(Luận văn) nghiên cứu thành phần hóa học và đánh giá tác dụng diệt tế bào ung thư của lá xạ đen (ehretia asperula zoll mor)

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT NGUYỄN THỊ THU THỦY lu an n va gh tn to NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG DIỆT p ie TẾ BÀO UNG THƯ CỦA LÁ XẠ ĐEN d oa nl w (Ehretia asperula Zoll & Mor) nf va an lu lm ul z at nh oi LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC z m co l gm @ an Lu HÀ NỘI – 2017 n va ac th si VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT NGUYỄN THỊ THU THỦY lu an va n NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG DIỆT to gh tn TẾ BÀO UNG THƯ CỦA LÁ XẠ ĐEN (Ehretia asperula Zoll & Mor) p ie nl w d oa CHUYÊN NGÀNH: SINH HỌC THỰC NGHIỆM nf va an lu Mã số: 60 42 01 14 lm ul z at nh oi LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC z gm @ NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS NGUYỄN TIẾN ĐẠT m co l an Lu HÀ NỘI - 2017 n va ac th si i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận văn công trình nghiên cứu tơi hướng dẫn PGS.TS Nguyễn Tiến Đạt Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Nếu khơng nêu trên, tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm đề tài lu an Tác giả luận văn n va p ie gh tn to Nguyễn Thị Thu Thủy d oa nl w nf va an lu z at nh oi lm ul z m co l gm @ an Lu n va ac th si ii LỜI CẢM ƠN Trước hết, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Tiến Đạt, Trung tâm nghiên cứu Chuyển giao công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa Học Công nghệ Việt Nam tận tình hướng dẫn suốt q trình học tập thực nghiên cứu Tơi xin cảm ơn Lãnh đạo Viện Y sinh nhiệt đới – Trung tâm Nhiệt đới Việt – Nga bạn đồng nghiệp phịng Thích nghi Y học qn tạo điều kiện giúp đỡ suốt q trình thực hiện, bảo vệ luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo, thầy cô giáo Viện Sinh thái lu Tài nguyên Sinh vật, cán nghiên cứu phịng Hoạt tính Sinh học an n va - Viện Hóa sinh biển, phịng Sinh học thực nghiệm - Viện Hóa học Hợp tình giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành luận văn Luận văn tiến hành hỗ trợ đề tài: “Nghiên cứu thành p ie gh tn to chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm khoa học Công nghệ Việt Nam nhiệt phần hóa học, đánh giá hoạt tính sinh học số hợp chất phân lập nl w từ Xạ đen tỉnh Hồ Bình Thử nghiệm tạo chế phẩm làm thực phẩm d oa chức từ cao chiết tiềm năng”, GS TS Đặng Đình Kim, Viện an lu Cơng nghệ mơi trường, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam làm nf va chủ nhiệm Tôi xin chân thành cảm ơn GS TS Đặng Đình Kim, ThS Vũ Thị luận văn z at nh oi lm ul Nguyệt nhiệt tình giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành Cuối tơi xin cảm ơn gia đình thân yêu, bạn bè, người thân đồng nghiệp – người bên tơi, ln động viên, khích lệ chỗ z dựa vững cho tơi suốt q trình học tập nghiên cứu @ gm Hà Nội, ngày 30 tháng 10 năm 2017 m co l Học viên an Lu Nguyễn Thị Thu Thủy n va ac th si iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC HÌNH v DANH MỤC BẢNG vi KÝ HIỆU VIẾT TẮT vii LỜI MỞ ĐẦU lu CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN an 1.1 Giới thiệu Xạ đen va n 1.1.1 Đặc điểm sinh thái phân bố hợp chất xạ đen ie gh tn to 1.1.2 Một số nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học