trần hoàng anh tổng hợp và thử tác dụng kháng tế bào ung thư của một số chất 5 methoxy 2 2 dimethyl2h chromen 6 carboxamid thơm

Một số hợp chất có nguồn gốc tự nhiên và tổng hợp đã được chứng minh là có khả năng ức chế hoạt động của HSP90 thông qua vị trí liên kết ATP tại vùng đầu N và có tác dụng chống ung thư..

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRẦN HOÀNG ANH

TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG KHÁNG TẾ BÀO UNG THƯ CỦA MỘT SỐ CHẤT 5-METHOXY-2,2-DIMETHYL-

2H-CHROMEN-6-CARBOXAMID THƠM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN HOÁ DƯỢC

HÀ NỘI – 2024

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRẦN HOÀNG ANH Mã sinh viên: 2091009

TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG KHÁNG TẾ BÀO UNG THƯ CỦA MỘT SỐ CHẤT 5-METHOXY-2,2-DIMETHYL-

1 Bộ môn Hoá hữu cơ Đại học dược Hà Nội

HÀ NỘI - 2024

Trước tiên, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới hai người thầy đã hướng

dẫn tôi thực hiện đề tài này, đó là PGS TS Phạm Thế Hải và TS Nguyễn Công

Trường Thầy cô không chỉ tận tình hướng dẫn, đưa ra lời khuyên chính xác kịp thời

mà còn tạo điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong suốt thời gian nghiên cứu thực hiện khóa luận tốt nghiệp này Đồng thời, tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới

ThS Nguyễn Nữ Huyền My cùng các thầy cô, kỹ thuật viên bộ môn Hóa Hữu Cơ,

các thầy cô trong trường, các phòng ban, thư viện đã giúp tôi hoàn thành khóa luận

Tôi xin chân thành cảm ơn TS Phạm Đức Vịnh Khoa Dược lý - Dược lâm sàng đã hỗ

trợ rất nhều trong quá trình đo hoạt tính sinh học các hợp chất

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới bạn Nguyễn Phương Thảo, bạn Phạm Thu

Bắc, bạn Nguyễn Hà Minh Đức cùng các thành viên khác đang tham gia nghiên cứu

tại bộ môn Hóa Hữu Cơ Mọi người đã cùng tôi vượt qua những lúc tưởng chừng như khó khăn nhất Thời gian được nghiên cứu cùng mọi người là một kỉ niệm đẹp, một phần quan trọng trong tuổi trẻ của tôi

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè đã luôn động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện khóa luận!

Hà Nội, ngày 01 tháng 06 năm 2024

Sinh viên

Trần Hoàng Anh

Mục lục

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ DANH MỤC CÁC HÌNH

1.2.3 Các hợp chất kết hợp khung deguelin và novobiocin 10

1.3 Tổng quan về khung benzimidazol 11

1.3.1 Giới thiệu 11

1.3.2 Khung benzimidazol trong các thuốc chống ung thư 12

1.3.3 Các phương pháp tổng hợp khung benzimidazol 12

1.4 Kỹ thuật Protein docking 15

1.5 Định hướng thiết kế cấu trúc 16

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1 Nguyên liệu 18

2.2 Thiết bị, dụng cụ và phần mềm 19

2.3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 19

2.3.1 Nội dung nghiên cứu 19

2.3.2 Phương pháp nghiên cứu 20

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ 25

4.3 Hoạt tính kháng tế bào ung thư 53

4.4 Mô phỏng docking phân tử 55 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

13C-NMR

1H-NMR A549 ATP CTCT CTD CTPT δ (ppm) DCC DCM DMAC DMAP DMF DMEM DMSO

DMSO-d6

EA EDC EGFR HOBt HSR IC50 FDA IR

J

MD MDA-MB-231 MEEVD

MeOH MS MW MTT NTD KDEL SAR

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton 1H Dòng tế bào ung thư phổi ở người Adenosin triphosphat

Công thức cấu tạo Miền đầu C của phân tử HSP90 Công thức phân tử

Độ dịch chuyển hóa học (đơn vị phần triệu) N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid

Dicloromethan N,N – dimethylacetamid Dimethylaminopyridin Dimethylformamid Môi trường nuôi cấy tế bào (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) Dimethylsulfoxid

Dimethylsulfoxid deutri hóa Ethylacetat

1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid Thụ thể yếu tố phát triển biểu bì (Epidermal growth factor receptor) Hydroxybenzotriazol

Phản ứng sốc nhiệt (heat shock reaction) Nồng độ ức chế 50% sự phát triển của tế bào ung thư thử nghiệm Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ

Phổ hồng ngoại (Infrared Spectrometry) Hằng số tương tác (Hz)

Miền giữa của phân tử HSP90 Dòng tế bào ung thư vú

Trình tự Met-Glu-Glu-Val-Asp Methanol

Phổ khối lượng (Mass Spectrometry) Vi sóng (Microwave)

3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromid Miền đầu N của phân tử HSP90

Trình tự Lys-Asp-Glu-Leu Mối liên quan cấu trúc – tác dụng (structure activity relationship)

SKLM To

nc TEA

Sắc ký lớp mỏng Nhiệt độ nóng chảy

Triethylamin

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1: Nguyên vật liệu, hóa chất, dung môi dùng trong nghiên cứu 18

Bảng 3.1: Kết quả tổng hợp của 3 chất mục tiêu 33

Bảng 3.2: Kết quả kiểm tra độ tinh khiết của các chất tổng hợp được 34

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 1.1: Tổng hợp khung benzimidazol từ 4-methyl-2-nitroacetanilid 12

Sơ đồ 1.2: Phản ứng ngưng tụ Philip để tổng hợp khung benzimidazol 13

Sơ đồ 1.3: Tổng hợp benzimidazol sử dụng xúc tác NAP-ZnO 13

Sơ đồ 1.4: Tổng hợp benzimidazol bằng chiếu xạ vi sóng 13

Sơ đồ 1.5: Tổng hợp benzimidazol nhờ xúc tác oxy phân tử 14

Sơ đồ 1.6: Iod xúc tác tổng hợp benzimidazol 14

Sơ đồ 1.7: Tổng hợp benzimidazol với Natri metabisulfit hấp phụ trên silica gel trong ethanol 14

Sơ đồ 1.8: Tổng hợp benzimidazol nhờ xúc tác NaHSO3 15

Sơ đồ 1.9: Tổng hợp benzimidazol nhờ ngưng tụ OPDA với ceton 15

Sơ đồ 1 10: Thiết kế chất mục tiêu từ NCT và khung benzimidazol 17

Sơ đồ 2 1: Sơ đồ tổng hợp chất trung gian amin 20

Sơ đồ 2 2: Sơ đồ tổng hợp chất mục tiêu 21

Sơ đồ 3 1: Sơ đồ kết quả tổng hợp hoá học 25

Sơ đồ 3.2: Tổng hợp 4-chloro-3-nitrobenzamid (II) 26

Sơ đồ 3.3: Tổng hợp 3-nitro-4-(benzyllamino)benzamid (III.1) 26

Sơ đồ 3.4: Tổng hợp 4-((3,4-dimethoxybenzyl)amino)-3 nitrobenzamid (III.2) 27

Sơ đồ 3.5: Tổng hợp 4-((4-fluorobenzyl)amino)-3-nitrobenzamid (III.3) 27

Sơ đồ 3.6: Tổng hợp 3-amino-4-(benzylamino)benzamid (IV.1) 28

Sơ đồ 3.7: Tổng hợp 3-amino-4-((3,4-dimethoxybenzyl)amino)benzamid (IV.2) 28

Sơ đồ 3.8: Tổng hợp 3-amino-4-((4-fluorobenzyl)amino)benzamid (IV.3) 28

Sơ đồ 3 9: Tổng hợp 1-benzyl-2-(4-nitrophenyl)-1H-benzo[d]imidazol-5-carboxamid (V.1) 29

Sơ đồ 3.10: Tổng hợp 1-(3,4-dimethoxybenzyl)-2-(4-nitrophenyl)-1H-benzo [d] imidazol-5-carboxamid (V.2) 29

Sơ đồ 3.11: Tổng hợp 1-(4-fluorobenzyl)-2-(4-nitrophenyl)-1H-benzo [d]

4-kẽm/CH3COOH trong MeOH 44 Sơ đồ 4 5: Cơ chế phản ứng EDC coupling 45 Sơ đồ 4.7: Cơ chế hình thành 2 proton khác nhau trên nhóm amid 49

