hà nguyễn phương anh nghiên cứu bào chế hệ tự nhũ hoá chứa rutin

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

HÀ NGUYỄN PHƯƠNG ANH

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ HỆ TỰ NHŨ

HOÁ CHỨA RUTIN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2024

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

HÀ NGUYỄN PHƯƠNG ANH

Mã sinh viên: 1901016

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ HỆ TỰ NHŨ

HOÁ CHỨA RUTIN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn

1 PGS TS Vũ Thị Thu Giang 2 ThS Nguyễn Thị Huyền

Nơi thực hiện đề tài:

1 Bộ môn Bào chế trường Đại học

Dược Hà Nội

HÀ NỘI – 2024

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc với

PGS.TS Vũ Thị Thu Giang và ThS Nguyễn Thị Huyền – những người đã tận tình

giúp đỡ, hướng dẫn và động viên tôi hoàn thành khoá luận này

Tôi xin chân thành cảm Ban giám hiệu, các phòng ban, các thầy cô giáo và cán bộ nhân viên trường Đại học Dược Hà Nội đã truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu trong suốt 5 năm học tập tại trường

Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới các thầy cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên tại bộ môn Bào chế - Trường Đại học Dược Hà Nội đã quan tâm, giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài tại bộ môn

Xin chân thành cảm ơn các bạn sinh viên khoá 74 đang nghiên cứu khoa học và thực hiện khóa luận tốt nghiệp tại Bộ môn Bào chế đã luôn sẻ chia, giúp đỡ tôi trong

quá trình nghiên cứu tại bộ môn Đặc biệt xin cảm ơn bạn Vũ Văn Phùng đã luôn

giúp đỡ, đồng hành cùng tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Cuối cùng, tôi xin được cảm ơn đặc biệt đến gia đình và bạn bè, những người luôn ủng hộ, động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quãng thời gian học tập và nghiên cứu vừa qua

Xin chân thành cảm ơn

Hà Nội, ngày 3 tháng 6 năm 2024

Sinh viên

Hà Nguyễn Phương Anh

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG

1.1.3 Tác dụng trên da của rutin 3

1.1.4 Dược động học và hướng cải thiện khả năng thấm qua da 4

1.2.4 Nghiên cứu bào chế hệ tự nhũ hoá 10

1.2.5 Một số phương pháp đánh giá hệ tự nhũ hoá 11

1.2.6 Một số nghiên cứu về hệ tự nhũ hoá chứa rutin 13

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2.1 Nguyên liệu, thiết bị nghiên cứu 14

2.1.1 Nguyên liệu 14

2.1.2 Thiết bị nghiên cứu 15

2.1.3 Động vật thí nghiệm 15

2.2 Phương pháp nghiên cứu 15

2.2.1 Nghiên cứu tiền công thức 15

2.2.2 Nghiên cứu bào chế hệ tự nhũ hoá chứa rutin 20

2.2.3 Đánh giá một số đặc tính của hệ tự nhũ hoá bào chế được 21

2.3 Phương pháp xử lý số liệu, thiết kế thí nghiệm và tối ưu hoá công thức 24 2.3.1 Phương pháp xử lý số liệu 24

2.3.2 Phương pháp thiết kế thị nghiệm và tối ưu hoá công thức 24

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 25

3.1 Kết quả nghiên cứu tiền công thức 25

3.1.1 Kết quả xây dựng phương pháp định lượng rutin 25

3.1.2 Đánh giá đặc tính của rutin nguyên liệu 26

3.2.3 Thiết kế thí nghiệm và tối ưu hoá công thức bào chế SEDDS chứa rutin 33

3.2.4 Phân tích yếu tố ảnh hưởng 34

3.2.5 Xác định vùng công thức tối ưu hệ SEDDS chứa rutin 37 3.3 Đánh giá một số đặc tính của mẫu SEDDS bào chế theo công thức tối ưu 39

3.3.1 Đánh giá một số đặc tính vật lý của mẫu SEDDS tối ưu 39

3.3.2 Đánh giá khả năng giải phóng và lưu giữ hoạt chất trên da lưng chuột của

hệ tự nhũ hoá chứa rutin 40 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

SNEDDS Hệ nano tự nhũ hoá (Self-nanoemulsifying drug delivery system) SPF

Bội số thời gian bảo vệ da so với không sử dụng sản phẩm chống nắng trong cùng điều kiện tác động tia UV (Sun Protection Factor)

