1. Trang chủ
  2. » Luận Văn - Báo Cáo

nguyễn hà minh đức tổng hợp và thử tác dụng kháng tế bào ung thư của một số dẫn chất ure mang khung 5 methoxy 2 2 dimethyl 2h chromen

77 0 0
Tài liệu đã được kiểm tra trùng lặp

Đang tải... (xem toàn văn)

Tài liệu hạn chế xem trước, để xem đầy đủ mời bạn chọn Tải xuống

THÔNG TIN TÀI LIỆU

Thông tin cơ bản

Tiêu đề Tổng hợp và thử tác dụng kháng tế bào ung thư của một số dẫn chất ure mang khung 5-methoxy-2,2dimethyl-2H-chromen
Tác giả Nguyễn Hà Minh Đức
Người hướng dẫn TS. Nguyễn Công Trường
Trường học Trường Đại học Dược Hà Nội
Chuyên ngành Dược Sĩ
Thể loại Khóa Luận Tốt Nghiệp
Năm xuất bản 2024
Thành phố Hà Nội
Định dạng
Số trang 77
Dung lượng 3,62 MB

Cấu trúc

  • CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN (12)
    • 1.1. Tác d ụng kháng tế bào ung thư của các dẫn chất có chứa nhóm chứa ure . 2 1. Ho ạt tính kháng tế bào ung thư của một số thuốc có chứa nhóm chức ure (0)
      • 1.1.2. Ho ạt tính kháng tế bào ung thư của các dẫn chất mang khung 5-methoxy-2,2- dimethyl-2H-chromen (19)
    • 1.2. Các ph ản ứng liên quan đến tổng hợp dẫn chất mang khung 5-methoxy-2,2- dimethyl-2H-chromen (21)
    • 1.3. Định hướng thiết kế cấu trúc (24)
  • CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, DỤNG CỤ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU (0)
    • 2.1. Nguyên v ật liệu, thiết bị (25)
      • 2.1.1. Nguyên li ệu (25)
      • 2.1.2. Thi ết bị (26)
    • 2.2. N ội dung nghiên cứu (26)
      • 2.2.1. T ổng hợp hóa học (26)
      • 2.2.2. Tinh ch ế và xác định cấu trúc các dẫn chất tổng hợp được (26)
      • 2.2.3. Th ử hoạt tính kháng tế bào ung thư của các dẫn chất tổng hợp được (0)
    • 2.3. Phương pháp nghiên cứu (27)
      • 2.3.1. Phương pháo tổng hợp hóa học (0)
      • 2.3.2. Phương pháp kiểm tra độ tinh khiết (27)
      • 2.3.3. Phương pháp tinh chế và xác định cấu trúc (27)
      • 2.3.4. Phương pháp thử hoạt tính kháng tế bào ung thư (27)
  • CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM KẾT QUẢ (29)
    • 3.1 T ổng hợp hóa học (29)
      • 3.1.1. T ổng hợp (5-methoxy-2,2-dimethyl-2 H-chromen-6-yl)carbamat (0)
      • 3.1.2. T ổng hợp 1-(4-fluorophenyl)-3-(5-methoxy-2,2-dimethyl-2 H-chromen-6- yl)ure (33)
      • 3.1.3. T ổng hợp 1-(2,3-dihydro-1 H-inden-2-yl)-3-(5-methoxy-2,2-dimethyl-2H- chromen-6-yl)ure (34)
    • 3.2. Ki ểm tra độ tinh khiết, khẳng định cấu trúc (36)
      • 3.2.1. Ki ểm tra độ tinh khiết của sản phẩm (36)
      • 3.2.2. Kh ẳng định cấu trúc (37)
    • 3.3. Th ử hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro (41)
  • CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN (43)
    • 4.1. V ề tổng hợp hóa học (43)
      • 4.1.1. V ề các phản ứng tổng hợp (5-methoxy-2,2-dimethyl-2 H-chromen-6- yl)carbamat (0)
      • 4.1.2. V ề các phản ứng tổng hợp dẫn chất ure mang nhân 5-methoxy-2,2-dimethyl- 2H-chromen (46)
    • 4.2. V ề khẳng định khấu trúc (0)
      • 4.2.1. V ề phổ hồng ngoại (IR) (47)
      • 4.2.2. V ề phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 H-NMR (48)
      • 4.2.3. V ề phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13 C-NMR (50)
      • 4.2.4. V ề phổ khối MS (52)
    • 4.3. V ề hoạt tính kháng tế bào ung thư (53)
    • D. J.Chang (23)

Nội dung

TỔNG QUAN

Các ph ản ứng liên quan đến tổng hợp dẫn chất mang khung 5-methoxy-2,2- dimethyl-2H-chromen

1.2.1 Phản ứng ngưng tụ Petasis

Vào đầu thế kỉ 21, Q.Wang cùng tổ chức Lett đã thực hiện phản ứng đóng vòng bằng acid boronic vinylic, salicylaldehyd và amin được hỗ trợ bởi nhóm hydroxyl tiếp giáp với nửa aldehyd Phương pháp xúc tác sử dụng amin liên kết với nhựa cho phép điều chế 2H -chromen khá thuận lợi mà còn dễ dàng xử lí sau khi phản ứng hoàn toàn Phản ứng có hiệu suất dao động từ 50 đến 85% [39]

Sơ đồ 1.1 Quy trình tổng hợp dẫn chất 2H-chromen bởi Q.Wang

1.2.2 Phản ứng đóng vòng ái điện tử

Vào năm 2007, Worlikar đã thực hiện quá trình iodocyl hóa các ete aryl propargylic để tạo ra 2H-chromen với hiệu suất tuyệt vời (lớn hơn 90%) Sự có mặt của base khá quan trọng đối với phản ứng vì nếu không có chúng thì hiệu suất giảm xuống 58% Một số base bổ sung đã được kiểm tra trong phản ứng này, nhưng NaHCO3 được phát hiện là cho hiệu suất tốt nhất Phương pháp này áp dụng đối với rất nhiều nhóm chức khác nhau khi R có thể thay thành methoxy, aldehyd hay nitro [42]

Sơ đồ 1.2 Quy trình tổng hợp dẫn chất 2H-chromen bởi Worlikar 1.2.3 Phản ứng thế của dị vòng

Sau đó trong năm 2012, Graham cùng cộng sự đã sử dụng 2-ethoxy-2H - chromen cùng Ni(cod) 2 ,PPh 3 và p -fluorophenyl axit boronic trong dioxan/ t - AmOH làm dung môi thu được phản ứng dị vòng với hiệu suất dao động từ 58- 95%

Phản ứng cũng có tính chọn lọc vùng, đưa nhóm alkyl (R 1 ) đến vị trí C-2 thay vì vị trí C-4 với tỷ lệ lớn hơn 20:1 (tỷ lệ đồng phân ) Nhìn chung, phương pháp này hiển thị phạm vi mở rộng đối với cả hai đối tác ghép nối, có khả năng mở rộng và có thời gian phản ứng ngắn tại thời điểm đó Hơn nữa, chất xúc tác và phối tử đều rẻ tiền và quá trình tinh chế sản phẩm rất đơn giản vì các sản phẩm phụ duy nhất phát sinh từ quá trình thủy phân acetal và protodeboration [16]

Sơ đồ 1.3 Quy trình tổng hợp dẫn chất 2H-chromen bởi Graham

1.2.4 Phản ứng thế clor và tạo vòng Claisen của Dong-Jo Chang

Cũng tại năm 2012, , nhóm nghiên cứu của Chang và cộng sự đã tiến hành tổng hợp các dẫn chất 2,2-dimethyl-2H-chromen-5-ol qua một phản thế clor, tạo thành chất trung gian là 3-((2-methylbut-3-yn-2-yl)oxy)phenol Với sự có mặt của dung môi N,N- dimethylanilin, sản phẩm trung gian được đóng thành vòng chromen có 2 nhóm thế methyl ở vị trí số 2

Hỗn hợp gồm resorcinol ,1,8-Diazabicyclo(5.4.0)undec-7-en, Trifluoroacetic anhydrid và 3 đương lượng CuCl 2 trong dung môi CH3CN duy trì ở 0 o Cvà thời gian 2 – 3 giờ với hiệu suất chỉ được 45% Phản ứng đóng vòng sau đó thì hiệu suất cao hơn , lên đến 91% [34]

Sơ đồ 1.4 Quy trình tổng hợp dẫn chất 2,2-dimethyl-2H-chromen-5-ol bởi D.J Chang

1.2.5 Phản ứng thế clor và tạo vòng Claisen của Jiyoung Mun

Vẫn tại năm 2012, Jiyoung Mun đã thử sử dụng dẫn chất clor thay cho alcol của Chang, chỉ cần xúc tác với NaOH rất đơn giản và hòa tan chất trong dung môi DMF

Tuy nhiên phản ứng cần được đun nóng ở 60°C trong 8 giờ và hiệu suất vẫn không được tối ưu Ở phản ứng đóng vòng, NMP được chọn làm dung môi cho chu trình Claisen do có nhiệt độ sôi cao (202 o C) và dễ dàng loại bỏ dung dịch ether dư bằng cách rửa với nước [28]

