nguyễn phương thảo tổng hợp và thử tác dụng kháng tế bào ung thư của một số dẫn chất 2 methoxybenzamid có chứa vòng thơm

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN PHƯƠNG THẢO TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG KHÁNG TẾ BÀO UNG THƯ CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT 2-METHOXYBENZAMID CÓ CHỨA VÒNG THƠM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC S

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN PHƯƠNG THẢO

TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG KHÁNG TẾ BÀO UNG THƯ CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT 2-METHOXYBENZAMID CÓ

CHỨA VÒNG THƠM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN PHƯƠNG THẢO Mã sinh viên: 1901639

TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG KHÁNG TẾ BÀO UNG THƯ CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT 2-METHOXYBENZAMID CÓ

LỜI CẢM ƠN

Những dòng đầu tiên, tôi xin được chân thành cảm ơn đến những người đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này

Trước tiên, tôi xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc đến những người thầy cô đáng kính đã

hướng dẫn tôi thực hiện đề tài này: TS Nguyễn Công Trường và ThS Nguyễn Nữ Huyền

My - Bộ môn Hóa Hữu Cơ - Khoa Công nghệ Hóa dược - Trường Đại học Dược Hà Nội

Thầy cô đã luôn tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức, những kinh nghiệm quý báu và tạo điều kiện thuận lợi nhất cho tôi hoàn thành khóa luận một cách tốt nhất Đồng thời, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các giảng viên, kỹ thuật viên đang công tác tại Khoa Công Nghệ Hóa Dược - Trường Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận này

Cuối cùng, tôi cũng xin được cảm ơn gia đình, bạn bè cùng các thành viên khác cũng

đang tham gia nghiên cứu tại bộ môn Hóa Hữu Cơ, đặc biệt là bạn Phạm Thu Bắc, bạn

Nguyễn Hà Minh Đức, bạn Trần Hoàng Anh, em Trần Thị Vân Anh, em Lê Tiến Dũng,

em Trần Nhật Minh, cùng các em K75, K76, K77 Sự đồng hành, chia sẻ và động viên

của mọi người chính là nguồn động lực đối với tôi trong suốt quãng thời gian làm thực nghiệm

Hà Nội, ngày 1 tháng 6 năm 2024

Sinh viên

Nguyễn Phương Thảo

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH

1.3.1 Phương pháp amid hóa trực tiếp không sử dụng xúc tác 10

1.3.2 Phương pháp tổng hợp amid sử dụng xúc tác kim loại 11

2.2.2 Thử độc tính tế bào của các dẫn chất tổng hợp được 16

2 3 Phương pháp nghiên cứu 16

2.3.1 Phương pháp tổng hợp các dẫn chất 2-methoxybenzamid thơm 16

2.3.2 Phương pháp tinh chế và xác định cấu trúc 16

2.3.3 Phương pháp xác định hoạt tính gây độc tế bào 16

CHƯƠNG 3 : THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ 19

3.1 Tổng hợp hóa học 19

3.1.1 Tổng hợp các dẫn chất acid 4-((3-halogenobenzyl)oxy) 2-methoxybenzoic20 3.1.2 Tổng hợp chất trung gian 2-amino-5-(dimethylamino)benzamid (8) 24

3.1.3 Tổng hợp các dẫn chất 2-methoxybenzamid thơm 26

3.2 Kiểm tra độ tinh khiết, khẳng định cấu trúc 29

3.2.1 Kiểm tra độ tinh khiết 29

4.1.2 Tổng hợp chất trung gian 2-amino-5-(dimethylamino)benzamid (8) 36

4.1.3 Phản ứng tổng hợp các dẫn chất 2-methoxybenzamid thơm (9a-c) 37

4.2 Khẳng định cấu trúc 38

4.2.1 Phổ khối lượng (MS) 38

4.2.2 Phổ hồng ngoại IR 39

4.2.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR) 40

4.2.4 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon (13C-NMR) 42

4.3 Về hoạt tính kháng tế bào ung thư 43

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45

TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

IC50 Nồng độ ức chế 50% sự phát triển của tế bào ung thư thử nghiệm

MDA-MB-231 Dòng tế bào ung thư biểu mô tuyến vú

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 1.1: Phản ứng tổng hợp amid trực tiếp từ acid carboxylic và amin 10

Sơ đồ 1.2: Phản ứng tổng hợp amid sử dụng xúc tác kim loại 11

Sơ đồ 1.3: Phản ứng tổng hợp amid sử dụng xúc tác triphenyl borat 12

Sơ đồ 1.4: Phản ứng tổng hợp amid sử dụng EDC, HOBt 13

Sơ đồ 3.1: Quy trình tổng hợp các dẫn chất 2-methoxybenzamid thơm (9a-c) 19

Sơ đồ 3.2: Quy trình tổng hợp các dẫn chất (3a-c) 21

Sơ đồ 3.3: Quy trình tổng hợp các dẫn chất (4a-c) 22

Sơ đồ 3.4: Quy trình tổng hợp 5-cloro-2-nitrobenzamid (6) 24

Sơ đồ 3.5: Quy trình tổng hợp 5-(dimethylamino)-2-nitrobenzamid (7) 25

Sơ đồ 3.6: Quy trình tổng hợp 2-amino-5-(dimethylamino)benzamid (8) 26

Sơ đồ 3.7: Quy trình tổng hợp các dẫn chất 2-methoxybenzamid thơm (9a-c) 27

Sơ đồ 4.1: Cơ chế tổng hợp các chất (3a-c) 35

Sơ đồ 4.2: Cơ chế tổng hợp các dẫn chất acid (4a-c) 36

Sơ đồ 4.3: Cơ chế tổng hợp chất (6) 36

Sơ đồ 4.4: Cơ chế tổng hợp các dẫn chất (9a-c) [26] 38

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1: Nguyên vật liệu, hóa chất, dung môi dùng trong nghiên cứu 14

