng phân N2 Khảo sát thực nghiệm cho thấy khi đặt phản ứng bằng dung môi là DMF sẽ cho tỉ lệ giữa đồng phân N1 và đồng phân N2 là khoảng 7:3 Tiến hành tách 2 đồng phân này bằng sắc ký cột sử dụng pha động là hệ dung môi EA:n-hexan = 1:2 thu được đồng phân N1 trước (đồng phân kém phân cực hơn) và đồng phân N2 được sử dụng tổng hợp các dẫn chất trong nghiên cứu khác
Cơ chế đề xuất cho phản ứng như sau:
Sơ đồ 4.1 Cơ chế đề xuất cho phản ứng N-alkyl hóa
Phản ứng khử nhóm nitro thơm
Phản ứng khử hóa được thực hiện với tác nhân khử hóa là H2, xác tác Pd/C 10%, dung môi MeOH và tiến hành ở điều kiện thường Sản phẩm cuối cùng thu được với hiệu suất lên đến 90%
Chất xúc tác palladi được sử dụng là kim loại quý, có thể sử dụng để khử hóa nhiều nhóm chức Do lượng Pd cần sử dụng là ít và Pd có giá thành khá cao nên thường được trộn với chất mang như than hoạt tính
Cơ chế đề xuất cho phản ứng khử như sau:
Sơ đồ 4.2 Cơ chế đề xuất cho phản ứng khử nhóm nitro thơm
Quá trình đặt phản ứng cần lưu ý kiểm tra các hệ thống chỗ nối, hệ thống ống dẫn và các van tránh rò rỉ khí H2 Đồng thời khí H2 cũng dễ gây cháy nổ khi có mặt O2, do đó cần đuổi khí trong thiết bị nhiều lần trước khi chạy phản ứng Bên cạnh đó việc đuổi các khí khác ra khỏi thiết bị còn giúp tối ưu hóa hiệu suất phản ứng Sản phẩm thu được là amin thơm rất dễ bị oxy hóa nên quá trình xử lý phản ứng cần tiến hành nhanh chóng và amin thu được cần bảo quản lạnh, tránh ánh sáng.
Phản ứng amin hóa khử
Phản ứng amin hóa khử được thực hiện với chất tham gia phản ứng là benzaldehyd Tác nhân khử hóa là NaBH3CN, là một tác nhân khử hóa yếu, chọn lọc nối đôi imin, phản ứng thực hiện trong môi trường acid yếu (pH = 4-5) bằng cách sử dụng acid acetic, làm proton hóa nguyên tử oxy của nhóm carbonyl, tạo điều kiện thuận lợi cho tác nhân ái nhân tấn công vào nguyên tử carbon của nhóm thế này Tuy nhiên nếu môi trường có pH quá thấp sẽ làm amin có xu hướng bị proton hóa từ đó làm giảm tính ái nhân của tác nhân này và giảm hiệu suất phản ứng
Phản ứng sử dụng tác nhân khử hóa là NaBH3CN vì đây là một tác nhân khử hóa yếu do chất tham gia phản ứng là benzaldehyd, việc sử dụng tác nhân khử hóa mạnh (NaBH4) có thể sẽ làm cho benzaldehyd bị khử hóa thành phenol, làm giảm hiệu suất cúa phản ứng Trong khi đó sử dụng NaBH3CN có khả năng khử hóa nhẹ, chọn lọc không ảnh hưởng đến benzaldehyd
Cơ chế đề xuất của phản ứng amin hóa khử như sau:
Sơ đồ 4.3 Cơ chế đề xuất cho phản ứng amin hóa khử
KHẲNG ĐỊNH CẤU TRÚC
Phổ hồng ngoại (IR)
Dựa vào phổ đồ có thể quan sát thấy sơ bộ sự tồn tại các nhóm chức và liên kết quan trọng của các chất đã được tổng hợp được Kết quả biện giải phổ được trình bày ở trong bảng 3.3
- Dao động hóa trị liên kết N-H amin nằm trong vùng 3423-3292 cm -1
- Dao động hóa trị liên kết C-H vòng thơm nằm trong khoảng 3003-2931 cm -1
- Dao động hóa trị của liên kết của C=N nằm trong khoảng 1640-1628 cm- 1
- Dao động hóa trị của liên kết của C=C vòng thơm trong khoảng 1599-1493 cm -1
- Dao động hóa trị liên kết C-O nằm trong khoảng 1288-1249 cm -1
Hình 4.1 Phổ IR chất IVc
Như vậy có thể thấy dữ liệu phổ IR phù hợp với công thức cấu tạo dự kiến của các chất IVa-d đã tổng hợp được Tuy nhiên dữ liệu phổ IR chưa cung cấp đầy đủ các thông tin để khẳng định cấu trúc của các chất đó nên cần thêm dữ liệu của phổ khối lượng và phổ cộng hưởng từ hạt nhân.