Sơ đồ 1.5 Quy trình tổng hợp dẫn chất 2,2-dimethyl-2H-chromen-5-ol bởi Jiyoung Mun

1.2.6 Phản ứng oxy hóa dị vòng

Trong năm 2018, Hongchan An đã có sự khác biệt, đột phá hơn trong việc điều chế dẫn chất, khi chỉ sử dụng 1 phản ứng với 3-methyl-2-butenal vẫn đi từ resorcinol được hòa tan trong dung môi Ethanol và xúc tác CaCl2.2H2O với triethylamin chỉ cần đun hồi lưu trong 3 tiếng với hiệu suất khá cao, hơn 70% [41]

Sơ đồ 1.6 Quy trình tổng hợp dẫn chất 2,2-dimethyl-2H-chromen-5-ol bởi Hongchan An

Định hướng thiết kế cấu trúc

Từ phần lý thuyết trên, ta có thể thấy, phần cấu trúc chromen và nhân ure là hai vị trí quan trọng, có nhiều nghiên cứu chứng minh cho tác dụng chống các tế bào ung thư đáng kể của chúng Do đó, đề tài tiến hành kết hợp một cách phù hợp, loại bỏ phần cấu trúc ethylen trên khung chromen ban đầu, thu được phần cấu trúc mới, giữ lại phần vòng benzen và nhóm methoxy

Thay thế và phát triển phần cấu trúc bên còn lại của nhân ure sẽ cho chúng ta nhiều cơ hội và sự phát triển đa dạng trong việc tìm ra các thuốc mới, vòng benzen trung tâm tạo liên kết π-cation với các acid amin khác nên phần cấu trúc này nên được giữ lại khi phát triển Từ đó chúng tôi sẽ thay thế các nhóm thế có chứa nhân thơm để phát huy được tối đa khả năng chống ung thư của hợp chất

Sơ đồ 1.7 Định hướng thiết kế cấu trúc các chất ure chống ung thư mới mang khung 5-methoxyl-2,2-dimethyl-2H-chromen

NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, DỤNG CỤ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Nguyên v ật liệu, thiết bị

Các hóa chất, dung môi dùng trong thực nghiệm đa phần có nguồn gốc, xuất xứ từ hãng Sigma-Aldrich (Mỹ), Merck (Đức) và Trung Quốc Các hóa chất được sử dụng trực tiếp, không tinh chế thêm và được trình bày ở bảng dưới đây:

Bảng 2.1 Các nguyên liệu sử dụng trong thực nghiệm STT Nguyên liệu Nguồn gốc, xuất xứ

3 Calcium cloride dihydrat Trung Quốc

5 Thiếc (II) clorid dihydrat Trung Quốc

9 Phenyl cloroformat Sigma-Aldrich (Mỹ)

10 Sodium sulfate khan Xilong Scientific (Trung Quốc)

19 3-methyl-2-butenal AK Scientific (Mỹ)

20 Pyridin Xilong Scientific (Trung Quốc)

22 tert-Butyl alcohol Shanghai Zhanyun Chemical

23 Quinolin-8-amin AK Scientific (Mỹ)

24 4-fluoro anilin Xilong Scientific (Trung Quốc)

25 2,3-dihydro-1H-inden-2-amin Trung Quốc

- Dụng cụ thủy tinh: cốc có mỏ (100 mL, 250 mL, 500 mL), đũa, phễu, phễu Buchner, cột sắc ký, bình chiết, sinh hàn, bình cầu (50 mL, 100 mL, 250 mL,

- Máy cô quay chân không Buchi Rotavapor R-200 (Thụy Sĩ)

- Buồng soi UV CN-6 Vilber Lourmat (Pháp)

- Máy siêu âm Ultrasonic LC 60 H (Đức)

- Máy khuấy từ gia nhiệt IKA RCT Basic (Đức)

- Cân kỹ thuật Sartorius (Đức)

- Bản mỏng silicagel TLC 60 F 254 Merck (Đức)

- Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân ( 1 H-NMR, 13 C-NMR) Bruker Avance 500 MHz của hãng Bruker BioSpin (Thụy Sĩ) tại Khoa Hóa Học – Trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội

- Máy đo phổ hồng ngoại FT-IR Affinity-IS-Shimadzu (Nhật Bản) tại Viện Hóa Học – Viện Hàn Lâm Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam

- Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân ( 1 H-NMR, 13 C-NMR) Bruker Avance III

HD 600 MHz của hãng Bruker BioSpin (Thụy Sĩ) tại Viện Hóa Học – Viện Hàn Lâm Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam

- Máy đo phổ khối 1100 Series LC - MSD - Trap – SL của hãng Agilent tại Viện Hóa Học – Viện Hàn Lâm Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam

- Máy đo nhiệt độ nóng chảy nhiệt điện MPA 120 (Mỹ) tại Bộ môn Hóa Hữu Cơ

– Trường Đại học Dược Hà Nội.

N ội dung nghiên cứu

Tổng hợp 3 dẫn chất 5-methoxy-2,2-dimethyl-2H-chromen, bao gồm:

- 1-(5-methoxy-2,2-dimethyl-2H-chromen-6-yl)-3-(quinolin-8-yl)ure

- 1-(4-fluorophenyl)-3-(5-methoxy-2,2-dimethyl-2H-chromen-6-yl)ure

- 1-(2,3-dihydro-1H-inden-2-yl)-3-(5-methoxy-2,2-dimethyl-2H-chromen-6- yl)ure

2.2.2 Tinh chế và xác định cấu trúc các dẫn chất tổng hợp được

- Tinh chế các dẫn chất tổng hợp được bằng phương pháp chiết lỏng – lỏng, sắc ký cột

- Kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm bằng sắc ký lớp mỏng

- Đánh giá độ tinh khiết và xác định cấu trúc bằng các phương pháp phổ: phổ khối lượng (MS), phổ hồng ngoại (IR), phổ cộng hưởng từ hạt nhân ( 1 H-NMR, 13 C-

2.2.3 Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư của các chất tổng hợp được

Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư của các dẫn chất 5-methoxy-2,2-dimethyl-2H-chromen tổng hợp được trên các dòng tế bào: Ung thư phổi A549 và ung thư vú MDA-MB-231.

Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp tổng hợp hóa học

Sử dụng các phương pháp tổng hợp hữu cơ cổ điển và hiện đại để tổng hợp các dẫn chất dự kiến

Theo dõi phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng và đánh giá sơ bộ độ tinh khiết của sản phẩm

2.3.2 Phương pháp kiểm tra độ tinh khiết

Sắc ký lớp mỏng: được sự dụng để theo dõi tiến trình diễn ra của phản ứng, xác định được thời điểm phản ứng kết thúc, kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm sau khi tinh chế Sắc ký lớp mỏng được tiến hành trên bản mỏng tráng sẵn silicagel GF254 tráng sẵn, được hoạt hóa ở 110 o C trong 30 phút Hệ dung môi sẽ được pha tùy vào đặc điểm riêng biệt của từng chất, từng phản ứng khác nhau Mẫu thử được hòa tan hoàn toàn trong dung môi phù hợp Bản mỏng được đặt trong bình sắc ký có dung môi bão hòa ở nhiệt độ phòng, cho dung môi pha động đến cách mép trên bản mỏng 0,5 cm thì quan sát kết quả dưới đèn từ ngoại ở bước sóng 254 nm

Nhiệt độ nóng chảy: Xác định bằng máy đo nhiệt độ nóng chảy nhiệt điện EZ – Melt

2.3.3 Phương pháp tinh chế và xác định cấu trúc

Sử dụng phương pháp chiết, phương pháp sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột để tinh chế các hợp chất tổng hợp được Các chất sau khi tổng hợp và đánh giá sơ bộ độ tinh khiết được xác định cấu trúc bằng phương pháp phổ, bao gồm: phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton ( 1 H-NMR) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon ( 13 C-NMR)

2.3.4 Phương pháp thử hoạt tính kháng tế bào ung thư

Hoạt tính kháng tế bào ung thư của các chất tổng hợp được thực hiện tại Phòng thí nghiệm dược lý phân tử, Bộ môn Dược lý, Khoa Dược Lý Dược Lâm Sàng, Trường Đại học Dược Hà Nội Áp dụng theo phương pháp MTT đối với các chất đã tổng hợp được trên hai dòng tế bào ung thư gồm: ung thư phổi A549 và ung thư vú MDA- MB-

Hoạt tính gây độc tế bào được thực hiện dựa trên phương pháp MTT (3-(4,5- dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium do nhà hóa học Tim Mosman lần đầu tiên phát hiện ra vào năm 1983 [27] Phương pháp này đánh giá khả năng sống sót của tế bào thông qua khả năng khử MTT có màu vàng thành một phức hợp formazan có màu tím do hoạt động của enzym dehydrogenase có trong ty thể Sản phẩm formazan này sau khi được hòa tan bằng DMSO và tiến hành đo mật độ quang (OD) ở bước sóng

570 nm Giá trị thể hoạt tính được tính là IC 50 (nồng độ chất thử ức chế 50% sự phát triển của tế bào)[10]