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1: Cấu trúc của HSP90 2

Hình 1.2: Cơ chế hoạt động của HSP90 3

Hình 1.3: Độ dài chuỗi acid amin của các đồng dạng HSP90 5

Hình 1.4: Cơ chế của phản ứng sốc nhiệt (HSR) 6

Hình 1 5 Các vị trí liên kết ATP tại miền đầu C HSP90 7

Hình 1.6: Cấu trúc của novobiocin 8

Hình 1.7: Novobiocin và các dẫn chất 9

Hình 1.8: Deguelin và các dẫn chất 10

Hình 1.9: chuỗi dẫn chất NCT từ khung cấu trúc novobiocin và deguelin 11

Hình 1.10: Các thuốc trên thị trường có chứa khung benzimidazol 11

Hình 1.11: Các hợp chất chứa khung benzimidazol ức chế HSP90 12

Hình 1.12: Bản chất của phương pháp protein docking 16

Hình 2.1: Công thức chung của các dẫn chất carboxylic acid có chứa khung benzimidazol 20

5-methoxy-2,2-dimethyl-2H-chromene-6-Hình 4.1: Phổ IR hợp chất CT-239 47

Hình 4.2: Phổ khối của chất CT-239 48

Hình 4.3: Công thức chung của các chất mục tiêu 48

Hình 4.4 Phổ 1H-NMR của CT-239 51

Hình 4.5: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR của CT-239 53

Hình 4.6: Hình ảnh tương tác của 3 chất tổng hợp được và NCT-58 tại túi liên kết miền đầu C HSP90 55

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ung thư là một vấn đề sức khỏe toàn cầu với tỷ lệ mắc bệnh và tử vong ngày càng cao Khoảng 90% số ca tử vong liên quan đến ung thư là do sự lan rộng của khối u thông qua quá trình di căn [29] Điều trị có mục tiêu phân tử đã trở thành một trong những phương pháp chính của điều trị y học cho ung thư Trong các tài liệu gần đây, một số lượng lớn các mục tiêu và phương pháp mới cho điều trị chống ung thư đã được báo cáo Trong đó, HSP90 được coi là một đích phân tử tiềm năng cho việc phát triển các thuốc chống ung thư mới

Một số hợp chất có nguồn gốc tự nhiên và tổng hợp đã được chứng minh là có khả năng ức chế hoạt động của HSP90 thông qua vị trí liên kết ATP tại vùng đầu N và có tác dụng chống ung thư Tuy nhiên, một số dẫn chất đã được đưa vào thử nghiệm lâm sàng nhưng chưa hợp chất nào thành công ra thị trường do độc tính và tác dụng phụ của chúng [52] May mắn thay các nghiên cứu gần đây đã phát hiện ra các chất ức chế đầu C của HSP90 có thể khắc phục nhước điểm trước đó của thuốc ức chế đầu N [57] Và các chất tự nhiên đầu tiên được phát hiện ra có thể ức chế miền đầu C đó là novobiocin và deguelin Bên cạnh đó thì khung benzimidazol cũng cho thấy tiềm năng ức chế tế bào ung thư Do đó nghiên cứu sẽ thực hiện nghiên cứu và tổng hợp hợp các chất ức chế đầu C của HSP90 từ sự kết hợp khung cấu trúc của deguelin và

benzimidazol với tên đề tài “Tổng hợp và thử tác dụng kháng tế bào ung thư của

một số chất 5-methoxy-2,2-dimethyl-2H-chromen-6-carboxamid thơm” với mục

1.1.2 Cấu trúc, chức năng và cơ chế hoạt động của HSP90

Cấu trúc tổng thể của HSP90 là một homodimer với mỗi monomer gồm 3 miền riêng biệt: miền đầu N (NTD), miền giữa (MD) và miền đầu C (CTD) Ngoài ra ở các sinh vật nhân thực thì HSP90 có thêm vùng liên kết tĩnh điện (charged region) nối

miền đầu C và miền giữa với nhau (Hình 1.1) [1] Mỗi miền cấu trúc trong HSP90 có

chức năng cụ thể Miền đầu N chứa vị trí liên kết ATP có vai trò quan trọng với các protein chaperon trong siêu họ protein GHKL (Gyrase, HSP90, histidine kinase, and MutL) [3] Miền giữa có các rãnh kỵ nước nơi xảy ra tương tác giữa các protein cilent và HSP90 có vai trò quan trọng đối với việc điều chỉnh hoạt động ATPase trong đầu N [48] Miền đầu C bao gồm 2 vị trí quan trọng đó là vị trí chịu trách nhiệu cho quá trình dimer hoá 2 chuỗi monomer và vị trí tương tác với các co-chaperon nhờ trình tự bảo tồn Met-Glu-Glu-Val-Asp (MEEVD) CTD chứa một vị trí liên kết nucleotid điều hoà hoạt động ATPase trong NTD [6]

Hình 1.1: Cấu trúc của HSP90

3 Các nghiên cứu trước đây cho thấy các thành viên thuộc họ HSP90 đều thực hiện chức năng gấp các protein cilent thông qua 1 chu trình phức tạp Mặc dù chưa hiểu biết đầy đủ về chu trình chu trình gấp protein cilent, nhưng các nhà khoa học chỉ ra bộ máy chaperon HSP90 hoạt động trong chu trình có sự phối hợp của các co-chaperon, protein cilent và immunophilin [13] [14] (Hình 1.2)

Hình 1.2: Cơ chế hoạt động của HSP90

Đầu tiên các protein cilent mới được tổng hợp hoặc gấp sai được liên kết với chaperon HSP40/HSP70 hình thành phức hợp protein Sau đó protein client trong phức hợp này sẽ được sẽ được liên kết với HSP90 nhờ sự hỗ trợ bởi HOP (protein tổ chức HSP70-HSP90) Sau khi protein cilent được liên kết với HSP90, các co-chaperon khác, các immunophilin (FKBP51, FKBP52) được thêm vào homodimer HSP90 tạo thành phức hợp dị protein được kích hoạt trong khi HSP70 và HOP được giải phóng Sau đó ATP sẽ được liên kết với NTD của HSP90 để chuyển HSP90 từ trạng thái mở sang trạng thái đóng Sau đó các co-chaperon p23 và aha1 (aha1 chưa được thể hiện trên sơ đồ) đến gắn vào HSP90 và hỗ trợ quá trình gấp lại protein cilent Cuối cùng nhờ miền giữa của HSP90 gây ra quá trình thuỷ phân ATP thành ADP sẽ giúp gấp lại protein cilent đồng thời tăng cường giải phóng ra các immunophilin và co-chaperone và protein cilent đã được gấp lại HSP90 sau đó tiếp tục bước vào chu trình mới để gấp lại protein cilent khác [21]

Thông qua sự tương tác với protein cilent và các chất hỗ trợ hoạt động (protein co-chaperon), HSP90 tạo điều kiện cho việc gấp và ổn định nhiều loại protein cilent, điều chỉnh các con đường truyền tín hiệu như tăng sinh và chết theo chu trình của tế

4 bào, chống lại các tác nhân gây căng thẳng như sốc nhiệt, thiếu hụt chất dịnh dưỡng Đặc biệt HSP90 thường được biểu hiện quá mức trong các tế bào ung thư và góp phần gây ung thư bằng cách ổn định và kích hoạt các protein cilent khác nhau liên quan đến sự phát triển, sống sót và di căn của các tế bào ung thư Do đó, đích phân tử HSP90 đã nổi lên như một mục tiêu sinh học đầy hứa hẹn trong điều trị ung thư bằng cách ngăn chặn nhiều con đường truyền tín hiệu gây ung thư [48]

1.1.3 Phân loại

HSP90 thông thường được phân loại dựa theo vị trí xuất hiện trong tế bào, trong đó HSP90α1, HSP90α2 và HSP90β nằm trong tế bào chất; GRP94 xuất hiện trong lưới nột chất và TRAP1 chủ yếu nằm trong ty thể [19]

HSP90α1 và HSP90α2 là 2 đồng dạng phổ biến ở trên con người, cả hai có cấu trúc tương tự nhau, chỉ khác nhau ở điểm HSP90α1 có phần mở rộng hơn ở miền đầu N phần còn lại của cấu trúc đều giống nhau ở cả hai dạng đồng dạng bao gồm miền đầu N được bảo tồn cao, miền liên kết, miền giữa liên quan đến hoạt động ATPase và miền đầu C Cả hai dạng này đều là protein tế bào cảm ứng Ngoài ra Các đồng phân Hsp90α đã được xác định là biểu hiện ngoại bào trên các tế bào ung thư vú gây ra các tương tác rất quan trọng cho sự xâm lấn của khối u [13], cho thấy đích HSP90α là đích tiềm năng cho các chất chống ung thư