Bảng 3.1: Kết quả tổng hợp các dẫn chất 2-methoxybenzamid 29

Bảng 3.2: Giá trị Rf và tonc của các dẫn chất (9a-c) 30

Bảng 3.3: Số liệu phổ MS của các dẫn chất (9a-c) 30

Bảng 3.4: Số liệu phổ IR của các dẫn chất (9a-c) 31

Bảng 3.5: Số liệu phổ 1H-NMR của các dẫn chất (9a-c) 32

Bảng 3.6: Số liệu phổ 13C-NMR của các dẫn chất (9a-c) 33

Bảng 3.7: Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của các dẫn chất 2-methoxybenzamid thơm (9a-c) trên hai dòng tế bào ung thư A549 và MCF-7 34

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 4.1: Phổ MS của chất (9a) 39

Hình 4.2: Phổ IR của chất (9a) 40

Hình 4.3: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR) của chất (9b) 42

Hình 4.4: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon của dẫn chất (13C-NMR) (9b) 43

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hiện nay, ung thư là nguyên nhân gây tử vong đứng thứ hai sau bệnh tim mạch [2] Ước tính mới của Cơ quan Nghiên cứu Ung thư Quốc tế (IARC) về gánh nặng ung thư toàn cầu cho thấy số ca ung thư mới tăng lên 19,3 triệu và số ca tử vong do ung thư tăng lên 10 triệu vào năm 2020 (báo cáo GLOBOCAN 2020) [38] Trên toàn cầu, cứ 5 người thì có 1 người mắc bệnh ung thư trong suốt cuộc đời, cứ 9 nam giới thì có 1 người và 12 phụ nữ thì có 1 người chết vì căn bệnh ung thư Đến năm 2030, gánh nặng trên toàn thế giới dự kiến sẽ tăng lên 26 triệu ca mắc mới và 17 triệu ca tử vong do ung thư mỗi năm [39] Ung thư là một nhóm bệnh liên quan đến các nhóm tế bào có biểu hiện tăng trưởng không kiểm soát được (tăng sinh), xâm nhập và phá hủy các mô lân cận (xâm lấn) và lan sang các bộ phận khác của cơ thể thông qua bạch huyết hoặc máu (di căn) [20], [13]

Hóa trị liệu ung thư đã được nghiên cứu và đưa vào sử dụng từ 5 thập kỷ trước và cho thấy hoạt động chống ung thư chống lại một số khối u ác tính ở người [12] Tuy nhiên, các thuốc này cũng gây những độc tính trên tế bào thường và phần lớn các khối u ác tính ở người được chứng minh là có khả năng kháng hóa chất Do đó, việc phát triển các thuốc chống ung thư mới và các phương pháp điều trị có hiệu quả rất quan trọng trong điều trị triệt căn hay điều trị bổ trợ cho người bệnh và là nhu cầu cấp thiết ở Việt Nam và thế giới Các hợp chất mang khung 2-methoxybenzamid đã được báo cáo là có tác dụng đa dạng: chống nôn, an thần và chống loạn thần, chống khó tiêu, chống trầm cảm [5] và chống tăng sinh tế bào ung thư [15] Trong nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng 2-methoxybenzamid là khung kết nối có lợi cho sự ức chế các tế bào ung thư [28], [32], [37]

Trên cơ sở đó, với mong muốn phát triển các tác nhân chống ung thư mới, khóa luận:

“Tổng hợp và thử tác dụng kháng tế bào ung thư của một số dẫn chất 2- methoxybenzamid có chứa vòng thơm.” được tiến hành với 2 mục tiêu sau:

1 Tổng hợp được một số dẫn chất 2-methoxybenzamid có chứa vòng thơm

Năm 2021, Chinyu Sun và các cộng sự đã xây dựng và tổng hợp một nhóm các dẫn

chất có chứa khung 2-methoxybenzamid (dãy chất Ia, Ib) làm chất ức chế đường dẫn truyền

Hedgehog (Hh) - con đường liên quan đến sự phát triển của nhiều loại ung thư Sự kích hoạt bất thường của đường dẫn Hh có thể tăng cường sự hình thành và lan rộng của các khối u ác tính như ung thư biểu mô tế bào đáy (BCC), u tủy sọ (MB), ung thư tụy, ung thư đại trực tràng và ung thư bạch cầu Trong xét nghiệm báo cáo Gli-luc, nhóm chất ức chế

methoxybenzamid làm chất kết nối có lợi cho việc ức chế con đường Hh Trong đó, đáng

chú ý nhất là hợp chất (Ic) có khả năng ức chế con đường Hh mạnh mẽ nhất với giá trị

năng ức chế của hợp chất vismodegib được sử dụng làm chất đối chứng dương Cơ sở của sự ức chế này được cho là do sự ức chế Smo (Protein Smoothened) - thành phần chính của

đường truyền tín hiệu Hh Đặc biệt, hợp chất Ic vẫn giữ được hiệu lực ức chế đối với Smo

đột biến, hơn nữa, nó còn thể hiện hoạt tính chống tăng sinh tốt hơn đối với các tế bào Daoy kháng vismodegib [37]

(Ic) IC50 = 0,03 μM

Carmine Stolfi và các cộng sự đã phát triển một số dẫn chất của mesalamin - một chất đã được nghiên cứu thực nghiệm cho thấy có thể ức chế con đường duy trì sự phát triển của tế bào CRC (ung thư đại trực tràng) và bước đầu đánh giá tác dụng của các dẫn chất này