TCNSX Tiêu chuẩn nhà sản xuất TLDCNH Tỷ lệ dược chất được nhũ hoá

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Một số sản phẩm mỹ phẩm chứa rutin trên thị trường 6

Bảng 2.1 Nguyên liệu được sử dụng trong quá trình nghiên cứu 14

Bảng 2.2 Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 15

Bảng 2.3 Môi trường thử độ tan của rutin 18

Bảng 3.1 Một số đặc tính vật lý của rutin nguyên liệu 26

Bảng 3.2 Hệ số phân bố dầu nước của rutin 29

Bảng 3.3 Diện tích vùng hình thành nhũ tương 32

Bảng 3.4 Thông số biến đầu vào thiết kế thí nghiệm 34

Bảng 3.5 Yêu cầu các biến đầu ra 34

Bảng 3.6 Kết quả tối ưu hoá bằng mạng nơ ron nhân tạo 37

Bảng 3.7 Dự đoán các thông số KTG, PDI và tỷ lệ dược chất được nhũ hoá của các công thức lựa chọn 39

Bảng 3.8 Một số đặc tính của nhũ tương tạo thành 39

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của rutin 2

Hình 1.2 Giản đồ pha vùng hình thành nano nhũ tương [1] 10

Hình 1.3 Giản đồ pha hệ Capryol 90 - Cremophor RH 40 - Transcutol HP [3] 11

Hình 3.1 Độ tan của rutin trong các tá dược 30

Hình 3.2 Ảnh hưởng tỷ lệ tá dược trong công thức SEDDS tới các biến đầu ra 35

Hình 3.3 Ảnh hưởng của tỷ lệ rutin tới các KTG, PDI và tỷ lệ dược chất được nhũ hoá của nhũ tương.………37

Hình 3.4 Vùng thiết kế tối ưu của công thức hệ tự nhũ hoá chứa rutin 38

Hình 3.5 Lượng rutin giải phóng qua da của các công thức trong 24 giờ 41

Hình 3.6 Lượng rutin được lưu giữ trong da sau 24 giờ 42

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Lão hoá là một quá trình tự nhiên, xảy ra liên tục và tăng dần theo thời gian Quá trình này có thể quan sát rõ nhất thông qua những biểu hiện thay đổi trên da theo thời gian Xã hội ngày càng phát triển, nhu cầu về các sản phẩm chăm sóc da, chống lão hoá ngày càng tăng Mỹ phẩm có chứa thành phần có nguồn gốc tự nhiên được ưa chuộng do thân thiện với môi trường, ít tác dụng phụ Rutin là một trong những flavonoid có hoạt tính sinh học, có hàm lượng đáng kể trong nhiều loại thực vật Bên cạnh nhiều lợi ích đối với tim mạch như tăng sức bền thành mạch, bảo vệ tim mạch, rutin còn có nhiều tác dụng khác như chống oxy hoá, kháng khuẩn [11] Nhiều nghiên cứu cho thấy rutin có nhiều lợi ích trên da như chống lão hoá [26], ngăn ngừa tổn thương do tia UV gây ra [30], [54], [56], chống và làm giảm các triệu chứng viêm da [26] Tuy có tiềm năng ứng dụng trong mỹ phẩm nhưng trở ngại lớn nhất đối với rutin chính là độ tan trong nước thấp, khả năng thấm qua da kém có thể ảnh hưởng đến hiệu quả chăm sóc da[54] Vì vậy, một số phương pháp đã được ứng dụng nhằm tăng độ tan và khả năng thấm qua da của rutin như nghiên cứu ứng dụng dạng hỗn dịch nano và tinh thể nano rutin, hệ phân tán rắn, phức hợp với phospholipid hoặc thay đổi cấu trúc hoá học [20], [29], [36], [48]

Nano nhũ tương đã được ứng dụng trong nhiều chế phẩm mỹ phẩm do khả năng phân phối thuốc có kiểm soát, cải thiện độ tan, tính thấm và độ ổn định của hoạt chất, đặc biệt những hoạt chất có nguồn gốc từ tự nhiên [15], [60] Hiện nay, hệ tự nhũ hoá (SEDDS) ngày càng được quan tâm nghiên cứu và đã được chứng minh có tiềm năng trong cải thiện sinh khả dụng và hiệu quả tác dụng của các hoạt chất có hạn chế về độ tan, tính thấm cũng như độ ổn định hóa học Với những ưu thế như vậy, SEDDS đã được nghiên cứu, ứng dụng trong mỹ phẩm dưới các dạng lotion và một số dạng bào chế bán rắn khác như kem, gel [4], [44]