HSP90β còn được gọi là protein cấu trúc có chức năng quan trọng trong việc gấp và ổn định protein cilent trong các con đường truyền tin tế bào, duy trì sự sống tế bào [24] Về mặt cấu trúc HSP90β có mức độ tương đồng khoảng 85% so với đồng dạng HSP90α [24] Do đó thông thường HSP90 được sử dụng để chỉ định cho cả 2 đồng dạng này trừ khi có nghiên cứu sâu về 1 đồng dạng cụ thể

Protein GRP94, còn gọi là glucose-regulated protein 94 (GRP94), là một chaperon chủ yếu trong ty thể tế bào GRP94 đảm nhiệm việc gấp protein, bảo vệ protein khỏi tự phá hủy và duy trì sự ổn định của chúng GRP94 được kích hoạt trong các điều kiện căng thẳng tế bào, như sự tích tụ protein bất thường hoặc điều kiện môi trường bất lợi [11] Về cấu trúc, GRP94 có ba miền giống HSP90, nhưng khác nhau ở trình tự và độ dài chuỗi acid amin ở đầu N để phù hợp với sự tương tác với các protein cilent trong ty thể Hơn nữa, Đầu C của GRP94 có trình tự bảo tồn KDEL thay vì MEEVD như các HSP90 khác [21]

Protein TRAP1 (TNF receptor-associated protein 1) là một chaperon protein tham gia vào quá trình gấp protein và bảo vệ các protein trong ty thể khỏi sự tự phân hủy Ngoài ra, nó còn đóng vai trò quan trọng trong việc cân bằng nội môi của ty thể và điều chỉnh các quá trình liên quan đến năng lượng và sự sống còn của tế bào Về mặt

5 cấu trúc TRAP1 cũng có 3 miền như các HSP90 khác nhưng không có vùng liên kết kỵ nước và trình tự bảo tồn MEEVD [12]

Hình 1.3: Độ dài chuỗi acid amin của các đồng dạng HSP90

1.1.4 HSP90 là mục tiêu phân tử sinh học đầy tiềm năng cho các chất chống ung thư

Trong các nghiên cứu trước đây, các khối u ung thư được báo cáo phát hiện HSP90 biểu hiện quá mức bao gồm ung thư tuyến tụy, buồng trứng, vú, phổi… [46,58,64] HSP90 là chaperon protein có nhiều trong các tế bào nhân thực và có khả năng hỗ trợ gấp lại với hàng trăm protein cilent khác nhau, bao gồm các kinase, protein vận chuyển, thụ thể của hormon steroid, và các protein khác có vai trò quan trọng trong sự sống và chết của tế bào [62] Nhờ cơ chế này mà đối tế bào bình thường HSP90 sử dụng để điều chỉnh sự tăng sinh, tăng trưởng, biệt hóa và chết của chúng Mặt khác, các tế bào ung thư được đặc trưng bởi sự tăng sinh dai dẳng không kiểm soát được và thiếu các cơ chế điều hòa tự nhiên chịu trách nhiệm cho sự tăng sinh tế bào và cân bằng nội môi [38] Vì vậy các chaperon protein như HSP90 đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ và duy trì sự ổn định của những protein cilent trong tế bào ung thư nên các chất ức chế nhắm đích HSP90 được phát triển và tổng hợp để điều trị các bệnh ung thư liên quan đến HSP90

Ban đầu các nhà nghiên cứu tập trung khám phá các chất ức chế HSP90 tại vị trí ATPase của miền đầu N (NTD) theo cơ chế ức chế cạnh tranh với ATP gắn vào Các

sản phẩm tự nhiên như geldanamycin (GA) có nguồn gốc từ Streptomyces

hygroscopeus và kháng sinh radicicol (RD), phân lập từ Monosporium bonorden cho

thấy sự ức chế khả năng tăng sinh và phát triển của khối u [9, 60] Với cấu trúc tương tự ATP, các chất ức chế HSP90 này liên kết với vị trí ATPase của NTD trong cấu trúc HSP90, do đó cản trở quá trình liên kết và thủy phân ATP dẫn đến sự suy thoái của các protein cilent gây ung thư HSP90 [17] Mặc dù hiệu quả chống ung thư của GA và RD

đã được thử nghiệm trong nhiều nghiên cứu in vivo và in vitro nhưng nó vẫn chưa

được chấp thuận cho sử dụng lâm sàng do tính không ổn định về cấu trúc và gây độc

6 cho gan [61] Do đó các các dẫn chất của GA và RD được phát triển để nhắm mục tiêu đầu N của HSP90

Tuy nhiên, cho đến nay các chất ức chế HSP90 nhắm mục tiêu vào đầu N được đưa vào thử nghiệm lâm sàng nhưng chưa có chất nào được FDA chấp thuận trở thành thuốc điều trị ung thư Điều này là do những ảnh hưởng có hại cho sức khỏe của phản ứng sốc nhiệt (HSR) [36] HSR là một cơ chế điều hòa tăng HSP90 và các protein sốc

nhiệt khác như một phương pháp để khắc phục căng thẳng tế bào (hình 1.4) Sau khi

các chất ức chế vào HSP90 sẽ khiến protein này giải phóng ra yếu tố HSF-1 (heat shock factor -1: yếu tố gây sốc nhiệt), yếu tố này sẽ khiến cho tế bào tăng tổng hợp các HSP trong đó có HSP90 Vì vậy mà nồng độ chất ức chế phải tăng để ức chế HSP90 tăng tổng hợp dẫn đến xuất hiện độc tính quá liều

Hình 1.4: Cơ chế của phản ứng sốc nhiệt (HSR)

Do đó đến nay các nhà nghiên cứu đang chuyên hướng sang các chất ức chế miền đầu C của HSP90 mang lại một giải pháp thay thế có giá trị để nhắm mục tiêu vào các tế bào ung thư mà không gây ra HSR Trong bài nghiên cứu này cũng sẽ đi sâu vào vị trí hoạt động tại CTD cũng như thiết kế hợp lý chất ức chế nhắm đích vào vị trí hoạt động trong CTD của HSP90

1.1.5 Vị trí hoạt động tại miền đầu C của HSP90

Với những lợi ích điều trị của việc nhắm mục tiêu HSP90 CTD, các nhà nghiên cứu đã cố gắng phát triển các chất ức chế nhắm miền đầu C CTD thể hiện bốn đặc tính sinh hóa: 1) liên kết các phối tử, 2) tạo thành homodimer HSP90, 3) duy trì tương tác với các co-chaperon và 4) cung cấp khả năng chống lại sự phân giải protein [68] HSP90 CTD chứa một số vùng liên kết; vị trí liên kết nucleotid, trình tự MEEVD nằm ở đầu cuối và vùng giữa giao diện MD và giao diện thu nhỏ [26] Do chưa có các cấu trúc tinh thể giữa các chất ức chế và vị trí liên kết này, hầu hết các nghiên cứu đều chỉ ra các vị trí giả định ở vùng đầu C có thể liên kết với các chất ức chế Các nghiên cứu

7 tính toán đã xác định được ít nhất bốn túi trong CTD là vị trí gắn kết giả định cho các

chất ức chế HSP90 (Hình 1.5) [27] Nghiên cứu sau đó của Neckers và đồng nghiệp

đã chứng minh rằng ATP và novobiocin (chất ức chế đầu C HSP90 đầu tiên được khám phá) liên kết với cùng một vị trí gắn kết ở đầu C và trong các acid amin 657–677 [28] Hơn nữa, sự gắn kết của novobiocin tại CTD tạo ra một sự thay đổi về hình dạng và điều chỉnh hoạt động ATPase trong NTD

Hình 1 5 Các vị trí liên kết ATP tại miền đầu C HSP90

Sgobba và các cộng sự đã chỉ ra rằng có một vị trí liên kết với phân tử ATP ở vùng đầu C của HSP90, được xác định là đích đến của các chất ức chế miền đầu C [57] Nghiên cứu docking của Sgobba và các cộng sự sử dụng các chương trình AutoLigand và SiteMap [56] Nghiên cứu này đã xác định 4 vị trí liên kết giả định trong miền đầu C của HSP90, bao gồm pck1a, pck1b, pck2 và pck3 [56] Dựa trên điểm số docking cũng như các tương tác với vị trí liên kết của nobobiocin và các dẫn chất của nó mà các nhà khoa học đã cho rằng các chất ức chế có khả năng cao sẽ tương tác với túi liên kết pck1b Trong đó phần đường và vòng coumarin của novobiocin liên kết với Lys631, Lys632, Lys576 và Glu584, vòng coumarin và benzamid tạo tương tác kỵ nước với Ala629 và Tyr627, còn cầu nối amid có thể tạo liên kết hydro quan trọng với Lys615 [56]