Trong đó, hợp chất 2-methoxy-5-amino-N-hydroxybenzamid (II) cho thấy tác dụng ức chế

sự tăng sinh và sống sót của tế bào CRC mạnh hơn gấp 10 lần so với mesalamin và cản trở

sự phát triển của CRC in vivo mà không làm thay đổi sự tăng sinh của tế bào ruột bình

thường nên có thể giúp thiết kế các chương trình phòng ngừa ung thư đại trực tràng mới

Cơ chế chống tăng sinh được đưa ra là hợp chất (II) kích thích ERS (căng thẳng lưới nội

chất) và điều chỉnh các protein liên quan đến ERS Cảm ứng ERS là một trong những cơ chế chính mà qua đó các tác nhân khác nhau phát huy hoạt động chống ung thư ERS xảy ra khi chức năng của lưới nội chất bị rối loạn, dẫn đến sự tích tụ các protein không gấp nếp hoặc gấp nếp sai trong lưới nội chất Để khôi phục lại sự cân bằng, các tế bào kích hoạt phản ứng mở xoắn protein (UPR) tác động theo vai trò kép: vừa có tính thích nghi vừa có

tính gây chết các tế bào khối u [44], [43] Do đó, sơ bộ thấy rằng khả năng (II) có tác dụng

ở liều thấp hơn mesalamin có thể liên quan đến việc kích hoạt con đường ERS trong tế bào CRC [35], [36]

Trong đó hợp chất (IIIa) có tác dụng chống tăng sinh với IC50 = 0,54±0,28 μM trên HCT- 116 có thể so sánh với hợp chất của chất ức chế kép PI3K và mTOR là BEZ235 Kết quả xét nghiệm hoạt tính enzyme PI3K và mTOR và kết quả xét nghiệm Western blot của hợp

chất (IIIa) cho thấy rằng (IIIa) có thể ức chế con đường PI3K/AKT/mTOR Hơn nữa, hợp chất (IIIa) cũng thể hiện tác dụng ức chế sự phát triển của khối u ở mô hình xenograft U-

87 MG trên chuột đã được thiết lập khi theo dõi về sự thay đổi thể tích khối u Trên nhóm

chuột được thử nghiệm bằng hợp chất (IIIa) ở mức liều 20 mg/kg và 50 mg/kg cho thấy

khả năng ức chế sự phát triển của khối u lần lượt là 30,05% và 57,20% so với nhóm chứng [32]

thử nghiệm lâm sàng giai đoạn II Hoạt tính in vitro được thử nghiệm đầu tiên ở tế bào

Jurkat (bệnh bạch cầu lymphoblastic cấp tính tế bào T) và đối với các hợp chất có hoạt tính

BxPC-3 và PANC-1 Trong đó, dẫn chất ortho-methoxybenzamid (IVa) cho thấy khả năng

ức chế được cải thiện đối với cả tế bào MIA PaCa-2 và PANC-1 so với FK866 - chất đối

chứng dương Hợp chất (IVa) đặc biệt vì các dẫn chất para- và meta-methoxy tương tự cho kết quả hoạt tính kém hơn nhiều Hợp chất (IVa) là chất ức chế tăng trưởng tế bào PANC-

2,6-dimethoxybenzamid (IVb) có tác dụng ức chế tăng trưởng tốt hơn nhiều đối với các

so với FK866 2,4,6-trimethoxybenzamid (IVc) là chất ức chế tăng trưởng tế bào MIA

PaCa-2 tốt nhất tổng hợp được (IC50 = 0,16 nM) [7]

(IVa) R = 2-(MeO)C6H4 IC50 = 0,08 nM (PANC-1) (IVb) R = 2,6-(MeO)2C6H3 IC50 = 0,5 nM (MIA PaCa-2); 0,004 nM (BxPC-3) (IVc) R = 2,4,6-(MeO)3C6H2 IC50 = 0,16 nM (MIA PaCa-2)

Năm 2002, Kazuo Umezawaa và các cộng sự đã nghiên cứu tổng hợp các dẫn chất

dehydroxymethylepoxyquinomicin (DHMEQ) (V) và thử khả năng ức chế của chúng với

(OMe-DHMEQ) (Vb) không làm giảm hoạt động ức chế trong khi sự có mặt của nhóm

hexyl hay phenyl ở vị trí này làm giảm hoạt tính khi so sánh với chất đối chứng dương là

tố phiên mã cảm ứng, kích thích sự biểu hiện của các cytokin gây viêm như IL-1, IL-6, IL-

κB có thể ngăn chặn sự sống sót và tăng trưởng của các tế bào ung thư [10]

Dựa trên nghiên cứu của Umezawaa, Riko Nakagawa và các cộng sự đã tổng hợp hợp

chất N-(7,8-dioxo-7,8-dihydronaphthalen-1-yl)-2-methoxybenzamid (MBNQ) (VI) trong

đó 1,2-naphthoquinon (2-NQ) thay thế cho phần epoxy-quinon của OMe-DHMEQ Kết quả

tính tế bào mạnh hơn ở tế bào A549 bằng cách gây ra hiện tượng chết tế bào theo chương

trình chống lại các tế bào ung thư phổi Bằng chứng là 10 µM (VI) làm giảm đáng kể khả

năng tồn tại của các tế bào A549 trong khi 2-NQ không biểu hiện độc tính gây độc tế bào ở nồng độ này Nhóm methoxy salicylat cũng được chứng minh đã làm giảm độc tính thành công đối với các tế bào bình thường và tăng cường hoạt động chống ung thư phổi Ngoài

ra, hoạt động chống ung thư của (VI) chống lại nhóm 60 dòng tế bào ung thư ở người đã

được Chương trình Trị liệu Phát triển tại Viện Ung thư Quốc gia (NCI, Hoa Kỳ) kiểm tra

