trần hoàng anh tổng hợp và thử tác dụng kháng tế bào ung thư của một số chất 5 methoxy 2 2 dimethyl2h chromen 6 carboxamid thơm

Một số hợp chất có nguồn gốc tự nhiên và tổng hợp đã được chứng minh là có khả năng ức chế hoạt động của HSP90 thông qua vị trí liên kết ATP tại vùng đầu N và có tác dụng chống ung thư..

TỔNG QUAN

Tổng quan về đích Heat shock protein 90 (HSP90)

HSP90 là một protein chaperon xuất hiện nhiều ở các sinh vật nhân thực, đóng vai trò vai trò thiết yếu trong nhiều quá trình của tế bào bao gồm kiểm soát chu kỳ tế bào, sự sống của tế bào, hormon và các con đường truyền tín hiệu khác HSP90 hoạt động bằng cách hỗ trợ một nhóm các protein (protein cilent) gấp lại thành các cấu trúc chức năng của chúng, ổn định chúng chống lại sự biến tính do các điều kiện gây căng thẳng như nhiệt độ và tạo điều kiện cho chúng phân hủy thích hợp khi cần thiết [21] Tuy nhiên, chức năng tương tự này cũng xuất hiệt ở các tế bào ung thư [21] Do đó, HSP90 đã nổi lên như một mục tiêu đầy hứa hẹn để phát triển các phương pháp điều trị ung thư mới

1.1.2 Cấu trúc, chức năng và cơ chế hoạt động của HSP90

Cấu trúc tổng thể của HSP90 là một homodimer với mỗi monomer gồm 3 miền riêng biệt: miền đầu N (NTD), miền giữa (MD) và miền đầu C (CTD) Ngoài ra ở các sinh vật nhân thực thì HSP90 có thêm vùng liên kết tĩnh điện (charged region) nối miền đầu C và miền giữa với nhau (Hình 1.1) [1] Mỗi miền cấu trúc trong HSP90 có chức năng cụ thể Miền đầu N chứa vị trí liên kết ATP có vai trò quan trọng với các protein chaperon trong siêu họ protein GHKL (Gyrase, HSP90, histidine kinase, and MutL) [3] Miền giữa có các rãnh kỵ nước nơi xảy ra tương tác giữa các protein cilent và HSP90 có vai trò quan trọng đối với việc điều chỉnh hoạt động ATPase trong đầu N [48] Miền đầu C bao gồm 2 vị trí quan trọng đó là vị trí chịu trách nhiệu cho quá trình dimer hoá 2 chuỗi monomer và vị trí tương tác với các co-chaperon nhờ trình tự bảo tồn Met-Glu-Glu-Val-Asp (MEEVD) CTD chứa một vị trí liên kết nucleotid điều hoà hoạt động ATPase trong NTD [6]

Hình 1.1: Cấu trúc của HSP90

3 Các nghiên cứu trước đây cho thấy các thành viên thuộc họ HSP90 đều thực hiện chức năng gấp các protein cilent thông qua 1 chu trình phức tạp Mặc dù chưa hiểu biết đầy đủ về chu trình chu trình gấp protein cilent, nhưng các nhà khoa học chỉ ra bộ máy chaperon HSP90 hoạt động trong chu trình có sự phối hợp của các co-chaperon, protein cilent và immunophilin [13] [14] (Hình 1.2)

Hình 1.2: Cơ chế hoạt động của HSP90 Đầu tiên các protein cilent mới được tổng hợp hoặc gấp sai được liên kết với chaperon HSP40/HSP70 hình thành phức hợp protein Sau đó protein client trong phức hợp này sẽ được sẽ được liên kết với HSP90 nhờ sự hỗ trợ bởi HOP (protein tổ chức HSP70-HSP90) Sau khi protein cilent được liên kết với HSP90, các co-chaperon khác, các immunophilin (FKBP51, FKBP52) được thêm vào homodimer HSP90 tạo thành phức hợp dị protein được kích hoạt trong khi HSP70 và HOP được giải phóng Sau đó ATP sẽ được liên kết với NTD của HSP90 để chuyển HSP90 từ trạng thái mở sang trạng thái đóng Sau đó các co-chaperon p23 và aha1 (aha1 chưa được thể hiện trên sơ đồ) đến gắn vào HSP90 và hỗ trợ quá trình gấp lại protein cilent Cuối cùng nhờ miền giữa của HSP90 gây ra quá trình thuỷ phân ATP thành ADP sẽ giúp gấp lại protein cilent đồng thời tăng cường giải phóng ra các immunophilin và co-chaperone và protein cilent đã được gấp lại HSP90 sau đó tiếp tục bước vào chu trình mới để gấp lại protein cilent khác [21]

Thông qua sự tương tác với protein cilent và các chất hỗ trợ hoạt động (protein co-chaperon), HSP90 tạo điều kiện cho việc gấp và ổn định nhiều loại protein cilent, điều chỉnh các con đường truyền tín hiệu như tăng sinh và chết theo chu trình của tế

Protein HSP90 hoạt động là lá chắn bảo vệ các tế bào khỏi căng thẳng, thiếu hụt dinh dưỡng Trong ung thư, HSP90 quá mức ổn định và kích hoạt các protein khác thúc đẩy sự phát triển, tồn tại và di căn của tế bào ung thư Do đó, đích phân tử HSP90 được coi là mục tiêu điều trị ung thư đầy triển vọng, có khả năng ngăn chặn nhiều con đường truyền tín hiệu gây ung thư.

HSP90 thông thường được phân loại dựa theo vị trí xuất hiện trong tế bào, trong đó HSP90α1, HSP90α2 và HSP90β nằm trong tế bào chất; GRP94 xuất hiện trong lưới nột chất và TRAP1 chủ yếu nằm trong ty thể [19]

HSP90α1 và HSP90α2 là 2 đồng dạng phổ biến ở trên con người, cả hai có cấu trúc tương tự nhau, chỉ khác nhau ở điểm HSP90α1 có phần mở rộng hơn ở miền đầu N phần còn lại của cấu trúc đều giống nhau ở cả hai dạng đồng dạng bao gồm miền đầu

N được bảo tồn cao, miền liên kết, miền giữa liên quan đến hoạt động ATPase và miền đầu C Cả hai dạng này đều là protein tế bào cảm ứng Ngoài ra Các đồng phân Hsp90α đã được xác định là biểu hiện ngoại bào trên các tế bào ung thư vú gây ra các tương tác rất quan trọng cho sự xâm lấn của khối u [13], cho thấy đích HSP90α là đích tiềm năng cho các chất chống ung thư