Do đó trong nghiên cứu này mô phỏng docking phân tử cũng sẽ dock các chất thiết kế được vào vị trí pck1b

1.2.1 Novobiocin và các dẫn chất

Chất ức chế đầu C được phát hiện đầu tiên là sản phẩm tự nhiên novobiocin có thể làm gián đoạn bộ máy gấp protein HSP90, dẫn đến quá trình thủy phân protein cilent và gây ra quá trình tự hủy của tế bào ung thư [50] Cấu trúc novobiocin bao gồm

8

3 phần: chuỗi bên benzamid, khung coumarin và đường noviose (Hình 1.6) [63] Mặc

dù novobiocin có khả năng ức chế tăng sinh protein mà không gây ra phản ứng sốc nhiệt (HSR) nhưng novobiocin có tác dụng chống tăng sinh yếu (IC50 là 700 µM trên dòng tế bào SkBr3) [49]

Hình 1.6: Cấu trúc của novobiocin

Kể từ khi phát hiện ra novobiocin là chất ức chế miền đầu C đầu tiên, nhiều chất

tương tự đã được tổng hợp (Hình 1.7) và các nghiên cứu mối liên quan cấu trúc-tác

dụng (SAR) dần làm sáng tỏ A4 (2) là chất tương tự novobiocin đầu tiên được báo cáo

là kết hợp chuỗi bên acetamid thay cho chuỗi bên benzamid prenylat hóa được tìm thấy trong novobiocin Tuy nhiên việc thay thế chuỗi bên bằng acetamid đã dẫn đến xuất hiện HSR ở nồng độ thấp hơn 1000 lần so với nồng độ cần thiết cho quá trình chống tăng sinh protein cilent [67] Do đó, một nghiên cứu mối liên quan cấu trúc - tác dụng (SAR) về chuỗi bên amid đã chứng minh rằng chuỗi bên amid có độ dài từ 5 carbon trở lên sẽ chuyển trung tâm dị lập thể đầu C từ tác nhân bảo vệ thần kinh thành tác nhân chống tăng sinh [16] Việc khám phá độ lớn của chuỗi bên amid đã dẫn đến

KU174 (3), bao gồm cả đường noviose và chuỗi bên benzamid, 3 có hiệu lực tăng gấp

10-50 lần so với chất dẫn đường của nó [6] Các nghiên cứu SAR trước đây chỉ ra rằng việc thay thế khung coumarin bằng

biphenyl đã làm tăng hoạt tính chống tăng sinh Do đó, một loạt biphenylamid (4) đã

được tổng hợp và chứa vùng ưa nước, giúp cải thiện tác dụng chống lại tế bào MCF-7 Các amin bậc 3 được gắn vào giúp tăng cường hoạt động ức chế [15] Những nghiên

cứu như vậy cuối cùng đã dẫn đến việc tổng hợp ra phenyl cyclohexyl carboxamid 5,

chất này cho thấy hoạt động chống tăng sinh được cải thiện chống lại các tế bào SKBr3 [14]

9

Hình 1.7: Novobiocin và các dẫn chất

1.2.2 Deguelin và các dẫn chất

Một nhóm chất ức chế miền đầu C HSP90 khác dựa trên sản phẩm tự nhiên

deguelin (6) [38] Sự liên kết của 6 với CTD dẫn đến sự suy giảm protein cilent của

HSP90 Deguelin làm mất ổn định các tương tác HIF-1α và dẫn đến ức chế sự tăng

sinh tế bào ở một số dòng tế bào ung thư cả in vitro và in vivo [18, 27, 28] Tuy nhiên,

ở liều cao hơn, 6 là chất độc thần kinh Sau các nghiên cứu SAR sâu rộng của nhóm

Lee, một dẫn xuất deguelin mới, L80 (7a) đã được phát triển (Hình 1.8) 7a không gây

độc thần kinh, nhưng đã biểu hiện hoạt động chống tăng sinh và gây chết tế bào mạnh

mẽ chống lại nhiều dòng tế bào ung thư In vivo, 7a thể hiện các hoạt động chống lại

dòng tế bào ung thư phổi H1299 [32] Cuối cùng, các nghiên cứu đã dẫn đến 7b cải thiện hoạt động chống tăng sinh so với 7a

Các nghiên cứu tiếp theo về 7a, dẫn đến sự phát triển của 8 và SL-145 (9), gây ra

sự thoái biến của các protein cilent phụ thuộc HSP90 và thể hiện hoạt động gây độc tế

bào chống lại tế bào ung thư vú (dòng MDA-MB-231 và 4T1) [27] 10 được tổng hợp để cải thiện độ hòa tan so với 7a đồng thời cải thiện các đặc tính giống thuốc của khung cấu trúc [41] Một chất tương tự deguelin khác, SH-1242 (11) đã được phát triển và thể hiện hoạt tính tương tự như 7a Sự gắn kết từ 11 với HSP90 phá vỡ sự

tương tác giữa HSP90 và co-chaperon, protein tổ chức HSP90-HSP70 (HOP) và thể

10

hiện hoạt động chống ung thư tốt chống lại nhiều loại ung thư phổi khác nhau in

vivo [34]

Hình 1.8: Deguelin và các dẫn chất

1.2.3 Các hợp chất kết hợp khung deguelin và novobiocin

Với sự thành công của các chất ức chế đầu C HSP90 có nguồn gốc từ deguelin và novobiocin, tiềm năng kết hợp 2 khung cấu trúc này thành một khung duy nhất đã được nghiên cứu Chuỗi dẫn chất từ deguelin và novobiocin (NCT) được thiết kế và

tổng hợp thông qua quá trình lai giữa novobiocin và deguelin (Hình 1.9) NCT-50 (12)

có hoạt tính ức chế cao hơn và độc tính thấp hơn cả novobiocin và deguelin 12 thể

hiện hoạt động ức chế chống lại cả tế bào ung thư phổi và ức chế chức năng của HSP90 bằng cách ổn định cấu trúc mở của homodimer [20] Chất tương tự khác, NCT-

80 (13) đã ức chế sự kích hoạt STAT3 và làm gián đoạn sự tương tác giữa HSP90 và STAT3, nên việc điều trị trong ung thư phổi với 13 dẫn đến hoạt động chống ung thư

cả in vitro và in vivo mà không cần kích hoạt STAT3 hoặc Wnt/β -con đường truyền tín

hiệu β-catenin [26] Mức HSF-1 cao hơn tồn tại trong bệnh ung thư vú dương tính với Her2 và tương quan trực tiếp với thể tích khối u và giảm khả năng sống sót [53] Điều

trị khối u ung thư vú bằng NCT-58 (14) làm giảm biểu hiện CD44/ALDH1, một dấu hiệu sớm của tế bào gốc ung thư vú Ngoài ra, 14 đã dẫn đến việc gây tế bào chết theo

chương trình thông qua kích hoạt caspase-3/caspase-7 và điều hòa giảm biểu hiện

HSF-1, HSP70 và HSP90 [43] Hơn nữa, 14 thể hiện khả năng tiêu diệt các tế bào

kháng thuốc chống ung thư và gây ra sự thoái hóa của Her2, Her3, EGFR và p95Her2

11

[45] Kết quả là, 14 đại diện cho một khung mới để tối ưu hóa các phân tử nhỏ nhằm

điều trị bệnh ung thư vú dương tính

Hình 1.9: chuỗi dẫn chất NCT từ khung cấu trúc novobiocin và deguelin

Với những ưu điểm của chuỗi các dẫn chất NCT, trong nghiên cứu này sẽ dựa theo khung cấu trúc của NCT để thiết kế ra các dẫn chất mới có khả năng ức chế HSP90 tại miền đầu C

1.3.1 Giới thiệu

Benzimidazol là một khung cấu trúc thường sử dụng trong việc phát triển thuốc Nó được cấu tạo từ sự kết hợp vòng imidazol và vòng benzen Nó là một khung cấu

trúc rất phổ biến được sử dụng trong nhiều thuốc trên thị trường (Hình 1.10) [65]