p 1.1.3 Tác dụng sinh học 12 nl w 1.1.4 Một số thuốc y học cổ truyền: 13 d oa 1.2 Giới thiệu chung phương pháp Sắc kí 13 an lu 1.2.1 Phương pháp sắc kí lớp mỏng (SKLM) 13 nf va 1.2.2 Phương pháp sắc ký cột 17 lm ul 1.3 Sơ phương phác xác định cấu trúc 19 1.3.1 Phổ khối lượng MS 20 z at nh oi 1.3.2 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR 21 1.3.3 Phổ 1H-NMR 22 z 1.3.4 Phổ 13C-NMR 22 @ l gm 1.3.5 Phổ DEPT 23 1.3.6 Phổ 2D-NMR 23 co m 1.4 Giới thiệu số phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào 25 an Lu CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 27 n va 2.1 Mẫu thực vật 27 ac th si iv 2.2 Dụng cụ, thiết bị hóa chất 28 2.2.1 Dụng cụ thiết bị chiết tách mẫu 28 2.2.2 Dụng cụ thiết bị xác định cấu trúc 29 2.2.3 Hoá chất 29 2.2.4 Dòng tế bào (cell lines) 30 2.3 Chiết phân đoạn 30 2.4 Phân lập số hợp chất xạ đen 32 2.4.1 Phân lập hợp chất Ed 3.2 Ed 5.5 33 2.4.2 Phân lập hợp chất Ed 17.3 35 lu an 2.4.3 Phân lập hợp chất Ed 11.4 36 n va 2.5 Hằng số vật lý số liệu phổ nghiệm 37 2.5.2 Hợp chất Ed 5.5 37 gh tn to 2.5.1 Hợp chất Ed 3.2 37 p ie 2.5.3 Hợp chất Ed 17.3 38 2.5.4 Hợp chất Ed 11.4 38 w oa nl 2.6 Phương pháp thử khả gây độc tế bào (cytotoxicity) 39 d CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 42 lu nf va an 3.1 Hợp chất 1: Ed 3.2 42 3.2 Hợp chất 2: Ed 5.5 44 lm ul 3.3 Hợp chất 3: Ed 17.3 47 z at nh oi 3.4 Hợp chất 4: Ed 11.4 50 3.5 Kết thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào 54 z CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 56 @ 4.1 KẾT LUẬN 56 gm l 4.2 KIẾN NGHỊ 56 m co TÀI LIỆU THAM KHẢO 58 an Lu PHỤ LỤC PHỔ 62 n va ac th si v DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Ehretia asperula Zoll & Mor Hình 1.2: Cấu trúc số hợp chât theo tài liệu Hình 1.3: Cấu trúc số hợp chất theo tài liệu Hình 1.4: Cấu trúc số hợp chất theo tài liệu 10 Hình 1.5: Cấu trúc số hợp chất theo tài liệu 11 Hình 1.6: Cấu trúc số hợp chất theo tài liệu 12 Hình 2.1 Mẫu Xạ đen thu Hịa Bình 27 lu an Hình 2.2 Mẫu tiêu Xạ đen giám định 28 n va Hình 2.3 Sơ đồ chiết phân đoạn, phân lập cao xạ đen 32 tn to Hình 2.4 Sơ đồ phân lập hợp chất Ed 3.2 Ed 5.5 34 gh Hình 2.5 Sơ đồ phân lập hợp chất Ed 17.3 35 p ie Hình 2.6 Sơ đồ phân lập hợp chất Ed 11.4 36 nl w Hình 3.1 Phổ 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz) hợp chất Ed 3.2 42 oa Hình 3.2: Phổ 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz) hợp chất Ed 5.5 44 d Hình 3.3 Phổ 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz) hợp chất Ed 5.5 45 an lu Hình 3.4 Phổ DEPT hợp chất Ed 5.5 45 nf va Hình 3.5 Phổ 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz) hợp chất Ed 17.3 47 lm ul Hình 3.6 Phổ 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz) hợp chất Ed 17.3 48 z at nh oi Hình 3.7 Phổ 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz) hợp chất Ed 11.4 50 Hình 3.8 Phổ 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz) hợp chất Ed 11.4 51 z Hình 3.9 Phổ hai chiều HSQC hợp chất Ed 11.4 52 @ m co l gm Hình 3.10 Phổ hai chiều HMBC hợp chất Ed 11.4 52 an Lu n va ac th si vi DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Hoạt tính sinh học cắn chiết xạ đen vi khuẩn Gram dương Gram âm Bảng 3.1 Bảng so sánh số liệu phổ 1H-NMR Ed 3.2 với số liệu phổ 1HNMR caffeic acid 43 Bảng 3.2 Bảng so