HSP90β còn được gọi là protein cấu trúc có chức năng quan trọng trong việc gấp và ổn định protein cilent trong các con đường truyền tin tế bào, duy trì sự sống tế bào [24] Về mặt cấu trúc HSP90β có mức độ tương đồng khoảng 85% so với đồng dạng HSP90α [24] Do đó thông thường HSP90 được sử dụng để chỉ định cho cả 2 đồng dạng này trừ khi có nghiên cứu sâu về 1 đồng dạng cụ thể

Protein GRP94, còn gọi là glucose-regulated protein 94 (GRP94), là một chaperon chủ yếu trong ty thể tế bào GRP94 đảm nhiệm việc gấp protein, bảo vệ protein khỏi tự phá hủy và duy trì sự ổn định của chúng GRP94 được kích hoạt trong các điều kiện căng thẳng tế bào, như sự tích tụ protein bất thường hoặc điều kiện môi trường bất lợi [11] Về cấu trúc, GRP94 có ba miền giống HSP90, nhưng khác nhau ở trình tự và độ dài chuỗi acid amin ở đầu N để phù hợp với sự tương tác với các protein cilent trong ty thể Hơn nữa, Đầu C của GRP94 có trình tự bảo tồn KDEL thay vì MEEVD như các HSP90 khác [21]

Protein TRAP1 (TNF receptor-associated protein 1) là một chaperon protein tham gia vào quá trình gấp protein và bảo vệ các protein trong ty thể khỏi sự tự phân hủy Ngoài ra, nó còn đóng vai trò quan trọng trong việc cân bằng nội môi của ty thể và điều chỉnh các quá trình liên quan đến năng lượng và sự sống còn của tế bào.

5 cấu trúc TRAP1 cũng có 3 miền như các HSP90 khác nhưng không có vùng liên kết kỵ nước và trình tự bảo tồn MEEVD [12]

Hình 1.3: Độ dài chuỗi acid amin của các đồng dạng HSP90

1.1.4 HSP90 là mục tiêu phân tử sinh học đầy tiềm năng cho các chất chống ung thư

Trong các nghiên cứu trước đây, các khối u ung thư được báo cáo phát hiện HSP90 biểu hiện quá mức bao gồm ung thư tuyến tụy, buồng trứng, vú, phổi… [46,58,64] HSP90 là chaperon protein có nhiều trong các tế bào nhân thực và có khả năng hỗ trợ gấp lại với hàng trăm protein cilent khác nhau, bao gồm các kinase, protein vận chuyển, thụ thể của hormon steroid, và các protein khác có vai trò quan trọng trong sự sống và chết của tế bào [62] Nhờ cơ chế này mà đối tế bào bình thường HSP90 sử dụng để điều chỉnh sự tăng sinh, tăng trưởng, biệt hóa và chết của chúng Mặt khác, các tế bào ung thư được đặc trưng bởi sự tăng sinh dai dẳng không kiểm soát được và thiếu các cơ chế điều hòa tự nhiên chịu trách nhiệm cho sự tăng sinh tế bào và cân bằng nội môi [38] Vì vậy các chaperon protein như HSP90 đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ và duy trì sự ổn định của những protein cilent trong tế bào ung thư nên các chất ức chế nhắm đích HSP90 được phát triển và tổng hợp để điều trị các bệnh ung thư liên quan đến HSP90

Ban đầu các nhà nghiên cứu tập trung khám phá các chất ức chế HSP90 tại vị trí ATPase của miền đầu N (NTD) theo cơ chế ức chế cạnh tranh với ATP gắn vào Các sản phẩm tự nhiên như geldanamycin (GA) có nguồn gốc từ Streptomyces hygroscopeus và kháng sinh radicicol (RD), phân lập từ Monosporium bonorden cho thấy sự ức chế khả năng tăng sinh và phát triển của khối u [9, 60] Với cấu trúc tương tự ATP, các chất ức chế HSP90 này liên kết với vị trí ATPase của NTD trong cấu trúc HSP90, do đó cản trở quá trình liên kết và thủy phân ATP dẫn đến sự suy thoái của các protein cilent gây ung thư HSP90 [17] Mặc dù hiệu quả chống ung thư của GA và RD đã được thử nghiệm trong nhiều nghiên cứu in vivo và in vitro nhưng nó vẫn chưa được chấp thuận cho sử dụng lâm sàng do tính không ổn định về cấu trúc và gây độc

6 cho gan [61] Do đó các các dẫn chất của GA và RD được phát triển để nhắm mục tiêu đầu N của HSP90

Tuy nhiên, cho đến nay các chất ức chế HSP90 nhắm mục tiêu vào đầu N được đưa vào thử nghiệm lâm sàng nhưng chưa có chất nào được FDA chấp thuận trở thành thuốc điều trị ung thư Điều này là do những ảnh hưởng có hại cho sức khỏe của phản ứng sốc nhiệt (HSR) [36] HSR là một cơ chế điều hòa tăng HSP90 và các protein sốc nhiệt khác như một phương pháp để khắc phục căng thẳng tế bào (hình 1.4) Sau khi các chất ức chế vào HSP90 sẽ khiến protein này giải phóng ra yếu tố HSF-1 (heat shock factor -1: yếu tố gây sốc nhiệt), yếu tố này sẽ khiến cho tế bào tăng tổng hợp các HSP trong đó có HSP90 Vì vậy mà nồng độ chất ức chế phải tăng để ức chế HSP90 tăng tổng hợp dẫn đến xuất hiện độc tính quá liều

Hình 1.4: Cơ chế của phản ứng sốc nhiệt (HSR)

Chất ức chế nhắm miền đầu C của HSP90

1.2.1 Novobiocin và các dẫn chất

Chất ức chế đầu C được phát hiện đầu tiên là sản phẩm tự nhiên novobiocin có thể làm gián đoạn bộ máy gấp protein HSP90, dẫn đến quá trình thủy phân protein cilent và gây ra quá trình tự hủy của tế bào ung thư [50] Cấu trúc novobiocin bao gồm

3 phần: chuỗi bên benzamid, khung coumarin và đường noviose (Hình 1.6) [63] Mặc dù novobiocin có khả năng ức chế tăng sinh protein mà không gây ra phản ứng sốc nhiệt (HSR) nhưng novobiocin cú tỏc dụng chống tăng sinh yếu (IC50 là 700 àM trờn dòng tế bào SkBr3) [49]

