Đang tải... (xem toàn văn)
Microsoft Word bia bao cao doc B« Y tÕ B¸o c¸o kÕt qu¶ nghiªn cøu ®Ò tµi cÊp bé Nghiªn cøu thµnh phÇn hãa häc vµ t¸c dông b¶o vÖ gan cña c©y cá mËt (Eriochloa ramosa (Retz ) Hack hä Poaceae Chñ nhiÖn[.]
Bô Y tế Báo cáo kết nghiên cứu đề tài cấp Nghiên cứu thành phần hóa học tác dụng bảo vệ gan cỏ mật (Eriochloa ramosa (Retz.) Hack họ Poaceae Chủ nhiện đề tài Cơ quan chủ trì đề tài TS.Lê Thị Kim Loan Viện Dợc liệu 7440 10/7/2009 năm 2008 Bô Y tế Báo cáo kết nghiên cứu đề tài cấp Nghiên cứu thành phần hóa học tác dụng bảo vệ gan cđa c©y cá mËt (Eriochloa ramosa (Retz.) Hack hä Poaceae Chủ nhiện đề tài TS Lê Thị Kim Loan Cơ quan chủ trì đề tài Viện Dợc liệu Cấp qu¶n lý Bé Y tÕ Thêi gian thùc hiƯn tõ tháng năm 2006 đến tháng năm 2008 Tổng kinh phí thực đề tài 270 triệu đồng Trong kinh phí SNKH 270 triệu đồng năm 2008 Bỏo cáo kết nghiên cứu đề tài cấp Bộ Tên đề tài: Nghiên cứu thành phần hóa học tác dụng bảo vệ gan cỏ mật ( Eriochloa ramosa ( Retz.) Hack., họ Poaceae Chủ nhiệm đề tài: TS Lê Thị Kim Loan Cơ quan chủ trì đề tài: Viện Dược liệu Cơ quan quản lý đề tài: BộY tế Danh sách người thực chính: - TS Lê Thị Kim Loan - Viện Dược liệu PGS.TS Bùi Thị Bằng - Viện Dược liệu DSCKI Nguyễn Thị Kim Bích - Viện Dược liệu CN Ngô Văn Trại - Viện Dược liệu TS Phan Văn Kiệm - Viện Hóa hợp chất tự nhiên PGS.TS Nguyễn Trọng Thông - Đại học Y Hà Nội PGS.TS Vũ Thị Ngọc Thanh - Đại học Y Hà Nội DS Nguyễn Kim Phượng - Viện Dược liệu ThS Đỗ Thị Phương - Viện Dược liệu Thời gian thực đề tài từ tháng năm 2006 đến tháng năm 2008 ( Được gia hạn đến 2/2009) chữ viết tắt C mt CM Dch chit nước cỏ mật Mn Dịch chiết cồn ( ethanol ) cỏ mật MC Dịch chiết cồn- nước cỏ mật MCN Polyssccharid/cỏ mật MN1 Lớp chất lại sau loại polysaccharid dịch chiết nước cỏ mật MN2 Sắc ký lớp mỏng SKLM Methanol MeOH Phổ khối lượng phun mù điện tử ESI-mS Độ quay cực [ α ]D Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR Carbon tetraclorid CCl4 Paracetamol PAR Alanin aminotransferase ALT Aspartat aminotransferase AST Malondialdehyd MDA Cytochrom - P450 CyP Cyt- P450 N-acetyl-p-benzoquinoneimin NAPQI Thể tích trung bình hồng cầu MCV mơc lơc ĐẶT VẤN ĐỀ TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Bệnh viêm gan số xét nghiệm thường dùng để đánh giá tổn thương gan 2.1.1 Bệnh viêm gan 2.1.2 Một số xét nghiệm thường dùng để đánh giá tổn thương gan 2.2 Thuốc phương pháp điều trị viêm gan 2.2.1 Thuốc điều trị viêm gan 2.2.2 Các phương pháp điều trị viêm gan 2.3 Tổng quan cỏ mật ( Eriochloa ramosa (Retz.) Hack.) NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11 3.1 Nguyên liệu 11 3.2 Hóa chất động vật thí nghiệm 11 3.3 Phương pháp nghiên cứu 12 3.3.1 Phương pháp nghiên cứu thực vật 3.3.2 Phương pháp nghiên cứu thành phần hóa học dược liệu 12 3.3.3 Phương pháp nghiên cứu tác dụng sinh học 14 3.3.3.1 Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan 12 14 3.3.3.2 Nghiên cứu tác dụng làm tăng phục hồi tổn thương gan 16 3.3.3.3 Nghiên cứu tác dụng hiệp đồng giấc ngủ với phenobarbital 16 3.3.3.4 Nghiên cứu tác dụng lợi mật 17 3.3.3.5 Nghiên cứu tác dụng chống viêm cấp 17 3.3.3.6 Nghiên cứu tác dụng chống viêm mạn 18 3.3.3.7 Nghiên cứu độc tính cấp 19 3.3.3.8 Nghiên cứu độc tính bán trường diễn 19 3.3.3.9 Phương pháp xử lý kết 20 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 21 4.1 Kết nghiên cứu thực vật 21 4.2 Kết nghiên cứu thành phần hóa học 24 4.2.1 Định tính thành phân hóa học 24 4.2.2 Định lượng thành phần hoa học cao nước cao cồn cỏ mật 26 4.2.3 Nghiên cứu phân lập xác định cấu trúc số thành phần hóa học cỏ mật 27 4.2.3.1 Nghiên cứu phân lập số thành phần hóa học 27 4.2.3.2 Hằng số vật lý liệu phổ hợp chất 30 4.2.3.3 Xác định cấu trúc hóa học hợp chất 34 4.3 Nghiên cứu tác dụng sinh học 70 4.3.1 Nghiên cứu sàng lọc tác dụng bảo vệ gan cỏ mật 4.3.2 4.3.2.1 Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan cao nước cỏ mật 75 Ảnh hưởng cỏ mật lên lượng gan chuột -Trên mơ hình gây tổn thương gan thực nghiệm CCl4 -Trên mơ hình gây tổn thương gan thực nghiệm PAR 4.3.2.2 68 Ảnh