 Nguyên li ệu và phương pháp thử

Tế bào ung thư vú MDA-MB-231 và ung thư phổi A549 có nguồn gốc từ ATCC sẽ được lưu trữ trong N 2 lỏng, và được duy trì trong môi trường DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) có bổ sung huyết thanh thai bò (FBS) 10% và dung dịch kháng sinh 1% (penicillin 50,000 unit/L và streptomycin 50mg/L) Tế bào được duy trì trong tủ ấm tạo ẩm ở 37 o C với 5% CO 2 Tất cả các thuốc thử nuôi cấy tế bào có nguồn gốc từ Thermo Scientific (Waltham, MA, USA) Các thiết bị nuôi cấy tế bào (đĩa nuôi cấy mô 96 giếng, đĩa 10 mm, đĩa 35 mm và phiến kính 8 giếng) được mua từ Corning Incorporated (Somerville, Massachusetts, Hoa Kỳ)

 Quy trình xác định hoạt tính kháng tế bào ung thư

Tế bào được cấy trong đĩa 96 giếng với mật độ 10 4 tế bào/giếng trong môi trường DMEM đầy đủ Sau khi ủ qua đêm, môi trường cũ sẽ được thay thế bằng môi trường không chứa FBS và được bổ sung thêm chất thử với các nồng độ tăng dần lần lượt là

1, 3, 10, 30, 100 àM Cũn đối với chất tham chiếu doxorubicin sẽ được thử với cỏc nồng độ 0,1; 0,3; 1; 3 và 10 àM Tế bào được tiếp tục nuụi cấy trong vũng 72 giờ, sau đú thờm 10 àL dung dịch MTT vào mụi trường nuụi cấy để thu được nồng độ cuối cựng là 0,5 mg/ml Sau khi ủ với MTT trong 2 tiếng thì hút bỏ môi trường,lúc này tinh thể formazan được sinh ra sẽ được hũa tan trong 200àL DMSO và tiến hành đo quang tại bước sóng 570nm

 X ử lý kết quả thực nghiệm

Tỉ lệ ức chế tế bào tại mỗi nồng độ được tính theo công thức:

% ức chế tế bào = (ΔODchứng – ΔODmẫu thử)/ΔODchứng x 100, trong đó ΔODchứng/mẫu thử ODchứng/mẫu thử - OD trắng

Giá trị IC50 (và khoảng tin cậy 95%) được ước lượng từ đáp ứng tại 5 nồng độ riêng biệt, sử dụng phương pháp hồi quy phi tuyến với mô hình sigmoidal dose response trên phần mềm GraphPad Prism 8.3.0 (San Diego, CA, USA)

THỰC NGHIỆM KẾT QUẢ

T ổng hợp hóa học

Quy trình tổng hợp các dẫn chất 5-methoxy-2,2-dimethyl-2H- chromen được tiến hành theo sơ đồ sau:

Sơ đồ 3.1 Quy trình tổng hợp các dẫn chất ure mang nhân 5-methoxy-2,2- dimethyl- 2H- chromen

Nguyên li ệu và điều kiện : (a) KOH, H2O, reflux 90 o C, 6h; (b) 3-methyl-2-butenal, pyridin, 140 o C, 16h; (c) CH3I, K2CO3, DMF, 70 o C, 3h; (d) SnCl2.2H2O, EtOH, Reflux, 1h; (e) Pyridin, DCM, 0 o C – rt, overnight; (f) TEA, t BuOH, 4h

Quá trình tiến hành cụ thể qua 8 giai đoạn:

- 5 Giai đoạn : Tổng hợp phenyl (5-methoxy-2,2-dimethyl-2H-chromen-6- yl)carbamat (VI)

- Giai đoạn 6: Tổng hợp 1-(4-fluorophenyl)-3-(5-methoxy-2,2-dimethyl-2H- chromen-6-yl)ure (VIIa)

- Giai đoạn 7: Tổng hợp 1-(2,3-dihydro-1H-inden-2-yl)-3-(5-methoxy-2,2- dimethyl-2H-chromen-6-yl)ure (VIIb)

- Giai đoạn 8: Tổng hợp 1-(5-methoxy-2,2-dimethyl-2H-chromen-6-yl)-3- (quinolin-8-yl)ure (VIIc)

3.1.1 Tổng hợp phenyl (5-methoxy-2,2-dimethyl-2H-chromen-6-yl)carbamat 3.1.1.1 Tổng hợp 4-nitrobenzen-1,3-diol

Sơ đồ 3.2.Tổng hợp 4-nitrobenzen-1,3-diol

- Dụng cụ: Bình cầu đáy tròn 100 mL, nhiệt kế, máy khuấy từ gia nhiệt, máy cô quay chân không, ống đun hồi lưu, cột chạy sắc ký, bình chiết 500mL

Thêm 2(g) 4-Flor-1-nitrobenzen-2-ol bổ sung thêm 3,5(g) KOH (đương lượng 5) rồi hòa tan trong dung môi H 2 O , tiến hành đun hồi lưu phản ứng ở 90 o C Theo dõi phản ứng bằng TLC với hệ dung môi khai triển EtOAc : n-hexan (1:20 v/v) Phản ứng kết thúc sau 6 giờ

Sau khi phản ứng kết thúc thì làm nguội tại nhiệt độ phòng trước khi tiến hành chiết với dung môi EtOAc Lớp hữu cơ của hỗn hợp chiết sẽ được rửa với dung dịch nước muối NaCl, tiếp tục thêm Na 2 SO4để hấp thu hết phần nước rồi tiến hành cô quay ở áp suất giảm đến khi thu được sản phẩm Tiến hành chạy sắc ký cột nhanh bằng dung môi EtOAc : hexan ( tăng dần 1:25, 1:20),cất quay loại dung môi và thu được sản phẩm là chất rắn tinh khiết màu vàng nhạt (II) Đạt hiệu suất 60,77%

- Kết quả: Hợp chất II:

+ Cảm quan: Chất rắn màu vàng nhạt

+ Rf = 0,35 (TLC, silica gel 60 F254, hệ dung môi EtOAc : hexan = 1:20 v/v)

3.1.1.2 Tổng hợp 2,2-dimethyl-6-nitro-2H-chromen-5-ol

Sơ đồ 3.3.Tổng hợp 2,2-dimethyl-6-nitro-2H-chromen-5-ol

- Dụng cụ: Bình cầu đáy tròn 100 mL, nhiệt kế, máy khuấy từ gia nhiệt, máy cô quay chân không, ống đun hồi lưu, cột chạy sắc ký, bình chiết 500 mL

Thêm 1.2g 4-nitrobenzen-1,3-diol hòa tan vừa đủ với dung môi pyridin rồi thêm 1(g) 3- methyl- 2- butenal với đương lượng bằng với nguyên liệu (II) rồi tiến hành đun

21 hồi lưu phản ứng ở 140 o C Theo dõi phản ứng bằng TLC với hệ dung môi khai triển EtOAc : n-hexan (1:50 v/v) Phản ứng kết thúc sau 16 giờ

Sau khi phản ứng kết thúc thì làm nguội tại nhiệt độ phòng trước khi tiến hành chiết với dung môi EtOAc Lớp hữu cơ của hỗn hợp chiết sẽ được rửa với dung dịch nước muối NaCl,thu lấy pha dung môi hữu cơ, làm khan nước bằng Na2SO4 và đem cất quay loại dung môi rồi tiến hành cô quay ở áp suất thấp đến khi thu được sản phẩm

Tiến hành chạy sắc ký cột nhanh bằng dung môi EtOAc : hexan ( tăng dần 1:50, 1:40) cất quay loại dung môi và thu được sản phẩm là chất rắn tinh khiết màu vàng (III)

- Kết quả: Hợp chất III:

+ Cảm quan: Chất rắn màu vàng

+ Rf = 0,65(TLC, silica gel 60 F254, hệ dung môi EtOAc : hexan = 1:20 v/v) + Phổ 1 H-NMR (400 MHz, CDCl 3 ) δ 11,23 (s; 1H); 7,90 (d; J = 9,60 Hz; 1H);

3.1.1.3 Tổng hợp 5-methoxy-2,2-dimethyl-6-nitro-2H-chromen

Sơ đồ 3.4 Tổng hợp 5-methoxy-2,2-dimethyl-6-nitro-2H-chromen

- Dụng cụ : Bình cầu đáy tròn 100 mL, nhiệt kế, máy khuấy từ gia nhiệt, máy cô quay chân không, ống đun hồi lưu, bình chiết 500 mL

Hòa tan 0,78(g) 2,2-dimethyl-6-nitro-2H-chromen-5-ol vào trong dung môi

DMF, thêm 0,3ml CH3I (đương lượng 1.3) và 1,5(g) K 2 CO3 (đương lượng 3)ở nhiệt độ phòng Phản ứng được đun hồi lưu và khuấy ở 70 o C trong 3 tiếng Làm nguội phản ứng ở nhiệt độ phòng trước khi tiến hành chiết với EtOAc Lớp hữu cơ của hỗn hợp chiết sẽ được rửa với dung dịch muối, tiếp tục thêm Na 2 SO4để làm khan nước rồi tiến hành cô quay ở áp suất thấp đến khi thu được chất rắn có màu vàng Sản phẩm không cần phải chạy săc ký cột và đạt hiệu suất là 78.05%