Hình 1.6: Cấu trúc của novobiocin

Kể từ khi phát hiện ra novobiocin là chất ức chế miền đầu C đầu tiên, nhiều chất tương tự đã được tổng hợp (Hình 1.7) và các nghiên cứu mối liên quan cấu trúc-tác dụng (SAR) dần làm sáng tỏ A4 (2) là chất tương tự novobiocin đầu tiên được báo cáo là kết hợp chuỗi bên acetamid thay cho chuỗi bên benzamid prenylat hóa được tìm thấy trong novobiocin Tuy nhiên việc thay thế chuỗi bên bằng acetamid đã dẫn đến xuất hiện HSR ở nồng độ thấp hơn 1000 lần so với nồng độ cần thiết cho quá trình chống tăng sinh protein cilent [67] Do đó, một nghiên cứu mối liên quan cấu trúc - tác dụng (SAR) về chuỗi bên amid đã chứng minh rằng chuỗi bên amid có độ dài từ 5 carbon trở lên sẽ chuyển trung tâm dị lập thể đầu C từ tác nhân bảo vệ thần kinh thành tác nhân chống tăng sinh [16] Việc khám phá độ lớn của chuỗi bên amid đã dẫn đến KU174 (3), bao gồm cả đường noviose và chuỗi bên benzamid, 3 có hiệu lực tăng gấp 10-50 lần so với chất dẫn đường của nó [6]

Các nghiên cứu SAR trước đây chỉ ra rằng việc thay thế khung coumarin bằng biphenyl đã làm tăng hoạt tính chống tăng sinh Do đó, một loạt biphenylamid (4) đã được tổng hợp và chứa vùng ưa nước, giúp cải thiện tác dụng chống lại tế bào MCF-7 Các amin bậc 3 được gắn vào giúp tăng cường hoạt động ức chế [15] Những nghiên cứu như vậy cuối cùng đã dẫn đến việc tổng hợp ra phenyl cyclohexyl carboxamid 5, chất này cho thấy hoạt động chống tăng sinh được cải thiện chống lại các tế bào SKBr3 [14]

Hình 1.7: Novobiocin và các dẫn chất

1.2.2 Deguelin và các dẫn chất

Một nhóm chất ức chế miền đầu C HSP90 khác dựa trên sản phẩm tự nhiên deguelin (6) [38] Sự liên kết của 6 với CTD dẫn đến sự suy giảm protein cilent của HSP90 Deguelin làm mất ổn định các tương tác HIF-1α và dẫn đến ức chế sự tăng sinh tế bào ở một số dòng tế bào ung thư cả in vitro và in vivo [18, 27, 28] Tuy nhiên, ở liều cao hơn, 6 là chất độc thần kinh Sau các nghiên cứu SAR sâu rộng của nhóm Lee, một dẫn xuất deguelin mới, L80 (7a) đã được phát triển (Hình 1.8) 7a không gây độc thần kinh, nhưng đã biểu hiện hoạt động chống tăng sinh và gây chết tế bào mạnh mẽ chống lại nhiều dòng tế bào ung thư In vivo, 7a thể hiện các hoạt động chống lại dòng tế bào ung thư phổi H1299 [32] Cuối cùng, các nghiên cứu đã dẫn đến 7b cải thiện hoạt động chống tăng sinh so với 7a

Các nghiên cứu tiếp theo về 7a, dẫn đến sự phát triển của 8 và SL-145 (9), gây ra sự thoái biến của các protein cilent phụ thuộc HSP90 và thể hiện hoạt động gây độc tế bào chống lại tế bào ung thư vú (dòng MDA-MB-231 và 4T1) [27] 10 được tổng hợp để cải thiện độ hòa tan so với 7a đồng thời cải thiện các đặc tính giống thuốc của khung cấu trúc [41] Một chất tương tự deguelin khác, SH-1242 (11) đã được phát triển và thể hiện hoạt tính tương tự như 7a Sự gắn kết từ 11 với HSP90 phá vỡ sự tương tác giữa HSP90 và co-chaperon, protein tổ chức HSP90-HSP70 (HOP) và thể

10 hiện hoạt động chống ung thư tốt chống lại nhiều loại ung thư phổi khác nhau in vivo [34]

Hình 1.8: Deguelin và các dẫn chất

1.2.3 Các hợp chất kết hợp khung deguelin và novobiocin

Với sự thành công của các chất ức chế đầu C HSP90 có nguồn gốc từ deguelin và novobiocin, tiềm năng kết hợp 2 khung cấu trúc này thành một khung duy nhất đã được nghiên cứu Chuỗi dẫn chất từ deguelin và novobiocin (NCT) được thiết kế và tổng hợp thông qua quá trình lai giữa novobiocin và deguelin (Hình 1.9) NCT-50 (12) có hoạt tính ức chế cao hơn và độc tính thấp hơn cả novobiocin và deguelin 12 thể hiện hoạt động ức chế chống lại cả tế bào ung thư phổi và ức chế chức năng của HSP90 bằng cách ổn định cấu trúc mở của homodimer [20] Chất tương tự khác, NCT-

80 (13) ức chế STAT3 và HSP90, dẫn đến hiệu quả chống ung thư phổi khi không cần kích hoạt STAT3 hoặc con đường Wnt/β-catenin β HSF-1 cao trong ung thư vú dương tính với Her2, liên quan đến khối u lớn và giảm khả năng sống sót NCT-58 (14) làm giảm dấu hiệu tế bào gốc ung thư vú và gây chết tế bào thông qua caspase-3/7, giảm HSF-1, HSP70 và HSP90 14 tiêu diệt các tế bào kháng thuốc và gây thoái hóa Her2, Her3, EGFR và p95Her2.

11 [45] Kết quả là, 14 đại diện cho một khung mới để tối ưu hóa các phân tử nhỏ nhằm điều trị bệnh ung thư vú dương tính

Hình 1.9: chuỗi dẫn chất NCT từ khung cấu trúc novobiocin và deguelin

Với những ưu điểm của chuỗi các dẫn chất NCT, trong nghiên cứu này sẽ dựa theo khung cấu trúc của NCT để thiết kế ra các dẫn chất mới có khả năng ức chế HSP90 tại miền đầu C.

Tổng quan về khung benzimidazol

Benzimidazol là một khung cấu trúc thường sử dụng trong việc phát triển thuốc

Nó được cấu tạo từ sự kết hợp vòng imidazol và vòng benzen Nó là một khung cấu trúc rất phổ biến được sử dụng trong nhiều thuốc trên thị trường (Hình 1.10) [65]

Hình 1.10: Các thuốc trên thị trường có chứa khung benzimidazol

Omeprazol (thuốc điều trị dạ dày) Albendazol

(thuốc chống ung thư) CXCR3

1.3.2 Khung benzimidazol trong các thuốc chống ung thư

Trong số các loại thuốc chống ung thư được phát hiện trong những năm gần đây, nhiều dẫn xuất benzimidazol khác nhau đã thu hút được sự chú ý trong việc phát triển tác nhân chống ung thư do hoạt tính sinh học và ứng dụng lâm sàng đa dạng của chúng Benzimidazol có cấu trúc giống với các nucleotid purin tự nhiên, cho phép chúng dễ dàng tiếp xúc với các polyme sinh học trong hệ thống sống [25] Benzimidazol và các dẫn xuất của nó được báo cáo là đóng vai trò chính như chất ức chế topoisomerase, tác nhân xen kẽ DNA và alkyl hoá [59], chất đối kháng thụ thể androgen, chất ức chế poly(ADP-ribose) polymerase (PARP), chất ức chế protein kinase, … [25, 59] Một số dẫn xuất của benzimidazol đã được bán trên thị trường dưới dạng thuốc chống ung thư như bentamustin, selumetinib, galeteron và pracinuler

Cấu trúc khung benzimidazole đã được báo cáo trước đây là tác động lên đích HSP90 với khả năng ức chế sự tăng sinh của dòng tế bào MCF-7 rất tốt với giá trị IC50 1,31 μM Từ đó, các nhà nghiên cứu đã tiến hành tổng hợp và sàng lọc hoạt tính chống ung thư của một số dẫn xuất benzimidazole mới với gốc thế khác nhau ở vị trí 2 và 6 của vòng benzen.