Hình 1.10: Các thuốc trên thị trường có chứa khung benzimidazol

Telmisartan (thuốc hạ huyết áp)

Hoechst 33342 (thuốc chống virus)

Thiabendazol (thuốc chống nấm)

Mizolastin (thuốc đối kháng H3)

Omeprazol (thuốc điều trị dạ dày) Albendazol

(thuốc tẩy giun)

Bendamustin

(Chât đối kháng)

Benzitriamid (thuốc giảm đau)

12

1.3.2 Khung benzimidazol trong các thuốc chống ung thư

Trong số các loại thuốc chống ung thư được phát hiện trong những năm gần đây, nhiều dẫn xuất benzimidazol khác nhau đã thu hút được sự chú ý trong việc phát triển tác nhân chống ung thư do hoạt tính sinh học và ứng dụng lâm sàng đa dạng của chúng Benzimidazol có cấu trúc giống với các nucleotid purin tự nhiên, cho phép chúng dễ dàng tiếp xúc với các polyme sinh học trong hệ thống sống [25] Benzimidazol và các dẫn xuất của nó được báo cáo là đóng vai trò chính như chất ức chế topoisomerase, tác nhân xen kẽ DNA và alkyl hoá [59], chất đối kháng thụ thể androgen, chất ức chế poly(ADP-ribose) polymerase (PARP), chất ức chế protein kinase, … [25, 59] Một số dẫn xuất của benzimidazol đã được bán trên thị trường dưới dạng thuốc chống ung thư như bentamustin, selumetinib, galeteron và pracinuler Khung cấu trúc benzimidazol đã từng được báo cáo là có tác dụng lên đích HSP90 trước đây với khả năng chống tăng sinh dòng tế bào MCF-7 rất tốt với giá trị IC50 rất tốt lên tới 1,53 μM (Hình 1.11) [1] Do đó, với khả năng này của các hợp chất mang khung benzimidazol, nghiên cứu lựa chọn tổng hợp một số dẫn chất có khung benzimidazol với kỳ vọng tăng khả năng ức chế miền đầu C của HSP90

Hình 1.11: Các hợp chất chứa khung benzimidazol ức chế HSP90

1.3.3 Các phương pháp tổng hợp khung benzimidazol

Quá trình tổng hợp đầu tiên của benzimidazol được Hoebrecker thực hiện bằng cách khử 4-methyl-2-nitroacetanilid và sau đó ngưng tụ đóng vòng tạo khung benzimidazol (Sơ đồ 1.1) [47]

Sơ đồ 1.1: Tổng hợp khung benzimidazol từ 4-methyl-2-nitroacetanilid

Với sự phát triển về kiến thức và theo nhu cầu hiện tại, các phương pháp tổng hợp khác nhau đã được phát triển để tổng hợp khung cấu trúc benzimidazol, trong

thường xuất phát từ nguyên liệu ortho-phenyldiamine (OPDA)

13

a Phản ứng ngưng tụ o-phenyldiamin với acid carboxylic

Một phương pháp sử dụng phổ biến là ngưng tụ OPDA cùng với acid cacboxylic hoặc các dẫn xuất của nó, rồi đun nóng chúng lại với nhau trong môi trường acid HCl Đây là phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất được giải thích bởi Özbey và các cộng

sự [42] Sơ đồ 1.2 thể hiện quá trình ngưng tụ có xúc tác HCl của OPDA và acid

carboxylic

Sơ đồ 1.2: Phản ứng ngưng tụ Philip để tổng hợp khung benzimidazol

Khung benzimidazol có thể được tổng hợp bằng cách sử dụng các hạt nano ZnO

xúc tác (NAP-ZnO) để cho hiệu suất 90–98% o-phenyldiamin được đun nóng

bằng acid formic ở 70°C trong 6–240 phút Ưu điểm của phương pháp này là dễ dàng điều chế chất xúc tác NAP-ZnO, chất xúc tác nano không độc hại, có thể tái sử dụng và giá thành rẻ cũng như các điều kiện phản ứng an toàn Điều này làm cho nó trở thành phương pháp hiệu quả và thân thiện với môi trường (sơ đồ 1.3) và được nghiên

cứu bởi Alinezhad và các cộng sự [4]

Sơ đồ 1.3: Tổng hợp benzimidazol sử dụng xúc tác NAP-ZnO

Trong thời gian gần đây, alumina, silica gel và zeolite HY đã được sử dụng làm chất xúc tác trong quá trình tổng hợp benzimidazol (Sơ đồ 1.4) OPDA phản ứng với acid carboxylic béo, thơm hoặc dị vòng cùng với alumina, zeolit hoặc silica gel, bằng cách trộn chúng trong cối [51] Sau đó, hỗn hợp này được xử lý bằng chiếu xạ vi sóng trong 5–9 phút ở 160–560 Volt

Sơ đồ 1.4: Tổng hợp benzimidazol bằng chiếu xạ vi sóng

b Phản ứng ngưng tụ OPDA với aldehyd

NAP-ZnO, 6-240p Acid formic, 70o

14 Quá trình tổng hợp các dẫn xuất benzimidazol từ OPDA có thể được thực hiện bằng cách sử dụng aldehyd trong methanol có xúc tác oxy phân tử ở nhiệt độ phòng

Thay vì sử dụng nhiều chất oxy hóa nguy hiểm và tốn kém, Park và cộng sự đã phát

triển phản ứng hiệu quả hơn, thiết thực hơn và thân thiện với môi trường hơn bằng cách sử dụng bức xạ ánh sáng khả kiến [44] sử dụng oxy phân tử làm chất oxy hóa.(sơ đồ 1.5)

Sơ đồ 1.5: Tổng hợp benzimidazol nhờ xúc tác oxy phân tử

Trong một nghiên cứu được thực hiện bởi Sarkate và cộng sự, iod xúc tác tổng hợp 2-aryl-1-arylmethyl-1H-benzimidazol, bằng cách đun nóng OPDA với aldehyd ở

80–90°C trong 1,5 giờ (sơ đồ 1.6) [5] Phương pháp này đơn giản, hiệu quả, thân thiện với môi trường và hiệu quả cho việc tổng hợp

Sơ đồ 1.6: Iod xúc tác tổng hợp benzimidazol

Theo báo cáo của Kumar và cộng sự, sử dụng natri metabisulphit hấp phụ trên silicagel để tổng hợp benzimidazol được chứng minh là phản ứng tổng hợp thân thiện với môi trường Phản ứng diễn ra nhanh, hiệu quả và loại bỏ việc sử dụng các hóa chất đắt tiền và độc hại để tạo ra khung benzimidazol quan trọng với số lượng lớn Dung dịch OPDA trong ethanol được thêm vào benzaldehyd, sau đó Na2S2O5-SiO2 (Na2S2O5

được hấp phụ trên silicagel) được thêm vào và khuấy trong 4 đến 8 giờ (sơ đồ 1.7) [30]

Sơ đồ 1.7: Tổng hợp benzimidazol với Natri metabisulfit hấp phụ trên silica gel

trong ethanol

Một tác nhân khác sử dụng để tổng hợp 2-phenylbenzimidazol từ là NaHSO3 B.Soni đã tiến hành thí nghiệm và cho thấy hiệu suất phản ứng lên tới 85.35% [23] Sơ đồ 1.11

Na2S2O5 hấp phụ trên silicagel EtOH, 4-8 giờ

Iod/nước 80-90oC, 1,5 giờ MeOH, ánh sáng

khả kiến Oxy không khí

15

Bên cạnh đó, NaHSO3 là một hợp chất đặc biệt, có khả năng kết hợp với aldehyd Việc sử dụng NaHSO3 trong quá tình tổng hợp này cũng đã cho thấy hiệu suất tốt, tiến hành đơn giản hơn và giảm thời gian phản ứng ở một vài nghiên cứu trước đây NaHSO3 cũng là một tác nhân tan trong nước, có thể dễ dàng loại bỏ trong quá trình tinh chế sản phẩm, giá thành thấp, có thể dễ dàng tìm thấy trong điều kiện phòng thí nghiệm Do đó nghiên cứu sử dụng phản ứng này để tổng hợp khung benzimidazol

c Phản ứng ngưng tụ OPDA với ceton Dẫn xuất benzimidazol có thể được tổng hợp bằng cách ngưng tụ OPDA với nhiều ceton khác nhau Benzimidazol tạo thành không đối xứng và khá không bền nên bị phân hủy để tạo thành hỗn hợp gồm hai dẫn xuất benzimidazol khác nhau phụ thuộc vào nhóm alkyl bị loại bỏ (sơ đồ 1.9) [2]