Những phát hiện thu được cho thấy (VI) có hoạt tính cao chống lại một số tế bào bạch cầu

cũng như tế bào ung thư buồng trứng/thận [28]

(VI)

Năm 2021, nhóm nghiên cứu của Alaaeldin M F Galal và Khaled Mahmoud đã công bố nghiên cứu tổng hợp 20 dẫn chất mang khung 2-methoxybenzamid kết hợp với các dẫn

chất sulfonyl-α-L-amino acid (dãy chất VII) Các dẫn chất này được thử nghiệm in vitro về

hoạt tính chống tăng sinh trên 4 dòng tế bào: ung thư vú (MCF-7), ung thư biểu mô tế bào gan (HepG2), ung thư ruột kết (HCT-116), dòng tế bào tuyến tụy (PaCa2) và so sánh với dòng tế bào thường, trong đó doxorubicin được sử dụng làm chất đối chứng dương Kết

quả cho thấy các hợp chất (VIIa), (VIIb), (VIIc) lần lượt là các dẫn chất có hoạt tính mạnh

µg/mL tương ứng Cơ chế gây độc tế bào được đề xuất là thông qua liên kết với vị trí gắn colchicin của tubulin bằng cách ngăn chặn sự phân chia tế bào ở pha G2/M [15]

1.2 Tác dụng kháng tế bào ung thư của các dẫn chất có chứa khung 2- aminobenzamid

Khung 2-aminobenzamid hay anthranilamid được lý luận rằng có liên kết nội phân tử mạnh giữa nhóm chức amin và nhóm chức carbonyl của amid để tạo thành một vòng giả sáu cạnh có thể bắt chước vòng phthalazin [14] 2-aminobenzamid đã được sử dụng rộng rãi như một khung đặc quyền để tạo ra các phân tử thuốc khác nhau [18], [9], [6] Hơn nữa, nhiều dẫn chất có chứa 2-aminobenzamid trước đây đã được báo cáo là chất chống ung thư [18], [17], [9]

Hợp chất AAL993 (2-((4-pyridyl)methyl)amino-N-(3-(trifluoromethyl)phenyl)

benzamid) là một chất ức chế chọn lọc và mạnh mẽ các VEGFR, có đặc tính chống khối u

mạnh, đặc tính dược lý tốt và sinh khả dụng qua đường uống tốt [24], [25] CI-1040 (2-((2-

cloro-4-iodophenyl)amino)-N-(cyclopropylmethoxy)-3,4-difluorobenzamid) chất ức chế

protein kinase kinase 1/2 (MEK1/2) hoạt hóa mitogen đầu tiên trong quá trình phát triển

lâm sàng, đã cho thấy hoạt động chống ung thư ở nhiều mô hình khối u in vitro và in vivo [4], [31] Các gốc 2-aminobenzamid có trong các cấu trúc này được coi là nguyên nhân tạo

nên đặc tính chống ung thư mạnh

Năm 2013, Jianzhen Liu và các cộng sự đã tổng hợp 17 dẫn chất 2-aminobenzamid được thử hoạt tính gây độc tế bào trên dòng tế bào ung thư ruột kết ở người (HCT-116) và

dòng tế bào ung thư biểu mô tuyến vú ở người (MDA-MB-231) Trong đó, hợp chất (VIII)

có hoạt tính gây độc tế bào tốt nhất trên cả hai dòng tế bào HCT-116 và MDA-MB-231 với

sinh được cải thiện trên các tế bào MDA-MB-231 và HCT-116 so với chất đối chiếu

AAL993 (19,11±0,86 μmol/L trên HCT-116 và >80 μmol/L trên MDA-MB-231) Hợp chất

(VIII) có thể đóng vai trò là ứng cử viên hàng đầu trong việc phát triển các tác nhân chống

ung thư mới, tuy nhiên vẫn chưa biết chính xác liệu hợp chất này có đích tác dụng cụ thể hay chỉ là một tác nhân gây độc tế bào [21]

IC50 = 14,60±3,54 μmol/L (HCT 116),

Năm 2009, Kenneth Huang và các cộng sự đã nghiên cứu các dẫn chất 2- aminobenzamid ức chế HSP 90 Nghiên cứu đã cho thấy khung 2-aminobenzamid có ái lực

liên kết mạnh mẽ với HSP 90 Các hợp chất (IXa), (IXb), (IXc) cho thấy hoạt động chống

tăng sinh mạnh mẽ trên nhiều loại tế bào ung thư với giá trị IC50 ở nanomol Trong đó, hợp

chất (IXa) cho kết quả sinh khả dụng và hiệu quả qua đường uống tốt và được chọn để đánh

giá trong nhiều thử nghiệm lâm sàng giai đoạn I Cơ chế được đề xuất là ức chế HSP 90 thông qua cảm ứng HSP 70 và phân hủy các protein client cụ thể [17]

Sau nghiên cứu của Huang, các chất ức chế HSP 90 mang cấu trúc 2-aminobenzamid

tương tự đã được tổng hợp và nghiên cứu Hợp chất BJ-B11, cho thấy tác dụng chống tăng

sinh mạnh hơn trên các tế bào ung thư bạch cầu (K562) và u nguyên bào thần kinh (SK-N-

của ty thể, dẫn đến hiện tượng chết tế bào theo chương trình của các tế bào K562 với cơ

chế có thể liên quan đến việc bất hoạt đường truyền tín hiệu Akt [19] Hợp chất mới AT-

533, được xác định ức chế hoạt động của HSP 90, có thể ngăn chặn đáng kể bệnh ung thư

vú bằng cách ức chế sự hình thành mạch và có thể được sử dụng như một tác nhân chống hình thành mạch tiềm năng nhắm vào con đường truyền tín hiệu HIF-1α/VEGF/VEGFR-2