sánh số liệu phổ 1H-NMR 13C-NMR Ed 5.5 với số liệu phổ 1H-NMR Methyl caffedte 46 Bảng 3.3 Bảng so sánh số liệu phổ 1H-NMR 13C-NMR Ed 17.3 với số lu liệu phổ 1H-NMR Rosmarinic acid 49 an n va Bảng 3.4 Bảng so sánh số liệu phổ 1H-NMR 13C-NMR Ed 11.4 với số Bảng 3.5: Kết hoạt tính gây độc tế bào 54 p ie gh tn to liệu phổ 1H-NMR Methyl rosmarinate 53 d oa nl w nf va an lu z at nh oi lm ul z m co l gm @ an Lu n va ac th si vii KÝ HIỆU VIẾT TẮT Ký hiệu Tiếng Anh Ehretia asperula Zoll & Mor Xạ đen C-NMR Carbon (13) Nucleaedr Magnetic Resonance Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon (13) H-NMR Hydro (1) Nucleaedr Magnetic Resonance Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1) DEPT Distortionless Enhancement by Phổ DEPT HMBC Polarization Transfer Phổ tương tác dị hạt nhân qua Heteronucleaedr Multiple Bond nhiều liên kết Coherence HSQC Heteronucleaedr Single Quantum Correlation Phổ tương tác dị hạt nhân qua liên kết Chemical shift Độ chuyển dịch hóa học Part per million Một phần triệu Ed 13 Tiếng Việt lu an n va gh tn to δ ie ppm p s Doublet dd nl w d Singlet Rf retardation factors lu Human hepatocellular carcinoma Tế bào Ung thư gan nf va an Human lung adenocarcinoma Tế bào Ung thư phổi Human breaedst adenocarcinoma Tế bào Ung thư vú z at nh oi lm ul MCF-7 Phát triển chậm d LU-1 oa Hep-G2 Double of doublet Tế bào Ung thư cổ tử cung HeLa W Water nước D Dichloromethane H n-Hexane M Methanol E Ethyl acetate A Acetone z HeLa cervical cancer cells HeLa m co l gm @ an Lu n va ac th si LỜI MỞ ĐẦU Vai trò quan trọng hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học khẳng định từ y học cổ truyền y học đại Giá trị chúng khơng có cơng dụng trực tiếp làm thuốc chữa bệnh mà cịn dùng làm nguyên mẫu cấu trúc dẫn đường cho phát phát triển nhiều dược phẩm Việt Nam đánh giá có nguồn tài nguyên dược liệu phong phú có nhiều kinh nghiệm sử dụng nguồn dược liệu nhờ vào y học cổ truyền lâu đời Theo thống kê Việt Nam có lu 13000 lồi thực vật khoảng 4000 lồi sử dụng làm thuốc Đây an lợi để khai thác nguồn dược liệu phục vụ cho va n sống Các nghiên cứu hố học theo định hướng hoạt tính sinh học gh tn to đường ngắn hiệu để tìm kiếm có chọn lọc hoạt chất từ nguồn tài nguyên thiên nhiên p ie Ung thư coi bệnh nan y khả oa nl w kháng thuốc, gây di mạnh tế bào ung thư Chính thế, việc phát d triển loại dược phẩm đặc trị ngăn ngừa trình di ung an lu thư vấn đề cấp thiết y học đại Cây xạ đen có tên khoa học nf va Ehretia asperula Zoll & Mor, họ Vòi Voi (Boraginaceae) Xạ đen phân bố lm ul chủ yếu tỉnh Sơn La, Hà Nam, Quảng Ninh, Hịa Bình, chúng mọc tự z at nh oi nhiên rừng Xạ đen thân gỗ mọc leo thành bụi, nhánh non trịn, khơng lơng Dài trung bình 5-7m có tới hàng chục mét, thân già vỏ nâu đốm trắng, chồi non có màu tím đỏ Tại Việt Nam có số cơng z @ trình nghiên cứu Xạ đen như: Lê Thế Trung cộng (1999) l gm nghiên cứu khả chữa ung thư xạ đen Hịa Bình; Nguyễn Huy m xạ đen co Cường (2008) nghiên cứu thành phần hóa học thăm dị hoạt tính sinh học an Lu n va ac th si 57 đồng thời sâu vào hoạt tính sinh học hợp chất phân lập kết thu công bố tạp chí khoa học Chúng tơi hy vọng với đề tài thiết thực góp phần làm rõ thành phần hóa học có xạ đen, giúp có nhìn tổng qt hiểu rõ đặc tính sinh học, cơng dụng lu an n va p ie gh tn to d oa nl w nf va an lu z at nh oi