Phổ khối phân giải cao (HR-MS)
Trên phổ đồ của 4 dẫn chất IVa-d được tổng hơp trong bảng 3.4 đều cho thấy xuất hiện các pic ion có cường độ mạnh ứng với giá trị [M+H] + Phương pháp phân tích phổ khối phân giải cao có thể đưa ra độ chính xác cao nhất của giá trị m/z [31]
Các kết quả phổ khối phân giải cao cần phải tính toán độ lệch giữa giá trị lý thuyết và giá trị thực tế đo được Công thức được tính toán như sau: ppm độ lệch = ([M+H] + dự kiến - [M+H] + thực tế) / [M+H] + dự kiến × 10 6 Tạp chí “American Society for Mass Spectrometry” đề ra yêu cầu quy định cho mức chấp nhận giá trị độ lệch nằm trong khoảng ± 5 ppm Mặc dù sự chính xác của ± 5 ppm chỉ là quy ước về giá trị đo thực tế và lý thuyết, chưa có những quy định cụ thể nào về độ đúng và độ chính xác của thiết bị [17]
Hình 4.2 Phổ khối phân giải cao HR-MS chất IVd
Chất IVd có CTPT dự kiến là C19H23N3O3 có pic ion phân tử m/z [M+H] + dự kiến là 342,1812 Trên phổ đồ xuất hiện pic ion [M+H] + cường độ mạnh nhất là 342,1820 Như vậy sơ bộ cho thấy dẫn chất IVd có số khối đúng như số khối dự kiến
Các dẫn chất IVa-d được tính toán độ lệch giữa giá trị dự kiến và thực tế, các kết quả cho thấy giá trị đều nằm trong khoảng cho phép Kết quả giá trị ppm của dẫn chất
IVa-d lần lượt là: 2,68; 2,01; 2,33; 2,33 Các giá trị này đều nằm trong khoảng ± 5ppm, từ đó có thể sơ bộ khẳng định các chất tổng hợp được có số khối như dự kiến.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton ( 1 H-NMR)
Dựa trên phổ 1 H-NMR của 4 dẫn chất đã tổng hợp được trình bày ở phụ lục và bảng 3.5 ta có thể nhận thấy:
- Tín hiệu của các proton nhóm N-H rất yếu và khó xác định, nguyên nhân có thể do proton của nhóm này khá linh động, dễ bị trao đổi với dung môi (CDCl3)
- Tín hiệu của proton nhóm OH là pic đơn, tù, choãi và khó xác định, nguyên nhân do proton của nhóm OH rất linh động
- Các proton của vòng thơm 1H-indazol xuất hiện độ dịch chuyển trong khoảng 7,45 - 6,25 ppm
- Các proton của nhóm benzen có độ dịch chuyển trong khoảng 7,10 - 6,57 ppm
- Các proton của nhóm O-CH3 nằm trong vùng dịch chuyển từ 3,89 - 3,78 ppm thể hiện bằng pic đơn, có tích phân là 3 tương ứng với 3 nguyên tử H
Hình 4.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton chất IVa
Phổ cộng hưởng từ carbon ( 13 C-NMR)
Trên phổ đồ 13 C-NMR của các chất IVa-d (phụ lục 14-17) và bảng 3.6 ta thấy đều xuất hiện đầy đủ các pic carbon đặc trưng và độ dịch chuyển phù hợp với công thức các chất dự kiến
- Các tín hiệu của các carbon trong nhân thơm xuất hiện độ dịch chuyển nằm ở trong khoảng giá trị 160,84 - 87,86 ppm
- Đối với dẫn chất IVc-d có chứa nhóm thế methoxy, tín hiệu của nhóm O-CH3 nằm trong vùng giá trị 61,24 - 56,03 ppm
- Tín hiệu carbon của CH2 xuất hiện trong vùng 49,06 - 43,40 ppm
- Tín hiệu carbon của nhóm N-CH3 dao động trong khoảng 34,93 - 34,81 ppm
- Tín hiệu carbon của CH3 nằm trong vùng 11,81 - 11,78 ppm
Hình 4.4 Phổ cộng hưởng từ carbon chất IVd