[41] Cả BJ-B11 và AT-533 đều cho thấy tác dụng ức chế sự tăng sinh tế bào ung thư tốt

hơn so với 17-AAG - một chất ức chế HSP 90 đã được thử nghiệm lâm sàng giai đoạn III [41], [19]

Với những nghiên cứu về hoạt tính kháng tế bào ung thư đáng quan tâm nêu trên của

các dẫn chất mang khung 2-methoxybenzamid và 2-aminobenzamid, đề tài “Tổng hợp và

thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư của một số dẫn chất 2-methoxybenzamid thơm”

được thực hiện nhằm tìm kiếm, sàng lọc các hợp chất có hoạt tính kháng tế bào ung thư, trong đó, các dẫn chất được thiết kế đều là các amid được tổng hợp từ các acid 2- methoxybenzoic và amin 2-aminobenzamid để tạo thành khung 2-methoxybenzamid

1.3 Các phương pháp tổng hợp amid

Amid là một nhóm chức quan trọng và là một phần không thể thiếu trong nhiều dược phẩm, sản phẩm tự nhiên, hóa chất nông nghiệp và polyme Do đó, nhiều quy trình đã được phát triển để tổng hợp amid từ acid carboxylic, alcol, aldehyd, nitril, v.v [16] Dưới đây là một số phương pháp tổng hợp amid từ acid carboxylic và amin:

1.3.1 Phương pháp amid hóa trực tiếp không sử dụng xúc tác

Phương pháp amid hóa trực tiếp từ acid carboxylic và amin được báo cáo sớm nhất và năm 1902 [1] Trong số các phương pháp tổng hợp amid đã biết, đây là phương pháp lý

tưởng, xanh và kinh tế hơn cả [16] do sản phẩm phụ duy nhất là nước Tuy nhiên phương

pháp này phần lớn chưa được tối ưu hóa do cần nhiệt độ cao để cản trở sự hình thành của các muối amoni carboxylat William và cộng sự đã nghiên cứu ngưng tụ amin và acid carboxylic sử dụng dung môi không phân cực toluen (hoặc xylen) với điều kiện tối thiểu trong khoảng 110-150oC theo sơ đồ 1.1 [3]:

Sơ đồ 1.1: Phản ứng tổng hợp amid trực tiếp từ acid carboxylic và amin

Theo thử nghiệm cho thấy điều kiện phản ứng này khá hạn chế với các aryl acid và anilin [3]

1.3.2 Phương pháp tổng hợp amid sử dụng xúc tác kim loại

Việc sử dụng chất xúc tác gốc kim loại để amid hóa trực tiếp acid carboxylic và amin chủ yếu nhận được sự chú ý trong vài năm gần đây [22] Năm 2012, William và các cộng sự lần đầu tiên báo cáo về việc sàng lọc sử dụng chất xúc tác kim loại nhóm IV cho quá trình amid hóa Nhóm nghiên cứu đã tổng hợp 17 amid khác nhau, hiệu suất đạt từ 56-94% Điều kiện phản ứng được tiến hành theo sơ đồ 1.2 [3]:

Sơ đồ 1.2: Phản ứng tổng hợp amid sử dụng xúc tác kim loại

Ưu điểm của phương pháp giúp đẩy nhanh quá trình hình thành liên kết amid, lượng chất xúc tác sử dụng ít và hiệu suất cao (có thể lên đến 90%) [29] Mặc dù mang lại tính đột phá mới nhưng phương pháp này vẫn bị hạn chế do yêu cầu về nhiệt độ thực hiện phản ứng cao [40]

1.3.3 Phương pháp sử dụng dẫn chất boron làm chất xúc tác

Năm 1996, Yamamoto và các cộng sự lần đầu tiên báo cáo sử dụng acid arylboronic như một chất xúc tác hữu cơ để tổng hợp amid bằng cách ngưng tụ acid carboxylic và amin Kể từ đó, đã có sự tiến bộ đáng kể trong quá trình amid hóa sử dụng xúc tác và nhiều dẫn chất của acid arylboronic đã được báo cáo là chất xúc tác mới Năm 2018, Sekar và các cộng sự đã giới thiệu triphenyl borat, một chất xúc tác boron mới trong quá trình amid hóa Thử nghiệm tổng hợp trên 18 chất, hiệu suất đạt từ 16-92% Phản ứng được tiến hành theo sơ đồ 1.3:

Sơ đồ 1.3: Phản ứng tổng hợp amid sử dụng xúc tác triphenyl borat

Phương pháp đã phát triển này yêu cầu lượng chất xúc tác thấp, thời gian phản ứng

Stark để loại nước như các xúc tác Boron trước đó [16], [29] Tuy nhiên phương pháp này yêu cầu nhiệt độ phản ứng cao, điều này có thể dẫn đến sự racemic hóa và làm hạn chế lượng cơ chất có thể thực hiện phản ứng [22]

1.3.4 Phương pháp tổng hợp amid thông qua Carbodiimid/ N-Hydroxybenzotriazol

Phương pháp carbodiimid (RN=C=NR’) được Sheehan và Hess đưa vào sử dụng tổng

hợp peptid từ năm 1955 [33] Đến nay, phương pháp này vẫn tiếp tục là một trong những

quy trình tổng hợp amid phổ biến nhất [42], [11] Một số tác nhân ghép cặp carbodiimid thường được sử dụng: dicyclohexylcabodiimid (DCC) [33], diisopropylcarbodiimid (DIC)

và 3-ethyl-1(N,N-dimethyl)aminopropylcarbodiimid (EDCI) [34] Để hạn chế sự racemic hóa và hình thành N-acylure không phản ứng, các chất ái nhân như N-hydroxybenzotriazol