Khả năng ức chế miền đầu C của HSP90 của hợp chất mang khung benzimidazol được đánh giá qua chỉ số IC50 lên tới 1,53 μM Chính vì thế, nghiên cứu lựa chọn tổng hợp các dẫn chất có khung benzimidazol với kỳ vọng gia tăng khả năng ức chế của hợp chất.

Hình 1.11: Các hợp chất chứa khung benzimidazol ức chế HSP90

1.3.3 Các phương pháp tổng hợp khung benzimidazol

Quá trình tổng hợp đầu tiên của benzimidazol được Hoebrecker thực hiện bằng cách khử 4-methyl-2-nitroacetanilid và sau đó ngưng tụ đóng vòng tạo khung benzimidazol (Sơ đồ 1.1) [47]

Sơ đồ 1.1: Tổng hợp khung benzimidazol từ 4-methyl-2-nitroacetanilid

Với sự phát triển về kiến thức và theo nhu cầu hiện tại, các phương pháp tổng hợp khác nhau đã được phát triển để tổng hợp khung cấu trúc benzimidazol, trong thường xuất phát từ nguyên liệu ortho-phenyldiamine (OPDA)

13 a Phản ứng ngưng tụ o-phenyldiamin với acid carboxylic

Một phương pháp sử dụng phổ biến là ngưng tụ OPDA cùng với acid cacboxylic hoặc các dẫn xuất của nó, rồi đun nóng chúng lại với nhau trong môi trường acid HCl Đõy là phương phỏp được sử dụng rộng rói nhất được giải thớch bởi ệzbey và cỏc cộng sự [42] Sơ đồ 1.2 thể hiện quá trình ngưng tụ có xúc tác HCl của OPDA và acid carboxylic

Sơ đồ 1.2: Phản ứng ngưng tụ Philip để tổng hợp khung benzimidazol

Khung benzimidazol có thể được tổng hợp bằng cách sử dụng các hạt nano ZnO xúc tác (NAP-ZnO) để cho hiệu suất 90–98% o-phenyldiamin được đun nóng bằng acid formic ở 70°C trong 6–240 phút Ưu điểm của phương pháp này là dễ dàng điều chế chất xúc tác NAP-ZnO, chất xúc tác nano không độc hại, có thể tái sử dụng và giá thành rẻ cũng như các điều kiện phản ứng an toàn Điều này làm cho nó trở thành phương pháp hiệu quả và thân thiện với môi trường (sơ đồ 1.3) và được nghiên cứu bởi Alinezhad và các cộng sự [4]

Sơ đồ 1.3: Tổng hợp benzimidazol sử dụng xúc tác NAP-ZnO

Trong thời gian gần đây, alumina, silica gel và zeolite HY đã được sử dụng làm chất xúc tác trong quá trình tổng hợp benzimidazol (Sơ đồ 1.4) OPDA phản ứng với acid carboxylic béo, thơm hoặc dị vòng cùng với alumina, zeolit hoặc silica gel, bằng cách trộn chúng trong cối [51] Sau đó, hỗn hợp này được xử lý bằng chiếu xạ vi sóng trong 5–9 phút ở 160–560 Volt

Sơ đồ 1.4: Tổng hợp benzimidazol bằng chiếu xạ vi sóng b Phản ứng ngưng tụ OPDA với aldehyd

14 Quá trình tổng hợp các dẫn xuất benzimidazol từ OPDA có thể được thực hiện bằng cách sử dụng aldehyd trong methanol có xúc tác oxy phân tử ở nhiệt độ phòng Thay vì sử dụng nhiều chất oxy hóa nguy hiểm và tốn kém, Park và cộng sự đã phát triển phản ứng hiệu quả hơn, thiết thực hơn và thân thiện với môi trường hơn bằng cách sử dụng bức xạ ánh sáng khả kiến [44] sử dụng oxy phân tử làm chất oxy hóa.(sơ đồ 1.5)

Sơ đồ 1.5: Tổng hợp benzimidazol nhờ xúc tác oxy phân tử

Trong một nghiên cứu được thực hiện bởi Sarkate và cộng sự, iod xúc tác tổng hợp 2-aryl-1-arylmethyl-1H-benzimidazol, bằng cách đun nóng OPDA với aldehyd ở 80–90°C trong 1,5 giờ (sơ đồ 1.6) [5] Phương pháp này đơn giản, hiệu quả, thân thiện với môi trường và hiệu quả cho việc tổng hợp

Sơ đồ 1.6: Iod xúc tác tổng hợp benzimidazol

Theo báo cáo của Kumar và cộng sự, sử dụng natri metabisulphit hấp phụ trên silicagel để tổng hợp benzimidazol được chứng minh là phản ứng tổng hợp thân thiện với môi trường Phản ứng diễn ra nhanh, hiệu quả và loại bỏ việc sử dụng các hóa chất đắt tiền và độc hại để tạo ra khung benzimidazol quan trọng với số lượng lớn Dung dịch OPDA trong ethanol được thêm vào benzaldehyd, sau đó Na2S2O5-SiO2 (Na2S2O5 được hấp phụ trên silicagel) được thêm vào và khuấy trong 4 đến 8 giờ (sơ đồ 1.7) [30]

Sơ đồ 1.7: Tổng hợp benzimidazol với Natri metabisulfit hấp phụ trên silica gel trong ethanol

Một tác nhân khác sử dụng để tổng hợp 2-phenylbenzimidazol từ là NaHSO3 B.Soni đã tiến hành thí nghiệm và cho thấy hiệu suất phản ứng lên tới 85.35% [23] Sơ đồ 1.11

Na 2 S 2 O 5 hấp phụ trên silicagel EtOH, 4-8 giờ Iod/nước 80-90 o C, 1,5 giờ MeOH, ánh sáng khả kiến Oxy không khí