Để góp phần ứng dụng rutin trong mỹ phẩm chăm sóc da, đề tài “Nghiên cứu bào chế hệ tự nhũ hoá chứa rutin” được thực hiện với các mục tiêu:

1 Xây dựng được công thức bào chế hệ tự nhũ hoá chứa rutin 2 Đánh giá được một số đặc tính của hệ tự nhũ hoá chứa rutin đã bào chế

2

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về rutin

1.1.1 Nguồn gốc

Rutin là một flavonol có mặt trong nhiều loại trái cây và rau củ, được tìm thấy

lần đầu tiên trong cây tử lý hương (Ruta graveolens L.) vào năm 1842 và được đặt tên

theo loài cây này Các loài thuộc chi kiều mạch là một trong những nguồn rutin quan trọng nhất, ngoài ra rutin còn gặp trong nhiều loài thực vật khác như các cây họ cam, hy thiêm, vọng cách, chè, Các nguồn nguyên liệu chính để sản xuất rutin hiện nay là

Sophora joponica L., Eucalyptus macrorrhyncha F.Muell, Fagopyrum esculentum

Moench và Fagopyrum tataricum L [23] Ở nước ta, hoa hoè chứa hàm lượng rutin cao

hơn rất nhiều so với các dược liệu khác và cũng cao hơn so với hoè trồng ở các nước trên thế giới

1.1.2 Công thức hoá học và tính chất vật lý

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của rutin

Rutin là một flavonol glycosid thuộc nhóm flavonoid, tạo thành khi thay thế nhóm hydroxyl của quercetin ở vị trí C-3 bằng các nhóm đường glucose và rhamnose, có tên khoa học là 2-(3,4-dihydroxyphenyl)-5,7-dihydroxy-3-[(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-trihydroxy-6-[[(2R,3R,4R,5R,6S)-3,4,5-trihydroxy-6-methyloxan-2-

yl]oxymethyl]oxan-2-yl]oxychromen-4-one với công thức phân tử là C27H30O16

Phân tử lượng của rutin là 610,5 g/mol, rutin kém tan trong nước (125 mg/L), tan tốt trong methanol (55 g/L), ethanol (5,5 g/L), pyridin (37.3 g/L) [42], acetone, n-propanol Nhiệt độ nóng chảy của rutin là 125°C, giá trị logP là -0.87 (theo drugbank.com), pKa = 6.37 (theo Pubchem) Rutin được xếp vào nhóm IV trong bảng phân loại sinh dược học (BCS), có tính tan kém và thấm kém [8]

Rutin có cấu trúc glycosid nên dễ bị các men có sẵn trong dược liệu hoặc acid phân huỷ Trong môi trường kiềm rutin khá bền, chỉ ở điều kiện dung dịch kiềm đặc và có nhiệt độ cao thì rutin mới bị phá vỡ cấu trúc, cụ thể là rutin sẽ mở vòng C tạo thành một dẫn chất acid thơm và một dẫn chất phenol [27]

Năm 2016, một nhóm nghiên cứu người Hàn đã tiến hành thực nghiệm xác định tác dụng chống lão hoá của rutin đối với nguyên bào sợi và da người bằng cách thực

hiện thử nghiệm in vivo trên người Sau 2 và 4 tuần tiến hành đo và phân tích mật độ

da, độ đàn hồi của da, chiều dài và diện tích của vết chân chim và số lượng nếp nhăn ở đuôi mắt Nhìn chung, kết quả cho thấy tác dụng của rutin đối với tình trạng lão hoá do các phản ứng oxy hoá thông qua sự cải thiện về các dấu hiệu lão hoá da như: tăng độ đàn hồi và mật độ da, giảm chiều dài, diện tích và số lượng nếp nhăn, vết chân chim Khả năng chống lão hoá da của rutin được nghiên cứu nhờ hiệu quả làm tăng sinh collagen typ 1 trên da do tăng biểu hiện mRNA của collagen typ 1 và ức chế hoạt động của enzym MMPs – tác nhân gây lão hoá da [24], [18]