- Kết quả: Hợp chất IV:

+ Cảm quan: Chất rắn màu vàng

+ Rf = 0,42 (TLC, silica gel 60 F254, hệ dung môi EtOAc : hexan = 1:50 v/v)

+ Phổ 1 H-NMR (400 MHz, CDCl 3 ) δ 7,77 (d; J = 8,80 Hz; 1H); 6,60 (d; J = 9,60 Hz;

3.1.1.4 Tổng hợp 5-methoxy-2,2-dimethyl-2H-chromen-6-amin

Sơ đồ 3.5 Tổng hợp 5-methoxy-2,2-dimethyl-2H-chromen-6-amin

- Dụng cụ: Bình cầu 2 cổ đáy tròn 100 mL, nhiệt kế, máy khuấy từ gia nhiệt, máy cô quay chân không, bình chiết 100 mL, bình chiết 500mL, cột sắc ký

Hoà tan chất 0,64(g) 2,2-dimethyl-6-nitro-2H-chromen-5-ol, 3 đương lượng SnCl2.2H2O tương đương 1,83(g), 2 giọt HCl đặc, đun hồi lưu ở 110 o C Theo dõi phản ứng bằng TLC với hệ dung môi khai triển MeOH : DCM (1:49)

Sau khi phản ứng kết thúc, thêm nước cất và chiết với EtOAc 4 lần, điều chỉnh pH = 10 – 11 với dung dịch NaOH 20%, thu lấy pha dung môi hữu cơ, làm khan nước bằng Na2SO4 và đem cất quay loại dung môi Tinh chế bằng sắc ký cột với hệ dung môi MeOH : DCM (tăng dần tỉ lệ 1:49, 5:95, 10:90 v/v), cất quay loại dung môi và thu được sản phẩm (V) là chất rắn màu trắng

+ Cảm quan: Chất rắn màu trắng

+ Rf = 0,58 (TLC, silica gel 60 F254, hệ dung môi MeOH : DCM = 1:50 v/v)

+ Phổ 1 H-NMR (500MHz, DMSO-d6) δ 6,49 (d; J = 9,60 Hz; 1H); 6,47 (d; J = 8,50

3.1.1.5 Tổng hợp phenyl (5-methoxy-2,2-dimethyl-2H-chromen-6-yl)carbamat

Sơ đồ 3.6 Tổng hợp phenyl (5-methoxy-2,2-dimethyl-2H-chromen-6-yl)carbamat

- Dụng cụ: Bình cầu 2 cổ đáy tròn 100 mL, nhiệt kế, máy khuấy từ gia nhiệt, máy cô quay chân không, bình gạn 100 mL, bình chiết 500mL, cột sắc ký

Hòa tan 0,49(g) chất 5-methoxy-2,2-dimethyl-2H-chromen-6-amin vào trong dung môi DCM sau đó thêm 0,5ml pyridin vào hỗn hợp Nhỏ từ từ 0,2ml phenyl cloroformate vào bình phản ứng tại 0 o C rồi khuấy duy trì tại nhiệt độ phòng qua đêm Sau khi phản ứng hoàn toàn thì tiến hành chiết với EtOAc Lớp hữu cơ của hỗn hợp chiết sẽ được rửa với dung dịch muối, tiếp tục thêm Na2SO4để loại phần nước rồi tiến hành cô quay ở áp suất thấp đến khi thu được chất rắn Chất thu được sau đó sẽ được chạy sắc ký cột với hệ dung môi EtOAC: hexan (1:20, 1:10) để thu được sản phẩm tinh khiết có màu vàng Phản ứng đạt hiệu suất là 83.25%

- Kết quả: Hợp chất VI:

+ Cảm quan: Chất rắn màu vàng

+ Rf = 0,33 (TLC, silica gel 60 F254, hệ dung môi EtOAC: hexan = 1:20 v/v)

+ phổ 1 H-NMR (500MHz, DMSO-d6) δ 9,28 (s; 1H); 7,41 (t; J = 7,65 Hz; 2H); 7,27

(d; J = 7,95 Hz; 1H); 7,24 (t; J = 7,45 Hz; 1H); 7,18 (d; 7,85 Hz; 2H); 6,56 (d; J 9,85 Hz; 1H); 6,55 (d; J = 8,60 Hz; 1H); 5,82 (d; J = 9,95 Hz; 1H); 3,75 (s; 3H); 1,37 (s; 6H)

3.1.2 Tổng hợp 1-(4-fluorophenyl)-3-(5-methoxy-2,2-dimethyl-2H-chromen-6- yl)ure

Sơ đồ 3.7.Tổng hợp 1-(4-fluorophenyl)-3-(5-methoxy-2,2-dimethyl-2H-chromen- 6-yl)ure

- Dụng cụ: Bình cầu 2 cổ đáy tròn 100 mL, nhiệt kế, máy khuấy từ gia nhiệt, máy cô quay chân không, bình gạn 100 mL, bình chiết 500mL, cột sắc ký

Hòa tan 0.1ml 4-fluoroanilin vào trong dung dịch tert-buthanol tại nhiệt độ phòng sau đó thêm 100mg chất phenyl (5-methoxy-2,2-dimethyl-2H-chromen-6- yl)carbamat vào và tiếp tục nhỏ từ từ 0.3ml TEA vào bình phản ứng, cho nhiệt độ

50 o C rồi khuấy duy trì tại nhiệt độ này trong 4h Sau khi phản ứng hoàn toàn thì tiến hành chiết với EtOAc Lớp hữu cơ của hỗn hợp chiết sẽ được rửa với dung dịch muối, tiếp tục thêm Na 2 SO4 để hấp thu hết phần nước rồi tiến hành cô quay ở áp suất thấp đến khi thu được chất rắn Chất thu được sau đó sẽ được chạy sắc ký cột với hệ dung môi MeOH : DCM (tăng dần tỉ lệ 1:49, 5:95, 10:90 v/v)để thu được sản phẩm tinh khiết có màu trắng Phản ứng đạt hiệu suất là 33.47%.

- Kết quả: Hợp chất VIIa:

+ Cảm quan: Chất rắn trắng

+ Rf = 0,54 (TLC, silica gel 60 F254, hệ dung môi MeOH : DCM = 1:49 v/v)

3.1.3 Tổng hợp 1-(2,3-dihydro-1H-inden-2-yl)-3-(5-methoxy-2,2-dimethyl-2H- chromen-6-yl)ure

Sơ đồ 3.8 Tổng hợp 1-(2,3-dihydro-1H-inden-2-yl)-3-(5-methoxy-2,2-dimethyl- 2H-chromen-6-yl)ure

- Dụng cụ: Bình cầu 2 cổ đáy tròn 100 mL, nhiệt kế, máy khuấy từ gia nhiệt, máy cô quay chân không, bình gạn 100 mL, bình chiết 500mL, cột sắc ký

Hòa tan 0,3ml 2,3-dihydro-1H-inden-2-amin vào trong dung dịch tert-buthanol tại nhiệt độ phòng sau đó thêm 100mg phenyl (5-methoxy-2,2-dimethyl-2H-chromen- 6-yl)carbamat vào Nhỏ từ từ 0,3ml TEA vào bình phản ứng , bật bếp tại 50 o C rồi khuấy duy trì tại nhiệt độ này trong 4h Sau khi phản ứng hoàn toàn thì tiến hành chiết với EtOAc Lớp hữu cơ của hỗn hợp chiết sẽ được rửa với dung dịch muối, tiếp tục

25 thêm Na2SO4 để hấp thu hết phần nước rồi tiến hành cô quay ở áp suất thấp đến khi thu được chất rắn Chất thu được sau đó sẽ được chạy sắc ký cột với hệ dung môi MeOH : DCM (tăng dần tỉ lệ 1:49, 5:95, 10:90 v/v) để thu được sản phẩm tinh khiết có màu trắng ngà Phản ứng đạt hiệu suất là 43.31%.