HOẠT TÍNH SINH HỌC
Các chất tổng hợp được thử tác dụng kháng tế bào ung thư biểu mô hạ họng FaDu so sánh với chất chứng dương là Paclitaxel Kết quả cho thấy chất IVa có hoạt tính yếu với IC50 lớn hơn 50àM Trong khi đú cỏc chất IVb-d cho kết quả IC50 nhỏ hơn 50àM đặc biệt chất IVc cho hoạt tớnh khỏng tế bào tốt nhất với IC50 là 1,87 ± 0,08 àM
Từ kết quả hoạt tính cho thấy các nhóm thế khác nhau và vị trí nhóm thế khác nhau sẽ cho kết quả khả năng gây độc tế bào ung thư khác nhau Cụ thể khi so sánh hoạt tính ức chế giữa chất IVa và IVb nhận thấy khi 2 nhóm thế trên vòng benzen giống nhau khác ở vị trí của OH chuyển từ 2-OH sang 3-OH khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư FaDu tốt hơn Tương tự như vậy, chất IVc và IVd đều có 3 nhóm thế là (- OCH3) khác nhau ở vị trí nhóm thế, chuyển từ vị trí 5-OCH3 sang vị trí 2-OCH3 cho kết quả hoạt tính tốt hơn khi IVc có giá trị IC50 nhỏ hơn gấp 10 lần so với IVd Đối với chất IVa và IVd, với sự có mặt của nhóm thế OH ở vị trí ortho và (-
OCH3) ở vị trí para cho kết quả ức chế sự phát triển của tế bào FaDu kém hơn so với
IVd khi không có nhóm thế OH Xét trường hợp vị trí thế số 3 và 4 có nhóm đẩy e, 2 chất IVb và IVc đều có nhóm thế OCH3 ở vị trí số 4, trong đó chất IVc có nhóm thế (- OCH3) ở vị trí 3 so với nhóm OH cho thấy kết quả gây độc tế bào tốt hơn Tương tự như vậy, khi xét ở vị trí thế số 2 và 4, chất IVc có IC50 tốt hơn với nhóm thế (-OCH3) ở vị trí số 2 so với nhóm OH của chất IVa Như vậy, có thể kết luận rằng việc có mặt của nhóm thế đẩy e như (-OCH3) giúp cho chất có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư tốt hơn, cho thấy tầm quan trọng của nhóm thế kỵ nước khi được đặt ở vị trí 4
Trong công bố năm 2022 của nhóm nghiên cứu về các dẫn chất có khả năng ức chế sự phát triển tế bào ung thư mà IDO1 biểu hiện cao mang khung indazol, khi xuất hiện nhóm thế methyl ở cả hai vị trí N1 và C3, các dẫn chất cho kết quả ức chế kháng tế bào ung thư tốt hơn [23] Kết quả hoạt tính kháng tế bào của các dẫn chất IVa-d khẳng định thêm vai trò của khung indazol trong quá trình nghiên cứu phát triển thuốc điều trị ung thư Bên cạnh đó, khi so sánh với các dẫn chất không mang nhóm thế methyl ở cả hai vị trí N1 và C3 trong nghiên cứu của nhóm năm 2023 [24], các dẫn chất đã tổng hợp được trong khóa luận có thể hiện được khả năng gây độc tế bào ung thư FaDu Điều này đã khẳng định rằng 1,3-dimethyl indazol là khung cấu trúc quan trọng cho hoạt tính kháng tế bào ung thư
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Kiến nghị
Tiếp tục tổng hợp và thử hoạt tính sinh học của các dẫn chất mang khung indazol, đặc biệt là các dẫn chất thế vào vị trí số 4 hoặc các nhóm đẩy điện tử khác nhằm tìm kiếm và sàng lọc những dẫn chất có hoạt tính tốt và đưa ra SAR
Thử độc tính tế bào của các dẫn chất tổng hợp được trên những dòng tế bào ung thư khác mà IDO1 có biểu hiện cao như YD-15, MCF7, HCT116.