1.1.3.2 Chống nắng và ngăn ngừa tổn thương do tia UV gây ra

Rutin đã được kiểm chứng là làm giảm các dấu hiệu viêm da do tác động của tia UVB trên da chuột Nghiên cứu của Choi và cộng sự đã cho thấy việc thoa rutintrên da chuột 30 phút trước khi chiếu tia UVB làm giảm quá trình peroxide hoá lipid và tăng sinh biểu bì do UVB gây ra nhờ tác dụng ức chế hoạt động của enzym cyclooxygenase-2 (COX-2) và nitric oxide synthase (iNOS) từ đó có thể ức chế p38 MAP kinase và JNK là 2 yếu tố gây ra tác động của UVB lên COX-2 trên da [17]

Bên cạnh đó, người ta đã quan sát khi rutin kết hợp với dạng nhũ tương dầu trong nước ở nồng độ 10% cho ra giá trị hệ số chống nắng tương tự như homosalate và cho hiệu quả chống tia UVA khá đáng kể Khi được kết hợp cùng với titan dioxide, chỉ số SPF thu được là 30 [19] Hệ nano lipid chứa rutin cũng được chứng minh là có tiềm năng trong việc sử dụng như một sản phẩm chống nắng [30]

1.1.3.3 Chống viêm da

Nghiên cứu của Choi và Kim năm 2013 chỉ ra tác dụng làm giảm triệu chứng viêm da dị ứng trên tai chuột bằng cách ức chế sự xâm nhập của tế bào mast vào tai và nồng độ histamin trong huyết thanh, ngoài ra còn làm giảm triệu chứng viêm da dị ứng tiếp xúc được xác định qua độ dày của tai và sự tăng sinh tế bào lympho, nồng độ IgG2a và biểu hiện của các interferon Nghiên cứu này cho thấy rutin có tiềm năng trong việc điều trị các bệnh viêm da dị ứng [16]

Không chỉ dùng đơn độc, rutin còn có thể kết hợp các các hoạt chất khác để hiệp đồng tăng tác dụng chống lão hoá, bảo vệ da Việc kết hợp cùng với acid ascobic (vitamin C) cho đặc tính chống oxy hóa cao hơn so với hoạt động của hợp chất đơn lẻ

4 và cho thấy tác dụng mạnh hơn chống lại sự hình thành các loại oxy phản ứng do tia cực tím gây ra Sự kết hợp giữa acid ascorbic và rutin là sự bổ sung cho nhau trong các hoạt động chống oxy hóa, chức năng vận chuyển và truyền tín hiệu của chúng Các hoạt động kết hợp chống oxy hóa, chống viêm và chống apoptotic của chúng cho thấy rutin và acid ascorbic là một nhóm có khả năng bảo vệ tế bào chống lại tổn thương da do tia cực tím gây ra [25] Rutin kết hợp với acid caffeic được xác định là có tiềm năng chống lão hoá và oxy hoá thông qua việc ức chế các enzym collagenase, tyrosinase, elastase và hyaluronidase [26]

1.1.3.4 Làm nhanh lành vết thương

Rutin được phối hợp vào dạng hydrogel khi bôi lên vết thương ngoài da của chuột, làm giảm diện tích vết thương so với hydrogel đối chứng Có sự giảm stress oxy hóa ở vùng vết thương được biểu thị bằng việc giảm peroxid hóa lipid và hàm lượng protein carbonyl cùng với tăng hoạt tính catalase Hydrogel chitosan giải phóng rutin để chữa lành vết thương ngoài da đã được bào chế Những hydrogel này thúc đẩy rõ rệt sự hình thành của biểu mô mới và hạt dày hơn, gần với biểu mô ban đầu hơn [9]