(HOBt) được thêm vào để tạo ra các este hoạt hóa có khả năng acyl hóa hiệu quả các nhóm amin [11], [26]

Năm 2011, nhóm nghiên cứu của Caldarelli và các cộng sự đã tổng hợp 11 dẫn chất

4,5-Dihydro-pyrazolo[4,3-h]quinazolin-3-carboxamid với sự có mặt của EDC, HOBt và

N,N-Diisopropylethylamin trong DMF theo sơ đồ 1.4, hiệu suất cao từ 60-93% [8]

Sơ đồ 1.4: Phản ứng tổng hợp amid sử dụng EDC, HOBt

CHƯƠNG 2 : NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, DỤNG CỤ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG

PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Hóa chất, thiết bị

Để thực hiện khóa luận này, chúng tôi đã sử dụng một số dụng cụ, thiết bị, dung môi và hóa chất của Phòng thí nghiệm của Bộ môn Hóa Hữu Cơ, trường Đại học Dược Hà Nội

2.1.1 Nguyên vật liệu, hóa chất, dung môi

Hóa chất sử dụng trong quá trình thực nghiệm có xuất xứ từ các công ty hóa chất như Merck, Việt Nam, Trung Quốc, … Các hóa chất này được sử dụng trực tiếp không qua tinh chế thêm và được trình bày ở bảng 2.1

Bảng 2.1: Nguyên vật liệu, hóa chất, dung môi dùng trong nghiên cứu

2.1.2 Thiết bị thí nghiệm

- Dụng cụ thủy tinh: bình cầu 500mL, 250mL, 100mL, 50mL, sinh hàn, phễu, cốc thủy tinh các lại, bình lọc hút, phễu Buchner, bình nón, bình chiết, pipet Pasteur,…

- Bơm hút chân không KNF (Đức) - Máy cất quay EYELA (Nhật Bản) - Tủ sấy Heraeus (Đức)

- Máy khuấy từ gia nhiệt IKA – RTC (Pháp) - Cân kĩ thuật (Trung Quốc)

- Cân phân tích (Trung Quốc) - Buồng soi UV bước sóng 254 nm Spectroline (Mỹ) - Cột chạy sắc ký

MHz của hãng Bruker BioSpin (Thụy Sĩ) tại Khoa Hóa học – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội

600 MHz và 126 MHz của hãng Bruker BioSpin (Thụy Sĩ) tại Viện Hóa Học – Viện Hàn Lâm Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam

- Máy đo phổ hồng ngoại FT-IR Affinity-IS-Shimadzu (Nhật Bản) tại Viện Hóa Học – Viện Hàn Lâm Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam

- Máy đo khối phổ 1100 Series LC – MSD – Trap – SL của hãng Agilent tại Viện Hóa Học – Viện Hàn Lâm Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam

- Máy đo nhiệt độ nóng chảy EZ – Melt, tại bộ môn Hóa Hữu Cơ - Trường Đại học

• N-(2-carbamoyl-4-(dimethylamino)phenyl)-4-((3-fluorobenzyl)oxy)-2-

methoxybenzamid (9b)

• 4-((3-bromobenzyl)oxy)-N-(2-carbamoyl-4-(dimethylamino)phenyl)-2-

methoxybenzamid (9c)

- Khẳng định cấu trúc của các chất tổng hợp được qua dữ liệu phổ hồng ngoại IR, phổ

2.2.2 Thử độc tính tế bào của các dẫn chất tổng hợp được

Tiến hành thử độc tính tế bào của 3 chất tổng hợp được trên trên 2 dòng tế bào ung thư người: A549 – tế bào ung thư phổi; MCF-7 – tế bào ung thư vú

2.3.1 Phương pháp tổng hợp các dẫn chất 2-methoxybenzamid thơm

- Sử dụng các phương pháp tổng hợp hữu cơ kinh điển và hiện đại để tổng hợp các dẫn chất dự kiến

- Theo dõi tiến trình phản ứng và sơ bộ đánh giá độ tinh khiết các chất bằng sắc ký lớp mỏng (SKLM)

2.3.2 Phương pháp tinh chế và xác định cấu trúc

- Sử dụng phương pháp sắc ký như: sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng và phương pháp kết tinh lại để tinh chế các chất tổng hợp được

- Sử dụng các phương pháp phổ hiện đại để xác định cấu trúc hóa học của các chất

NMR), phổ khối lượng (MS)

2.3.3 Phương pháp xác định hoạt tính gây độc tế bào

Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư của các dẫn chất tổng hợp được (9a-c) tại Phòng

theo phương pháp MTT trên 2 dòng tế bào ung thư người A549 và MCF-7 với nguyên tắc, chuẩn bị thí nghiệm, tiến hành thí nghiệm và xử lý kết quả thực nghiệm [23], [30], [27] như sau:

2.3.3.1 Nguyên tắc

Thử nghiệm hoạt tính kháng tế bào ung thư người được tiến hành theo phương pháp

in vitro để đánh giá khả năng sống sót của tế bào ung thư

Hoạt tính gây độc tế bào được thực hiện dựa trên phương pháp MTT (3-(4,5- dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium) được mô tả lần đầu tiên bởi tác giả Tim Mosma, 1983 Đây là phương pháp đánh giá khả năng sống sót của tế bào qua khả năng khử MTT (màu vàng) thành một phức hợp formazan (màu tím) bởi hoạt động của enzym dehydrogenase trong ty thể Như vậy sự thay đổi liên quan trực tiếp đến số lượng tế bào sống sót Sản phẩm formazan được hòa tan bằng DMSO và đo mật độ quang (OD) ở bước

triển của tế bào)