hưởng cỏ mật lên lên hoạt độ enzym transaminase 75 76 77 -Trên mơ hình gây tổn thương gan thực nghiệm CCl4 -Trên mơ hình gây tổn thương gan thực nghiệm PAR 4.3.2.3 Ảnh hưởng cỏ mật lên lên nồng độ bilirubintrong 80 -Trên mơ hình gây tổn thương gan thực nghiệm CCl4 -Trên mơ hình gây tổn thương gan thực nghiệm PAR 4.3.2.4 Ảnh hưởng cỏ mật lên lên mô bệnh học gan chuột 81 -Trên mơ hình gây tổn thương gan thực nghiệm CCl4 -Trên mơ hình gây tổn thương gan thực nghiệm PAR 4.3.2.5 Ảnh hưởng cỏ mật lên nồng độ MDA dịch đồng thể 90 -Trên mơ hình gây tổn thương gan thực nghiệm CCl4 -Trên mơ hình gây tổn thương gan thực nghiệm PAR 4.3.3 Nghiên cứu tác dụng làm tăng phục hồi tổn thương gan cao nước cỏ mật 4.3.4 91 Nghiên cứu tác dụng hiệp đồng giấc ngủ cao cỏ mật phối hợp với phối hợp với phenobarbital 103 4.3.5 Nghiên cứu tác dụng lợi mật cao nước cỏ mật 103 4.3.6 Nghiên cứu tác dụng chống viêm cấp cỏ mật 104 4.3.7 Nghiên cứu tác dụng chống viêm mạn cỏ mật 104 4.3.8 Nghiên cứu độc tính cấp 105 4.3.9 Nghiên cứu độc tính bán trường diễn 105 4.3.9.1 Tình trạng chung thay đổi thể trọng thỏ 105 4.3.9.2 Đánh giá chức tạo máu 106 4.3.9.3 Đánh giá chức gan 109 4.3.9.2 Đánh giá chức thận 112 BÀN LUẬN 117 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 139 TÀI LIỆU THAM KHẢO 142 PHỤ LỤC 147 - Bản tự đánh giá tình hình thực đóng góp ĐT - Danh sách tác giả - Những báo công bố BẢN TỰ ĐÁNH GIÁ Về tình hình thực đóng góp đề tài KH&CN cấp Bộ Tên đề tài: Nghiên cứu thành phần hóa học tác dụng bảo vệ gan cỏ mật ( Eriochloa ramosa ( Retz.) Hack., họ Poaceae Chủ nhiệm đề tài: TS Lê Thị Kim Loan Cơ quan chủ trì đề tài: Viện Dược liệu Thời gian thực (BĐ-KT): Tháng 7/2006 đến tháng 7/2008 ( Đã gia hạn đến tháng 2/2009) Tổng kinh phí thực Đề tài: 270 triệu đồng Trong đó, kinh phí từ NSNN: 270 triệu đồng Tình hình thực đề tài so với đề cương: 6.1/ Về mức độ hồn thành khối lượng cơng việc : Hồn thành nội dung nghiên cứu 6.2/ Về yêu cầu khoa học tiêu sản phẩm KHCN: Đạt yêu cầu khoa học tiêu sản phẩm 6.3/ Về tiến độ thực : So với thời gian thực xác nhận ĐC bị chậm CNĐT Cơ quan chủ trì ĐT có cơng văn gửi Vụ KH ĐTxin gia han CNĐT Viện DL nhận QĐ Vụ KH ĐT, cho phép ĐT kết thúc vào tháng 2/2009 Về đóng góp đề tài: Trên sở so sánh với thông tin công bố ấn phẩm nước đến thời điểm kết thúc đề tài, đề tài có điểm sau đây: 8.1/ Về giải pháp khoa học - công nghệ - Lần nghiên cứu chiết tách xác định cấu trúc hợp chất hữu cỏ mật ( Eriochloa ramosa ( Retz.) Hack ) Trong có chất mới, lần đầu xác nhận từ thiên nhiên - Lần nghiên cứu chứng minh tác dụng bảo vệ gan, làm tăng phục hồi tổn thương gan tác dụng lợi mật cỏ mật Tác dụng bảo vệ gan cỏ mật theo chế chống oxy hóa - Đã đánh giá độc tính cỏ mật thơng qua việc nghiên cứu độc tính cấp độc tính bán trường diễn, kết cho thấy dùng cỏ mật an tồn độc tính thấp 8.2/ Về phương pháp nghiên cứu Phương pháp NC tác dụng hiệp đồng giấc ngủ cỏ mật với phenobarbital Đây phương pháp nhằm chứng minh chế bảo vệ gan thuốc nghiên cứu 8.3/ Những đóng góp khác : - Hướng dẫn cán NC Viện Dược liệu thời gian tập - Đã hướng dẫn luận văn ThS Y học cho BS Đinh Thị Kim Chi, Luận văn bảo vệ thành công -Tham gia Hội thảo khoa học Quốc tế với nội dung ;” A new dammarane - type triterpene saponin from Eriochloa ramosa ( Retz.) Hack hội thảo tổ chức tháng 10/2007 Viện Khoa học CNVN - Đã có hai báo đăng tạp chí Dược liệu + Nghiên cứu sàng lọc tác dụng bảo vệ gan cỏ mật- Tạp chí DL số 3+4, tập 12/2007 + A new dammarane - type triterpene saponin from Eriochloa ramosa ( Retz.) Tạp chí DL số 2, tập 13/2008 Hà Nội.,ngày 20 tháng 12 năm2008 CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI (Họ, tên chữ ký) ĐẶT VẤN ĐỀ Viêm gan bệnh lý thường gặp bệnh gan mật Có nhiều nguyên nhân gây bệnh, loại virus ( A, B, C ), thuốc, rượu hóa chất xâm nhập vào gan Bệnh tiến triển từ viêm gan cấp đến viêm gan mạn tiến tới xơ gan ung thư gan Theo Phạm Hoàng Phiệt, Việt Nam nằm vùng dịch tễ viêm gan B với khoảng 10 triệu người mang HBsAg [23], ước tính tỷ lệ tử vong có liên quan đến viêm gan vào khoảng 48.000 người năm [29] Viêm gan nhiễm độc thuốc hóa chất thường gặp đặc biệt viêm gan dùng thuốc chống lao thuốc hạ sốt giảm đau paracetamol có xu hướng ngày tăng Viêm gan virus điều trị thuốc kháng virus Inteferol, Lamivudin Tuy nhiên thuốc có giá thành cao có nhiều tác dụng không mong muốn Hơn xuất dòng virus đột biến kháng Lamivudin Các trường hợp viêm gan nguyên nhân khác (do thuốc, hóa chất ) chưa có thuốc điều trị đặc hiệu, bệnh nhân chủ yếu điều trị thuốc làm tăng khả phục hồi tổn thương gan bảo vệ gan Một số thuốc bảo vệ gan nhập vào Việt Nam Silymarin (Legalon), Biphenyldimethyl dicarboxylat (Fortex) có tác dụng tương đối tốt song giá thành tương đối cao, không phù hợp với điều kiện kinh tế đa số người bệnh phải dùng thuốc dài ngày Vì việc nghiên cứu thuốc bảo vệ gan từ nguồn nguyên liệu nước điều cần thiết Y học cổ truyền nước ta có lịch sử hàng ngàn năm Với phong phú đa dạng sinh học vào bậc khu vực Đơng nam á, tạo điều kiện cho nước ta có nguồn thuốc dồi Dược liệu dùng chữa bệnh gan mật có nhiều thầy thuốc Y học cổ truyền sử dụng rộng rãi chi tử ( hạt dành dành ), actiso, nghệ vàng, nhân trần, bồ bồ Để tìm kiếm, bổ sung danh mục thuốc có tác dụng tốt lại có sẵn tự nhiên cơng việc cần thiết có ý nghĩa thực tiễn Cây cỏ mật mọc hoang vùng đồng trung du nước ta Theo kinh nghiệm nhân dân số địa phương Nam Định, Phú thọ, Sơn tây dùng cỏ mật để chữa cảm sốt, chữa mụn nhọt chữa bệnh gan mật Một số tác giả nước nghiên cứu tác dụng hạ sốt, giảm đau, lợi mật, lợi tiểu cỏ mật thực nghiệm [11], [26] chưa thấy có nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan phục hồi tổn thương gan Để có sở khoa học việc sử dụng thuốc với mục đích làm thuốc bảo vệ phục hồi tổn thương gan, tiến hành thực Đề tài “ Nghiên cứu thành phần hóa học tác dụng bảo vệ gan cỏ mật (Eriochloa ramosa (Retz.) Hack., họ Poaceae với mục tiêu sau: - Xác định thành phần hóa học cỏ mật - Xây dựng quy trình chiết xuất phân lập nhóm hoạt chất cỏ mật gián tiếp thông qua khả kéo dài giấc ngủ phối hợp với PB Kết bảng 4.37 cho thấy lô lô ( chuột uống cỏ mật với liều 4,5g/kg 9,0g/kg ), thời gian ngủ có xu hướng kéo dài, song khác biệt so với thời gian ngủ lô ( lơ chứng ) khơng có ý nghĩa thống kê (> 0,05 ) Thời gian ngủ tiềm tàng lô không khác lô Từ kết nghiên cứu đến kết luận, cỏ mật khơng có tác dụng ức chế CYP2E1 có nghĩa cỏ mật khơng ức chế chuyển hóa CCl4 PAR thành chất chất độc 5.3.4 Tác dụng lợi mật cao nước cỏ mật Mật tiết từ tế bào gan đưa xuống túi mật qua ống dẫn mật Tác dụng mật nhũ tương hóa lipid thức ăn Khi xuất mật xuống ruột, mật kéo theo nhiều chất độc gan giữ lại đào thải qua đường mật xuống ruột, theo phân Nếu gan bị tổn thương ảnh hưởng đến trình tạo mật xuất mật, ảnh hưởng đến tiêu hóa, hấp thu lipid, vitamin tan dầu đào thải số chất độc qua đường mật [8] Kết bảng 4.38 cho thấy hai lô uống cao nước cỏ mật liều 4,5 g/kg liều 9,0 g/kg làm tăng trọng lượng dịch mật có ý nghĩa so với lô chứng Tác dụng tăng theo liều dùng, uống cỏ mật liều cao 9,0 g/kg, trọng lượng dịch mật tăng cao lô uống cỏ mật liều 4,5 g/kg Actiso có tác dụng lợi mật tương đương cỏ mật liều 4,5 g/kg, thấp cỏ mật liều g/kg ( p < 0,05 ) Actiso dược liệu dùng thông dụng với tác dụng thông mật, chữa bệnh suy gan [3] So sánh tác dụng lợi mật actiso cỏ mật cho thấy cỏ mật tác dụng tốt actiso ( liều 9g/kg ) Kết mở triển vọng dùng cỏ mật dể làm thuốc thông mật actiso Cùng với tác dụng bảo vệ gan, tác dụng làm tăng phục hồi tổn thương gan, tác dụng lợi mật tốt góp phần làm cho việc sử dụng cỏ mật điều trị viêm gan có triển vọng 132 5.3 Tác dụng chống viêm cấp viêm mạn cỏ mật Để tìm hiểu cỏ mật có tác dụng chống viêm hay không? tiến hành nghiên cứu tác dụng Kết bảng 4.39 cho thấy cỏ mật với hai liều 3,0g/kg 6,0g/kg có xu hướng làm giảm nhẹ phản ứng phù chân chuột gây viêm cấp carragenin, khác biệt ý nghĩa thống kê so với lơ chứng Kết bảng 4.40 cho thấy cỏ mật với hai liều 3,0g/kg 6,0g/kg có xu hướng làm giảm nhẹ trọng lượng khối u hạt thực nghiệm, khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê so với lơ chứng Như thấy cỏ mật khơng thể tác dụng chống viêm cấp mạn tính 5.3.7 Bàn luận độc tính cấp bán trường diễn cao nước cỏ mật 5.3.7.1.