1.1.4 Dược động học và hướng cải thiện khả năng thấm qua da

1.1.4.1 Dược động học của rutin

Nhiều nghiên cứu cho thấy rutin có khả năng hoà tan kém và sinh khả dụng thấp trong các hệ thống sinh học Nghiên cứu của Carbonaro và Grant sử dụng rutin đường uống để đánh giá khả năng hấp thu qua ruột non của rutin Kết quả chỉ ra rằng rutin kém hấp thu qua ruột non và bị vi khuẩn trong đường ruột thuỷ phân thành quercetin, quercetin được hấp thu và tồn tại chủ yếu ở dạng liên hợp là quercerin glucuronide và quercerin sulfate, trong khi dạng rutin gốc không ghi nhận được trong máu sau khi uống, chứng tỏ rằng sinh khả dụng tuyệt đối đường uống của rutin gần như bằng 0 Ngoài ra một số chất chuyển hoá khác của rutin như acid homovanillic, acid 3,4-dihydroxyphenyl-acetic, 3,4- dihydroxytoluen, acid m-hydroxyphenylacetic cũng được phát hiện [38], [39] Rutin sau khi được hấp thu thông qua chuyển thành quercetin được thải trừ nhanh chóng qua phân và khoảng 10% qua nước tiểu, dưới dạng 3-OPAC (3-hydroxylphenyl-acetic acid), acid benzoic và acid hippuric [37]

Cũng chính vì rutin có khối lượng phân tử lớn, độ tan trong nước thấp (125 mg/L) dẫn đến khó khăn khi bào chế công thức Hơn nữa, tính thấm qua da hạn chế (hệ số thấm qua da trong dung dịch nước là 0,098 ± 0,015 mg/cm2.h), khả năng tan kém trong nhiều loại dầu (< 0.3 mg/g, 25°C) làm cho rutin sử dụng kém hiệu quả trong các sản phẩm dùng tại chỗ trên da [61]

1.1.4.2 Một số hướng nghiên cứu cải thiện thấm rutin qua da

Để có thể ứng dụng trong các chế phẩm dùng trên da cần áp dụng những biện pháp làm tăng độ tan và tính thấm của rutin qua da như hệ mang thuốc nano, ở kích

5 thước nano giúp tăng độ tan bão hòa, tăng diện tích tiếp xúc bề mặt và tăng tốc độ hòa tan; hệ mang nano lipid (nanostructured lipid carriers) có khả năng chứa nhiều hoạt chất hơn và dễ dàng sản xuất cũng như kiểm soát giải phóng; tạo phức với β-cyclodextrin làm tăng khả năng hòa tan và tốc độ hòa tan; chuyển dạng cấu trúc hóa học

Một số nghiên cứu tăng độ tan và khả năng thấm qua da của rutin: Rutin dạng nano tinh thể được nghiên cứu nhằm tăng độ tan bão hoà của rutin và được phối hợp trong gel carbopol để tạo thành gel tinh thể nano rutin (NC-gel) giúp nâng cao hiệu quả phân phối qua da Với những ưu điểm của NC-gel, lượng rutin thấm được qua da tăng hơn gấp 3 lần so với nhóm chứng dùng gel chứa rutin thô Kết quả

nghiên cứu dược lực học in vivo cho thấy sử dụng NC-gel hiệu quả trong việc ngăn

ngừa lão hoá và tổn thương mô do chiếu xạ tia cực tím Những kết quả này đã cho thấy NC-gel là chất mang lý tưởng cho ứng dụng bảo vệ da khỏi tia cực tím của rutin, cung cấp nền tảng có giá trị để cải thiện sinh khả dụng qua da của những hoạt chất kém tan khác [35]

Vi nhũ tương hoặc nano nhũ tương có thể cải thiện tính thấm hoạt chất qua lớp sừng và thâm nhập vào các lớp sâu hơn của da bằng nhiều cơ chế khác nhau: các chất diện hoạt và chất đồng diện hoạt vừa đóng vai trò như chất tăng cường thẩm thấu, vừa giúp tăng độ tan của hoạt chất; tăng diện tích tiếp xúc với da do kích thước giọt nhỏ, khả năng thấm ướt phù hợp Azar Kajbafvala và cộng sự đã nghiên cứu bào chế vi nhũ tương rutin với mục đích tăng tính thấm qua da Vi nhũ tương chứa tween 80 là chất diện hoạt, ethylene glycol là chất đồng diện hoạt và IPM (Isopropyl myristate) là pha

dầu Khả năng thấm ex vivo đã được đánh giá trên da chuột Kết quả cho thấy mẫu vi

nhũ tương đặc biệt là dạng gel có thể được sử dụng như một phương tiện hiệu quả để kéo dài quá trình vận chuyển rutin qua da như mong muốn trong công thức kem chống nắng [28]