độc tính - Mẫu thử được hòa tan bằng dung môi DMSO với nồng độ ban đầu là 20 mg/mL - Tiến hành pha loãng 2 bước trong đĩa 96 giếng thành 5 dãy nồng độ từ cao xuống thấp lần lượt là 2564, 640, 160, 40 và 10 µg/mL Nồng độ chất thử trong đĩa thử nghiệm tương ứng lần lượt là 128, 32, 8, 2 và 0,5 µg/mL

- Chất chuẩn dương tính: Chất tham chiếu Ellipticin hòa tan trong dung môi DMSO

- Lấy vào mỗi giếng 10 µL chất thử đã chuẩn bị ở trên và 190 µL dung dịch tế bào - Đối chứng dương của thí nghiệm là môi trường có chứa tế bào, đối chứng âm chỉ có môi trường nuôi cấy

- Đĩa thí nghiệm được ủ ở điều kiện tiêu chuẩn Sau 72 giờ mỗi giếng thí nghiệm được tiếp tục ủ với 10 µL MTT (5 mg/mL) trong 4h Sau khi loại bỏ môi trường, tinh thể formaran được hòa tan bằng 100 µL DMSO 100%

- Kết quả thí nghiệm được xác định bằng giá trị OD đo ở bước sóng 540 nm trên máy quang phổ Biotek Thí nghiệm được lặp lại 3 lần

2.3.3.4 Xử lý kết quả thực nghiệm

máy tính Rawdata

% ức chế tế bào = (ODchứng (+) – ODmẫu thử)/(ODchứng (+) – ODchứng (-)) x 100%

(Trong đó, HighConc/LowConc: chất thử ở nồng độ cao/chất thử thấp ở nồng độ thấp;

CHƯƠNG 3 : THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ

3.1 Tổng hợp hóa học

Quá trình tổng hợp các dẫn chất 2-methoxybenzamid thơm được tiến hành theo sơ đồ 3.1:

Chất Công thức cấu tạo

(9a)

(9b)

(9c)

Quá trình tổng hợp các dẫn chất 2-methoxybenzamid thơm bao gồm:

▪ Giai đoạn 1: Tổng hợp các dẫn chất trung gian acid 4-((3-halogenobenzyl)oxy)-2-

Sơ đồ 3.2: Quy trình tổng hợp các dẫn chất (3a-c) a) Tổng hợp chất 4-((3-fluorobenzyl)oxy)-2-methoxybenzaldehyd (3a)

• Tiến hành phản ứng

- Hòa tan 4-hydroxy-2-methoxybenzaldehyd (1) (800 mg; 5,26 mmol; 1 eq) trong

DMF trong bình cầu sạch đáy tròn dung tích 100 mL

- Thêm lần lượt 1-(cloromethyl)-3-fluorobenzen (2a) (760 mg; 5,26 mmol; 1 eq) và

K2CO3 (2,18 g; 15,78 mmol; 3 eq) vào bình phản ứng - Khuấy hỗn hợp phản ứng ở nhiệt độ thường trong vòng 12h - Theo dõi phản ứng bằng SKLM với dung môi pha động là EA:n-hexan = 2:8, phát hiện vết bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm

- Rf = 0,54 (SKLM, silicagel 60 F254, hệ dung môi EA:n-hexan = 2:8)

3.1.1.2 Tổng hợp các dẫn chất trung gian acid 4-((3-halogenobenzyl)oxy)-2- methoxybenzoic (4a-c)

Các dẫn chất acid 4-((3-halogenobenzyl)oxy)-2-methoxybenzoic (4a-c) được tổng

hợp bằng cách oxy hóa từ các dẫn chất 4-((3-halogenobenzyl)oxy)-2-methoxybenzaldehyd

(3a-c) theo sơ đồ 3.3:

Sơ đồ 3.3: Quy trình tổng hợp các dẫn chất (4a-c) a) Tổng hợp chất acid 4-((3-fluorobenzyl)oxy)-2-methoxybenzoic (4a)

• Tiến hành phản ứng

- Hòa tan 4-((3-fluorobenzyl)oxy)-2-methoxybenzaldehyd (3a) (1,10 g; 4,23 mmol; 5

eq) với ACN trong bình cầu đáy tròn dung tích 250 mL - Thêm lần lượt NaH2PO4.2H2O (0,13 g; 0,85 mmol; 1 eq), NaClO2 (0,58 g; 6,46

- Khuấy hỗn hợp phản ứng ở nhiệt độ phòng trong 3h - Theo dõi phản ứng bằng SKLM với dung môi pha động là EA:n-hexan = 1:9, phát hiện vết bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm

• Xử lý phản ứng

- Sau khi phản ứng kết thúc, làm lạnh bình phản ứng bằng nước đá và thêm nước cất lạnh thấy xuất hiện tủa bông xốp

- Lọc thu tủa trên phễu lọc Buchner và rửa tủa bằng nước cất lạnh (3 lần x 5 mL) - Chiết phần dịch lọc với EA (3 lần x 25 mL), gộp dịch chiết các lần, làm khan dịch chiết EA bằng Na2SO4 sau đó cất quay ở áp suất giảm tại 45oC để loại dung môi

- Sấy khô sản phẩm trong tủ sấy chân không

• Kết quả

- Cảm quan: Chất rắn màu trắng - Hiệu suất: 92% (1,08 g)

- Rf = 0,35 (SKLM, silicagel 60 F254, hệ dung môi EA:n-hexan = 1:9)

(s; 1H); 7,46 – 7,43 (m; 3H); 6.73 (d; J = 2,40 Hz; 1H); 6,65 (dd; J1 = 8,40 Hz; J2 = 2,40 Hz; 1H); 5,20 (s; 2H); 3,81 (s; 3H)

c) Tổng hợp chất acid 4-((3-bromobenzyl)oxy)-2-methoxybenzoic (4c)