Sơ đồ 1.9: Tổng hợp benzimidazol nhờ ngưng tụ OPDA với ceton

Protein docking – ra đời từ những năm 1980 – đã trở thành một trong những phương pháp được sử dụng phổ biến nhất trong quá trình thiết kế thuốc dựa trên cấu trúc vì có khả năng dự đoán với độ chính xác khá cao sự hình thành liên kết của cấu tử với receptor trong túi liên kết Nó phản ánh sự thành công của việc ứng dụng dữ liệu về cấu trúc của protein, được tạo bởi tinh thể học tia X và phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân (nuclear magnetic resonance – NMR) [66]

Docking đánh giá những liên kết có ý nghĩa và độ bền cao, và thậm chí còn có thể định lượng khả năng liên kết bởi các hàm tính điểm, qua đó phân hạng khả năng liên kết mạnh yếu của các cấu tử [22] Nhờ ưu điểm thực hiện trên máy tính với tốc độ nhanh, chính xác và chi phí không quá lớn, protein docking dần được coi là bước khởi đầu cho nghiên cứu thiết kế thuốc hiện đại

16 Docking thực chất một bài toán tối ưu, tìm vị trí và cấu hình phù hợp và đánh giá tương tác của một cơ chất gắn kết vào túi liên kết của protein Về mặt nhiệt động lực học, mục tiêu chính của docking là tìm ra cấu hình mà năng lượng tự do của toàn hệ là thấp nhất Để tìm cấu hình phù hợp nhất, cần liên hệ cấu hình không gian với các trị số đánh giá được khả năng gắn kết của cơ chất lên protein và sau đó áp dụng thuật toán

tìm kiếm [22] (Hình 1.12)

Hình 1.12: Bản chất của phương pháp protein docking

Thuật giải di truyền (Genetic Algorithm - GA) là thuật toán tìm kiếm được ứng dụng nhiều trong các chương trình docking như Autodock, Autodock Vina, GOLD GA áp dụng các lí thuyết liên quan đến học thuyết tiến hoá và chọn lọc tự nhiên Đầu tiên, thuật toán sẽ mã hoá tất cả các tham số của cấu trúc ban đầu trong một nhiễm sắc thế - biểu diễn bằng một vectơ Từ nhiễm sắc thể ban đầu này, tạo ngẫu nhiên một quần thể bao phủ một miền năng lượng Quần thể này được đánh giá và từ đó các nhiễm sắc thể thích nghi nhất (tức là có giá trị năng lượng thấp nhất) được chọn làm khung để tạo ra quần thể tiếp theo Quy trình này làm giảm năng lượng trung bình của toàn bộ nhiễm sắc thể bằng cách truyền các đặc tính cấu trúc thuận lợi từ một quần thể này sang một quần thể khác Sau một số chu kỳ tìm kiếm và đánh giá, cuối cùng ta sẽ tìm được một nhiễm sắc thể (cấu dạng) phù hợp với mức năng lượng tối thiểu [39]

Chương trình docking sử dụng các hàm tính điểm (scoring function) để ước lượng các năng lượng liên kết của phức hợp cấu tử - receptor Năng lượng này được cho bởi hằng số liên kết (Kd) và năng lượng tự do Gibbs (ΔGL) Dự đoán về năng lượng liên kết được thực hiện bằng cách đánh giá những tương tác hóa lý quan trọng bao gồm: các tương tác liên phân tử, các ảnh hưởng solvat và entropy [22] Do đó, số lượng các tham số hoá lý được đánh giá càng lớn thì độ chính xác càng cao Các hàm tính điểm hiệu quả nên đưa ra sự cân bằng giữa độ chính xác và tốc độ, đây là một điểm quan trọng khi làm việc với cơ sỡ dữ liệu lớn

Từ cấu trúc của chuỗi hợp chất NCT (NCT-50, NCT-58, NCT-80), ta có thể thấy, phần cấu trúc chromen có liên kết amid và nhóm methoxy tạo liên kết hydro quan

17 trọng với Ser677 và Lys615, là hai vị trí quan trọng trong liên kết với ATP của miền C của HSP90, đồng thời vòng benzen trung tâm tạo liên kết π-cation với các acid amin khác Do đó, trong nghiên cứu này phần cấu trúc chromen, benzen trung tâm và liên kết amid cầu nối của vòng chromen và benzen trung tâm được giữ lại Thay thế phần cấu trúc methoxy chứa dị vòng nitơ trên vòng benzen trung tâm bằng khung cấu trúc 5-carbamoylbenzimidazol với kỳ vọng tăng khả năng tạo liên kết π bởi vòng benzen và liên kết hydro từ nhóm amid

Sơ đồ 1 10: Thiết kế chất mục tiêu từ NCT và khung benzimidazol

18

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu

Các dung môi, hóa chất dùng cho tổng hợp đạt tiêu chuẩn dùng cho tổng hợp hóa dược (tinh khiết phân tích Analytical Reagent - AR), được đặt mua từ các nhà cung cấp trong nước hoặc nước ngoài Một số dung môi dùng để chiết tách, phân lập được mua từ các nhà cung cấp Trung Quốc Các hóa chất này được sử dụng trực tiếp, không trải qua thêm bất kỳ quá trình tinh chế nào, được liệt kê trong bảng như sau:

2 3,4–dimethoxy phenylmethanamin 15 NaHSO3

3 3-fluoro phenylmethanamin 16 4-nitro benzaldehyd 4 Acid 4-chloro-3-nitrobenzoic 17 Dimethyl acetamid (DMAC) 5 Acid 5-methoxy-2,2-dimethyl-2H-

19

2.2 Thiết bị, dụng cụ và phần mềm

- Dụng cụ thủy tinh: bình cầu 500mL, 250mL, 100mL, 50mL, sinh hàn, phễu, cốc thủy tinh các loại, bình lọc hút, phễu Buchner, bình nón, bình chiết, pipet Pasteur…

- Bơm hút chân không KNF (Đức) - Máy cất quay EYELA (Nhật Bản) - Tủ sấy Heraeus (Đức)

- Máy khuấy từ gia nhiệt IKA – RTC (Pháp) - Cân kỹ thuật (Trung Quốc)

- Cân phân tích (Trung Quốc) - Buồng soi UV 2 bước sóng 254 nm và 365 nm Spectroline (Mỹ) - Cột chạy sắc ký

- Sắc ký lớp mỏng: được tiến hành trên bản mỏng silicagel GF254 (Merck) - Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR) Bruker Acance 600 MHz với chất chuẩn nội tetramethylsilan (TMS) của hãng Bruker BioSpin (Thụy Sĩ) tại Viện Hóa Học – Viện Hàn Lâm Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam

- Máy đo phổ khối 1100 Series LC - MSD - Trap – SL của hãng Agilent tại Viện Hóa Học – Viện Hàn Lâm Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam

- Máy đo phổ hồng ngoại FT-IR Affinity-IS-Shimadzu (Nhật Bản) tại Khoa Hóa Học – Trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội

- Thiết bị máy tính dell Gen Intel(R) Core(TM) i5-5135G7 trên hệ điều hành Win10

- Phần mềm vẽ cấu trúc hóa học: Chemdraw 22.0 - Phần mềm docking: Molecular Operating Environment 2015 (MOE2105) - Phần mềm mô phỏng hình ảnh docking: Discovery studio 2024

2.3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Nội dung nghiên cứu

- Tổng hợp 3 dẫn chất 5-methoxy-2,2-dimethyl-2H-chromene-6-carboxylic acid có chứa khung benzimidazol mới có cấu trúc như hình 2.1

- Kiểm tra độ tinh khiết bằng sắc ký lớp mỏng và đo nhiệt độ nóng chảy

20 - Khẳng định cấu trúc của các dẫn chất tổng hợp dựa trên phân tích dữ liệu phổ hồng ngoại (IR), phổ cộng hưởng tử hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR), phổ khối lượng (MS)

- Đánh giá tác dụng kháng tế bào ung thư của các chất tổng hợp trên 2 dòng tế bào ung thư người bao gồm: Ung thư phổi A549 và ung thư vú MDA-MB-231

- Mô phỏng docking phân tử kết hợp với hoạt tính sinh học để nghiên cứu liên quan cấu trúc tác dụng của các dẫn chất