Một phương pháp khác được sử dụng phổ biến gần đây và mang lại hiệu quả tốt là hệ tự nhũ hoá (SEDDS) Đây là một phương pháp tiếp cận phổ biến và khả thi về mặt thương mại để giải quyết vấn đề sinh khả dụng đường uống thấp, tuy nhiên các nghiên cứu ứng dụng trên da còn hạn chế

The ma:nyo Heather

Chiết xuất cây thạch nam Rutin

Algaenia

Làm dịu da Chống lão hoá

Eye contour serum Universkin

Rutin 3,2% Niacinamide 4% Nha đam 5,4%

Giảm bọng, giảm sưng mắt

Kem Soothe Daily Mineral Sunscreen SPF 30

Rodan + Fields

Kết hợp nhiều chất chống nắng vô cơ, hữu cơ như TiO2,

ZnO,… với rutin

Chống nắng Làm dịu da Kem Red Teatree

Cicassoside Final Solution Cream

Some by mi

Niacinamide Adenosine Rutin

Ngừa mụn Làm sáng da Chống lão hoá

Kem Ves Rocher Sensitive Vegetal Soothing

Yves Rocher

Caffein Rutin

Làm dịu Dưỡng ẩm Chống Oxy hoá

1.2 Hệ tự nhũ hoá

1.2.1 Khái niệm

Hệ tự nhũ hoá (Self-emulsifying drug delivery system – SEDDS) là dạng khan của nhũ tương, là một hỗn hợp đồng nhất và ổn định của dầu, chất diện hoạt, chất đồng diện hoạt và hoạt chất Khi đưa vào pha nước và khuấy trộn nhẹ nhàng sẽ tạo ra nhũ tương có các giọt phân tán với kích thước từ 20 – 300 nm

SEDDS được phân thành 2 nhóm dựa theo kích thước các giọt phân tán bao gồm: Hệ tự vi nhũ hoá (Self-microsemulsifying drug delivery system – SMEDDS) với kích thước giọt phân tán dưới 100nm và hệ tự nano nhũ hoá (Self-nanoemulsifying drug delivery system – SNEDDS) với kích thước giọt phân tán trong khoảng 100 – 300 nm [4]

SEDDS cải thiện sinh khả dụng đường uống và hiệu quả điều trị của những hoạt chất khó tan trong nước Sau khi uống, các hệ thống này nhanh chóng phân tán trong dịch tiêu hóa, tạo ra các vi nhũ tương hoặc nano chứa thuốc hòa tan Do kích thước hạt cực nhỏ nên thuốc được nhũ hóa ở dạng vi/nano có thể dễ dàng được hấp thu qua đường bạch huyết, bỏ qua tác dụng chuyển hóa lần đầu qua gan [52]

Bên cạnh đó, SEDDS cũng cải thiện độ tan, kích thước giọt của nhũ tương tạo thành nhỏ có thể góp phần làm tăng hiệu quả điều trị tại chỗ của những hoạt chất thân dầu – những hoạt chất này thường có xu hướng tích tụ trong lớp sừng sau khi được giải phóng ra khỏi dạng bào chế, đây được coi là bước giới hạn tốc độ hấp thu vào biểu bì của những hoạt chất thân dầu Việc kết hợp vào công thức SEDDS giúp hoạt chất có thể thấm được tới lớp biểu bì và hạ bì, tăng khả năng hấp thu và điều trị tại chỗ của những hoạt chất thân dầu [47], [57]

Một số báo cáo gần đây cũng cho thấy SEDDS có thể được ứng dụng trong việc tăng sinh khả dụng, độ ổn định của các hoạt chất có nguồn gốc từ thực vật, các phương thuốc thảo dược và các chất dinh dưỡng [53]

So với nhũ tương thông thường, SEDDS có lợi thế [4] - Ổn định về nhiệt động học nên dễ lưu trữ và bảo quản Cải thiện được độ ổn định vật lý và hóa học của hoạt chất khi bảo quản trong thời gian dài do là dạng khan của nhũ tương, chỉ là hệ thân dầu đồng thể, không có pha nước trong thành phần

- Hệ SEDDS có thể đưa vào các dạng bào chế khác nhau như viên nang mềm, nang cứng Khi SEDDS được nạp vào vỏ nang có thể che giấu mùi vị khó chịu của thuốc