Độc tính cấp Trong thực nghiệm, cho chuột nhắt trắng uống cao nước cỏ mật với liều tăng dần từ 120g dược liệu/kg - gấp 27 lần liều điều trị chuột 492g dược liệu/kg thể trọng - gấp 109 lần liều điều trị chuột (gấp 123 lần liều dùng tính theo kg thể trọng người) chưa thấy biểu ngộ độc chuột chuột chết Đây thể tích tối đa đưa vào thể chuột (nồng độ thể tích tối đa cho phép), chưa xác định độc tính cấp chưa tính LD50 cỏ mật chuột nhắt trắng theo đường uống Điều phù hợp với nghiên cứu độc tính cấp cỏ mật số tác giả khác Đỗ Trung Đàm (2000), Nguyễn Thị Thanh Xuân (2005) nghiên cứu độc tính cấp cao cồn cỏ mật, kết cho thấy chuột nhắt trắng uống cao cồn liều 40g/kg, tương đương với 500g dược liệu khô/kg, gấp 1250 lần liều dùng tính theo kg thân trọng người khơng có chuột chết [11],[26] Nghiên cứu dùng cao nước cỏ mật tới liều 492g dược liệu khơ/kg, khơng thấy độc tính cấp khơng có chuột chết Cỏ mật thường dùng làm thức ăn cho gia súc Điều chứng tỏ cỏ mật loại thảo dược có độc tính cấp thấp, độ an tồn tương đối cao 133 5.3.7.2 Độc tính bán trường diễn Một số tác giả chứng minh cỏ mật có tác dụng hạ sốt, giảm đau, kháng khuẩn, lợi mật, lợi tiểu thực nghiệm [11],[12],[26] Để điều trị viêm gan, thời gian dùng thuốc thường phải kéo dài nhiều tuần đến vài tháng Vì để đảm bảo an tồn cho người bệnh sử dụng thuốc, ngồi đánh giá độc tính cấp, nghiên cứu độc tính bán trường diễn cỏ mật việc làm cần thiết Trong nghiên cứu độc tính bán trường diễn, chúng tơi dùng hai liều cao nước cỏ mật thỏ: Liều 1,2g/kg/ngày (liều có tác dụng tương đương người) liều cao gấp lần liều (4,8g/kg/ngày), theo nguyên tắc chung nghiên cứu độc tính bán trường diễn súc vật thực nghiệm, ngồi liều có tác dụng tương đương với liều lâm sàng, phải dùng thêm liều cao gấp lần liều dùng lâm sàng [28] Thỏ uống cao nước cỏ mật với liều: Liều thấp 1,2g dược liệu khô/kg (tương đương với liều dùng người, tính theo hệ số 3) liều cao 4,8g dược liệu khô/kg liên tục 30 ngày Lô chứng uống dung môi nước với thể tích tương tự lơ uống cỏ mật Theo dõi tình trạng chung, thể trọng thỏ, chức số quan quan trọng thể (cơ quan tạo máu, gan, thận) mơ bệnh học trước sau q trình uống thuốc Nếu thuốc có độc tính bán cấp ảnh hưởng tới tình trạng tồn thân, chức hình thái cấu trúc số quan thể Kết nghiên cứu thu cho thấy: * Tình trạng chung, thể trọng thỏ Trong suốt thời gian nghiên cứu, tất thỏ lô uống cỏ mật nước khoẻ mạnh, nhanh nhẹn, mắt sáng, lông mượt, ăn uống, hoạt động, tiết bình thường Mức độ gia tăng trọng lượng thỏ hai lô uống cao nước cỏ mật liều cao liều thấp không khác biệt so với lô chứng Sau 30 ngày uống thuốc, mổ thỏ quan sát đại thể thấy tất quan: tim, phổi, gan, lách, tụy, thận hệ thống tiêu hoá thỏ bình thường Điều chứng 134 tỏ cao nước cỏ mật khơng ảnh hưởng xấu tới tình trạng chung mức độ tăng trưởng thỏ uống thuốc liên tục 30 ngày, kể lô thỏ uống liều cao gấp lần liều điều trị * Ảnh hưởng cỏ mật đến quan tạo máu Máu tổ chức quan trọng thể, liên quan mật thiết với phận thể Về mặt bệnh lý, máu chịu ảnh hưởng số quan thể, đồng thời phản ánh tình trạng riêng quan tạo máu Nếu thuốc ảnh hưởng đến quan tạo máu trước hết thành phần máu bị thay đổi Do đó, để nghiên cứu ảnh hưởng thuốc đến chức phận tạo máu, số số lượng hồng cầu, số lượng huyết sắc tố, hematocrit, thể tích trung bình hồng cầu, số lượng bạch cầu, công thức bạch cầu số lượng tiểu cầu thỏ thí nghiệm xác định Huyết sắc tố hồng cầu giữ vai trò quan trọng, tiếp nhận oxy từ phổi đưa đến quan thể lấy CO2 khỏi thể Định lượng huyết sắc tố biết chức hồng cầu Hematocrit tỷ lệ phẩn trăm khối hồng cầu máu tồn phần Thể tích trung bình hồng cầu phản ánh đặc điểm tình trạng thiếu máu thể Nếu thuốc làm giảm số lượng hồng cầu, lượng huyết sắc tố hematocrit gây tình trạng thiếu máu Số lượng bạch cầu cơng thức bạch cầu máu ngoại vi gián tiếp phản ánh chức bảo vệ thể, đồng thời phản ánh chức phận quan tạo máu Tiểu cầu có nhiệm vụ tham gia vào chế cầm máu, đông máu Theo dõi số đánh giá chức phận tạo máu thỏ (số lượng hồng cầu, số lượng huyết sức tố, hematocrit, thể tích trung bình hồng cầu, số lượng bạch cầu, cơng thức bạch cầu số lượng tiểu cầu), kết bảng từ 42 đến 4.48 cho thấy sau 15 ngày 30 ngày uống cao nước cỏ mật, tất số hai lô trị giới hạn bình thường, khơng có khác biệt có ý nghĩa so với lơ chứng ( p t- 135 test student >0,05) so sánh hai thời điểm trước sau uống thuốc (p test trước – sau >0,05) Điều chứng tỏ cao nước cỏ mật không gây ảnh hưởng xấu đến quan tạo máu thỏ * Ảnh hưởng cao nước cỏ mật lên chức gan Trong thể, gan có vai trị lớn, đảm nhiệm nhiều chức quan trọng phức tạp Khi đưa thuốc vào thể, thuốc gây độc với gan, làm ảnh hưởng tới chức gan Vì đánh giá độc tính thuốc, ln cần nghiên cứu ảnh hưởng thuốc tới chức gan Để đánh giá mức độ tổn thương tế bào gan, người ta thường định lượng nồng độ enzym có nguồn gốc gan huyết Khi nồng độ enzym tăng thường gắn liền với độc tính thuốc huỷ hoại tế bào gan [22] Như biết, ALT enzym có nhiều gan, khư trú bào tương tế bào gan Khác với ALT, AST khơng có gan mà cịn có quan khác Trong tế bào gan, AST chủ yếu khư trú ty thể, phần khư trú bào tương Khi có tổn thương huỷ hoại màng tế bào gan, chí thay đổi tính thấm màng tế bào hoạt độ ALT tăng cao Khi tổn thương tế bào gan nặng hơn, mức tế bào, AST ty thể giải phóng ngồi Do tổn thương gan, hoạt độ ALT máu tăng cao AST đặc hiệu bệnh lý gan [8],[22],[34] Trong nghiên cứu này, hoạt độ AST ALT máu thỏ khác biệt có ý nghĩa so với lơ chứng so sánh thời điểm trước sau uống thuốc liên tục 15 ngày 30 ngày (Bảng 4.49 4.50), chứng tỏ cao nước cỏ mật không gây tổn thương tế bào gan Gan tham gia vào q trình tiêu hố lipid thức ăn thơng qua q trình tiết mật Xét nghiệm bilirubin máu để thăm dò chức tiết chuyển hoá mật gan [8],[19],[28] Kết nghiên cứu cho thấy nồng độ bilirubin toàn phần 136 máu thỏ lô chứng lô trị khơng có khác biệt tất thời điểm trước sau dùng thuốc (Bảng 51) Điều chứng tỏ cao nước cỏ mật khơng gây ảnh hưởng đến chức tiết chuyển hoá mật gan Để đảm nhiệm vai nhiệm vai trò quan trọng mình, gan có hệ thống enzym tham gia vào trình tổng hợp chuyển hoá chất glucid, protid, lipid [8] Gan quan tạo albumin, số globulin yếu tố đơng máu Ngun nhân gây thay đổi protid huyết thanh, đặc biệt albumin thường tổn thương tế bào gan Định lượng albumin máu có vai trị chẩn đốn tiên lượng bệnh gan [8] Mặt khác gan cịn tham gia vào q trình tổng hợp chuyển hoá lipid Cholesterol thành phần mật, gan tổng hợp Định lượng cholesterol máu để đánh giá chức tổng hợp lipid gan [8],[28] Trong nghiên cứu này, hàm lượng albumin cholesterol máu thỏ khơng có khác biệt có ý nghĩa so với lơ chứng so sánh thời điểm trước sau uống thuốc liên tục 15 ngày 30 ngày (Bảng 4.52 4.53), chứng tỏ cao nước cỏ mật không ảnh hưởng tới chức tổng hợp protid lipid gan Kết đánh giá ảnh hưởng cao nước cỏ mật lên chức gan thông qua số sinh hố hồn tồn phù hợp với quan sát mô bệnh học gan Sau 30 ngày uống cỏ mật, quan sát đại thể gan tất thỏ hai lơ uống thuốc khơng thấy hình ảnh tổn thương Trên hình ảnh vi thể thấy tế bào gan bình thường, khơng thối hố, khơng hoại tử, khoảng cửa không viêm, xoang mạch không sung huyết (Ảnh 4.22 và.4.23) Như vậy, uống cao nước cỏ mật liên tục 30 ngày không gây ảnh hưởng xấu tới chức hình thái gan * Ảnh hưởng cao nước cỏ mật đến chức thận Thận quan tiết thể Cầu thận ống thận dễ bị tổn thương 137 chất nội sinh ngoại sinh, có thuốc [28] Thận có đặc điểm dễ bị ngộ độc mơ khác mơ có nhiều máu qua [9] Khi đưa thuốc vào thể, phần lớn thuốc đào thải qua thận, nhiều thuốc gây độc cho thận, từ ảnh hưởng tới chức thận Creatinin xét nghiệm dùng để đánh giá chức lọc cầu thận Creatinin thành phần đạm máu ổn định nhất, không phụ thuộc vào chế độ ăn, thay đổi sinh lý mà phụ thuộc vào khả đào thải thận Khi cầu thận bị tổn thương, nồng độ creatinin tăng sớm ure Do để đánh giá theo dõi chức thận, creatinin máu tiêu quan trọng tin cậy ure [8],[19],[22],[28] Trong nghiên cứu chúng tôi, so sánh hàm lượng creatinin máu thỏ lô chứng lô trị (uống cao nước cỏ mật liều 1,2g dược liệu/kg/ngày 4,8g dược liệu/kg/ngày) thời điểm trước sau dùng thuốc 15 ngày 30 ngày không thấy thay đổi có ý nghĩa (Bảng 4.54) Quan sát đại thể thận tất thỏ nghiên cứu cấu trúc vi thể 30% số thỏ thực nghiệm sau uống thuốc liên tục 30 ngày cho thấy thận hồn tồn bình thường, khơng có tổn thương (Ảnh 4.25 4.26) Cho đến nay, giới Việt Nam chúng tơi chưa tìm thấy cơng trình nghiên cứu độc tính bán trường diễn cỏ mật Tài liệu nghiên cứu cỏ mật cịn Trong danh mục “Cây thuốc vị thuốc Việt Nam” Đỗ Tất Lợi (2001) chưa có thuốc Trong “Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam” [ ] nhắc đến cỏ mật với thơng tin cịn sơ sài Vì chúng tơi khơng có tài liệu để so sánh Kết nghiên cứu chứng minh cao nước cỏ mật không gây ảnh hưởng đến tình trạng chung thỏ, khơng làm thay đổi số gia tăng trọng lượng thể, số đánh giá chức tạo máu, chức gan thận thỏ mô bệnh học số quan Như cao nước cỏ mật khơng gây 138 độc tính bán trường diễn thỏ Tuy nhiên để đánh giá đầy đủ độc tính bán trường diễn thuốc, cần phải tiến hành nhiều loài súc vật khác nhau, theo nhiều đường dùng thuốc khác có kết luận xác KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN 6.1.Nghiên cứu thực vật - Đã mô tả đặc diểm hình thái cỏ mật, đặc điểm vi phẫu thân đặc điểm bột dược liệu làm sở cho việc thu hái xây dựng Tiêu chuẩn dược liệu - Đã hoàn thành tiêu dược liệu (các TB lưu giữ Khoa Tài nguyên -Viện Dược liệu) - Đã xây dựng Dự thảo Tiêu chuẩn dược liệu cỏ mật 6.2.Thành phần hóa học cỏ mật - Thành phần hóa học cỏ mật gồm số nhóm hoạt chất sau: Carotenoid, flavonoid, đường khử, flavonoid, acid hữu cơ, tanin, acid amin, saponin alcaloid - Lần phân lập xác định cấu trúc chất cỏ mật gồm : Vinaerioramoside, Ginsenoside A2 , Quercitrin, Daucosterol Palmatine Trong Vina-erioramoside chất lần phân lập từ thiên nhiên 6.3.Tác dụng sinh học cỏ mật 6.3.1 Tác dụng bảo vệ gan phục hồi tổn thương gan 6.3.1.1 Tác dụng bảo vệ gan Cao nước cỏ mật có tác dụng bảo vệ gan tốt Cao nước cỏ mật với liều 4,5g dược liệu/ kg 9,0g dược liệu /kg thể trọng có tác dụng bảo vệ gan hai mơ hình gây độc CCl4 liều đơn paracetamol liều cao chuột nhắt trắng, thông qua việc làm giảm rõ rệt hoạt độ AST, ALT huyết thanh, MDA dịch đồng thể gan giảm tổn thương mô bệnh học gan Tác dụng bảo vệ gan liều tương đương tương đương với silymarin 67mg/kg 6.3.1.2 Tác dụng làm tăng phục hồi tổn thương gan 139 Cao nước cỏ mật liều 9,0g/kg có tác dụng làm tăng phục hồi tổn thương gan CCl4 liều thấp kéo dài gây chuột nhắt trắng - Sau ngày điều trị, cao nước cỏ mật giảm rõ rệt hoạt độ AST, ALT huyết thanh, MDA dịch đồng thể gan, nhiên chưa đưa giá trị trở bình thường - Sau ngày điều trị, cao nước cỏ mật đưa hoạt độ enzym AST, ALT nồng độ MDA trở bình thương, khơng thấy cịn tổn thương mô bệnh học Cơ chế tác dụng bảo vệ phục hồi tổn thương gan cỏ mật thơng qua tác dụng chống oxy hóa, ức chế q trình peroxy hóa màng tế bào 6.3.2 Tác dụng lợi mật cao nước cỏ mật Cỏ mật liều 4,5 g/kg liều 9,0 g/kg làm tăng trọng lượng dịch mật có ý nghĩa so với lơ chứng, Actiso có tác dụng lợi mật tương đương cỏ mật liều 4,5 g/kg, thấp cỏ mật liều g/kg 6.3 3.Tác dụng chống viêm cấp viêm mạn cỏ mật Cỏ mật với hai liều 3,0g/kg 6,0g/kg tác dụng chống viêm cấp mơ hình phù chân chuột gây viêm cấp carragenin viêm mạn mơ hình gây u hạt thực nghiêm chuột Độc tính cấp độc tính bán trường diễn cỏ mật 6.4.1 Độc tính cấp Cao nước cỏ mật có độc tính cấp thấp, dùng đến liều 492g dược liệu/kg chuột nhắt trắng theo đường uống (gấp 109 lần liều điều trị chuột) khơng thấy có biểu ngộ độc chưa có chuột chết Vì chưa xác định độc tính cấp chưa tính LD50 cao nước cỏ mật chuột nhắt trắng theo đường uống 6.4.2 Độc tính bán trường diễn Cao nước cỏ mật liều 1,2g dược liệu/kg/ngày 4,8g dược liệu/kg/ngày cho thỏ uống liên tục 30 ngày, không thấy ảnh hưởng đến tình trạng chung, gia 140 tăng trọng lượng, chức hệ thống tạo máu, cấu trúc chức gan, thận thỏ KIẾN NGHỊ -Đề nghị gọi tên khoa học cỏ mật thân cao Eriochloa procera ( Retz.) C Hubb., họ Lúa ( Poaceae ), tên đồng danh Eriochloa ramosa ( Retz.) Hack - So với loại dược liệu có tác dụng bảo vệ gan , cỏ mật có nguồn nguyên liệu dồi dào, dễ kiếm giá thành rẻ Bước đầu nghiên cứu thành phần hóa học chứng minh cao nước cỏ mật có tác dụng bảo vệ gan, phục hồi tổn thương gan cấp, tác dụng lợi mật, độc tính cấp, độc tính bán trường diễn thấp Vì để bổ sung loại thuốc điều trị bệnh lý gan, mật từ nguồn nguyên liệu này, góp phần thay thuốc nhập khẩu, cần tiếp tục nghiên cứu chế phẩm từ cỏ mật làm thuốc bảo vệ gan Hà Nội ngày 10 tháng năm 2009 Xác nhận quan quản lý ĐT Chủ nhiệm ĐT TS Lê Thị Kim Loan 141 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Bùi Thị Bằng, Nguyễn Thượng Dong CS (2004) , Tác dụng chống viêm gan ức chế xơ gan chế phẩm chiết xuất từ chè đắng thu hái Cao bằng, Tạp chí Dược liệu số 5, tập 10, trang 145-151 Nguyễn Văn Đàn, Nguyễn Viết Tựu (1985), Phương pháp nghiên cứu hóa học thuốc, Nhà xuất Y học, chi nhánh TP Hồ Chí Minh Đỗ Huy Bích tác giả khác (2004), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật Bộ Y tế (2006), Tổng kết thẩm định báo cáo ADR năm 2002-2006, Trung tâm ADR quốc gia Chương trình hợp tác Việt Nam- Thuỵ Điển Bộ Y tế (1977), Dược điển Việt Nam tập 1, Nhà xuất Y học Bộ Y tế (2002), Dược điển Việt Nam III, Nhà xuất Y học Bộ môn Dược lý, Đại học Y Hà Nội ( 2005), Dược lý học lâm sàng, Nhà xuất Y học, trang 11-30,166-180 Bộ mơn Hố sinh, Đại học Y Hà Nội (2007), Hoá sinh, Nhà xuất Y học, trang 231-273, 318, 371-375 Bộ môn Miễn dịch, Đại học Y Hà Nội (2007), Sinh lý bệnh học, Nhà xuất Y học, trang 169-190 10 Bộ môn Nội, Đại học Y Hà Nội ( 004), Bệnh học nội khoa tập 1, Bài giảng sau đại học, Nhà xuất Y học, trang 113-130 11 Lê Văn Công tác giả khác ( 1999), Nghiên cứu thực vật học tác dụng hạ sốt cỏ mật, Tạp chí Dược liệu số 3, tập 14, trang 87-90 12 Lê Văn Công tác giả khác ( 999), Nghiên cứu độc tính cấp tác dụng giảm đau cỏ mật, Tạp chí Dược liệu số 5, tập 5, trang 146-149 13 Bùi Xuân Dương (2006), Sống với bệnh viêm gan, Nhà xuất công an nhân dân 14 Đỗ trung Đàm (2001), Phương pháp ngoại suy liều có hiệu tương đương người động vật thực nghiệm, Tạp chí Dược học số 3, trang 142 15 Vũ Bằng Đình, Phạm Kim Thanh, Viêm gan virus hậu quả, Nhà xuất Y học, trang 382-400 16 Lê Đăng Hà ( 1999), Một số đặc điểm dịch tễ lâm sàng hậu viêm gan virus, Thông tin Y Dược số 10, trang 12-15 17 Phạm Hoàng Hộ (2000), cỏ mật thân cao (Eriochloa procera (Retz.) C Hubb.), Cây cỏ Việt Nam, Nhà xuất trẻ, trang 675 18 Hồng Tích Huyền ( 1996), Viêm gan thuốc, Tài liệu giảng dậy sau đại họcChuyên ngành Dược lý - Đại học Y Hà Nội 19 Nguyễn Thế Khánh, Phạm Tử Dương (2001), Xét nghiệm sử dụng lâm sàng, Nhà xuất Y học, trang 650-691 20 Nguyễn Thị Tuyết Mai (2005), Nghiên cứu tác dụng bảo vệ phục hồi tổn thương gan cấp curcumioid thực nghiệm, Luận văn thạc sỹ Y học, trường Đại học Y Hà Nội 21 MIMS Việt Nam ( 2001), Thuốc điều trị bệnh gan mật 22 Phan Hải Nam ( 2004), Một số xét nghiệm hoá sinh lâm sàng, Học viện Quân Y, trang 22-36 23 Phạm Hoàng Phiệt ( 2001), Tổng quan tình hình viêm gan siêu vi B Việt Nam, Hội thảo khoa học điều trị viêm gan ngày nay, TP Hồ Chí Minh tháng 12/2001 24 Hồng Quang, Hoàng Hà ( 1997 ), Nghiên cứu so sánh mộth số số hoá sinh bệnh nhân viêm gan cấp HBV virus viêm gan khác, Tạp chí Y học Việt Nam số 8, trang 6-12 25 Hồng Trọng Thảng (2002), Bệnh tiêu hố gan mật, Nhà xuất Y học, trang 213-227 26 Nguyễn Thị Thanh Xuân (2005), Sơ tìm số tác dụng sinh học dịch chiết cồn cỏ mật (Eriochloa ramosa (Retz.) Hack , họ Poaceae)., Khoá luận tốt nghiệp Dược sĩ khoá 2001-2005 27 Viện Khoa học CN Việt Nam Đại học quốc gia (2005), Chi cỏ mật (Eriochloa H.B.K.), Danh lục loài thực vật Việt Nam, Nhà xuất Nông nghiệp, trang 844 143 28 Viện Dược liệu (2004), Phương pháp nghiên cứu tác dụng dược lý thuốc từ thảo dược , Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, trang 171-183 29 Cao Văn Viên ( 2005), Hội thảo chuyên đề Hepsera- bước tiến điều trị viêm gan siêu vi B mạn tính, Hà Nội 1/2005 30 Vũ Đình Vinh (2001), Hướng dẫn sử dụng xét nghiệm sinh hoá, Nhà xuất Y học, trang 251-253 Tiếng Anh 31 Agrawal, P.K (1989), Carbon-13 NMR of flavonoid , Elsevier Sciene Puliehers B V., pp 154-155 32 Bao En