R= benzyl; 3,4-dimethoxybenzyl; 3-flourobenzyl

Hình 2.1: Công thức chung của các dẫn chất

5-methoxy-2,2-dimethyl-2H-chromene-6-carboxylic acid có chứa khung benzimidazol

2.3.2 Phương pháp nghiên cứu

a Phương pháp tổng hợp

Các chất mục tiêu được tổng hợp hoá học theo quy trình gồm 2 giai đoạn và được giám sát phản ứng bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng được trình bày dưới đây:

Giai đoạn 1: Tổng hợp chất trung gian amin

Sơ đồ 2 1: Sơ đồ tổng hợp chất trung gian amin

21

Giai đoạn 2: Tổng hợp chất mục tiêu

Sơ đồ 2 2: Sơ đồ tổng hợp chất mục tiêu

b Phương pháp tinh chế

Sử dụng phương pháp chiết, phương pháp sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột để tinh chế các hợp chất tổng hợp được

c Phương pháp kiểm tra độ tinh khiết

Đề tài sử dụng phương pháp kiểm tra độ tinh khiết bằng sắc ký lớp mỏng và đo nhiệt độ nóng chảy:

Sắc ký lớp mỏng: được dùng để theo dõi quá trình phản ứng, xác định thời gian

điểm kết thúc phản ứng, kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm sau khi tinh chế Sắc ký lớp mỏng được tiến hành trên bản mỏng silicagel GF254 tráng sẵn, hoạt hóa ở 110oC trong 30 phút Hệ dung môi tùy thuộc vào đặc điểm của từng chất Mẫu thử được hòa tan trong dung môi thích hợp Để bản mỏng trong bình sắc ký đã bão hòa dung môi ở nhiệt độ phòng, cho dung môi chạy đến cách mép trên bản mỏng 0.5 cm Quan sát kết quả dưới đèn từ ngoại ở bước sóng 254 nm

Nhiệt độ nóng chảy: Xác định bằng máy đo nhiệt độ nóng chảy nhiệt điện EZ –

Melt

d Phương pháp khẳng định cấu trúc

Các chất sau khi tổng hợp và đánh giá sơ bộ độ tinh khiết được xác định cấu trúc bằng phương pháp phổ, bao gồm: phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon (13C-NMR)

- Phổ hồng ngoại (IR): ghi bằng máy FTIR Affinity-IS - Phổ khối lượng (MS): được ghi bằng máy khối phổ LTQ Orbitrap XLTM - Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR): được ghi bằng máy Bruker

AV-500 đo ở tần số 500 MHz hoặc 600 MHz Độ dịch chuyển hóa học (δ) được biểu thị bằng đơn vị phần triệu (ppm), lấy mốc là pic của chất chuẩn nội tetramethylsilan

(TMS), nhiệt độ ghi phổ khoảng 300 K, dung môi DMSO-d6

22

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon (13C-NMR): được ghi bằng máy Bruker

AV-500 đo ở tần số 126 MHz Độ dịch chuyển hóa học (δ) được biểu thị bằng đơn vị phần triệu (ppm), lấy mốc là pic của chất chuẩn nội tetramethylsilan (TMS), nhiệt độ

ghi phổ khoảng 300 K, dung môi DMSO-d6

e Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro

Hoạt tính kháng tế bào ung thư của các chất tổng hợp được thực hiện tại phòng thí nghiệm dược lý phân tử, Bộ môn Dược lý, Khoa Dược lý Dược lâm sàng, Trường Đại học Dược Hà Nội Tiến hành theo phương pháp MTT [54] đối với các chất tổng hợp được trên hai dòng tế bào ung thư gồm: Ung thư phổi A549 và ung thư vú MDA-MB-231

Nguyên tắc:

Hoạt tính gây độc tế bào được thực hiện dựa trên phương pháp MTT (3-(4,5- dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium) được mô tả lần đầu tiên bởi tác giả Tim Mosman, 1983 [40] Phương pháp này đánh giá khả năng sống sót của tế bào qua khả năng khử MTT (màu vàng) thành một phức hợp formazan (màu tím) bởi hoạt động của

enzym dehydrogenase trong ty thể Sản phẩm formazan được hòa tan bằng DMSO-d6

và đo mật độ quang (OD) ở bước sóng 570 nm [40] Giá trị thể hoạt tính là IC50 (nồng độ chất thử ức chế 50% sự phát triển của tế bào)

Nguyên liệu và phương pháp thử:

Tế bào ung thư vú MDA-MB-231 và ung thư phổi A549 có nguồn gốc từ ATCC được lưu trữ trong nitơ lỏng, đánh thức và duy trì trong môi trường DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) có bổ sung huyết thanh thai bò (FBS) 10% và dung dịch kháng sinh 1% (penicillin 50,000 unit/L và streptomycin 50mg/L) Tế bào được duy trì trong tủ ấm tạo ẩm ở 37oC với 5% CO2 Tất cả các thuốc thử nuôi cấy tế bào được mua từ Thermo Scientific (Waltham, MA, USA) Các thiết bị nuôi cấy tế bào (đĩa nuôi cấy mô 96 giếng, đĩa 10 mm, đĩa 35 mm và phiến kính 8 giếng) được mua từ Corning Incorporated (Somerville, Massachusetts, Hoa Kỳ)

Quy trình xác định hoạt tính kháng tế bào ung thư :

Tế bào được cấy trong đĩa 96 giếng với mật độ 104 tế bào/giếng trong môi trường DMEM đầy đủ Sau khi ủ qua đêm, môi trường được thay thế bằng môi trường không chứa FBS được bổ sung thêm chất thử với các nồng độ tăng dần lần lượt là 1, 3, 10, 30, 100 µM Chất tham chiếu doxorubicin được thử với các nồng độ 0,1; 0,3; 1; 3 và 10 µM Tế bào được tiếp tục nuôi cấy trong vòng 72 giờ, sau đó thêm 10 µL dung dịch MTT vào môi trường nuôi cấy để thu được nồng độ cuối cùng là 0,5 mg/ml Sau

23 khi ủ với MTT trong 2h thì hút bỏ môi trường, tinh thể formazan tạo thành được hòa

tan trong 200µL DMSO-d6 và tiến hành đo quang ở bước sóng 570nm

Xử lý kết quả thực nghiệm

Tỉ lệ ức chế tế bào tại mỗi nồng độ được tính theo công thức: % ức chế tế bào = (ΔODchứng – ΔODmẫu thử)/ΔODchứng x 100, trong đó ΔODchứng/mẫu thử = ODchứng/mẫu thử - ODtrắng

Giá trị IC50 (và khoảng tin cậy 95%) được ước lượng từ đáp ứng tại 5 nồng độ riêng biệt, sử dụng phương pháp hồi quy phi tuyến với mô hình sigmoidal dose response trên phần mềm GraphPad Prism 8.3.0 (San Diego, CA, USA)

f Mô phỏng docking

Để giải thích thêm về kết quả hoạt tính sinh học thì quá trình docking được tiến hành với một số chất tổng hợp nhắm đích HSP90 theo chương trình Molecular Operating Environment 2015 trên máy tính Dell với cấu hình máy 5th Gen Intel(R) Core (TM) i5- 5135G7 với hệ điều hành Win10 và các phần mềm hỗ trợ Chemdraw 22.0 và Discovery Studio 2024 Quá trình docking được tiến hành tại bộ môn Hoá Hữu cơ, Khoa Công nghệ Hóa dược, Trường Đại học Dược Hà Nội Quá trình docking được thực hiện gồm bốn bước: Xây dựng mô hình tương đồng, chuẩn bị protein, chuẩn bị cấu tử, mô phỏng docking

- Xây dựng mô hình tương đồng (homology protein): Do cấu trúc đầy đủ với

độ phân giải cao (resolution <3 Å) tại miền đầu C của HSP90 con người đến nay là chưa đầy đủ Do đó trong bài nghiên cứu này sử dụng kỹ thuật xây dựng mô hình tương đồng protein (homology protein) Nghiên cứu đã chọn ra 1 protein HSP90 của con người (PDB ID: 3Q6M) làm khuôn mẫu chính để xây dựng mô hình tương đồng Sử dụng trình tự FASTA của chuỗi này trong websever SWISSMODEL để tìm chuỗi protein phù hợp Sau khi tìm kiếm nhóm đã chọn 1 protein HSP90 của vi khuẩn E.Coli với cấu trúc đầy đủ (PDB ID: 2CG9) làm trình tự mục tiêu để xây dựng mô hình tương đồng Mô hình tương đồng được xây dựng bằng websever SWISSMODEL và được đánh giá tương đồng với hiệu suất mô hình tốt có thể sử dụng trong nghiên cứu này