- Kết quả: Hợp chất VIIb:

+ Cảm quan: Chất rắn trắng

+ Rf = 0,49 (TLC, silica gel 60 F254, hệ dung môi MeOH : DCM = 1:49 v/v)

3.1.4 Tổng hợp 1-(5-methoxy-2,2-dimethyl-2H-chromen-6-yl)-3-(quinolin-8- yl)ure

Sơ đồ 3.9 Tổng hợp 1-(5-methoxy-2,2-dimethyl-2H-chromen-6-yl)-3-(quinolin- 8-yl)ure

- Dụng cụ: Bình cầu 2 cổ đáy tròn 100 mL, nhiệt kế, máy khuấy từ gia nhiệt, máy cô quay chân không, bình gạn 100 mL, bình chiết 500mL, cột sắc ký

Hòa tan 0,5ml quinolin-8-amin vào trong dung dịch tert-buthanol tại nhiệt độ bình thường sau đó thêm phenyl (5-methoxy-2,2-dimethyl-2H-chromen-6-yl)carbamat vào và sau đó nhỏ từ từ 0,3ml TEA sau đó tiến hành phản ứng tại 50 o C rồi khuấy duy trì tại nhiệt độ này trong 4h Sau khi phản ứng hoàn toàn thì tiến hành chiết với EtOAc

Ki ểm tra độ tinh khiết, khẳng định cấu trúc

3.2.1 Kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm

Sản phẩm sau tổng hợp và tinh chế được kiểm tra độ tinh khiết bằng sắc ký lớp mỏng Hũa tan chất sau tổng hợp bằng ethyl acetat, chấm 2 – 6 àL lờn bản mỏng, sấy khô Triển khai sắc ký với hệ dung môi n-hexan - ethyl acetat hoặc methanol – dicloromethan với các tỷ lệ khác nhau Sau khi dừng chạy bản mỏng, sấy khô, quan sát bản mỏng dưới buồng soi UV ở bước sóng 254 nm, thấy duy nhất một vết rõ ràng, không thấy các vết nhòe, không thấy xuất hiện thêm các vết khác, đủ điều kiện đo phổ và thử hoạt tính sinh học Giá trị Rf được ghi lại ở bảng 3.2

3.2.1.2 Đo nhiệt độ nóng chảy

Nhiệt độ nóng chảy của các chất được đo bởi máy đo nhiệt độ nóng chảy MPA 120 tại Bộ môn Hóa hữu cơ – Trường Đại học Dược Hà Nội

Kết quả được tổng hợp ở bảng 3.2

Bảng 3.2 Nhiệt độ nóng chảy của các dẫn chất VIIa-c

Ký hiệu Công thức cấu tạo

Hệ dung môi triển khai sắc ký

Thông qua việc kiểm tra sắc ký lớp mỏng và nhiệt độ nóng chảy của các dẫn chất (VIIa-c) có thể thấy sơ bộ cho thấy các chất này là tinh khiết, đủ điều kiện để đo phổ và thử hoạt tính sinh học

Bảng 3.3 Số liệu phổ 1 H-NMR của các dẫn chất VIIa-c

Công thức cấu tạo 1 H NMR (600 MHz; DMSO-d6); δ (ppm); J (Hz)

1 H-NMR (600 MHz, DMSO- d6) δ 9,14 (s; 1H; Ha); 8,05 (s; 1H; Hb); 7,78 (d; 1H; J

= 8,82 Hz; H7); 7,46-7,44 (m; 2H; H5’;H3’ ); 7,12–7,09 (m; 2H; H2’; H6’); 6,55 (d; 1H; J = 9,90 Hz; H4); 6,51 (d; 1H; J = 8,82 Hz; H8); 5,81 (d; 1H; J = 10,20 Hz; H3); 3,72 (s; 3H; -OCH3); 1,36 (s; 6H; -CH3)

1H-NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 7,81 (d; J = 8,80 Hz; 1H; H7), 7,68 (s; 1H; Hb); 7,25 (m; 2H; H5’; H6’); 7,15 (m; 2H; H4’; H7’); 7,01 (d; J = 8,2 Hz; 1H; Ha); 6,51 (d;

1H; H8); 5,79 (d; J = 9,90 Hz; 1H; H3); 4,40 (m; 1H; H2’); 3,63 (s; 3H;-OCH3); 3,20 (d; J = 7,2 Hz; 1H; H’1’); 3,18 (d; J 7,2 Hz; 1H; H’3’); 2,75 (d; J = 4,8 Hz; 1H; H1’); 2,72 (d; J = 4,8; 1H; H3’); 1,34 (s; 6H; -CH3)

1H-NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 10,11 (s; 1H; Hb); 9,19 (s; 1H; Ha); 8,92 (dd; J 4,2 Hz; 1,7 Hz; 1H; H2’); 8,57 (dd; J = 6,2 Hz; 2,9 Hz; 1H; H3’); 8,37 (dd; J = 8,3 Hz; 1,7 Hz; 1H; H7’); 7,77 (d; J = 9,0 Hz; 1H; H7); 7,61 (dd; J = 8,3 Hz; 4,2 Hz; 1H; H6’); 7,48-7,56 (m; 2H; H4’; H5’); 6,57 (d; J 9,6 Hz; 1H; H4); 6,40 (d; J = 8,4 Hz, 1H; H8), 5,81 (d; J = 10,2 Hz; 1H; H3); 3,74 (s; 3H; -OCH3); 1,38 (s; 6H; -CH3)

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân ( 1 H-NMR, 13 C-NMR) của các dẫn chất (VIIa-c) được đo trên máy Bruker Acance 600MHz với chất chuẩn nội tetramethylsilan (TMS) của hãng Bruker BioSpin (Thụy Sĩ) tại Viện Hóa Học – Viện Hàn Lâm Khoa Học và

Công Nghệ Việt Nam với dung môi sử dụng là DMSO-d6 Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 H của 3 chất được ghi ở bảng 3.3 và các phụ lục 7-9 Dựa vào kết quả phân tích dữ liệu phổ ở bảng 3.3 cho thấy số lượng proton, độ bội của tín hiệu, độ dịch chuyển hóa học phù hợp với công thức cấu tạo dự kiến

Bảng 3.4 Số liệu phổ 13 C-NMR của các dẫn chất VIIa-c

Công thức cấu tạo 13 C-NMR (126 MHz, DMSO-d6), δ

Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13 C của 3 chất (VIIa-c) được ghi ở bảng 3.4 và các phụ lục 10-12 Dựa vào kết quả phân tích dữ liệu phổ ở bảng 3.6 cho thấy số lượng carbon, độ dịch chuyển hóa học của các nguyên tử carbon phù hợp với công thức cấu tạo dự kiến

Phổ đồ được ghi ở phụ lục 1 – 3 Kết quả phân tích số liệu phổ hồng ngoại của các dẫn chất VIIa-c được ghi ở bảng 3.5

Bảng 3.5 Số liệu phổ IR của các dẫn chất VIIa-c

Ký hiệu Công thức cấu tạo Phổ IR ( KBr) , cm -1

Phổ hồng ngoại của các dẫn chất (VIIa-c) được ghi nhận trên máy FT-IR Affinity-IS-Shimadzu (Nhật Bản) tại Viện Hóa Học – Viện Hàn Lâm Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam với kỹ thuật làm viên nén KBr ghi trong vùng 4000 – 500 cm-1 phổ

Kết quả phân tích số liệu phổ hồng ngoại được ghi ở bảng 3.5 qua dữ liệu phân tích phổ đồ, có thể thấy các dẫn chất (VIIa-c) có các tín hiệu phổ hồng ngoại đặc trưng phù hợp với các nhóm chức trong công thức cấu tạo dự kiến

Phổ đồ được ghi ở phụ lục 4 – 6 Kết quả phân tích số liệu phổ khối lượng của các dẫn chất VIIa-c được ghi ở bảng 3.6

Bảng 3.6 Số liệu phổ MS của các dẫn chất VIIa-c

Công thức cấu tạo CTPT M (đvC) m/z (ESI-

Qua dữ liệu phân tích phổ ở bảng 3.6 và phổ đồ, có thể thấy các phổ đồ đều có peak phân tử với cường độ mạnh và có số khối đúng bằng số khối dự kiến của chất tương ứng Phổ đồ ít phân nhánh, các peak phân mảnh đều có cường độ yếu Như vậy có thể khẳng định các chất tổng hợp có khối lượng phân tử đúng dự kiến.

Th ử hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro

Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào được trình bày ở bảng 3.7 Sau khi khẳng định cấu trúc, chúng tôi tiến hành đánh giá hoạt tính kháng tế bào ung thư người trên dòng tế bào ung thư vú MDA-MB-231 và ung thư phổi A549 tại Phòng thí nghiệm dược lý phân tử, Bộ môn Dược lý, Khoa Dược Lý Dược Lâm Sàng, Trường Đại học Dược Hà Nội

Bảng 3.7 Kết quả thử hoạt tính kháng tế bào ung thư của các dẫn chất VIIa-c

Chất Công thức cấu tạo Độc tính tế bào trên từng dòng tế bào

Ghi chú: IC 50 là nồng độ ức chế 50% sự phát triển 95% CI là khoảng tin cậy 95%

BÀN LUẬN

V ề tổng hợp hóa học

4.1.1 Về các phản ứng tổng hợp phenyl (5-methoxy-2,2-dimethyl-2H-chromen-6- yl)carbamat

4.1.1.1 Cơ chế của phản ứng tạo 4-nitrobenzen-1,3-diol

Phản ứng thế nucleohile nhân thơm S N ở đây thế nhóm Flor bằng nhóm -OH để tạo nhân phenol Phản ứng được thực hiện ở 50 o C

Sơ đồ 4.1 Cơ chế của phản ứng thế nhóm Flor với nhân hydroxyl

Flor có độ âm điện rất cao nhưng tại vòng benzen vẫn có tính đẩy electrone khiến cho electron tại vị trí carbon số 4 giảm, đồng thời do nhóm nitro có tính hút e, từ đó nhân OH - trong nước sẽ có xu hướng gắn vào vị trí C-4 này, electron lúc này sẽ được di chuyển đến cả nhóm nitro ( có tính hút electron) Sau đó do sự cân bằng điện tích, electron sẽ được dịch chuyển lại vị trí C4 và Flor dễ dàng đi ra để trả lại trạng thái thơm ban đầu