lm ul z m co l gm @ an Lu n va ac th si 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Võ Văn Chi (2012), Từ điển thuốc Việt Nam, Nhà xuất Y học Hà Nội Nguyễn Huy Cường, Luận án tiến sĩ, “Nghiên cứu thành phần hoá học thăm dị hoạt tính sinh học Xạ đen (Celastrus hindsii Benth & Hook.) Cùm rụm (Ehretia dentata Courch.)”, 2008 Phạm Thị Lương Hằng, Đồn Thị Dun, Nguyễn Thị Yến, Ngơ Thị lu an Trang (2013), “Phát triển phương pháp khuếch tán - so màu đĩa n va thạch sàng lọc phát chất có hoạt tính kháng khuẩn từ tn to dịch chiết thực vật”, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học tự Hoàng Quỳnh Hoa, Phạm Thanh Kỳ, Phan Văn Kiệm, Lê Mai Hương p ie gh nhiên Công nghệ, tập 29, số 2, tr 10-17 nl w (2009), “Xác định cấu trúc tác dụng gây độc tế bào acid d oa rosmarinic phân lập từ cùm cụm hoa dài (Ehretia longiflora Đỗ Tất Lợi (2004), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất nf va an lu Champ)”, Tạp chí Dược học, 8/2009, tr 27-30 Nguyễn Kim Phi Phụng (2007), Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, z at nh oi lm ul Y học Hà Nội Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh, tr.80-90 Tran Van Sung, Nguyen Huy Cuong, Trinh Thi Thuy, Pham Thi Ninh, z @ gm Le Thi Hong Nhung (2007), “Isolation and chracterization of triterpens co l and phenolic glycoside frome Celastrus hindsii Benth”, Internationnal Workshop on Herbal Medicinal Plants and Traditional Herb Remedies, m an Lu 20-21 September 2007, Hanoi, Vietnam, tr 85 n va ac th si 59 Trần Văn Sung, Nguyễn Huy Cường, Trịnh Thị Thủy, Phạm Thị Ninh, Lê Thị Hồng Nhung (2008), “Isolation and structural characterization of Phenolic glycoside and Triterpenes in Celastrus hindsii Benth” Tạp chí Hóa học, 46 (2), tr 224 - 228 Trinh Thi Thuy, Nguyen Huy Cuong, Tran Van Sung (2007), “Nitril glucoside, flavonol glucoside and polyphenolic acids from Ehretia dentata Courch”, Tạp chí Hóa Học, 45 (2), tr.228-232 10 Trinh Thi Thuy, Nguyen Huy Cuong, Tran Van Sung (2007), lu “Triterpenes from Celastrus hindsii Benth”, Tạp chí Hóa học, 45(3), tr an 373 – 376 va n 11 hóa học, Đại học Quốc gia Hà Nội gh tn to Nguyễn Đình Triệu (2015), Bài tập phương pháp vật lí ứng dụng p ie Tài liệu tiếng Anh nl w 12 Abedini A., Roumy V., Mahieux S., Biabiany M., Standaert-Vitse A, oa Rivière C., Sahpaz S., Bailleul F., Neut C., and Hennebelle T (2013), d “Rosmarinic Acid and Its Methyl Ester as AntimicrobialComponents of an lu nf va the Hydromethanolic Extract of Hyptis atrorubensPoit (Lamiaceae)”, Hindawi Publishing Corporation, Evidence-Based Complementary and lm ul Alternative Medicine, Volume 2013, Article ID 604536, p.11 z at nh oi 13 Chang S W., Kim K H., Lee I K., Choi S U., Ryu S Y., Lee K R.(2009), “Phytochemical Constituents of Bistorta manshuriensis”, z 14 gm @ Natural Product Sciences 15(4), p.234-240 Huang H C., Shen C C., Chen C F., Yang-Chang Wu Y C., Kuo Y l A Novel Agarofuran Sesquiterpene, Celahin D from m co H.(2000), Celastrus hindsii Benth., Chem Pharm Bull 48(7), p.1079-1080 an Lu n va ac th si 60 15 Kuo Y H., Kuo L M (1997), “Antitumour and anti-AIDS triterpenes from Celastrus hindsii”, Phytochemistry 1997, 44, p.1275–1281 16 Kuo Y H , Chen C F., Kuo L M Y (1995), “Celahinine, a new sesquiterpene pyridine alkaoid from celastrus hindsii”, Journol of Natural Products, Vol 58, No 11, p.1735-1738 17 Likhitwitayawuid K., Angerhofer C K., Cordell G A., Pezzuto J M., & Ruangrungsi N (1993), “Cytotoxic and antimalarial bisbenzylisoquinolme alkaloids from Stephania erecta”, Journal of lu Natural Products, 56(1), p.30-38 an va 18 Mossmann T (1983), “Rapid colorimetric assay for cellular growth n and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays”, J tn to Immunol, Meth.65, p.55-63 gh Skehan P., Storeng R., Scudiero D., Monks A., McMahon J., Vistica p ie 19 w D., Warren J.T., Bokesch H., Kenney S., Boyd M.R (1991), “New oa nl colorimetric cytotoxicity assay for anticancer agents”, Eur J Cancer 27, d p.1162–1168 an lu Takahashi K., Yoshioka Y., Kato E., KatsukiI S., Iida O., Hosokawa nf va 20 K., Kawabata J.(2010), “Methyl Caffeate as an α-Glucosidase Inhibitor lm ul from Solanum torvum Fruits and the Activity of RelatEd Compounds” z at nh oi Biosci, Biotechnol, Biochem, 74(4), p.741–745 21 Yu D., Susan L., Morris-Natschke, Lee K H (2006), “New z online August 2006 in Wiley InterScience l gm Published @ Developments in Natural Products-Based Anti-AIDS Resedrch”, (www.interscience.wiley.com), DOI 10.1002/mEd.20075 m co an Lu n va ac th si 61 Tài liệu website: 22 http://duoclieutuelinh.vn/xa-den.html 23 http://xadenhoabinh.vn/cong-trinh-nghien-cuu-cay-xa-den-cua-giao-sule-the-trung 24 Ancotnam.vn/mot-so-tac-dung-cua-cay-xa-den-than-duoc-tri-ungthu.html lu an n va p ie gh tn to d oa nl w nf va an lu z at nh oi lm ul z m co l gm @ an Lu n va ac th si 62 lu an n va p ie gh tn to PHỤ LỤC PHỔ d oa nl w ll fu an nv a lu oi m z at nh z m o l.c gm @ Lu an Phụ lục 1: Phổ 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz) hợp chất Ed 3.2 n va ac th si 63 lu an n va p ie gh tn to d oa nl w ll fu an nv a lu oi m z at nh z m o l.c gm @ an Lu n va Phụ lục 2: Phổ 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz) hợp chất Ed 5.5 ac th si 64 lu an n va p ie gh tn to d oa nl w ll fu an nv a lu oi m z at nh z m o l.c gm @ an Lu Phụ lục 3: Phổ 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz) hợp chất Ed 5.5 n va ac th si 65 lu an n va p ie gh tn to d oa nl w ll fu an nv a lu oi m z at nh z m o l.c gm @ an Lu Phụ lục 4: Phổ DEPT hợp chất Ed 5.5 n va ac th si 66 lu an n va p ie gh tn to d oa nl w ll fu an nv a lu oi m z at nh z m o l.c gm @ an Lu Phụ lục 5: Phổ 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz) hợp chất Ed 17.3 n va ac th si 67 lu an n va p ie gh tn to d oa nl w ll fu an nv a lu oi m z at nh z m o l.c gm @ an Lu Phụ lục 6: Phổ 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz) hợp chất Ed 17.3 n va ac th si 68 lu an n va p ie gh tn to d oa nl w ll fu an nv a lu oi m z at nh z m o l.c gm @ an Lu Phụ lục 7: Phổ 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz) hợp chất Ed 11.4 n va ac th si 69 lu an n va p ie gh tn to d oa nl w ll fu an nv a lu oi m z at nh z m o l.c gm @ an Lu Phụ lục 8: Phổ 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz) hợp chất Ed 11.4 n va ac th si 70 lu an n va p ie gh tn to d oa nl w ll fu an nv a lu oi m z at nh z m o l.c gm @ an Lu Phụ lục 9: Phổ hai chiều HSQC hợp chất Ed 11.4 n va ac th si 71 lu an n va p ie gh tn to d oa nl w ll fu an nv a lu oi m z at nh z m o l.c gm @ an Lu n va Phụ lục 10: Phổ hai chiều HMBC hợp chất Ed 11.4 ac th si