Wands ( 2000), Tretment of chronic liver disease with traditional chinese medicine , Journal of gastroenterology and hepatology,Vol.15,pp 67-70 33 Bataller, R., Brenner et all (2005), Liver fibrosis, Journal of clinical investigation 115, pp 209-218 34 Borel J.P, Maquart F el all (2006), Hóa sinh cho thày thuốc lâm sàng, Nhà xuất y học 35 Britton R.S., Bacon B.R (1994 ), Role of free radicals in liver diseases and hepatic fibrosis.41 (4 ), pp342-348 36 Dhawan B.N (1979), Hepatoprotective activity of natural products experimental evaluation, International workshop on medicinnal plants their bioactivity, screening and evaluation Lucknow, L15 37 Hewawasam R.P, Jayatilaka K.A.P.W Pathirana C et al (2003), Protective effects of Asteracantha longifolia extract in mouse liver injury induced by carbon tetrachlorid and paracetamol, Pharm pharmacol 55(10) , pp 1413-1418 38 Hewawasam R.P, Jayatilaka K.A.P.W Pathirana C et al (2004), Hepatoprotective effects of Epaltes divaricata extract on carbon tetrachlorid induced hepatotoxicity in mice, Indian J med res vol 120, pp 30-34 144 39 IsaacTúnez, M Carmen Munoz et al (2005), Hepato- and neurotoxicity induced by thioacetamide : Protective effects of melatonin and dimethylsulfoxide, Phamacological rearch, pp 223-228 40 Imperato F (1994), Luteolin 8-C-rhamnoside-7-O- rhamnoside from Pteris cretica Phytochemistry, 37, pp 589-590 41 Kathleen A.D.(1998), Toxicologic emergencies, Jeanmn M Roche, pp 197-209, 213-225 42 Kim D S, Chang Y.J et al (1995), Dammarane saponin from Panax ginseng , Phytochemistry 40 (5), pp 1493-1497 43 Lai C.L., Chien R.N et al (1997), Lamivudine is effective in supressing hepatitis B virut DNA in Chinese hepatitis B surface antigen carriers : a placebo-controlled trial, Hepatology 25, pp 241-244 44 Liu G.T et al ( 2005), Mechanism of protective action of bicyclol againts carbon tetrachlorid - induced liver injury in mice, Liver iternaltionalvol 25, pp872-870 45 Martin J S (1998), Acetaminophen, Toxicologic emegencies, Jeanmn M Roche, pp 543-558 46 Min Y.D., Yang M.C et al (2006), Protoberberine alkaloids and their reversal activity of P-gp expressed multidrug resistance (MDR) from the rhizoma of Cotis Japonica makino, Archives of Pharmacal Research 29, pp 757-761 47 Nagoev B.S., Abidw M.T., Ivanova M.R (2002), “ LPO and freeradical oxidation parameters in patiens with acute viral hepatitis “, Bull Exp Bio med 134 (6), pp 557558 48 Pradhan, S.C., et al (2006), Hepatoprotective herba drug, Silymarin from Experimental Pharmacology to clinical medicine, J Pharm pharmacol 52 (4), pp 437440 49 Rudnicki.M, Siveira M.M et all (2006), Protective effects of Passiflora alata extract pretreatment on carbon tetrachloride induced oxidative damage in rat., Food and chemical toxicology, pp 656-661 145 50 Voutquenne L et al (1999), Cytotoxic polyisoprenes and glycosides of long- chain fatty alcohol from Dimocarpus fumatus, Phytochemistry 50, pp 63-69 51 Weber L et al ( 2003), Hepatotoxicity and mechanism of action haloalkanes : carbon tetrachloride as a toxicological model, Crid Rev Toxicol 33 (2), pp 105-136 52 Wiliam m Lee (2003), Drug-induced hepatotoxicity., N.Engl J med vol 349, pp 478-485 53 Wolters L.M., Hansen B.E et al (2002), Vial dynamic in chronic hepatitis B patients during lamivudine therapy, Liver 22 (20), pp 121-126 54 Wong D.K.H, Cheung A.M et al (1993), Effects alpha-interferon treatment in patients with hepatitis B antigen possiticve chronic hepatitis B : A meta- analysis , Ann Intern Med 119, pp 312-323 55 Wong J B (1998), Iterferon treatment for chronic hepatitis B or C ìnfection : Cost and effectiveness , Acta Gastoenterol Belg Apr - Jun61, pp238-242 56 Yahara S et al (1979), Futher stdy on dammane-type saponin of roots , leaves, flower- buds and fruits Panax gíneng C A Mey., Chem Bull 27, pp 88-92 57 Yoshikawa M et al (2003), Structures of new dammarane-typ triterpene saponins from flower buds of Panax notoginseng and hepatoprotective efféct of principal gíneng saponin, Journal of natural products 66, pp 922-927 146