4.1.1.2 Cơ chế của phản ứng tạo 2,2-dimethyl-6-nitro-2H-chromen-5-ol

Phản ứng có 3 giai đoạn

Giai đoạn 1: tạo phenolat, nhóm -OH gắn trực tiếp lên vòng benzen sẽ cho một Hydro linh động hơn, nhóm -OH của phenol có tính acid yếu nên dễ dàng trở thành phenolat dưới tác dụng của base TEA, tuy nhiên nhóm -OH vị trí số 2 dễ tạo liên kết

Hydro với nhóm -NO 2 nên nhóm -OH vị trí số 4 sẽ dễ bị tách Hydro hơn

Giai đoạn 2: cộng A N , lúc này phenolat sẽ đóng vai trò như 1 tác nhân Nu, tấn công theo kiểu cộng Michael vào aldehyd, electron sẽ được dịch chuyển tới nhóm aldehyd , lúc này Hydro linh động trong alcol ethylic dung môi sẽ gắn vào vị trí này để tạo thành nhóm -OH Tuy nhiên nhóm -OH sẽ không bền khi đứng cạnh carbon có liên kết đôi, nên nhóm sẽ chuyển bị chuyển thành aldehyd

Giai đoạn 3: Đóng vòng nội phân tử, Triethylamin với tính base tiếp tục tấn công vào nhân -OH còn lại, tách H + tạo phenolat, và ngưng tụ vớ nhóm aldehyd và H 2 O

Sơ đồ 4.2 Cơ chế đóng vòng của phenol và aldehyd không no 4.1.1.3 Cơ chế của phản ứng tạo 5-methoxy-2,2-dimethyl-6-nitro-2H-chromen

K2CO3 và DMF đều có tính base nên sẽ tấn công vào hydro linh động của phenol tạo thành O - , sau đó Oxy này sẽ được gắn vào nhóm methyl và đẩy iod ra ngoài do nhóm methyl có tính đẩy e ( mạnh hơn khi liên kết với Iod) để tạo thành nhóm methoxy

Sơ đồ 4.3 Cơ chế thế nhân methyl vào nhóm hydroxyl 4.1.1.4 Cơ chế của phản ứng tạo 5-methoxy-2,2-dimethyl-2H-chromen-6-amin

Phân tử Sn trong SnCl2 vẫn còn 2 orbital 5p trống, có thể nhận liên kết từ 2 ion

Cl - để tạo thành SnCl42- Cặp electron không liên kết trên orbital 5s của SnCl42- có tính ái nhân cao, dễ dàng tạo liên kết với 1 ion H + , hình thành Cl4SnH - Tiếp theo, ion

H - được giải phóng từ Cl4SnH - tấn công vào nguyên tử N có tính electrophin Sự xen phủ orbital của ion H + với đôi electron không liên kết trên nguyên tử O thuộc nhóm nitro đã tăng cường tính electrophin của nguyên tử N Sau đó, 1 phân tử H2O được tách ra, hình thành trạng thái trung gian Ph-N + =O Quá trình tiếp theo lặp lại với sự

35 tấn công của 1 ion H - và sự tách ra 1 phân tử H2O, tạo nên chất trung gian Ph-N + -H

Nhờ hiệu ứng liên hợp, cation tồn tại các dạng cấu trúc với vị trí điện tích dương khác nhau, 1 phân tử nước đóng vai trò 1 tác nhân nucleophin tấn công vào vị trí ortho

Cuối cùng, sự proton hóa tạo nên sản phẩm và tách loại 1 phân tử nước

SnCl2.2H2O trong EtOH là tác nhân khử chọn lọc các hơp chất nitro thơm, trong khi các nhóm thế khác như aldehyd, ceton, este, cyano, halogen, O-benzyl không bị ảnh hưởng Sử dụng tác nhân này sẽ hạn chế được nguy cơ cháy nổ so với khi khử hóa bằng hydro phân tử với xúc tác Nguyên nhân là do khí hydro rất nhẹ, dễ bị rò rỉ và tạo hỗn hợp nổ với không khí ở khoảng nồng độ rất rộng (4 – 74%) Ngoài ra, tác nhân

SnCl2.2H2O còn có ưu điểm là giá thành thấp hơn các tác nhân khử hóa khác

Nhược điểm của phương pháp này là nhiệt độ phản ứng cao, thời gian phản ứng tương đối dài, tiềm ẩn các phản ứng phụ với acid mạnh như HCl

Sơ đồ 4.4 Cơ chế phản ứng khử hóa nhóm nitro vòng thơm

4.1.1.5 Cơ chế của phản ứng tổng hợp phenyl (5-methoxy-2,2-dimethyl-2H- chromen-6-yl)carbamat

Nhóm amin có có Nito đang giàu electrone sẽ kết hợp với carbon của ester phenyl chlrofromate

Sau khi tạo liên kết lúc này nito mang điện tích dương, nhân Oxy khi kết hợp thì trở thành điện tích âm, đẩy electron vào trong carbon bất đối và đẩy clo ra ngoài

Triethylamin có tính base mạnh sẽ lấy đi 1 Hydro còn lại của Nito mang điện tích dương tạo thành nhân carbamat

Sơ đồ 4.5 Cơ chế phản ứng tạo nhân carbamat 4.1.2 Về các phản ứng tổng hợp dẫn chất ure mang nhân 5-methoxy-2,2- dimethyl-2H- chromen Đầu tiên nhóm amin sẽ tấn công vào nhóm carbonyl của carbamat khiến cho electron ở Oxy đẩy ra ngoài Sau đó xúc tác có tính base là TEA sẽ lấy một hydro của nhóm amin để cân bằng về điện tích Lúc này oxy mang điện tích âm lúc này sẽ đẩy nhân O-phenyl ra ngoài để trở thành ure Trong trường hợp này chọn xúc tác TEA và dung môi t-BuOH vì chúng đều có phần alkyl khá dài, hạn chê khả năng cộng AN của chúng và nhóm carbonyl.

V ề khẳng định khấu trúc

Sơ đồ 4.6 Cơ chế phản ứng tạo dẫn chất ure mang khung 2,2-dimethyl-5- methoxy-2H- chromen

4.2 Về khẳng định cấu trúc

4.2.1 Về phổ hồng ngoại (IR)

Phổ đồ được ghi ở phụ lục 1 – 3 và kết quả phân tích phổ IR được ghi ở bảng 3.5 Qua phổ đồ của các chất, dải hấp phụ đặc trưng của các nhóm chức và liên kết ở các chất tổng hợp được VIIa-c đã được xác định Đó là các dải phổ đặc trưng của nhóm carbonyl (C=O), liên kết N-H, liên kết C-H của vòng thơm (aromatic), liên kết C(sp 3 )- H

Bên dưới là minh họa cho phổ đồ IR của dẫn chất VIIa

Hình 4.1 Phổ hồng ngoại (IR) của dẫn chất VIIa

Phổ đồ của VIIa xuất hiện đỉnh dao động hóa trị của nhóm carbonyl (C=O) tại

1641 cm -1 với cường độ mạnh nhất Nguyên nhân ở đây là do liên kết đôi C=O có độ phân cực cao từ đó nâng cường độ hấp thụ lên rõ rệt

Liên kết N-H thường có dải hấp thụ tại 3200 – 3500 cm -1 nên có thể xác định dải hấp thụ ở 3313 cm -1 phù hợp với dao động hóa trị của nhóm N-H

Trên phổ đồ, dải hấp thụ đặc trưng của liên kết C-H thuộc vòng thơm xuất hiện trong vùng 2929 cm -1 , liên kết C(sp 3 )-H có dải hấp thụ tại vùng 2854 - 2940 cm -1

Ngoài ra, phổ đồ của VIIa còn cho thấy dải hấp thụ tại vùng 1573 cm -1 tương ứng với liên kết đôi C=C của vòng thơm Đặc biệt, chất VIIa còn có liên kết của C-F thường nằm trong dải hấp thụ 1000-1400 cm -1 và có mũi nhọn cao nên có thể xác định tại vị trí 1209 cm -1

4.2.2 Về phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 H-NMR

Phổ đồ 1 H-NMR cho thấy sự trùng khớp về tổng số proton dựa trên đường cong tích phân trên phổ đồ với số nguyên tử H trong công thức phân tử của các dẫn chất

VIIa-c Các tín hiệu này có sự đặc trưng của các proton phù hợp với các dữ kiện về độ dịch chuyển hóa học, cường độ tích phân của mũi cộng hưởng, sự tách spin-spin, hằng số ghép J

Phổ đồ 1 H-NMR của các dẫn chất VIIa-c cho thấy:

- Proton của nhân thơm tại hấp thu tại vùng 6.5 - 8 ppm với tín hiệu mũi đơn nhưng khung Chromen có vòng thơm có nhóm –OCH3 đẩy điện tử làm cho vị trí ortho, para được che chắn mạnh hơn vị trí meta

- Proton của nhóm N-H hấp thu tại vùng 7,01 -10,11 ppm với 1 mũi đơn Chúng đều liên hợp vào vòng thơm nhưng Proton H chịu hiệu ứng +M của O ở vị trí

39 methoxyl làm tăng chắn nên độ dịch chuyển giảm

- 2 proton của vòng oxepan hấp thu tại vùng 5,5 – 7 ppm 2 proton này ghép từ với nhau đều cho tín hiệu 1 mũi đôi và có cùng hằng số J

- 6 proton của 2 nhóm -CH3 xuất hiện thành 1 mũi đơn tại 1,34 -1,37 ppm

- proton của nhóm -OCH3 hấp thu 1 mũi đơn tại 3,63 – 3.74 ppm Đối với trường hợp cụ thể như hợp chất VIIb:

Các proton gắn vào vòng thơm có độ dịch chuyển trong khoảng 5,5 – 8,0 ppm, bị giảm chắn bởi từ trường không đẳng hướng của vòng thơm Nhóm thế rút điện tử như nitro (-NHCO-) sẽ làm các proton ít bị chắn và dịch chuyển về vùng trường thấp Vòng benzen có H7 và H8 sẽ bị ảnh hưởng, trong đó H7 chịu tác động mạnh hơn do nằm gần nhóm ure hơn Chúng còn chịu sự tách spin-spin lẫn nhau nên mũi cộng hưởng của H7 và H8 là 2 mũi đôi tại 7.81 và 6.45 ppm, với hằng số ghép J = 8,8 Hz

Do khung ure có tính hút electron nên H5’ và H6’ (tương đương nhau và cho tín hiệu multiplet) nhưng sẽ nằm ở vùng trường thấp hơn so với H4’ và H7’ ( cũng tương đương nhau và cho tín hiệu multiplet trên phổ) vì chúng nằm gần khung ure hơn Vòng Oxepan có 2 hydro là H3 và H4 ghép spin-spin với nhau với hằng số ghép là J

= 9,9 Hz, tuy nhiên H4 có chịu thêm hiệu ứng +M của nhóm methoxyl gần đó khiến cho nó bị giảm che chắn hơn

Hình 4.2 Phổ 1 H-NMR của dẫn chất VIIb

Trong vùng cộng hưởng của khung cyclopentan, có 5 nguyên tử hydro, trong đó H2’ liên kết với cả 4 nguyên tử hydro còn lại nên cho tín hiệu multiplet, H’1’ và H’3’ có sự tương đương về mặt hóa học ( cùng J = 4,8) do cùng vị trí trục của vòng 5 nhưng không tương đương về mặt điện tích ( có độ rời hóa học ppm khác nhau) do đó chỉ có

1 trong 2 hydro này xen phủ được với obitan phản liên kết C-N ( hydro nào xen phủ vào sẽ bị hút electron nhiều hơn theo hiệu ứng -I nên ở từ trường thấp hơn) Tương tự

H1’ và H3’ (cùng J = 7,2) cũng tương đương về mặt hóa học nhưng không tương đương về mặt điện tích, do vòng cyclopentan có dạng thuyền nên các góc không bằng nhau nên sẽ có 1 Hydro ở vị trí biên có góc liên kết phù hợp để xen phủ Obitan của vòng thơm ( H nào xen phủ vào sẽ bị hút electron theo hiệu ứng -C và nằm ở từ trường thấp hơn

4.2.3 Về phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13 C-NMR

Kết quả phổ 13 C-NMR của các dẫn chất VIIa-d được ghi trong phụ lục 13 – 16 và bảng 3.5

Phổ đồ của cả 3 chất VIIa-c thể hiện đủ số loại carbon trong công thức Kết hợp cùng với số liệu của phổ 1 H-NMR, các tín hiệu đặc trưng của carbon trong các dẫn chất VIIa-c đã được nhận diện:

+ Carbon thuộc nhóm ure (153-156 ppm)

+ Carbon thuộc nhóm ete (61 ppm)

+ Carbon thuộc liên kết C=C (116-127 ppm) và C(sp 3 )-C(sp 3 ) (27 ppm)

Dưới đây là minh họa phổ 13 C-NMR của chất VIIb

Hình 4.3 Phổ 13 C-NMR của dẫn chất VIIb

Phổ đồ 13 C-NMR của VIIc đã hiển thị rõ nét, đủ 16 tín hiệu tương ứng với 22 loại carbon có trong công thức

Các nguyên tử C của vòng thơm xuất hiện ở vùng trường thấp do nguyên tử C ở trạng thái lai hóa sp 2 và chịu sự giảm chắn mạnh bởi từ trường không đẳng hướng của nhân thơm C15 thuộc nhóm carbonyl C=O có độ dịch chuyển hóa học lớn nhất (155.1 ppm) vì nguyên tử C này gắn trực tiếp vào nguyên tử N có độ âm điện mạnh Nguyên tử C5 có độ dịch chuyển hóa học cao thứ 2 (147.01 ppm) vì nó gắn trực tiếp vào vòng thơm có nguyên tử O nằm ngay bên cạnh

Các nguyên tử C20 và C23 tương đương nhau thuộc nhóm vòng cyclopentan có lai hóa sp 3 , không bị ảnh hưởng bởi hiệu ứng bất đẳng hướng từ vòng thơm, dẫn đến ít bị chắn và có độ dịch chuyển hóa học tại vùng trường cao Hai nguyên tử C11 và C12 tương đương, có độ dịch chuyển hóa học thấp (27ppm) nhất sau đó đến nguyên tử C là gắn trực tiếp vào nguyên tử O là 61ppm

Phổ đồ 13 C-NMR của VIIa có sự khuất hiện của nguyên tố Flor tại vị trí số 4 của vòng thơm nên sẽ khiến cho C21 và C23 (đối xứng) có tín hiệu doublet tại 115ppm,tương tự C20 và C24 ( đối xứng) cũng có tương tác với Flor và cho tín hiệu doublet tại 119ppm

Hình 4.4 Phổ 13 C-NMR của dẫn chất VIIa

Phổ đồ của 4 dẫn chất VIIa-c đều xuất hiện các đỉnh với giá trị tương ứng

[M+H] + có cường độ mạnh Vì vậy, có thể khẳng định các dẫn chất VIIa-c tổng hợp được có phân tử khối đúng với cấu trúc dự kiến

Ví dụ minh họa với dẫn chất VIIc Công thức phân tử (CTPT) của VIIc là

C22H21N2O3, có phân tử khối tương ứng là 375.43 Phổ đồ xuất hiện đỉnh [M+H] + với cường độ mạnh, có khối lượng hạt chia điện tích m/z = 376.0

Hình 4.5 Phổ khối lượng (MS) của dẫn chất VIIc

Thêm một ví dụ khác với dẫn chất VIIa: Công thức phân tử (CTPT) của VIIa là

C19H19FN2O3, có phân tử khối tương ứng là 342,37 Phổ đồ xuất hiện đỉnh [M+H] + với cường độ mạnh, có khối lượng hạt chia điện tích m/z = 342.9

Hình 4.6 Phổ khối lượng (MS) của dẫn chất VIIa

Kết quả này có thể đánh giá sơ bộ dẫn chất VIIa và VIIc có phân tử khối đúng với dự kiến.

J.Chang

1.2.5 Phản ứng thế clor và tạo vòng Claisen của Jiyoung Mun

Vẫn tại năm 2012, Jiyoung Mun đã thử sử dụng dẫn chất clor thay cho alcol của Chang, chỉ cần xúc tác với NaOH rất đơn giản và hòa tan chất trong dung môi DMF

Tuy nhiên phản ứng cần được đun nóng ở 60°C trong 8 giờ và hiệu suất vẫn không được tối ưu Ở phản ứng đóng vòng, NMP được chọn làm dung môi cho chu trình Claisen do có nhiệt độ sôi cao (202 o C) và dễ dàng loại bỏ dung dịch ether dư bằng cách rửa với nước [28]

Sơ đồ 1.5 Quy trình tổng hợp dẫn chất 2,2-dimethyl-2H-chromen-5-ol bởi Jiyoung Mun

1.2.6 Phản ứng oxy hóa dị vòng

Trong năm 2018, Hongchan An đã có sự khác biệt, đột phá hơn trong việc điều chế dẫn chất, khi chỉ sử dụng 1 phản ứng với 3-methyl-2-butenal vẫn đi từ resorcinol được hòa tan trong dung môi Ethanol và xúc tác CaCl2.2H2O với triethylamin chỉ cần đun hồi lưu trong 3 tiếng với hiệu suất khá cao, hơn 70% [41]

Sơ đồ 1.6 Quy trình tổng hợp dẫn chất 2,2-dimethyl-2H-chromen-5-ol bởi Hongchan An

1.3 Định hướng thiết kế cấu trúc

Từ phần lý thuyết trên, ta có thể thấy, phần cấu trúc chromen và nhân ure là hai vị trí quan trọng, có nhiều nghiên cứu chứng minh cho tác dụng chống các tế bào ung thư đáng kể của chúng Do đó, đề tài tiến hành kết hợp một cách phù hợp, loại bỏ phần cấu trúc ethylen trên khung chromen ban đầu, thu được phần cấu trúc mới, giữ lại phần vòng benzen và nhóm methoxy

Thay thế và phát triển phần cấu trúc bên còn lại của nhân ure sẽ cho chúng ta nhiều cơ hội và sự phát triển đa dạng trong việc tìm ra các thuốc mới, vòng benzen trung tâm tạo liên kết π-cation với các acid amin khác nên phần cấu trúc này nên được giữ lại khi phát triển Từ đó chúng tôi sẽ thay thế các nhóm thế có chứa nhân thơm để phát huy được tối đa khả năng chống ung thư của hợp chất

Sơ đồ 1.7 Định hướng thiết kế cấu trúc các chất ure chống ung thư mới mang khung 5-methoxyl-2,2-dimethyl-2H-chromen

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị

Các hóa chất, dung môi dùng trong thực nghiệm đa phần có nguồn gốc, xuất xứ từ hãng Sigma-Aldrich (Mỹ), Merck (Đức) và Trung Quốc Các hóa chất được sử dụng trực tiếp, không tinh chế thêm và được trình bày ở bảng dưới đây:

Bảng 2.1 Các nguyên liệu sử dụng trong thực nghiệm STT Nguyên liệu Nguồn gốc, xuất xứ

3 Calcium cloride dihydrat Trung Quốc

5 Thiếc (II) clorid dihydrat Trung Quốc

9 Phenyl cloroformat Sigma-Aldrich (Mỹ)

10 Sodium sulfate khan Xilong Scientific (Trung Quốc)

19 3-methyl-2-butenal AK Scientific (Mỹ)

20 Pyridin Xilong Scientific (Trung Quốc)

22 tert-Butyl alcohol Shanghai Zhanyun Chemical

23 Quinolin-8-amin AK Scientific (Mỹ)

24 4-fluoro anilin Xilong Scientific (Trung Quốc)

25 2,3-dihydro-1H-inden-2-amin Trung Quốc

- Dụng cụ thủy tinh: cốc có mỏ (100 mL, 250 mL, 500 mL), đũa, phễu, phễu Buchner, cột sắc ký, bình chiết, sinh hàn, bình cầu (50 mL, 100 mL, 250 mL,

- Máy cô quay chân không Buchi Rotavapor R-200 (Thụy Sĩ)

- Buồng soi UV CN-6 Vilber Lourmat (Pháp)

- Máy siêu âm Ultrasonic LC 60 H (Đức)

- Máy khuấy từ gia nhiệt IKA RCT Basic (Đức)

- Cân kỹ thuật Sartorius (Đức)

- Bản mỏng silicagel TLC 60 F 254 Merck (Đức)

- Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân ( 1 H-NMR, 13 C-NMR) Bruker Avance 500 MHz của hãng Bruker BioSpin (Thụy Sĩ) tại Khoa Hóa Học – Trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội

- Máy đo phổ hồng ngoại FT-IR Affinity-IS-Shimadzu (Nhật Bản) tại Viện Hóa Học – Viện Hàn Lâm Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam

- Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân ( 1 H-NMR, 13 C-NMR) Bruker Avance III

HD 600 MHz của hãng Bruker BioSpin (Thụy Sĩ) tại Viện Hóa Học – Viện Hàn Lâm Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam

- Máy đo phổ khối 1100 Series LC - MSD - Trap – SL của hãng Agilent tại Viện Hóa Học – Viện Hàn Lâm Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam

- Máy đo nhiệt độ nóng chảy nhiệt điện MPA 120 (Mỹ) tại Bộ môn Hóa Hữu Cơ

– Trường Đại học Dược Hà Nội

Tổng hợp 3 dẫn chất 5-methoxy-2,2-dimethyl-2H-chromen, bao gồm:

- 1-(5-methoxy-2,2-dimethyl-2H-chromen-6-yl)-3-(quinolin-8-yl)ure

- 1-(4-fluorophenyl)-3-(5-methoxy-2,2-dimethyl-2H-chromen-6-yl)ure

- 1-(2,3-dihydro-1H-inden-2-yl)-3-(5-methoxy-2,2-dimethyl-2H-chromen-6- yl)ure

2.2.2 Tinh chế và xác định cấu trúc các dẫn chất tổng hợp được

- Tinh chế các dẫn chất tổng hợp được bằng phương pháp chiết lỏng – lỏng, sắc ký cột

- Kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm bằng sắc ký lớp mỏng

- Đánh giá độ tinh khiết và xác định cấu trúc bằng các phương pháp phổ: phổ khối lượng (MS), phổ hồng ngoại (IR), phổ cộng hưởng từ hạt nhân ( 1 H-NMR, 13 C-

2.2.3 Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư của các chất tổng hợp được

Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư của các dẫn chất 5-methoxy-2,2-dimethyl- 2H-chromen tổng hợp được trên các dòng tế bào: Ung thư phổi A549 và ung thư vú MDA-MB-231

2.3.1 Phương pháp tổng hợp hóa học

Sử dụng các phương pháp tổng hợp hữu cơ cổ điển và hiện đại để tổng hợp các dẫn chất dự kiến

Theo dõi phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng và đánh giá sơ bộ độ tinh khiết của sản phẩm

2.3.2 Phương pháp kiểm tra độ tinh khiết

Sắc ký lớp mỏng: được sự dụng để theo dõi tiến trình diễn ra của phản ứng, xác định được thời điểm phản ứng kết thúc, kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm sau khi tinh chế Sắc ký lớp mỏng được tiến hành trên bản mỏng tráng sẵn silicagel GF254 tráng sẵn, được hoạt hóa ở 110 o C trong 30 phút Hệ dung môi sẽ được pha tùy vào đặc điểm riêng biệt của từng chất, từng phản ứng khác nhau Mẫu thử được hòa tan hoàn toàn trong dung môi phù hợp Bản mỏng được đặt trong bình sắc ký có dung môi bão hòa ở nhiệt độ phòng, cho dung môi pha động đến cách mép trên bản mỏng 0,5 cm thì quan sát kết quả dưới đèn từ ngoại ở bước sóng 254 nm

Nhiệt độ nóng chảy: Xác định bằng máy đo nhiệt độ nóng chảy nhiệt điện EZ – Melt

2.3.3 Phương pháp tinh chế và xác định cấu trúc

Sử dụng phương pháp chiết, phương pháp sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột để tinh chế các hợp chất tổng hợp được Các chất sau khi tổng hợp và đánh giá sơ bộ độ tinh khiết được xác định cấu trúc bằng phương pháp phổ, bao gồm: phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton ( 1 H-NMR) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon ( 13 C-NMR)

2.3.4 Phương pháp thử hoạt tính kháng tế bào ung thư

Hoạt tính kháng tế bào ung thư của các chất tổng hợp được thực hiện tại Phòng thí nghiệm dược lý phân tử, Bộ môn Dược lý, Khoa Dược Lý Dược Lâm Sàng, Trường Đại học Dược Hà Nội Áp dụng theo phương pháp MTT đối với các chất đã tổng hợp được trên hai dòng tế bào ung thư gồm: ung thư phổi A549 và ung thư vú MDA- MB-

Hoạt tính gây độc tế bào được thực hiện dựa trên phương pháp MTT (3-(4,5- dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium do nhà hóa học Tim Mosman lần đầu tiên phát hiện ra vào năm 1983 [27] Phương pháp này đánh giá khả năng sống sót của tế bào thông qua khả năng khử MTT có màu vàng thành một phức hợp formazan có màu tím do hoạt động của enzym dehydrogenase có trong ty thể Sản phẩm formazan này sau khi được hòa tan bằng DMSO và tiến hành đo mật độ quang (OD) ở bước sóng

570 nm Giá trị thể hoạt tính được tính là IC 50 (nồng độ chất thử ức chế 50% sự phát triển của tế bào)[10]

 Nguyên li ệu và phương pháp thử

Tế bào ung thư vú MDA-MB-231 và ung thư phổi A549 có nguồn gốc từ ATCC sẽ được lưu trữ trong N 2 lỏng, và được duy trì trong môi trường DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) có bổ sung huyết thanh thai bò (FBS) 10% và dung dịch kháng sinh 1% (penicillin 50,000 unit/L và streptomycin 50mg/L) Tế bào được duy trì trong tủ ấm tạo ẩm ở 37 o C với 5% CO 2 Tất cả các thuốc thử nuôi cấy tế bào có nguồn gốc từ Thermo Scientific (Waltham, MA, USA) Các thiết bị nuôi cấy tế bào (đĩa nuôi cấy mô 96 giếng, đĩa 10 mm, đĩa 35 mm và phiến kính 8 giếng) được mua từ Corning Incorporated (Somerville, Massachusetts, Hoa Kỳ)

 Quy trình xác định hoạt tính kháng tế bào ung thư

Tế bào được cấy trong đĩa 96 giếng với mật độ 10 4 tế bào/giếng trong môi trường DMEM đầy đủ Sau khi ủ qua đêm, môi trường cũ sẽ được thay thế bằng môi trường không chứa FBS và được bổ sung thêm chất thử với các nồng độ tăng dần lần lượt là

Ngày đăng: 22/08/2024, 17:04

TÀI LIỆU CÙNG NGƯỜI DÙNG

  • Đang cập nhật ...

TÀI LIỆU LIÊN QUAN