- Chuẩn bị protein: Cấu trúc protein mới được xây dựng sẽ được tải xuống dưới

dạng file pdb Cấu trúc sẽ được nhập vào trong phần mêm MOE2015 để được tiến hành chuẩn bị cấu trúc protein Tối ưu hoá năng lượng cấu trúc và thêm Hydro bằng Protonate 3D Dựa vào cách tương tác của NCT-58 với CTD của HSP90 trước đây, sử dụng “site finder” trong phần mềm xác định túi hoạt động tại miền đầu C trong cấu trúc protein HSP90 Cuối cùng protein được thêm trường lực Armber99, 1 trường lực

24 mô phỏng được môi trường xung quanh các đại phân tử như protein rồi cấu trúc sau khi được chuẩn bị hoàn tất sẽ lưu dưới định dạng moe

- Chuẩn bị phối tử: cấu trúc các cấu tử được vẽ cấu trúc 2D bằng phần mềm

ChemDraw 22.0 rồi được chuyển sang phần mềm MOE2015 để chuyển thành cấu trúc 3D, tối ưu hoá năng lượng (energy minimize), thêm trường lực (AM-BCC1) Cuối cùng các trúc sẽ được lưu vào trong 1 tệp dữ liệu database mdb

- Mô phỏng docking: Thực hiện mô phỏng docking bằng phần mêm MOE2015

với vị trí dock được xác định tại bước chuẩn bị protein, thực hiện dock 100 cấu dạng với mỗi phối tử và giữ lại 10 cấu dạng có năng lượng tốt nhất, còn lại các thông số khác sử dụng theo mặc định của phần mềm Đầu ra của tập tin là định dạng mdb có chứa thông số về năng lượng liên kết (Kcal/mol) và tư thế liên kết của cấu dạng

- Phân tích kết quả sau docking: Tập tin kết quả dạng mdb được mở chế độ

view dock trên phần mềm MOE 2015 đưa ra kết quả năng lượng liên kết (Kcal/mol) Sau đó, các tương tác cụ thể sẽ được phân tích trên phần mềm Discovery Studio 2024 Từ hình ảnh, các tương tác được liệt kê cụ thể và so sánh dữ liệu các kết quả với nhau Quá trình liệt kê các vị trí liên kết được phần mềm tiến hành tự động dựa trên dữ liệu về cấu tử và protein đã chuẩn bị trước đó Sau đó, tiến hành docking với chất chuẩn là NCT-58 để so sánh kết quả dữ liệu

25

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ 3.1 Tổng hợp hoá học

Kết quả tổng hợp hoá học được tóm tắt trong sơ đồ dưới đây (sơ đồ 3.1)

bao gồm cả trạng thái hợp chất và hiệu suất phản ứng:

Sơ đồ 3 1: Sơ đồ kết quả tổng hợp hoá học

R: CT-239= benzyl; CT-404= 3,4-dimethoxybenzyl; CT-406= 4-flourobenzyl

3.1.1 Tổng hợp 4-chloro-3-nitrobenzamid (II)

Cân 5g (24.8 mmol) acid 4-chloro-3-nitrobenzoic, thêm SOCl2 làm dung môi (khoảng 40mL), Thêm 5-10 giọt DMF làm xúc tác, đun hồi lưu tại 500C trong 4 giờ (có khuấy trộn), hệ phản ứng kín (Bịt kỹ đầu hở của ống sinh hàn tránh hệ tiếp xúc với nước) Đun nóng thì tạo ra dung dịch trong suốt Sau đó dừng phản ứng, hút kiệt SOCl2 rồi làm lạnh sâu bằng nước đá có thêm NaCl Cho thật nhanh và liên tục dung dịch amoniac (chú ý khói thoát ra mạnh và tỏa nhiệt nên chú ý làm trong tủ hút) đến khi hết khí thoát ra Sau đó khuấy ở nhiệt độ phòng 10-15 phút Thêm nước cất vào dung dịch tạo tủa Lọc thu tủa, phần dịch còn lại chiết với Ethyl Acetat, sau đó cô quay

26 dưới áp suất giảm ở 50oC Chất II thu được là chất rắn màu trắng có khối lượng 4,78

III), còn phần phần dịch lọc kiểm tra bằng TLC Nếu có chất trong phần dịch lọc thì

đem chiết với Ethyl Acetat rồi chạy sắc ký cột tách thu chất III.1 chất III.1 thu được

là chất rắn màu cam có khối lượng 0,62 g, hiệu suất phản ứng đạt 89 %

Sơ đồ 3.3: Tổng hợp 3-nitro-4-(benzyllamino)benzamid (III.1)

3.1.3 Tổng hợp 4-((3,4-dimethoxybenzyl)amino)-3 nitrobenzamid (III.2)

Chất III.2 được tổng hợp theo quy trình tương tự tổng hợp chất III.1, Từ hỗn hợp gồm 0,5 g (2,5 mmol) chất II, 0.69 g (5mmol) K2CO3, 0,4 ml (4 mmol) 3-4 dimethoxy

benzylamin thu được chất III.2 là chất rắn màu cam có khối lượng 0,66 g, hiệu suất

phản ứng đạt 80 %

Tổng hợp chất IV: 0,62 g (2,23 mmol) chất III.1 hòa tan trong 15mL MeOH,

sau đó bổ sung 0,72 g (11,44 mmol) HCOONH4vào dung dịch Thêm 50 mg Pd/C (10 wt%) Pd/C rồi bịt kín bình phản ứng bằng nút cao su có gắn bóng Sau khoảng 25 phút kiểm tra phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng (TLC) Sau khi phản ứng xảy ra xong, xử lí bằng cách đem lọc để loại bỏ Pd/C, rửa tiếp hỗn hợp Pd/C bằng dung môi Dichloromethane (DCM) cho đến khi hết chất trên Pd/C Đem cô quay dưới áp suất giảm phần dịch để loại bỏ hết hết dung môi, sau đó phần rắn còn lại được chạy sắc ký

cột (hệ dụng môi DCM:MeOH = 100:5) để loại bỏ hết tạp vô cơ thu được chất IV.1 là chất rắn màu vàng nhạt có khối lượng 420 mg, hiệu suất phản ứng đạt 76%

Sơ đồ 3.7: Tổng hợp 3-amino-4-((3,4-dimethoxybenzyl)amino)benzamid (IV.2)

3.1.7 Tổng hợp 3-amino-4-((4-fluorobenzyl)amino)benzamid (IV.3)

Chất IV.3 được tổng hợp theo quy trình tương tự tổng hợp chất IV.1, từ 0,63 g (2,18 mmol) chất III.3, 0,69 g (10,90 mmol) HCOONH4, 50 mg Pd/C (10 wt%) và 15mL MeOH, thu được sản phẩm là chất rắn màu vàng nhạt có khối lượng 400 mg, hiệu suất phản ứng đạt 71%

Sơ đồ 3.8: Tổng hợp 3-amino-4-((4-fluorobenzyl)amino)benzamid (IV.3)

3.1.8 Tổng hợp 1-benzyl-2-(4-nitrophenyl)-1H-benzo[d]imidazol-5-carboxamid (V.1)

Tổng hợp chất V: Hoà tan 420 mg (1,74 mmol) IV.1 bằng 10ml dung môi

Dimethylacetamid (DMAC) trong bình cầu 3 cổ Hoà tan tiếp IV.1, 316,0 mg (2,09

mmol) 4-nitrobenzaldehyd vào trong bình phản ứng Sau đó cho 906,2 mg (8,71

29 mmol) NaHSO3 vào hỗn hợp trên Phản ứng xảy ra trong hệ hở (mở hoàn toàn 2 nắp của bình cầu 3 cổ), đun hồi lưu ở 120oC trong 3 tiếng, có khuấy trộn và kiểm soát phản ứng bằng TLC Phản ứng xảy ra hoàn toàn thì kết thúc phản ứng rồi làm lạnh bình phản ứng, thêm nước lạnh vào bình để tạo tủa, vẫn làm lạnh liên tục khoảng 10 phút để kết tủa hoàn toàn Sau đó, đem đi lọc thu phần kết tủa (chất V), dịch lọc còn lại đem chiết với Ethyl acetat Gộp phần rắn thu được sau khi chiết và phần tủa lại với nhau rồi mang đi chạy sắc ký cột (hạt Silica gel, hệ dung môi DCM : MeOH) để tách tạp chất

thu được chất V.1 là chất rắn màu trắng có khối lượng 352 mg, hiệu suất phản ứng đạt