• Tiến hành phản ứng

- Tiến hành tương tự như tổng hợp chất (4a), sử dụng chất đầu (3c) (1,44 g; 4,48

- 1H-NMR (600 MHz, DMSO - d6) δ 12,16 (s; 1H); 7,70 (d; J = 8,40 Hz; 1H); 7,68 (s; 1H); 7,55 (m; 1H); 7,48 (m; 1H), 7,37 (t; J = 7,80 Hz; 1H); 6,72 (d; J = 2,40 Hz; 1H); 6,65 (dd; J1 = 8,40 Hz; J2 = 2,40 Hz; 1H); 5,19 (s; 2H); 3,81 (s; 3H)

3.1.2 Tổng hợp chất trung gian 2-amino-5-(dimethylamino)benzamid (8)

- Sau đó, thionyl clorid dư được loại bỏ bằng cất quay dưới áp suất giảm

khi nào không còn khí thoát ra từ trong bình phản ứng thì dừng - Phản ứng được tiếp tục khuấy ở nhiệt độ phòng trong 2 giờ - Theo dõi phản ứng bằng bằng SKLM với dung môi pha động là MeOH:DCM = 5:95, phát hiện vết bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm

• Xử lý phản ứng

- Sau khi phản ứng kết thúc, lọc thu kết tủa tạo thành trên phễu lọc Buchner và rửa

tủa bằng nước cất (3 lần x 5 mL), sấy khô để thu được 5-cloro-2-nitrobenzamid (6)

- Chiết phần dịch lọc với EA (3 lần x 25 mL), gộp dịch chiết các lần, làm khan dịch chiết EA bằng Na2SO4 sau đó cất quay ở áp suất giảm tại 45oC để loại dung môi

- Sấy khô sản phẩm trong tủ sấy chân không

• Kết quả

- Cảm quan: Chất rắn, màu trắng

- Hiệu suất: 90% (4,5 g)

- 1H-NMR (500 MHz, DMSO - d6) δ 8,21 (s; 1H); 8,05 (d; J = 8,50 Hz; 1H); 7,82 (s; 1H); 7,76 (dd; J1 = 8,50 Hz; J2 = 2,00 Hz); 7,74 (d; J = 2,00 Hz)

- Hòa tan hợp chất (6) (1 g; 5 mmol; 1 eq) trong dung môi DMF (5 mL) trong bình

cầu đáy tròn dung tích 100 mL, thêm dimethylamin (1 ml; 15 mmol; 3 eq), hỗn hợp được khuấy và gia nhiệt ở 110oC

- Theo dõi phản ứng bằng SKLM với hệ dung môi pha động MeOH:DCM = 5:95, phát hiện vết bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm

- Rf = 0,63 (SKLM, silicagel 60 F254, hệ dung môi MeOH:DCM = 5:95)

3.1.2.3 Tổng hợp chất 2-amino-5-(dimethylamino)benzamid (8)

(dimethylamino)-2-nitrobenzamid (7) bằng phản ứng khử theo sơ đồ 3.6:

Sơ đồ 3.6: Quy trình tổng hợp 2-amino-5-(dimethylamino)benzamid (8)

• Tiến hành phản ứng

vào bình phản ứng

- Theo dõi phản ứng bằng SKLM với hệ dung môi pha động MeOH:DCM = 5:95, phát hiện vết bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm

- Tinh chế sản phẩm bằng sắc kí cột silicagel với hệ pha động là MeOH:DCM, chất

(8) thu được ở hệ MeOH:DCM = 3:97

- Sấy khô trong tủ sấy chân không để thu sản phẩm

Tổng hợp các dẫn chất 2-methoxybenzamid thơm bằng phản ứng amid hóa giữa 2-

methoxybenzoic theo sơ đồ 3.7:

ơ đồ 3.7: Quy trình tổng hợp các dẫn chất 2-methoxybenzamid thơm (9a-c)

3.1.3.1 Tổng hợp N-(2-carbamoyl-4-(dimethylamino)phenyl)-4-((3-fluorobenzyl)oxy)-2- methoxybenzamid (9a)

• Tiến hành phản ứng

- Hòa tan 2-amino-5-(dimethylamino)benzamid (8) (50 mg; 0,27 mmol; 1 eq) vào

DMF trong bình cầu đáy tròn dung tích 50 mL, thêm lần lượt EDC.HCl (80 mg; 0,40 mmol; 1,5 eq), HOBt (57 mg; 0,40 mmol; 1,5 eq), TEA (0,05 mL) và acid 4-((3-fluorobenzyl)oxy)-

2-methoxybenzoic (4a) (92 mg; 0,33 mmol; 1,2 eq) vào bình phản ứng

- Theo dõi phản ứng bằng SKLM với hệ dung môi pha động MeOH:DCM = 5:95, phát hiện vết bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm

- Hiệu suất: 76% (95 mg)

Kết quả được trình bày cụ thể ở phần phụ lục

3.1.3.2 Tổng hợp N-(2-carbamoyl-4-(dimethylamino)phenyl)-4-((3-clorobenzyl)oxy)-2- methoxybenzamid (9b)

Kết quả được trình bày cụ thể ở phần phụ lục

3.1.3.3 Tổng hợp 4-((3-bromobenzyl)oxy)-N-(2-carbamoyl-4-(dimethylamino)phenyl)- 2-methoxybenzamid (9c)

Kết quả được trình bày cụ thể ở phần phụ lục

Hiệu suất tổng hợp và chỉ số hóa lý của các dẫn chất (9a-c) được trình bày trong bảng

dưới đây: