Thiết kế và tổng hợp các acid hydroxamic mang khung quinazolin hướng tác dụng kháng tế bào ung thư.

Thiết kế và tổng hợp các acid hydroxamic mang khung quinazolin hướng tác dụng kháng tế bào ung thư.Thiết kế và tổng hợp các acid hydroxamic mang khung quinazolin hướng tác dụng kháng tế bào ung thư.Thiết kế và tổng hợp các acid hydroxamic mang khung quinazolin hướng tác dụng kháng tế bào ung thư.Thiết kế và tổng hợp các acid hydroxamic mang khung quinazolin hướng tác dụng kháng tế bào ung thư.Thiết kế và tổng hợp các acid hydroxamic mang khung quinazolin hướng tác dụng kháng tế bào ung thư.Thiết kế và tổng hợp các acid hydroxamic mang khung quinazolin hướng tác dụng kháng tế bào ung thư.BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐOÀN THANH HIẾU THIẾT KẾ VÀ TỔNG HỢP CÁC ACID HYDROXAMIC MANG KHUNG QUINAZOLIN HƯỚNG TÁC DỤNG KHÁNG TẾ BÀO UNG.

Trang thiết bị cho thử hoạt tính sinh học 45

Các trang thiết bị sử dụng cho thử hoạt tính tại Khoa Dược, Đại học Chungbuk,Hàn Quốc: (1) Máy điện di gel Mini-PROTEAN® tetra cell (bình điện di) nối qua 2 điện cực với máy PowerPac® 250V/30A/300W (Bio-rad); (2) Tủ nuôi cấy Vision scientificCo.Ltd (model VS-9108 MS), tủ làm thực nghiệm (Vision bio-safety clean beach); (3)Kính hiển vi Nikon - FX-35DX để đếm tế bào, máy ly tâm Union 5KR, máy lắc Vortex genie 2; (4) Tủ lạnh giữ môi trường nuôi cấy, bồn làm ấm môi trường nuôi cấy đến 37 o CJeio tech SWB- 03, tủ giữ mẫu -18 o C (DIOS); (5) Pipet Gilson các loại 1000; 200; 20; 1-10; 2-20 àl; (6) Mỏy đo độ hấp thụ SpectraMax (Model: Max plus), mỏy đo độ hấp thụ huỳnh quang SpectraMax M2 kết nối máy tính.

NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 45

Nội dung nghiên cứu 45

- Thiết kế cấu trúc của các acid hydroxamic mới mang khung quinazolin hướng ức chế HDAC và kháng tế bào ung thư.

- Dự đoán tương tác của các chất dự kiến với mô hình cấu trúc trung tâm hoạt động của enzym HDAC2 bằng phương pháp docking protein.

2.3.1.2 Tổng hợp và xác định cấu trúc

- Tổng hợp acid hydroxamic mới mang khung quinazolin có cấu trúc đã được thiết kế và được dự đoán là có tương tác tốt với HDAC2.

- Khẳng định cấu trúc của các chất tổng hợp dựa trên phân tích dữ liệu phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng (MS) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân ( 1 H-NMR, 13 C-

2.3.1.3 Đánh giá hoạt tính sinh học

- Đánh giá tác dụng ức chế histon deacetylase tổng chiết từ tế bào HeLa của các dẫn chất tổng hợp được bằng phương pháp định lượng huỳnh quang.

- Đánh giá tác dụng kháng ung thư của các dẫn chất tổng hợp được trên một số dòng tế bào ung thư người.

- Phân tích liên quan cấu trúc – tác dụng của các dẫn chất, sử dụng kết quả docking phân tử.

- Dự đoán đặc tính dược động học – độc tính của một số chất có tác dụng sinh học nổi bật.

Phương pháp nghiên cứu 46

2.3.2.1 Phương pháp thiết kế cấu trúc

Với mục tiêu sàng lọc để tìm ra các chất tiềm năng có tác dụng ức chế HDAC tốt và kháng tế bào ung thư mạnh, các hợp chất trong luận án được thiết kế dựa trên cấu trúc khung cơ bản bao gồm 3 phần chính của các chất ức chế HDAC đã trình bày trong Chương 1, sử dụng các chất dẫn đường là nexturastat A, panobinostat và M344. Các dẫn chất mới được giữ nguyên cấu trúc acid hydroxamic cho phần liên kết với ion kẽm Sự thay đổi ở cấu trúc phần nhận diện bề mặt và phần cầu nối được thực hiện bằng cách áp dụng linh hoạt các biện pháp thiết kế cấu trúc cơ bản như thay đổi cấu trúc vòng, kéo dài/thu ngắn mạch nhánh và thay đổi nhóm thế Khung quinazolin được sử dụng làm cấu trúc chính cho phần nhận diện bề mặt, có thể gắn các nhóm thế khác nhau về vị trí hoặc tính chất hút/đẩy điện tử Vị trí liên kết giữa khung quinazolin với phần cầu nối cũng được khảo sát Các cấu trúc được sử dụng cho phần cầu nối là cấu trúc mang vòng thơm, hoặc được thay bằng mạch alkyl có độ dài khác nhau Nội dung cụ thể về kết quả thiết kế cấu trúc, cách tổng hợp và kết quả đánh giá tác dụng sinh học của các chất được trình bày chi tiết trong các phần tiếp theo của luận án.

Cấu trúc của tất cả các dẫn chất mới đã được thiết kế sẽ được dự đoán khả năng tương tác với phân tử mục tiêu của luận án là HDAC2, sử dụng kỹ thuật docking protein Các kết quả docking vào HDAC2 của tất cả dẫn chất và kết quả docking vào HDAC6 của một số dẫn chất được sử dụng cho việc bàn luận về mối liên quan cấu trúc – tác dụng của các chất đã tổng hợp được.

Các dẫn chất thiết kế (cấu tử) được tiến hành docking với HDAC2 và HDAC6 sử dụng chương trình Molecular Operating Environment (MOE 2009.10) [104] Quá trình docking được tiến hành tại bộ môn Hoá dược, Trường Đại học Dược Hà Nội, qua ba bước chuẩn bị cấu tử, chuẩn bị protein, mô phỏng docking như đã trình bày trong

Chương 1, cụ thể như sau:

Chuẩn bị cấu tử : Cấu trúc các cấu tử được vẽ cấu trúc 2D bằng phần mềm như

ChemDraw, sau đó được chuyển thành cấu trúc không gian 3D, sử dụng module clean in 3D của các phần mềm như Marvin Sketch Cấu trúc này sau đó được lưu dưới dạng

Trypos SYBYL molfile (*.MOL) và được sử dụng làm đầu vào cho các phần mềm để tối ưu hóa cấu tử cho chương trình mô phỏng docking bao gồm MOE 2009.10 và Avogadro 1.0 Các bước tối ưu hóa được tiến hành bao gồm gắn điện tích, deproton hóa các acid hydroxamic, xác định những liên kết có thể quay, gắn trường lực, sau đó xây dựng tập tin dữ liệu định dạng pdbqt.

Chuẩn bị protein : Cấu trúc của các HDAC mục tiêu được tìm kiếm trên Ngân hàng dữ liệu protein (https://www.rcsb.org/) Căn cứ vào chất lượng của hình ảnh protein, sự có mặt của trung tâm hoạt động kết hợp với phối tử, sự liền mạch của chuỗi protein, cấu trúc được lựa chọn cho thử nghiệm docking là HDAC2 (PDB ID: 4LXZ)

[78], và HDAC6 (PDB ID: 5EEI) [46] Sau khi có cấu trúc 3D, sử dụng các phần mềm để chuẩn bị protein cho chương trình mô phỏng docking Các bước chuẩn bị thường gồm: giữ nguyên vị trí của ion kẽm, loại nước và các cấu tử (nếu có), gắn điện tích, sửa điện tích cho cả phân tử và đặc biệt là cho các acid amin quan trọng, ví dụ như trên HDAC2 gồm His145, His146, Asp181, His183, Asp269, gắn trường lực, xây dựng tập tin định dạng pdbqt và gán trường lực AMBER FF99 [114].

Mô phỏng docking: Quá trình docking gồm hai bước chính là (1) dock lại chất đồng kết tinh nhằm đánh giá độ chính xác của mô hình docking, (2) dock các chất mới thiết kế sử dụng mô hình đã được kiểm chứng ở bước (1).

Trong luận án này, phương pháp docking được tiến hành bằng cách giữ cố định protein và để cấu tử di chuyển linh động trên bề mặt protein Lựa chọn kết quả docking dựa vào trạng thái liên kết của cấu tử với protein và tính năng lượng gắn kết giữa protein và cấu tử dựa trên điểm docking (docking scores) để lựa chọn cấu dạng tối ưu nhất của cấu tử khi gắn với protein Điểm docking được tính toán sử dụng các hàm tính điểm London hoặc GBVI/WSA để tính toán các mức năng lượng liên kết tối thiểu (GL, dGL, kcal/mol) và năng lượng liên kết tự do (GA, dGA, kcal/mol) Giá trị điểm docking thường nhận giá trị âm (-) Cấu dạng có giá trị này càng nhỏ cho thấy phức hệ cấu tử- protein tạo thành càng bền vững.

Bước 1, tiến hành docking lại với cấu tử ban đầu có trong cấu trúc protein (SAHA) để kiểm chứng sự lặp lại, giá trị độ lặp lại cần càng cao càng tốt và thỏa mãn yêu cầu RMSD < 2 Å [56], [143].

Bước 2, tiến hành docking các chất mới thiết kế vào trung tâm hoạt động củaHDAC Lựa chọn vị trí liên kết căn cứ theo các tiêu chí gồm cách thức tạo phức với ion kẽm và tương tác với các acid amin quan trọng trong trung tâm hoạt động.

2.3.2.3 Phương pháp tổng hợp, kiểm tra độ tinh khiết và xác định cấu trúc a Phương pháp tổng hợp

Sau khi có kết quả thiết kế cấu trúc, luận án dựa trên những nguyên tắc và phương pháp cơ bản của hóa học hữu cơ để tổng hợp các dẫn chất acid hydroxamic mới có phần nhận diện bề mặt mang khung quinazolin hoặc quinazolin-4(3H)-on và phần cầu nối là dẫn chất propenamid hoặc benzamid (hình 2.1) Luận án sử dụng các phản ứng: phản ứng ngưng tụ quinazolinon từ acid benzoic, phản ứng alkyl hóa, phản ứng amin hóa quinazolin-4(3H)-on, phản ứng tổng hợp acid hydroxamic từ ester Qui trình tổng hợp các dãy chất I – VIII được trình bày tóm tắt trong các sơ đồ 2.1-2.3.

Hình 2.1 Cấu trúc dự kiến của các dẫn chất dãy I-VIII.

Sơ đồ 2.1 Tóm tắt qui trình tổng hợp dãy I.

Sơ đồ 2.2 Tóm tắt qui trình tổng hợp dãy II.

- Dãy III: Tổng hợp theo qui trình tương tự dãy I, sử dụng methyl (E)-4- bromomethylpropenoat thay cho methyl 4-bromomethylbenzoat.

- Dãy IV: Tổng hợp theo qui trình tương tự dãy I, sử dụng ethyl 7- bromoheptanoat thay cho methyl 4-bromomethylbenzoat.

- Dãy V: Tổng hợp theo qui trình tương tự dãy I, sử dụng ethyl 8- bromooctanoat thay cho methyl 4-bromomethylbenzoat.

- Dãy VI: Tổng hợp theo qui trình tương tự dãy II, sử dụng ethyl 7- bromoheptanoat thay cho methyl 4-bromomethylbenzoat.

Sơ đồ 2.3 Tóm tắt qui trình tổng hợp dãy VII.

- Dãy VIII: Tổng hợp theo qui trình tương tự dãy VII, sử dụng methyl 4- (aminomethyl)benzoat hydrochlorid thay cho ethyl 7-aminoheptanoat hydrochlorid. b Phương pháp kiểm tra độ tinh khiết

- Nhiệt độ nóng chảy: Xác định bằng máy đo nhiệt độ nóng chảy nhiệt điện (Electrothermal digital).

- Sắc ký lớp mỏng: Dùng để theo dõi quá trình phản ứng, xác định thời điểm kết thúc phản ứng và kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm sau quá trình tinh chế Sắc ký lớp mỏng được tiến hành trên bản mỏng silica gel 60 GF 254 tráng sẵn được hoạt hóa ở 110 trong 30 phút Hệ dung môi pha động tùy thuộc vào đặc điểm của chất phân tích.

Chất phân tích được hòa tan trong dung môi thích hợp và đưa lên bản mỏng với thể tớch khoảng 2 àl Đặt bản mỏng vào bỡnh sắc ký đó bóo hũa dung mụi ở điều kiện phòng và để pha động chạy trên bản mỏng Quan sát kết quả dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm.

Quá trình tổng hợp, tinh chế các chất được thực hiện tại phòng thí nghiệm Nghiên cứu phát triển thuốc mới, bộ môn Hóa dược, Trường Đại học Dược Hà Nội. c Phương pháp xác định cấu trúc

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 55

KẾT QUẢ THIẾT KẾ CẤU TRÚC, DỰ ĐOÁN TƯƠNG TÁC, TỔNG HỢP HÓA HỌC VÀ KHẲNG ĐỊNH CẤU TRÚC 55 1 Kết quả thiết kế cấu trúc và dự đoán tương tác của các chất với

3.1.1 Kết quả thiết kế cấu trúc và dự đoán tương tác của các chất với HDAC2

Cấu trúc của các dẫn chất acid hydroxamic mới trong luận án được thiết kế dựa trên những khung cấu trúc mang hoạt tính, phù hợp với từng vùng chức năng trong khung cấu trúc ba phần chính của các chất ức chế HDAC Phần nhận diện bề mặt đã được chỉ ra trong các nghiên cứu nên là các cấu trúc vòng thơm, có thể kết hợp với các dị vòng giàu electron Quinazolin là khung cấu trúc mang dược tính có mặt trong nhiều hợp chất đã được chứng minh là có tác dụng kháng tế bào ung thư theo các cơ chế tổng hợp thymidylat, ức chế hệ enzym chỉnh sửa chuỗi ADN, ức chế receptor của yếu tố tăng trưởng biểu bì (EGFR) hay ức chế tubulin polymerase [148] Cấu trúc quinazolin đã được chứng minh là phù hợp cho phần nhận diện bề mặt của các dẫn chất hydroxamat hướng tác dụng ức chế HDAC6 [164], [166] Từ những kết quả khả quan của một số thử nghiệm tiền nghiên cứu, khung quinazolin được lựa chọn làm hợp phần chính cho vùng nhận diện bề mặt của các chất trong luận án, nhưng được phát triển thêm bằng cách thay đổi nhóm gắn ở vị trí số 4 (=O) Các nhóm thế trên khung quinazolin là các nhóm có kích thước nhỏ, được thay đổi loại và vị trí nhằm đánh giá tác động của hiệu ứng hút điện tử hoặc đẩy điện tử đến hoạt tính của các chất Vì vậy, các chất được luận án thiết kế có khung cấu trúc chung như sau:

Hình 3.1 Khung cấu trúc dự kiến của các dẫn chất.

Phần cầu nối của các chất được khảo sát là mạch alkyl có độ dài 6-7 carbon hoặc cấu trúc có chứa vòng thơm 6 cạnh Sử dụng cầu nối mang vòng thơm là hướng mới trong nghiên cứu các chất ức chế HDAC, cấu trúc đã được chứng minh là có khả năng tạo nhiều liên kết hơn giữa cơ chất với các acid amin thơm của enzym, trong đó có một số chất đã được cấp phép sử dụng làm thuốc chống ung thư như nexturastat A, belinostat và panobinostat [168].

Khung cấu trúc của các chất trong luận án được thiết kế dựa trên các hợp phần mang hoạt tính tiềm năng và đều là những khung cấu trúc mới chưa được công bố trong các tài liệu trước đó Nhằm củng cố thêm cơ sở cho việc tiến hành nghiên cứu thực nghiệm, các cấu trúc này được dự đoán tương tác với mô hình trung tâm hoạt động của HDAC2, sử dụng phần mềm docking MOE phiên bản 2009.10, cấu trúc tinh thể tia X của phức hợp HDAC2 với SAHA được thu thập từ ngân hàng dữ liệu protein (PDB ID: 4LXZ) [78] Kết quả dự đoán khả năng tương tác của các chất thiết kế với trung tâm hoạt động của HDAC2 được minh họa trong các hình 3.3, 3.5, 3.7, được trình bày trong các bảng 3.1 – 3.3 và được bàn luận chi tiết trong mục 4.2.

Như vậy, các dẫn chất trong luận án được thiết kế, tổng hợp và thử hoạt tính sinh học theo từng nhóm dãy chất qua ba bước như sau:

3.1.1.1 Bước 1 Thiết kế cấu trúc dãy chất I-III (nhóm 1)

Thay vùng nhận diện bề mặt của các chất dẫn đường nexturastat A và panobinostat bằng khung quinazolin-4(3H)-on, được các dãy chất I, II và III (nhóm

1) Các dãy chất này có cấu trúc benzamid/propenamid (cinnamamid) trong vùng cầu nối.

Hình 3.2 Kết quả thiết kế cấu trúc của các dẫn chất dãy I, II và III.

Các kết quả docking được minh họa trên hình 3.3 và bảng 3.1 cho thấy tất cả các cấu trúc dự kiến đều có tương tác tốt với enzym, với các giá trị năng lượng liên kết dG từ -27,25 kcal/mol đến -18,90 kcal/mol, thấp hơn hoặc tương đương SAHA (giá trị này của SAHA là 19,58 kcal/mol) Khoảng cách giữa ion kẽm và các nguyên tử oxy trong các nhóm hydroxyl và carbonyl của chức acid hydroxamic trong các chất đo được từ2,18-2,77 Å (giá trị này của SAHA là 2,33-2,34 Å) Kết quả docking phân tử các chất được trình bày và bàn luận trong mục 4.2.1 cũng chỉ rõ khả năng tương tác với HDAC2 thông qua các liên kết tạo phức chelat với ion kẽm ở đáy túi enzym, các liên kết hidro,liên kết  và tương tác van der Waals với các acid amin ở lòng túi và bề mặt enzym.Như vậy, kết quả dự đoán khả năng tương tác với HDAC2 cho thấy hầu hết các cấu trúc dự kiến có tương tác với enzym tốt hơn SAHA Đây là cơ sở để luận án tổng hợp các dẫn chất theo cấu trúc thiết kế, tinh chế và thử tác dụng sinh học của các chất dãy I-III trên các mô hình in vitro.

Hình 3.3 Mô phỏng docking SAHA, Ia-h, IIa-d và IIIa-d vào HDAC2.

(Vùng hoạt động và các trung tâm tương tác của HDAC2 có màu sáng; ion kẽm là hình cầu có màu xanh đậm.)

Bảng 3.1 Năng lượng liên kết với HDAC2 của các chất Ia-h, IIa-d và IIIa-d.

Khoảng cách tới Zn 2+ b Chất R dG c

SAHA a -19,58 2,33 2,34 a SAHA: acid suberoylanilidhydroxamic; b Khoảng cách (Å) từ các nguyên tử oxy (=O và -OH) của nhóm chức acid hydroxamic tới ion kẽm; c Năng lượng liên kết (kcal/mol) được tính bằng phần mềm MOE 2009.10

3.1.1.2 Bước 2 Thiết kế cấu trúc dãy chất IV-VI (nhóm 2)

Kết quả thử hoạt tính của các dãy chất nhóm 1 cho thấy khung quinazolin- 4(3H)- on phù hợp cho hoạt tính ức chế HDAC và độc tính tế bào Phần cầu nối của các dãy chất I, II và III (nhóm 1) là benzamid/propenamid (cinnamamid) cũng cho hoạt tính tốt Điều thú vị là dãy chất III thể hiện hoạt tính gây độc tế bào mạnh hơn các dãy chất I-II, kết quả này có sự phù hợp với hoạt tính ức chế enzym và được lý giải bằng các phân tích liên quan cấu trúc-tác dụng (mục 4.2.1) Kết quả docking phân tử của các dãy chất

IVa-i, Va-i, VIa-c cho thấy cấu trúc propenamid trong phần cầu nối của dãy chất III giúp cho cầu nối của các chất này dài hơn các dãy chất I-II, do đó, nhóm chức acid hydroxamic dễ dàng tiếp cận với ion kẽm ở phần đáy túi enzym hơn (chiều dài túi liên kết của HDAC2 ~8-10 Å) Cầu nối cinnamamid của các chất dãy III có độ dài tương đương cầu nối heptanamid của SAHA Vì vậy, cấu trúc quinazolin-4(3H)-on tiếp tục được sử dụng cho phần nhận diện bề mặt, phần cầu nối được thay bằng cấu trúc mạch thẳng có độ dài tương đương 6 hoặc 7 carbon, thu được các dãy chất IV, V, VI (nhóm 2).

Hình 3.4 Kết quả thiết kế cấu trúc của các dẫn chất dãy IV, V và VI.

Tương tự các chất nhóm 1, kết quả docking được minh họa trên Hình 3.5 và trình bày trong Bảng 3.2 cho thấy tất cả các cấu trúc dự kiến nhóm 2 đều có tương tác tốt với enzym, với các giá trị năng lượng liên kết dG từ -24,45 kcal/mol đến -16,39 kcal/mol, thấp hơn hoặc tương đương SAHA Đặc biệt, nhiều chất nhóm 2 có khoảng cách giữa ion kẽm và các nguyên tử oxy trong các nhóm hydroxyl và carbonyl của chức acid hydroxamic của các chất đo được ngắn hơn so với SAHA, ngược lại với các chất dãy I và II Với khoảng cách như vậy, các dẫn chất nhóm 2 thuận lợi hơn trong quá trình tạo phức chelat với ion kẽm ở đáy túi Kết quả docking phân tử các chất được trình bày và bàn luận trong mục 4.2.2 cũng chỉ rõ các chất nhóm 2 có cơ chế xúc tác tương tự SAHA, là cơ sở để luận án tổng hợp các dẫn chất dãy IV-IV theo cấu trúc thiết kế.

Hình 3.5 Mô phỏng docking SAHA (A) và IVa-i, Va-i, VIa-c (B) vào HDAC2.

(Vùng hoạt động và các trung tâm tương tác của HDAC2 có màu sáng

Ion kẽm là hình cầu có màu xanh đậm.)

Bảng 3.2 Năng lượng liên kết với HDAC2 của các chất IVa-i, Va-i và VIa-c.

Chất R dG c Khoảng cách tới Zn 2+ b Chất R dG c Khoảng cách tới Zn 2+ b

Ghi chú: a SAHA, acid suberoylanilidhydroxamic; b Khoảng cách (Å) từ các nguyên tử oxy (=O và - OH) của nhóm chức acid hydroxamic tới ion kẽm; c Năng lượng liên kết (kcal/mol) được tính bằng phần mềm MOE 2009.10

3.1.1.3 Bước 3 Thiết kế cấu trúc dãy chất VII-VIII (nhóm 3)

Kết quả thử hoạt tính của các chất nhóm 2 cho thấy vùng cầu nối là mạch thẳng 6C có hoạt tính tốt hơn mạch 7C Mặt khác, vùng cầu nối là benzamid hoặc cinnamamid trong cấu trúc của các chất nhóm 1 đều cho hoạt tính tốt Vì vậy, luận án tiếp tục thiết kế các dãy chất VII và VIII (nhóm 3) có sử dụng mạch thẳng 6C và cấu trúc benzamid cho vùng cầu nối Vùng nhận diện bề mặt là khung quinazolin nhưng liên kết với phần còn lại của các chất qua cầu nối C-N ở vị trí C 4 của khung quinazolin

Các chất nhóm 3 cũng được dự đoán khả năng tương tác enzym bằng kỹ thuật protein docking, kết quả trình bày trong bảng 3.3 cho thấy tất cả các chất dự kiến dãy

VII-VIII đều có liên kết chặt chẽ với trung tâm hoạt động của HDAC2, với các giá trị năng lượng liên kết đo được từ -20,37 kcal/mol đến -18,08 kcal/mol, tương đươngSAHA Cơ chế xúc tác enzym tương tự SAHA của các chất này cũng được chỉ rõ trong mục 4.2.3, là cơ sở để tổng hợp các dẫn chất dãy VII-VIII theo cấu trúc thiết kế.

Hình 3.6 Kết quả thiết kế cấu trúc của các dẫn chất dãy VII và VIII

Bảng 3.3 Năng lượng liên kết với HDAC2 của các chất VIIa-i và VIIIa-i.

Chất R dG c Khoảng cách tới Zn 2+ b Chất R dG c Khoảng cách tới Zn 2+ b

Ghi chú: a SAHA, acid suberoylanilidhydroxamic; b Khoảng cách (Å) từ các nguyên tử oxy (=O và - OH) của nhóm chức acid hydroxamic tới ion kẽm; c Năng lượng liên kết (kcal/mol) được tính bằng phần mềm MOE 2009.10

3.1.2.Kết quả tổng hợp hóa học

Luận án đã tổng hợp được 55 dẫn chất acid hydroxamic mới mang khung quinazolin Kết quả tổng hợp các dẫn chất được trình bày chi tiết trong các mục 3.1.2.1

– 3.1.2.3 và được tóm tắt trong phụ lục 1.

3.1.2.1 Tổng hợp N-hydroxy-4-((4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)methyl)benzamid và dẫn chất (Ia-h)

Dãy chất Ia-h được tổng hợp theo qui trình trong sơ đồ 3.1 dưới đây:

Sơ đồ 3.1 Qui trình tổng hợp dãy chất Ia-h. a Tổng hợp N-hydroxy-4-((4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)methyl)benzamid (Ia)

Chất Ia được tổng hợp lần lượt qua 3 phản ứng:

+ Phản ứng ngưng tụ Niementowski (phản ứng đóng vòng quinazolinon giữa acid anthranilic và formamid): Cân 274 mg (2,0 mmol) acid 2-aminobenzoic (3.1a) cho vào bình cầu đáy tròn 100 ml, thêm 4 ml formamid, trộn đều Khuấy hỗn hợp ở

120 ℃ trong 5-6 giờ Sau khi kết thúc phản ứng, rót hỗn hợp vào nước đá (20 ml), trung tính hóa hỗn hợp bằng dung dịch NaHCO 3 5 %, làm lạnh (< 0 ),℃ để yên trong

5 giờ để tạo tủa Lọc lấy tủa, rửa tủa bằng nước cất lạnh và sấy khô tủa ở 60ºC Sản phẩm thu được quinazolin- 4(3H)-on (3.2a) là chất rắn, màu trắng, hiệu suất 96 % (280 mg), R f = 0,35 (DCM:MeOH

= 14:1) Sản phẩm đủ tinh khiết để sử dụng cho phản ứng tiếp theo.

KẾT QUẢ THỬ TÁC DỤNG ỨC CHẾ ENZYM, ĐỘC TÍNH TẾ BÀO VÀ DỰ ĐOÁN MỘT SỐ THÔNG SỐ DƯỢC ĐỘNG HỌC – ĐỘC TÍNH 102 1 Kết quả thử tác dụng ức chế enzym và gây độc tế bào 102

DỰ ĐOÁN MỘT SỐ THÔNG SỐ DƯỢC ĐỘNG HỌC – ĐỘC TÍNH

3.2.1.Kết quả thử tác dụng ức chế enzym và gây độc tế bào

Các sản phẩm là 55 dẫn chất acid hydroxamic mới mang khung quinazolin được thử tác dụng ức chế HDAC tổng chiết từ tế bào HeLa bằng phương pháp huỳnh quang và đánh giá hoạt tính kháng tế bào ung thư người trên các dòng tế bào ung thư đại tràng (SW620), ung thư biểu mô tiền liệt tuyến (PC3), ung thư phổi không tế bào nhỏ (NCI- H23) tại khoa Dược, Đại học Chungbuk (Cheongju, Hàn Quốc) Kết quả giá trị

IC50 cụ thể của các chất được trình bày trong bảng 3.4.

Bảng 3.4 Tác dụng ức chế HDAC và gây độc tế bào của các dẫn chất.

(IC 50 , 1 M) Độc tính tế bào (IC 50 , 1 M)/Dòng tế bào 2

Ghi chú: 1 Nồng độ chất làm giảm 50% hoạt lực enzym hoặc sự phát triển tế bào; 2 Dòng tế bào: SW620, ung thư đại tràng; PC3, ung thư tuyến tiền liệt; NCI-H23, ung thư phổi; 4 SAHA, suberoylanilid acid, chất đối chứng dương tính

3.2.2.Kết quả dự đoán một số thông số dược động học và độc tính

Trong 55 dẫn chất mới tổng hợp được, một số chất có tác dụng sinh học nổi bật được lựa chọn để dự đoán một số thông số dược động học và độc tính bằng các công cụ và phần mềm tính toán tin sinh học Các chất được lựa chọn bao gồm VIIc, VIIg,

VIIIc và VIIIh Các chất này được tính toán độ tan, tính thấm, mức độ giống thuốc, khả năng phân bố qua hàng rào máu não, độ bền chuyển hóa, liên kết protein, nguy cơ gây độc đối với cơ thể và môi trường, Kết quả cho thấy chất VIIIc có tiềm năng trong các nghiên cứu tiếp theo để phát triển thành thuốc Để thuận lợi cho quá trình bàn luận, các kết quả cụ thể sẽ được trình bày trong mục 4.3.1.

BÀN LUẬN 105

BÀN LUẬN VỀ TỔNG HỢP HÓA HỌC VÀ KHẲNG ĐỊNH CẤU TRÚC 105 1 Tổng hợp hóa học 105

Các dẫn chất mới trong luận án đều có cấu trúc tương đối phức tạp, là các dẫn chất acid hydroxamic mang khung quinazolin hoặc quinazolin-4(3H)-on, liên kết qua phần cầu nối là mạch carbon no hoặc không no dài từ 5-6 carbon, có thể chứa nhân thơm Để tổng hợp 55 dẫn chất mới này, cần thực hiện các qui trình gồm từ 3 đến 4 bước, sử dụng các phản ứng cơ bản sau: (1) Phản ứng Niementowski ngưng tụ tạo vòng quinazolin-4(3H)-on; (2) Phản ứng tạo vòng 2-methylquinazolin-4(3H)-on qua trung gian benzoxazinon; (3) Phản ứng N-alkyl hóa khung quinazolin-4(3H)-on; (4)

Phản ứng C 4- amin hóa khung quinazolin-4(3H)-on; (5) Phản ứng N-acyl hóa tạo acid hydroxamic.

4.1.1.1 Phản ứng Niementowski ngưng tụ tạo vòng quinazolin-4(3H)-on

Ngưng tụ tạo vòng quinazolin-4(3H)-on từ dẫn chất acid 2-aminobenzoic và formamid là phản ứng đầu tiên trong qui trình tổng hợp các chất thuộc dãy I, III-V,

VII- VIII, dựa trên phản ứng Niementowski, có cơ chế phản ứng minh họa trong sơ đồ

Sơ đồ 4.1 Cơ chế phản ứng Niementowski ngưng tụ tạo vòng quinazolin-4(3H)-on.

Giai đoạn đầu là sự ngưng tụ loại đi một phân tử nước giữa dẫn chất acid 2- aminobenzoic và formamid, xảy ra ở nhiệt độ thấp nhờ xúc tác của chính acid ban đầu, tạo chất trung gian imin Tiếp theo, ở nhiệt độ cao, cặp điện tử tự do trên nguyên tử N của formamid ban đầu tấn công vào carbon của nhóm chức carboxylic, sự trao đổi proton loại một phân tử nước và hỗ biến keto-enol sẽ tạo ra vòng quinazolin-4(3H)-on.

Trong phản ứng này, formamid là chất tham gia, đồng thời là dung môi cho phản ứng Giai đoạn tạo liên kết amid cần nhiệt độ cao, tuy nhiên, nhiệt độ quá cao có thể phân hủy sản phẩm, giảm hiệu suất phản ứng Vì vậy các phản ứng ngưng tụ này

– 6 giờ, cho hiệu suất cao (85 – 96 %) Sản phẩm dẫn chất quinazolin-4(3H)-on kết tủa khi rót hỗn hợp phản ứng vào nước lạnh, vì vậy một lượng natri hydrocarbonat được thêm vào để tạo muối của acid 2-aminobenzoic còn dư tan trong nước, giúp tạp này được loại bỏ dễ dàng khỏi sản phẩm.

4.1.1.2 Phản ứng tạo vòng 2-methylquinazolin-4(3H)-on qua trung gian benzoxazinon Để tổng hợp các dẫn chất của 2-methyl-quinazolin-4(3H)-on từ nguyên liệu đầu acid 2-aminobenzoic, luận án sử dụng phản ứng tạo vòng 2-methylquinazolin-4(3H)- on qua trung gian benzoxazinon Đây là giai đoạn đầu tiên trong qui trình tổng hợp các dãy chất II và VI, có cơ chế phản ứng được minh họa trong sơ đồ 4.2.

Sơ đồ 4.2 Cơ chế phản ứng tạo vòng 2-methylquinazolin-4(3H)-on qua trung gian benzoxazinon.

Phản ứng one-pot gồm 2 giai đoạn Ở giai đoạn đầu tiên, phản ứng đóng vòng loại nước giữa một phân tử quinazolin-4(3H)-on và anhydrid acetic, tạo hợp chất vòng mới là dẫn chất của 2-methyl-4H-benzo[d][1,3]oxazin-4-on Ở giai đoạn này, anhydrid acetic vừa là tác nhân, vừa là xúc tác cho phản ứng Phản ứng xảy ra hoàn toàn sau khi đun hồi lưu trong khoảng 1 đến 2 giờ Giai đoạn tiếp theo, amoni acetat được thêm vào hỗn hợp phản ứng với lượng dư (khoảng 2 đương lượng so với acid anthranilic ban đầu) để tạo khung 2-methylquinazolin-4(3H)-on nhờ liên kết amid được tạo thành thay cho liên kết ester của nhân oxazin-4-on Ở giai đoạn này, nhiệt độ cần được duy trì trong khoảng 80 – 100 , đồng thời theo dõi tiến trình phản ứng để kết thúc phản ứng℃ ở thời điểm phù hợp, tránh kéo dài dẫn đến xuất hiện nhiều tạp Phản ứng ở giai đoạn 2 xảy ra hoàn toàn sau khoảng 3 giờ, với hiệu suất cao (87 – 94 %) Một lượng natri hydrocarbonat được thêm vào hỗn hợp sản phẩm để loại bỏ tạp acid acetic sinh ra trong phản ứng.

4.1.1.3 Phản ứng N-alkyl hóa khung quinazolin-4(3H)-on

Phản ứng N-alkyl hóa giữa các tác nhân alkyl bromid và các dẫn chất của quinazolin-4(3H)-on được sử dụng trong luận án để tổng hợp các ester trung gian của các dãy chất I-VI Cơ chế của phản ứng được minh họa trong sơ đồ 4.3.

Sơ đồ 4.3 Cơ chế phản ứng N-alkyl hóa dẫn chất quinazolin-4(3H)-on.

Phản ứng N-alkyl hóa vào khung quinazolin có cơ chế của phản ứng thế ái nhân, sử dụng các tác nhân alkyl hóa là alkyl-, allyl- hay benzyl- halogenid Tuy nhiên, quinazolin-4(3H)-on có tính ái nhân yếu, cần được hoạt hóa bằng một base đủ mạnh để chuyển các dẫn chất amid này từ dạng phân tử sang dạng anion có tính ái nhân mạnh hơn Vì vậy, theo các tài liệu tham khảo, các phản ứng này đều được thực hiện trong môi trường base, có thể sử dụng các muối carbonat (Na2CO3, K2CO3, Cs2CO3), các hydrid (LiH, NaH, CaH2), triethylamin (TEA), … để làm xúc tác cho phản ứng, với các dung môi aceton, DMF, DMA, MeCN, NMP hay DMSO [48], [119] Luận án lựa chọn điều kiện phản ứng là xúc tác K2CO3 dung môi aceton hoặc DMF cho các phản ứng gắn các nhóm thế vào khung quinazolin, sử dụng tác nhân alkyl hóa là các alkyl- hoặc benzoyl- bromid Một lượng nhỏ KI được thêm vào nhằm làm tăng tốc độ và hiệu suất của phản ứng (do –I dễ bị thế hơn –Br trong phản ứng).

Nhiệt độ cũng là một điều kiện quan trọng và được cân nhắc trong quá trình xây dựng quy trình tổng hợp Ban đầu, các phản ứng N-alkyl hóa các dẫn chất quinazolin-4(3H)-on được thực hiện ở nhiệt độ phòng, trong khoảng 24 giờ, phản ứng xảy ra chậm và không hoàn toàn Khi nâng nhiệt lên khoảng 50 ,℃ phản ứng xảy ra nhanh hơn, hiệu suất cao hơn (79-89 %) Phản ứng sử dụng dung môi DMF xảy ra kém chọn lọc khi thực hiện ở nhiệt độ cao hơn, đến khoảng 90-100 , sản phẩm thu được không℃ tinh khiết và hiệu suất giảm Vì vậy, các phản ứng N-alkyl hóa dẫn chất quinazolin-4(3H)-on thực hiện trong luận án đều được tiến hành ở 50 ℃ trong 24 giờ với sự có mặt của K2CO3 và KI trong dung môi aceton hoặc DMF. Đối với các quinazolin-4(3H)-on, phản ứng alkyl hóa với các tác nhân alkyl bromid có thể xảy ra ở N 1 , N 3 hoặc OH tùy theo điều kiện phản ứng Theo các kết quả nghiên cứu của M Spulak và cộng sự, khi sử dụng các điều kiện phản ứng tương tự điều kiện phản ứng của luận án (K2CO3, NaI và DMF), các sản phẩm thu được dẫn chất N 3 - alkyl hóa của quinazolin-4(3H)-on [48] Các sản phẩm N-alkyl hóa sinh ra cũng được khẳng định thông qua dữ liệu phổ NMR của các dẫn chất dãy I-VI trong luận án Các phổ 1 H-NMR của các dẫn chất này đều cho thấy proton của nhóm CH2 liên kết trực tiếp với N 3 có độ dịch chuyển khoảng 5,20-5,51 ppm với nhóm thế chứa vòng benzen (dãy I-III), khoảng 3,93-4,50 ppm với nhóm thế là các mạch hydrocarbon no hoặc vòng no (dãy IV-VI) Phổ 13 C-NMR của các dẫn chất đều có 2 tín hiệu cộng hưởng khoảng 159,66- 169,60 ppm tương ứng 2 nhóm carbonyl của hợp phần hydroxamic và khung quinazolin-4(3H)-on Các kết quả phân tích phổ NMR của các dãy chất I-VI trong luận án có sự tương đồng với kết quả phân tích phổ NMR của các dẫn chất N-alkyl hóa của quinazolin-4(3H)-on trong nghiên cứu của Špulák M.

[133], giúp khẳng định chắc chắn các dẫn chất đã tổng hợp trong luận án đều là sản phẩm N-alkyl hóa.

4.1.1.4 Phản ứng C 4 -amin hóa khung quinazolin-4(3H)-on

Các ester trung gian của hai dãy chất VII và VIII được tổng hợp bằng phản ứng

C 4 -amin hóa giữa dẫn chất quinazolin-4(3H)-on và các ester amin, với sự có mặt của các chất xúc tác PyBOP và DBU Cơ chế của phản ứng được minh họa trong sơ đồ

4.4 Phản ứng gắn nhóm amin vào C 4 của khung quinazolinon chính là phản ứng one- pot tạo liên kết C-N theo cơ chế thế ái nhân giữa các hợp chất vòng có hỗ biến keto – enol với các tác nhân ái nhân có chứa amin Theo các tài liệu tham khảo được, phản ứng cần thực hiện trong môi trường base để chuyển dạng keto (dạng lactam) của các dị vòng thơm sang dạng enol (dạng phenol) ái nhân hơn dạng keto Tương tự như phản ứng N- alkyl hóa dẫn chất quinazolin-4(3H)-on, phản ứng này có thể sử dụng các base như DBU, TEA, muối carbonat, làm xúc tác, với các dung môi MeCN, DMF, aceton, Để tăng tốc độ của phản ứng ghép cặp này, cần sử dụng các xúc tác kim loại (như Pd, Cu, Ni, ), hoặc các chất có cấu trúc là muối của phospho (như BOP, PyBOP, BroP, PyBroP, ) [147], [69], [32] Dựa vào các tài liệu tham khảo, đặc biệt là kết quả tổng hợp một số dẫn chất quinazolinon bằng phản ứng amin hóa C 4 , luận án lựa chọn và sử dụng điều kiện phản ứng là các chất xúc tác DBU và PyBOP, dung môi acetonitril để thực hiện phản ứng gắn nhóm amin của ester vào vị trí C 4 của khung quinazolin-4(3H)- on Để phản ứng xảy ra hoàn toàn, các chất xúc tác được dùng với lượng dư so với quinazolin-4(3H)-on, khoảng 1,3 đương lượng PyBOP và 3 đương lượng DBU.