Sơ đồ 1.8: Tổng hợp benzimidazol nhờ xúc tác NaHSO 3

Bên cạnh đó, NaHSO3 là một hợp chất đặc biệt, có khả năng kết hợp với aldehyd Việc sử dụng NaHSO3 trong quá tình tổng hợp này cũng đã cho thấy hiệu suất tốt, tiến hành đơn giản hơn và giảm thời gian phản ứng ở một vài nghiên cứu trước đây NaHSO3 cũng là một tác nhân tan trong nước, có thể dễ dàng loại bỏ trong quá trình tinh chế sản phẩm, giá thành thấp, có thể dễ dàng tìm thấy trong điều kiện phòng thí nghiệm Do đó nghiên cứu sử dụng phản ứng này để tổng hợp khung benzimidazol c Phản ứng ngưng tụ OPDA với ceton

Dẫn xuất benzimidazol có thể được tổng hợp bằng cách ngưng tụ OPDA với nhiều ceton khác nhau Benzimidazol tạo thành không đối xứng và khá không bền nên bị phân hủy để tạo thành hỗn hợp gồm hai dẫn xuất benzimidazol khác nhau phụ thuộc vào nhóm alkyl bị loại bỏ (sơ đồ 1.9) [2]

Sơ đồ 1.9: Tổng hợp benzimidazol nhờ ngưng tụ OPDA với ceton

Kỹ thuật Protein docking

Protein docking – ra đời từ những năm 1980 – đã trở thành một trong những phương pháp được sử dụng phổ biến nhất trong quá trình thiết kế thuốc dựa trên cấu trúc vì có khả năng dự đoán với độ chính xác khá cao sự hình thành liên kết của cấu tử với receptor trong túi liên kết Nó phản ánh sự thành công của việc ứng dụng dữ liệu về cấu trúc của protein, được tạo bởi tinh thể học tia X và phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân (nuclear magnetic resonance – NMR) [66]

Protein docking đánh giá bản chất và độ bền của các liên kết, thậm chí định lượng được khả năng liên kết thông qua các hàm tính điểm Phương pháp này có thể xếp hạng mức độ mạnh yếu của liên kết giữa các thành phần Docking được thực hiện trên máy tính, đảm bảo tốc độ nhanh, độ chính xác cao và chi phí thấp, đưa protein docking trở thành bước khởi đầu thiết yếu trong nghiên cứu thiết kế thuốc hiện đại.

16 Docking thực chất một bài toán tối ưu, tìm vị trí và cấu hình phù hợp và đánh giá tương tác của một cơ chất gắn kết vào túi liên kết của protein Về mặt nhiệt động lực học, mục tiêu chính của docking là tìm ra cấu hình mà năng lượng tự do của toàn hệ là thấp nhất Để tìm cấu hình phù hợp nhất, cần liên hệ cấu hình không gian với các trị số đánh giá được khả năng gắn kết của cơ chất lên protein và sau đó áp dụng thuật toán tìm kiếm [22] (Hình 1.12)

Hình 1.12: Bản chất của phương pháp protein docking

Thuật giải di truyền (Genetic Algorithm - GA) là thuật toán tìm kiếm được ứng dụng nhiều trong các chương trình docking như Autodock, Autodock Vina, GOLD GA áp dụng các lí thuyết liên quan đến học thuyết tiến hoá và chọn lọc tự nhiên Đầu tiên, thuật toán sẽ mã hoá tất cả các tham số của cấu trúc ban đầu trong một nhiễm sắc thế - biểu diễn bằng một vectơ Từ nhiễm sắc thể ban đầu này, tạo ngẫu nhiên một quần thể bao phủ một miền năng lượng Quần thể này được đánh giá và từ đó các nhiễm sắc thể thích nghi nhất (tức là có giá trị năng lượng thấp nhất) được chọn làm khung để tạo ra quần thể tiếp theo Quy trình này làm giảm năng lượng trung bình của toàn bộ nhiễm sắc thể bằng cách truyền các đặc tính cấu trúc thuận lợi từ một quần thể này sang một quần thể khác Sau một số chu kỳ tìm kiếm và đánh giá, cuối cùng ta sẽ tìm được một nhiễm sắc thể (cấu dạng) phù hợp với mức năng lượng tối thiểu [39]

Chương trình docking sử dụng các hàm tính điểm (scoring function) để ước lượng các năng lượng liên kết của phức hợp cấu tử - receptor Năng lượng này được cho bởi hằng số liên kết (Kd) và năng lượng tự do Gibbs (ΔGL) Dự đoán về năng lượng liên kết được thực hiện bằng cách đánh giá những tương tác hóa lý quan trọng bao gồm: các tương tác liên phân tử, các ảnh hưởng solvat và entropy [22] Do đó, số lượng các tham số hoá lý được đánh giá càng lớn thì độ chính xác càng cao Các hàm tính điểm hiệu quả nên đưa ra sự cân bằng giữa độ chính xác và tốc độ, đây là một điểm quan trọng khi làm việc với cơ sỡ dữ liệu lớn.

Định hướng thiết kế cấu trúc

Xét cấu trúc của chuỗi hợp chất NCT (NCT-50, NCT-58, NCT-80), có thể thấy, phần cấu trúc chromen có liên kết amid và nhóm methoxy tạo liên kết hydro quan trọng.

17 trọng với Ser677 và Lys615, là hai vị trí quan trọng trong liên kết với ATP của miền C của HSP90, đồng thời vòng benzen trung tâm tạo liên kết π-cation với các acid amin khác Do đó, trong nghiên cứu này phần cấu trúc chromen, benzen trung tâm và liên kết amid cầu nối của vòng chromen và benzen trung tâm được giữ lại Thay thế phần cấu trúc methoxy chứa dị vòng nitơ trên vòng benzen trung tâm bằng khung cấu trúc 5-carbamoylbenzimidazol với kỳ vọng tăng khả năng tạo liên kết π bởi vòng benzen và liên kết hydro từ nhóm amid

Sơ đồ 1 10: Thiết kế chất mục tiêu từ NCT và khung benzimidazol

NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Nguyên liệu

Các dung môi và hóa chất sử dụng trong tổng hợp hóa dược đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích (AR) được nhập từ các nhà cung cấp trong và ngoài nước Một số dung môi dùng cho chiết tách và phân lập được mua từ Trung Quốc Các hóa chất này được sử dụng trực tiếp mà không trải qua bất kỳ quá trình tinh chế nào Danh sách hóa chất được liệt kê trong bảng dưới đây.

Bảng 2.1: Nguyên vật liệu, hóa chất, dung môi dùng trong nghiên cứu

STT Nguyên liệu STT Nguyên liệu

4 Acid 4-chloro-3-nitrobenzoic 17 Dimethyl acetamid (DMAC)

5 Acid 5-methoxy-2,2-dimethyl-2H- chromen-6-carboxylic

11 Dung dịch NaOH 2N 24 Na2SO4 (bột)

12 HCl đặc 25 Ethyl acetat (EA)

Thiết bị, dụng cụ và phần mềm

- Dụng cụ thủy tinh: bình cầu 500mL, 250mL, 100mL, 50mL, sinh hàn, phễu, cốc thủy tinh các loại, bình lọc hút, phễu Buchner, bình nón, bình chiết, pipet Pasteur…

- Bơm hút chân không KNF (Đức)

- Máy cất quay EYELA (Nhật Bản)

- Máy khuấy từ gia nhiệt IKA – RTC (Pháp)

- Cân kỹ thuật (Trung Quốc)

- Cân phân tích (Trung Quốc)

- Buồng soi UV 2 bước sóng 254 nm và 365 nm Spectroline (Mỹ)

- Sắc ký lớp mỏng: được tiến hành trên bản mỏng silicagel GF254 (Merck)

- Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân ( 1 H-NMR, 13C-NMR) Bruker Acance 600 MHz với chất chuẩn nội tetramethylsilan (TMS) của hãng Bruker BioSpin (Thụy Sĩ) tại Viện Hóa Học – Viện Hàn Lâm Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam

- Máy đo phổ khối 1100 Series LC - MSD - Trap – SL của hãng Agilent tại Viện Hóa Học – Viện Hàn Lâm Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam

- Máy đo phổ hồng ngoại FT-IR Affinity-IS-Shimadzu (Nhật Bản) tại Khoa Hóa Học – Trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội

- Thiết bị máy tính dell Gen Intel(R) Core(TM) i5-5135G7 trên hệ điều hành Win10

- Phần mềm vẽ cấu trúc hóa học: Chemdraw 22.0

- Phần mềm docking: Molecular Operating Environment 2015 (MOE2105)

- Phần mềm mô phỏng hình ảnh docking: Discovery studio 2024

Nội dung và phương pháp nghiên cứu

- Tổng hợp 3 dẫn chất 5-methoxy-2,2-dimethyl-2H-chromene-6-carboxylic acid có chứa khung benzimidazol mới có cấu trúc như hình 2.1

- Kiểm tra độ tinh khiết bằng sắc ký lớp mỏng và đo nhiệt độ nóng chảy

- Khẳng định cấu trúc của các dẫn chất tổng hợp dựa trên phân tích dữ liệu phổ hồng ngoại (IR), phổ cộng hưởng tử hạt nhân ( 1 H-NMR, 13 C-NMR), phổ khối lượng (MS)

- Đánh giá tác dụng kháng tế bào ung thư của các chất tổng hợp trên 2 dòng tế bào ung thư người bao gồm: Ung thư phổi A549 và ung thư vú MDA-MB-231

- Mô phỏng docking phân tử kết hợp với hoạt tính sinh học để nghiên cứu liên quan cấu trúc tác dụng của các dẫn chất

Hình 2.1: Công thức chung của các dẫn chất 5-methoxy-2,2-dimethyl-2H- chromene-6-carboxylic acid có chứa khung benzimidazol

2.3.2 Phương pháp nghiên cứu a Phương pháp tổng hợp

Các chất mục tiêu được tổng hợp từ hai bước phản ứng hóa học, bao gồm phản ứng ban đầu và phản ứng tiếp theo Trong quá trình này, phương pháp sắc ký lớp mỏng được sử dụng để theo dõi tiến trình của phản ứng, cho phép các nhà nghiên cứu quan sát sự thay đổi về nồng độ các chất phản ứng và sản phẩm theo thời gian.

Giai đoạn 1: Tổng hợp chất trung gian amin

Sơ đồ 2 1: Sơ đồ tổng hợp chất trung gian amin

Giai đoạn 2: Tổng hợp chất mục tiêu

Sơ đồ 2 2: Sơ đồ tổng hợp chất mục tiêu b Phương pháp tinh chế

Sử dụng phương pháp chiết, phương pháp sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột để tinh chế các hợp chất tổng hợp được c Phương pháp kiểm tra độ tinh khiết Đề tài sử dụng phương pháp kiểm tra độ tinh khiết bằng sắc ký lớp mỏng và đo nhiệt độ nóng chảy:

Sắc ký lớp mỏng là kỹ thuật sử dụng để giám sát tiến trình phản ứng, xác định thời điểm phản ứng kết thúc và kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm tinh chế Phương pháp này được thực hiện trên bản mỏng silicagel GF254 được tráng sẵn và hoạt hóa ở nhiệt độ 110°C trong 30 phút Hệ dung môi phụ thuộc vào tính chất của từng chất Mẫu thử được hòa tan trong dung môi phù hợp Bản mỏng được để trong bình sắc ký bão hòa dung môi ở nhiệt độ phòng, cho dung môi di chuyển đến cách mép trên bản mỏng 0,5 cm Kết quả được quan sát dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm.

Nhiệt độ nóng chảy: Xác định bằng máy đo nhiệt độ nóng chảy nhiệt điện EZ –

Melt d Phương pháp khẳng định cấu trúc

Các chất sau khi được tổng hợp và đánh giá độ tinh khiết sơ bộ sẽ được xác định cấu trúc bằng phương pháp phổ Các phương pháp phổ gồm có: phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon (13C-NMR).

- Phổ hồng ngoại (IR): ghi bằng máy FTIR Affinity-IS

- Phổ khối lượng (MS): được ghi bằng máy khối phổ LTQ Orbitrap XLTM

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton ( 1 H-NMR): được ghi bằng máy Bruker

AV-500 đo ở tần số 500 MHz hoặc 600 MHz Độ dịch chuyển hóa học (δ) được biểu thị bằng đơn vị phần triệu (ppm), lấy mốc là pic của chất chuẩn nội tetramethylsilan (TMS), nhiệt độ ghi phổ khoảng 300 K, dung môi DMSO-d 6

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon ( 13 C-NMR): được ghi bằng máy Bruker

AV-500 đo ở tần số 126 MHz Độ dịch chuyển hóa học (δ) được biểu thị bằng đơn vị phần triệu (ppm), lấy mốc là pic của chất chuẩn nội tetramethylsilan (TMS), nhiệt độ ghi phổ khoảng 300 K, dung môi DMSO-d 6 e Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro

Hoạt tính kháng tế bào ung thư của các chất tổng hợp được thực hiện tại phòng thí nghiệm dược lý phân tử, Bộ môn Dược lý, Khoa Dược lý Dược lâm sàng, Trường Đại học Dược Hà Nội Tiến hành theo phương pháp MTT [54] đối với các chất tổng hợp được trên hai dòng tế bào ung thư gồm: Ung thư phổi A549 và ung thư vú MDA- MB-231

Hoạt tính gây độc tế bào được thực hiện dựa trên phương pháp MTT (3-(4,5- dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium) được mô tả lần đầu tiên bởi tác giả Tim Mosman, 1983 [40] Phương pháp này đánh giá khả năng sống sót của tế bào qua khả năng khử MTT (màu vàng) thành một phức hợp formazan (màu tím) bởi hoạt động của enzym dehydrogenase trong ty thể Sản phẩm formazan được hòa tan bằng DMSO-d 6 và đo mật độ quang (OD) ở bước sóng 570 nm [40] Giá trị thể hoạt tính là IC50 (nồng độ chất thử ức chế 50% sự phát triển của tế bào)

Nguyên liệu và phương pháp thử:

Các tế bào MDA-MB-231 ung thư vú và A549 ung thư phổi được mua từ ATCC và bảo quản trong nitơ lỏng Các tế bào được đánh thức và nuôi cấy trong môi trường DMEM bổ sung 10% huyết thanh thai bò và 1% dung dịch kháng sinh, sau đó được duy trì ở 37°C với 5% CO2 trong tủ ấm tạo ẩm Toàn bộ thuốc thử nuôi cấy tế bào được mua từ Thermo Scientific (Waltham, MA, USA), còn thiết bị nuôi cấy (đĩa nuôi cấy mô 96 giếng, đĩa 10 mm, đĩa 35 mm và phiến kính 8 giếng) được mua từ Corning Incorporated (Somerville, Massachusetts, Hoa Kỳ).

Quy trình xác định hoạt tính kháng tế bào ung thư :

Tế bào được cấy trong đĩa 96 giếng với mật độ 104 tế bào/giếng trong môi trường DMEM đầy đủ Sau khi ủ qua đêm, môi trường được thay thế bằng môi trường không chứa FBS được bổ sung thêm chất thử với các nồng độ tăng dần lần lượt là 1, 3,

10, 30, 100 àM Chất tham chiếu doxorubicin được thử với cỏc nồng độ 0,1; 0,3; 1; 3 và 10 àM Tế bào được tiếp tục nuụi cấy trong vũng 72 giờ, sau đú thờm 10 àL dung dịch MTT vào môi trường nuôi cấy để thu được nồng độ cuối cùng là 0,5 mg/ml Sau

23 khi ủ với MTT trong 2h thì hút bỏ môi trường, tinh thể formazan tạo thành được hòa tan trong 200àL DMSO-d 6 và tiến hành đo quang ở bước súng 570nm

Xử lý kết quả thực nghiệm

Tỉ lệ ức chế tế bào tại mỗi nồng độ được tính theo công thức:

% ức chế tế bào = (ΔODchứng – ΔODmẫu thử)/ΔODchứng x 100, trong đó ΔODchứng/mẫu thử = ODchứng/mẫu thử - ODtrắng

Giá trị IC50 (và khoảng tin cậy 95%) được ước lượng từ đáp ứng tại 5 nồng độ riêng biệt, sử dụng phương pháp hồi quy phi tuyến với mô hình sigmoidal dose response trên phần mềm GraphPad Prism 8.3.0 (San Diego, CA, USA) f Mô phỏng docking Để giải thích thêm về kết quả hoạt tính sinh học thì quá trình docking được tiến hành với một số chất tổng hợp nhắm đích HSP90 theo chương trình Molecular Operating Environment 2015 trên máy tính Dell với cấu hình máy 5th Gen Intel(R) Core (TM) i5- 5135G7 với hệ điều hành Win10 và các phần mềm hỗ trợ Chemdraw 22.0 và Discovery Studio 2024 Quá trình docking được tiến hành tại bộ môn Hoá Hữu cơ, Khoa Công nghệ Hóa dược, Trường Đại học Dược Hà Nội Quá trình docking được thực hiện gồm bốn bước: Xây dựng mô hình tương đồng, chuẩn bị protein, chuẩn bị cấu tử, mô phỏng docking

- Xây dựng mô hình tương đồng (homology protein): Do cấu trúc đầy đủ với độ phân giải cao (resolution -8,7 Kcal/mol) Ngược lại đối với CT-406 chỉ gắn thêm nguyên tử F tại vị trí số 4 trên benzyl khiến phân tử này vẫn nằm gọn trong túi liên kết tương tự NCT-58 mà lại vẫn có thể làm tăng tính ái lực của hợp chất với các vị trí liên kết trên trung tâm hoạt động

− Xem xét vị trí liên kết của cả 3 hợp chất mục tiêu (CT-239, CT-404, CT-406) cùng với NCT-58 (Hình 4.6) có thể thấy vị trí tại túi liên kết của cả 4 hợp chất là tương đồng nhau về khung chromen cũng như là phần nhân thơm để tạo liên kết 𝜋 với các amino acid, điều này cho thấy các chất có thể có hoạt tính tốt hơn NCT-58 Tuy nhiên thực tế chỉ có CT-406 thực sự có hoạt tính tốt hơn NCT-58 là do cấu trúc của các dẫn chất mới tổng hợp còn cồng kềnh, chứa các nhóm gây cản trở không gian như methoxy (CT-404) hoặc chỉ có mỗi nhóm thế benzyl (CT-239) khiến cho hợp chất cồng kềnh hơn mà lại không giúp tăng tương tác tại túi liên kết, gây cản trở tạo các tương tác quan trọng với đích như liên kết H với Lys615, Ser677, Glu611 như của

− Với số lượng chất thử còn ít và mới thử nghiệm hoạt tính trên 2 dòng tế bào, do đó chưa có đủ cơ sở chắc chắc để kết luận về chiều hướng thay đổi của hoạt tính gây độc tế bào Tuy vậy 3 chất này cũng làm tăng số lượng chất có hoạt tính trong dãy 5- methoxy-2,2-dimethyl-2H-chromen-6-carboxamid thơm, từ đó góp phần thể hiện rõ

55 mối quan hệ cấu trúc – hoạt tính của dãy chất này để từ đó phát triển nhiều thuốc kháng ung thư mới hứa hẹn và tiềm năng hơn

Hình 4.6: Hình ảnh tương tác của 3 chất tổng hợp được và NCT-58 tại túi liên kết miền đầu C HSP90

Chú thích: CT-239: màu cam; CT-404: màu xanh lá cây;

CT-406: màu hồng; NCT-58: màu vàng

Mô phỏng docking phân tử 55 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Cấu trúc vùng đầu C của HSP90 đã được nghiên cứu có chứa vùng hoạt động ATP [55] Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu nào chỉ ra được chính xác vị trí hoạt động của ATP này Nghiên cứu của Sgobba và cộng sự là nghiên cứu đầu tiên xây dựng được cấu trúc miền đầu C của HSP90 và đưa ra dự đoán về vị trí liên kết ATP [55] Cụ thể, vị trí gắn ATP được dự đoán là amino acid ở vị trí 609 – 620, 627, 632 và 672 –

681 Mô hình mô phỏng docking giữa hợp chất thiết kế và protein HSP90 được sử dụng để tìm hiểu tương tác cụ thể với cấu trúc miền đầu C của HSP90

Ba dẫn chất thiết kế được tiến hành nghiên cứu docking với mô hình miền đầu

C của protein HSP90 của Sgobba và được so sánh bằng chất đối chiếu là NCT-58 Kết quả dự đoán trên phần mềm MOE 2015 cho thấy cả 3 chất đều đưa ra năng lượng liên kết (từ -9,65 đến -9,40 kcal/mol) thấp hơn so với hợp chất đối chiếu NCT-58 (-8,76 kcal/mol) Điều này cho thấy các chất thiết kế được dự đoán có khả năng liên kết với miền đầu C của HSP90 tốt hơn so với NCT-58

Nghiên cứu docking còn chỉ rõ các tương tác của các dẫn chất với protein HSP90 Các hợp chất thiết kế đều cho liên kết hydro ở vị trí cấu nối amid với amino acid của chuỗi A Lys615, Lys582 (hoặc Lys 632) và các liên kết π - alkyl ở amino acid của chuỗi B pro524 và Ile522

56 Khi so sánh giữa hợp chất có hoạt tính tốt nhất CT-406 (-9,59 kcal/mol) và hợp chất đối chiếu NCT-58 (-8,76 kcal/mol), cả hai hợp chất này đều có cùng liên kết hydro với amino acid Lys615 tại cầu nối amid và liên kết π – alkyl giữa vòng thơm với lys615 Ngoài ra, hợp chất CT-406 có thêm liên kết π tại amino acid pro524B, với vòng thơm và với cấu trúc phức tạp hơn thì CT-406 có thể tạo được nhiều tương tác Van-der-waal với túi liên kết Hơn nữa CT-406 còn có nguyên tử Flo cũng có khả năng tạo tương tác halogen với amino acid Lys582 Do đó dẫn tới CT-406 có khả năng liên kết tốt hơn NCT-58 tại vị trí hoạt động đầu C của HSP90 nên hoạt tính trên tế bào ung thư của CT-406 tốt hơn

Các liên kết hydro được biểu hiện và lựa chọn trong phần mềm đều cho khoảng cách liên kết nhỏ hơn 3Å (2,10 – 2,84 Å) cho thấy độ bền chắc liên kết trong vùng mô phỏng Trong đó, amino acid Lys615 liên kết với hai nhóm -NH trong cấu trúc amid thể hiện liên kết hydro cổ điển màu xanh lá cây, thể hiện tương tác bền với protein tương đồng với cách thức tương tác của NCT-58 với đích được báo cáo trước đó Ngoài ra, liên kết carbon-hydro còn được thể hiện với độ dài liên kết dều nhỏ hơn 3 Å chứng tỏ độ bền của liên kết Vòng thơm benzyl của benzimidazol, nhóm thế R thơm và vòng thơm trên nhân chromen cũng đóng vai trò quan trọng trong việc tăng tương tác π-alkyl với các amino acid Lys615, Met625 Thêm vào đó, các tương tác Van der Waals xung quanh phân tử với các amino acid Các tương tác π và Van der Waals thể hiện vị trí amino acid tương tác nằm ở cả hai nhánh A và B của protein, từ đó có thể thấy khả năng liên kết bền của hợp chất thiết kế với protein và có thể ảnh hưởng tới chức năng dimer hóa ở vùng C của protein HSP90 Các amino acid liên kết với các dẫn chất mới này đều nằm trong vùng gắn ATP theo mô hình dự đoán Sgobba [56] Do đó, các tương tác này có thể làm tăng ái lực với protein và có thể dự đoán có tác dụng ức chế protein HSP90

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Từ kết quả của nghiên cứu đã trình bày, nhóm nghiên cứu đã rút ra được một số kết luận như sau:

1 Tổng hợp và khẳng định cấu trúc

• Đã tổng hợp được 3 dẫn chất Tổng hợp của một số dẫn chất 5-methoxy-2,2- dimethyl-2H-chromen-6-carboxamid thơm với khung benzimidazol với các nhóm thế

R khác nhau Trong đó cả 3 chất đều là các chất mới, chưa được công bố trong các tài liệu tham khảo được

• Tất cả các chất tổng hợp được đều được kiểm tra độ tinh khiết bằng sắc ký lớp mỏng và đo nhiệt độ nóng chảy, được khẳng định cấu trúc bằng các phổ hồng ngoại (IR), phổ cộng hưởng từ hạt nhân ( 1 H-NMR, 13 C-NMR), phổ khối lượng (MS) Kết quả thu được cho thấy các chất tổng hợp được có cấu trúc đúng như dự kiến

2 Hoạt tính gây độc tế bào Đã thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư của 3 dẫn chất tổng hợp được với 2 dòng tế bào ung thư người là ung thư phổi A549 và ung thư vú MDA-MB-231 Kết quả cho thấy có 3/ 3 chất tổng hợp được có hoạt tính sinh học trên 2 dòng tế bào ung thư thử nghiệm Trong 3 dẫn chất, hợp chất hợp chất CT-406 có hoạt tính kháng tế bào ung thư mạnh trờn dũng tế bào ung thư vỳ MDA-MB-231 với giỏ trị IC50 = 3,857àM và trờn dũng tế bào phổi A549 với giỏ trị IC50 = 8,158 àM và tốt hơn so với chất đối chiếu

3 Mô phỏng docking phân tử

Cả 3 chất khi thực hiện mô phỏng docking phân tử đều có năng lượng liên kết thấp hơn NCT-58, đồng cho ra vị trí tương tác tại túi liên kết miền đầu C của HSP90 giống với NCT-58 Do đó cả 3 chất có khả năng ức chế tế bào ung thư tốt

Từ các kết quả ở trên tôi xin có một số đề xuất như sau:

• Tiếp tục thử sàng lọc hoạt tính gây độc tế bào của các dẫn chất tổng hợp được trên các dòng ung thư khác nhau: ung thư gan, ung thư đại tràng, ung thư dạ dày…

• Thử hoạt tính ức chế HSP90 đối với dẫn chất CT-406

• Tiếp tục tổng hợp và thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các dẫn chất 5- methoxy-2,2-dimethyl-2H-chromen-6-carboxamid thơm khác nhằm tìm kiếm các chất có triển vọng trong dãy chất này với định hướng

• Khảo sát thay đổi điều kiện phản ứng amid hoá tại bước cuối cùng tổng hợp chất mục tiêu để tăng hiệu suất phản phản ứng