Nhiệt độ của phản ứng cũng là một yếu tố cần lưu ý khi xây dựng qui trình tổng hợp Theo các tài liệu tham khảo, phản ứng có thể thực hiện ở nhiệt độ phòng đến dưới

60 Tuy nhiên, ngoài những ưu điểm như ít độc hơn các chất cùng nhóm, giúp phản℃ ứng xảy ra nhanh và hoàn toàn, tác nhân xúc tác cho phản ứng ghép cặp PyBOP mà luận án lựa chọn không bền với nhiệt Vì vậy, các phản ứng C 4 -amin hóa mà luận án sử dụng để tổng hợp các ester trung gian của các dãy chất VII-VIII đều được thực hiện ở nhiệt độ phòng trong khoảng 24 giờ Các sản phẩm thu được đều có độ tinh khiết tốt với hiệu suất khá cao (khoảng 83 -94 %).

Sơ đồ 4.4 Cơ chế phản ứng C 4 -amin hóa khung quinazolin-4(3H)-on.

4.1.1.5 Phản ứng N-acyl hóa tạo acid hydroxamic

Tổng hợp acid hydroxamic từ ester và hydroxylamin là phản ứng cuối cùng của mỗi qui trình tổng hợp để tạo ra các dẫn chất hydroxamic theo thiết kế ban đầu, có cơ chế phản ứng được minh họa trong sơ đồ 4.5. Đây là phản ứng acyl hóa theo cơ chế thế ái nhân vào nhóm amin, chỉ có thể xảy ra trong môi trường kiềm mạnh (pH > 10), trong đó hydroxylamin là tác nhân quan trọng đối với phản ứng tạo thành acid hydroxamic [117] Tuy nhiên, hydroxylamin dạng tự do không bền, dễ phân hủy, dễ gây nổ và khó bảo quản, vì vậy, tác nhân này được dùng dưới dạng muối hydrochlorid Trong môi trường kiềm mạnh là dung dịch NaOH bão hòa, dạng muối sẽ được chuyển hoàn toàn thành dạng base tự do Nhằm làm tăng hiệu suất của phản ứng, hydroxylamin được dùng với lượng dư khoảng 10 đương lượng so với ester.

Sơ đồ 4.5 Cơ chế phản ứng N-acyl hóa tạo acid hydroxamic.

Ngoài các vai trò chuyển hoàn toàn hydroxylamin dạng muối sang dạng base tự do và tạo môi trường có pH đủ cao (> 10 - 12) để phản ứng N-acyl hóa tạo acid hydroxamic có thể xảy ra, lượng natri hydroxyd dư thêm vào hỗn hợp phản ứng còn tạo muối natri của acid hydroxamic mới tạo thành, giúp sản phẩm tan hết trong dịch phản ứng Tuy nhiên, bản thân OH - cũng là một tác nhân ái nhân mạnh, vì vậy, môi trường kiềm mạnh từ một lượng dư NaOH có thể làm các ester bị thủy phân thành các acid carboxylic rất khó để loại bỏ, làm giảm hiệu suất của phản ứng và gây khó khăn cho giai đoạn tinh chế sản phẩm Vì vậy, các phản ứng tổng hợp acid hydroxamic trong luận án đều được thực hiện ở nhiệt độ thấp (0 ) bằng cách sử dụng hỗn hợp đá℃ muối, đồng thời nhỏ từ từ dung dịch natri hydroxyd bão hòa đã được làm lạnh vào bình phản ứng (nhằm tránh nhiệt độ tăng lên đột ngột có thể làm phân hủy hydroxylamin tự do) Trong quá trình thực hiện phản ứng, các yếu tố nhiệt độ và pH được kiểm tra và duy trì Diễn biến phản ứng được theo dõi thường xuyên bằng sắc ký ứng phù hợp, tránh kéo dài thời gian phản ứng không cần thiết làm phân hủy sản phẩm.

BÀN LUẬN VỀ LIÊN QUAN CẤU TRÚC – TÁC DỤNG 121 1 Hoạt tính sinh học của các dãy chất Ia-h , IIa-d và IIIa-d 121

Từ kết quả thử tác dụng ức chế HDAC, kết quả thử độc tính trên ba dòng tế bào ung thư người (mục 3.2.1) và kết quả docking phân tử các chất, hoạt tính sinh học của từng nhóm dãy chất sẽ được bàn luận, sau đó so sánh toàn bộ các chất đã được tổng hợp nhằm phân tích mối liên quan giữa cấu trúc và tác dụng sinh học, cuối cùng tìm ra khung cấu trúc và các chất tiềm năng cho những nghiên cứu tiếp theo.

4.2.1 Hoạt tính sinh học của các dãy chất Ia-h, IIa-d và IIIa-d

Kết quả thử tác dụng ức chế HDAC và gây độc tế bào của các chất Ia-h, IIa-d và IIIa-d được trình bày trong bảng 4.1.

Kết quả trong bảng 4.1 cho thấy nhìn chung các chất tổng hợp được đều có tác dụng ức chế HDAC đáng kể với 13/16 chất có IC50 < 1 M, giá trị này của SAHA là 0,23 M, khẳng định khung quinazolinon trong cấu trúc phần nhận diện bề mặt tốt cho hoạt tính ức chế enzym.

Khi thiết kế cấu trúc, việc gắn các nhóm thế trên khung quinazolin nhằm khảo sát ảnh hưởng của loại nhóm thế, tính chất đẩy/hút điện tử và vị trí của nhóm thế đến hoạt tính Có thể thấy ở dãy I, tác dụng ức chế HDAC giảm dần theo thứ tự: chất không có nhóm thế (Ia), chất có nhóm thế đẩy electron (methyl – Ib và Ic, methoxy –

Id), chất có nhóm thế hút electron (fluoro – If và Ig) Tuy nhiên, ảnh hưởng của các nhóm thế đến hoạt tính của các chất dãy III được xếp theo thứ tự ngược lại với dãy I.Mặt khác, ảnh hưởng của vị trí gắn nhóm thế lại khác nhau tùy thuộc vào từng nhóm thế Chẳng hạn, khi thế methyl, vị trí 6 (chất Ic, IIIc) cho hoạt tính tốt hơn vị trí 7(chất Ib, IIIb), ngược lại khi thế fluoro, vị trí 7 (chất If) cho khả năng ức chế enzym mạnh hơn vị trí 6 (chất Ig) Như vậy xét về vị trí gắn nhóm thế, nhóm đẩy điện tử ở vị trí C6 tốt hơn C7, và ngược lại đối với nhóm thế hút điện tử Việc thêm nhóm thế methyl vào vị trí 2 trên khung quinazolinon làm cho hoạt tính của chất IIa giảm so với chất ban đầu Ia , nhưng khi gắn thêm các nhóm thế khác như 7-methoxy (chất IIb), 6-methoxy (chất IIc), 6- cloro (chất IId), hoạt tính ức chế enzym có sự thay đổi khác nhau so với các chất tương ứng (Ib, Ic, Ih) Những kết quả này cho thấy ảnh hưởng của các nhóm thế trên khung quinazolinon trong vùng nhận diện bề mặt đến hoạt tính ức chế HDAC đối với các chất nhóm 1 là chưa rõ ràng và cần được nghiên cứu, bàn luận thêm.

Bảng 4.1 Kết quả ức chế HDAC và gây độc tế bào của các chất Ia-h, IIa-d và IIIa-d.

Chất R LogP 1 Ức chế HDAC

(IC 50 , 2 M) Độc tính tế bào (IC 50 , 2 M)

Ghi chú: 1 Tính bằng ChemDraw 9.0 software; 2 Nồng độ chất làm giảm 50% hoạt lực enzym hoặc sự phát triển tế bào; 3 Dòng tế bào: SW620, ung thư đại tràng; PC3, ung thư tuyến tiền liệt; NCI-H23, ung thư phổi; 4 SAHA, acid suberoylanilidhydroxamic, chất đối chứng dương tính

Kết quả trong bảng 4.1 cũng cho thấy các chất dãy III đều ức chế HDAC2 mạnh hơn các chất dãy I, ba chất IIIb – IIId tác dụng mạnh nhất trong toàn bộ 16 chất thuộc cả ba dãy, chứng tỏ cấu trúc cinnamamid trong cầu nối tốt cho hoạt tính ức chế enzym hơn cấu trúc benzamid.

Về độc tính tế bào, tất cả các dẫn chất dãy I-III đều có tác dụng ức chế đáng kể sự phát triển của cả ba dòng tế bào thử nghiệm Có tới 11/16 chất có giá trị IC50 thấp hơn giá trị này của SAHA, điều này giúp khẳng định cấu trúc quinazolinon tốt cho hoạt tính trên tế bào Tương tự như hoạt tính trên HDAC2, ảnh hưởng của các nhóm thế gắn trên khung quinazolinon tới độc tính tế bào cũng chưa rõ ràng.

Tuy nhiên, tác dụng gây độc tế bào của các dẫn chất có tương quan tỷ lệ khác nhau với tác dụng ức chế HDAC Chẳng hạn, các chất Ie và IIb có tác dụng ức chế enzym mạnh nhất, đồng thời cũng gây độc tế bào mạnh nhất trong từng dãy Ia-h và IIa- d So với chất đối chiếu dương tính SAHA, các chất dãy Ia-h có độc tính tế bào tương đương (chất Ia-d, Ig) hoặc hơi mạnh hơn (chất Ie, If, Ih), trong khi các chất này đều có tác dụng ức chế HDAC2 yếu hơn SAHA Các chất dãy IIa-d có độc tính tế bào mạnh hơn dãy Ia-h, đặc biệt, chất IIb (IC50 = 0,46-1,18 M) gây độc tế bào mạnh gấp 4-8 lần chất Ib (IC50 = 3,65-4,85 M), tuy nhiên, các chất IIa-d ức chế HDAC không mạnh hơn Ia-h Để giải thích rõ hơn về tương quan khác nhau giữa tác dụng ức chế HDAC và độc tính tế bào của các chất này, cần có thêm những thử nghiệm trên các dạng HDAC khác nhau Theo báo cáo của Zhang Q và cộng sự [173], dãy các acid hydroxamic có cấu trúc 4-aminoquinazolin là nhóm nhận diện bề mặt có tác dụng ức chế chọn lọc hơn trên HDAC1 và HDAC2 Nghiên cứu của Blackburn C mới đây cho thấy các hợp chất mang cấu trúc N-hydroxybenzamid có tác dụng ức chế mạnh và chọn lọc hơn trên isozym HDAC6 [16] Dịch chiết nhân tế bào HeLa có chứa các HDAC hoạt động, nhưng chứa nhiều dạng HDAC nhóm I (HDAC1-3), trong khi HDAC6 có nhiều ở bào tương Các kết quả nghiên cứu về các chất ức chế HDAC nhóm I đã được trình bày trong phần Tổng quan của luận án đã cho thấy, nhiều dẫn chất mang hợp phần benzamid và cinnamamid trong cấu trúc của phần cầu nối có tác dụng ức chế chọn lọc HDAC8, một isozym có nồng độ tăng cao ở các mô ung thư rõ rệt so với các mô khỏe mạnh Những điều này góp phần giải thích cho sự bất tương đồng về hoạt tính của các chất như đã trình bày ở trên khi sử dụng SAHA, một chất ức chế HDAC phổ rộng làm chất đối chiếu dương tính Mặt khác, những nghiên cứu gần đây cho thấy các acid hydroxamic chứa cấu trúc quinazolin có thể ức chế các đích tác dụng khác như các protein kinase, tương tự như gefitinib hoặc erlotinib [4] Ngoài ra,các chất IIa-d có giá trị logP lớn hơn các chất Ia- h, có thể chính khả năng thấm qua màng tế bào tốt hơn cũng góp phần giúp các chất IIa- d có hoạt tính ức chế tế bào tốt hơn so với các chất Ia-h Tương quan khác nhau giữa độc tính tế bào với khả năng ức chế HDAC của các chất cũng có thể liên quan đến hai yếu tố này.

Trong số các dẫn chất thuộc ba dãy, dãy chất IIIa-d có hoạt tính ức chế HDAC mạnh nhất, đồng thời cũng là các chất tác dụng tốt trên cả ba dòng tế bào thử nghiệm, với hoạt tính gây độc tế bào mạnh gấp 2-4 lần SAHA Đặc biệt, các chất IIIb, IIIc và

IIId là những chất ức chế HDAC mạnh nhất, cũng là những chất có tác dụng mạnh trên tế bào Điều này cho thấy phần cầu nối giữa acid hydroxamic và khung quinazolin có mạch carbon dài hơn (do có thêm vinylen -CH=CH-) có thể tốt hơn cho hoạt tính ức chế enzym.

Như đã chỉ ra trong bảng 4.1, một số chất tổng hợp được có hoạt tính in vitro mạnh hơn SAHA, trong đó nổi bật là các chất Ie, IIb, IIIb, IIIc và IIId với khả năng gây độc tế bào mạnh Mặt khác, HDAC2 là isozym biểu hiện nhiều trên dòng tế bào HeLa Vì vậy, để nghiên cứu sâu tương quan cấu trúc – tác dụng sinh học, mô phỏng protein docking được thực hiện với enzym HDAC2.

Các kết quả mô phỏng docking được minh họa trên hình 3.3, bảng 3.1 (đã trình bày trong mục 3.1.1) và hình 4.4, cho thấy các chất dãy IIIa-d có liên kết chặt chẽ với trung tâm hoạt động của HDAC2 ở các vị trí tương tự như SAHA, với các giá trị năng lượng liên kết đo được từ -19,59 đến -18,90 kcal/mol, tương đương hoặc hơi cao hơn so với SAHA (dG = -19,58 kcal/mol) Khoảng cách giữa ion kẽm và các nguyên tử oxy trong các nhóm hydroxyl và carbonyl của chức acid hydroxamic trong các chất dãy IIIa- d đo được từ 2,18-2,52 Å (giá trị này của SAHA là 2,33-2,34 Å) Các chất dãy Ia-h và IIa-d đều có năng lượng liên kết thấp hơn SAHA, với khoảng cách giữa ion kẽm và acid hydroxamic dài hơn SAHA Như đã trình bày trong Chương 1 Tổng quan, các dẫn chất hydroxamat có cấu trúc chung gồm 3 phần: (1) nhóm gắn kết với

Zn 2+ trên vị trí tác dụng của các enzym HDAC là acid hydroxamic (ZBG- Zn 2+ binding group), (2) cầu nối là mạch hydrocarbon thân dầu (Linker) và (3) nhóm nhận diện bề mặt (Cap), gắn với cầu nối qua liên kết amid hoặc amin, có khả năng tương tác với các acid amin tại bề mặt của enzym Thiết kế cấu trúc của luận án hướng đến việc tạo ra phần nhận diện bề mặt mới bằng cách sử dụng cấu trúc quinazolin và thay đổi cấu trúc, độ dài của phần cầu nối Các kết quả nghiên cứu trước đây của một số tác giả đã chỉ ra rằng độ dài tối ưu cho phần cầu nối là mạch methylen có 6C [46] Kết quả nghiên cứu của luận án cho thấy có sự khác biệt về hoạt tính giữa dãy chất IIIa-d (nhận diện bề mặt quinazolin-4(3H)- on, cầu nối cinnamamid) và IIa-d (nhận diện bề mặt 2- methylquinazolin-4(3H)-on, cầu nối N-hydroxybenzamid), Ia-h (nhận diện bề mặt quinazolin-4(3H)-on, cầu nối N- hydroxybenzamid) Kết quả docking phân tử cũng thể hiện sự khác biệt tương ứng về

IIb năng lượng liên kết và các hướng liên kết Các chất Ia-h và IIa-d đều có 3 liên kết hydro giữa acid hydroxamic với các acid amin His183, Gly154 và Phe210, có liên kết tạo phức chelat với ion kẽm (tương tự cơ chế xúc tác enzym của SAHA) Phần nhận diện bề mặt cấu trúc quinazolin có sự khác biệt về các liên kết với miệng túi của enzym so với liên kết từ vòng anilin của SAHA Hệ vòng thơm trong phần nhận diện bề mặt của các chất IIa-d tạo liên kết hydro với nhiều acid amin ở phần miệng túi enzym như Pro34, Asp140 và Leu276 Các chất IIIa-d có các liên kết với enzym chặt chẽ hơn so với các chất Ia-h và IIa-d, đặc biệt là chất IIIc, ngoài các liên kết hydro với His146, Asp181, Tyr308 và Gly306, chất này còn có hai tương tác  với Phe155 và Phe210 Có thể chính phần cầu nối dài hơn so với hai dãy chất còn lại đã giúp phần nhận diện bề mặt của các chất dãy IIIa-d tương tác tốt hơn với các acid amin ở phần miệng túi của enzym, đồng thời giúp các chất có thể tiến sâu vào lòng mạch enzym, làm tăng ái lực liên kết tạo phức chelat với ion kẽm cũng như có thêm các tương tác hydro giữa nhóm chức hydroxamic với các acid amin ở phần đáy túi (hình 4.4).

Hình 4.4 Mô phỏng docking các chất Ie, IIb và IIIc vào HDAC2.

Như vậy, 16 dẫn chất N-hydroxybenzamid/N-hydroxycinnamamid mới mang khung quinazolin-4(3H)-on đã được tổng hợp đều có hoạt tính ức chế HDAC và có độc tính mạnh trên cả ba dòng tế bào thử nghiệm So với SAHA, một số chất ức chếHDAC và gây độc tế bào tương đương hoặc mạnh hơn Nghiên cứu docking phân tử cho thấy các chất đều có liên kết tốt với enzym HDAC2, nhiều chất có liên kết chặt chẽ với enzym hơn SAHA, điều này góp phần giải thích vì sao một số chất có hoạt tính mạnh hơn chất đối chứng Các chất như Ia, IIb-d, IIIb-d có độc tính tế bào mạnh gấp 4 lần SAHA, đồng thời ức chế tốt HDAC với các giá trị IC 50 cỡ M Đặc biệt, các dẫn chất

BÀN LUẬN VỀ CÁC HỢP CHẤT TIỀM NĂNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 142 1 Bàn luận về các hợp chất tiềm năng 142

4.3.1.Bàn luận về các hợp chất tiềm năng

Những hiểu biết sớm về dược động học và độc tính (ADMET) đóng vai trò quan trọng trong nghiên cứu phát triển thuốc mới, giúp tối ưu hóa các ứng viên tiềm năng phát triển thành thuốc Vì vậy, luận án đã sử dụng một số công cụ và phần mềm tin sinh học để tính toán một số thông số lý hóa, thông số dược động học và độc tính của các chất tiềm năng nhất Dựa trên các kết quả thử hoạt tính ức chế HDAC và độc tính tế bào, bốn chất VIIc, VIIg, VIIIc và VIIIh được chọn để dự đoán ADMET Các chất này được kiểm tra tính giống thuốc theo qui tắc Ro5 của Lipinsky và tính giống chất dẫn đường Ro3 của Teague Kết quả dự đoán được chỉ ra trên bảng 4.6 cho thấy cả bốn chất đều thỏa mãn qui tắc Ro5 (với khối lượng phân tử 30 > 30 > 30

Sinh khả dụng đường uống (%) 55 55 60 60

Phân bố qua hàng rào máu não

(BBB) 7 Thấp Trung bình Trung bình Cao

% gắn với protein huyết tương

Thể tích phân bố (Vd, l/kg) 0,935 0,904 0,706 0,706

CYP1A2, CYP2C9 Ức chế CYP1A2, CYP2C9 Ức chế CYP1A2, CYP2C9

Trên hệ cơ quan Tuần hoàn, sinh sản, nội tiết

Tuần hoàn, sinh sản, nội tiết

Gan, sinh sản, nội tiết Gan, sinh sản, nội tiết

Trên bộ gen Không Không Đột biến Đột biến Đối với môi trường Động vật giáp xác thủy sinh Động vật giáp xác thủy sinh Động vật giáp xác thủy sinh Động vật giáp xác thủy sinh Độc tính cấp (độ) IV IV IV IV

Ghi chú: 1 Độ tan nội tại ở 25°C được tính theo công thức ESOL của Delaney ([27]); 2 Số vi phạm qui tắc giống thuốc Ro5 của Lipinski; 3 Số vi phạm qui tắc giống chất dẫn đường Ro3 của Teague; 4 Số vi phạm qui tắc 3Prule của P.T.Hai; 5 Phân loại tính thấm qua màng Caco-2 được dự đoán theo quy tắc 3Prule (nhóm cao là P app ≥ 16×10 6 cm/s, nhóm trung bình là 0,7×10 -6 ≤ P app < 16×10 -6 cm/s) ; 6 Cơ chất của P-gp được xác định thông qua cơ sở dữ liệu trực tuyến http://pgp.biozyne.com; 5 Phân bố qua hàng rào máu não được phân loại dựa theo thông số logBB trong phần mềm Volsurf+1.0.4: nhóm trung bình nếu 0 ≤ logBB < 0,5; nhóm thấp nếu - 0,3 ≤ logBB < 0 và nhóm rất thấp nếu logBB < - 0,3; 7 Độ bền vững chuyển hóa được xác định đối với enzym cytochrom người bằng phần mềm SwissADME http://www.swissadme.ch

Bơm tống thuốc P-glycoprotein (P-gp) có sự biểu hiện quá mức trong nhiều tế bào ung thư, đồng thời đóng vai trò quan trọng trong cơ chế kháng đa thuốc của hóa trị liệu Vì vậy, khả năng gắn với protein này cũng là một yếu tố được quan tâm khi dự đoán đặc điểm về hấp thu của các chất Kết quả cho thấy hai chất VIIc và VIIg được dự đoán là có khả năng trở thành cơ chất của protein P-gp Tuy nhiên, ngoài chất VIIc hầu như không có tương tác với cytocrom P450, ba chất còn lại đều được dự đoán là cơ chất và có thể ức chế nhiều loại cytochrom, đặc biệt là CYP1A, CYP2C và CYP3A. Chất VIIIc được dự đoán là ít bị chuyển hóa lần đầu do ít bị chuyển hóa bởi P-gp và CYP.

Những thông tin về tỷ lệ gắn kết với protein huyết thanh (PPB) và thể tích phân bố (Vd) có ý nghĩa trong việc xác định độ an toàn và chế độ liều của các chất [18] Hai chất VIIIc và VIIIh có giá trị PPB cao trên 90 %, ngược lại, hai chất VIIc và VIIg có PPB thấp hơn, khoảng trên 60 % và được dự đoán là an toàn hơn các chất còn lại Về khả năng phân bố, các chất thể hiện sự phân bố trong các mô cơ quan của cơ thể cao hơn nhiều so với trong huyết thanh (Vd huyết thanh = 0,57 l/kg) Khả năng phân bố của các chất qua hàng rào máu não cũng thay đổi ở các mức thấp, trung bình và cao.

Cuối cùng, các dữ liệu về độc tính của bốn chất này được dự đoán bằng phần mềm admetSAR phiên bản cập nhật 2.0 theo ba nhóm độc tính: trên hệ cơ quan, trên hệ gen và độc tính đối với môi trường [162] Kết quả dự đoán cho thấy cả bốn chất đều không có độc tính hoặc có độc tính rất thấp trên mắt, da, gan và hệ tuần hoàn với các giá trị xác suất ΔP < 0,8 Trong đó, VIIIc và VIIIh được dự đoán là có độc tính rất thấp trên gan (ΔP = 0,775) Ngược lại, chất VIIc và VIIg thể hiện độc tính rất thấp trên hệ tuần hoàn vì có khả năng ức chế hERG với ΔP = 0,767 – 0,795 Việc ức chế hERG (Human Ether-a-go-go-related Gene, gen đóng vai trò quan trọng đối với hoạt động của kênh kali) có thể dẫn đến hậu quả làm kéo dài QT do thuốc, loạn nhịp tim và/hoặc xoắn đỉnh [162] Ngoài ra, khả năng gây rối loạn nội tiết của các chất cũng được dự báo dựa trên mức độ tương tác của các chất này với các receptor androgen, estrogen, thyroid, glucocorticoid, peroxisome proliferator-activated receptors γ và aromatase [162] Cả bốn chất đều được dự báo là hầu như không ảnh hưởng hoặc có tác động yếu đến các cơ quan sinh sản và nội tiết khi có mức độ tương tác rất yếu hoặc yếu với các receptor, theo thứ tự mức độ ảnh hưởng lần lượt là VIIc < VIIg < VIIIc

Định dạng
Số trang	436
Dung lượng	27,18 MB