1.2.2.2 Nhược điểm

Bên cạnh ưu điểm, hệ tự nhũ hoá cũng tồn tại một số hạn chế: Hệ không phù hợp cho các hoạt chất phải sử dụng ở liều quá cao, khả năng duy trì hoạt chất ở dạng hoà tan phụ thuộc lớn vào độ tan của nó trong pha dầu, nếu chất diện hoạt hoặc đồng dung môi có vai trò lớn trong việc hoà tan hoạt chất trong hệ thì nguy cơ hoạt chất bị tủa hoặc kết tinh lại là rất cao Hoạt chất có thể bị tủa lại khi SEDDS tiếp xúc với dịch tiêu hoá làm mất đi những ưu điểm của hệ

Thành phần dầu trong công thức có thể bị oxy hoá trong quá trình bảo quản, nhược điểm này có thể khắc phục bằng cách bổ sung những chất chống oxy hoá thân dầu vào công thức

8 Tuy ổn định hơn nhũ tương, nhưng SEDDS vẫn có thể bị phân lớp Để khắc phục nhược điểm này có thể hoá rắn hệ SEDDS

1.2.3 Thành phần của hệ tự nhũ hoá

1.2.3.1 Hoạt chất

Hoạt chất được sử dụng trong hệ thống Self-Emulsifying Drug Delivery Systems (SEDDS) chủ yếu thuộc nhóm II và IV trong bảng phân loại sinh dược học bào chế (BCS) Đây là nhóm thuốc có đặc điểm khả năng hòa tan kém, liều điều trị thấp, và điểm nóng chảy thấp, đồng thời giá trị log P > 4 [6]

Đặc tính của hệ SEDDS bị ảnh hưởng bởi các tính chất lý hóa của hoạt chất như log P, pKa và khối lượng phân tử Sự kết hợp hoạt chất vào SEDDS có thể dẫn đến việc tăng kích thước các giọt phân tán của nhũ tương tạo thành [22]

1.2.3.2 Pha dầu

Pha dầu là thành phần quan trọng trong công thức hệ tự nhũ hoá Các thuộc tính lý hoá của dầu có ảnh hưởng đáng kể tới quá trình tự nhũ hoá, kích thước giọt của nhũ tương, khả năng hoà tan hoạt chất Các loại dầu có chuỗi hydrocarbon quá dài như dầu thực vật (dầu đậu nành) hoặc triglycerid chuỗi dài rất khó để tự nhũ hóa, trong khi các loại dầu có chuỗi trung bình (các triglycerid mạch trung bình) và dầu có chuỗi ngắn (hoặc khối lượng phân tử thấp), như các monoglycerid mạch trung bình và các este của acid béo (ethyl oleat), rất dễ tự nhũ hóa so với các triglycerid chuỗi dài [40]

Hiện nay các triglycerid mạch trung bình mới được bán tổng hợp có đặc tính hoạt động bề mặt đang dần thay thế những triglycerid mạch trung bình thông thường[55] Ngoài ra, một số loại dầu tự nhiên như dầu thầu dầu, dầu ô liu, dầu đậu nành cũng thường được sử dụng để làm tăng độ tan của hoạt chất, ưu điểm của dầu tự nhiên khi sử dụng trên da là có khả năng tương thích với da [58]

Pha dầu tuy có vai trò quan trọng trong việc tăng độ tan và cải thiện khả năng thẩm thấu qua da của hoạt chất, nhưng nồng độ acid béo cũng như loại acid béo có mặt trong dầu cũng có thể ảnh hưởng tới khả năng tăng thấm qua da Vì vậy, pha dầu phải được chọn với khả năng hòa tan thuốc tối ưu cùng với thành phần acid béo thuận lợi nhằm mục đích tăng cường khả năng thấm

1.2.3.3 Chất diện hoạt

Các đặc tính của chất diện hoạt như chỉ số cân bằng dầu nước (HLB), độ nhớt, khả năng tương tác với pha dầu đóng vai trò quan trọng trong hệ tự nhũ hoá Trong đó chỉ số HLB của chất diện hoạt đặc trưng cho khả năng tự nhũ hoá của SEDDS, thông thường chọn những chất diện hoạt có chỉ số HLB cao và thân nước để phân tán và hình thành nhũ tương nhanh chóng, kích thước giọt nhỏ và hiệu suất nhũ hoá tốt [40] Chất diện hoạt không ion hoá thường được sử dụng nhiều hơn do tính an toàn và hiệu

9 quả, còn chất diện hoạt có nguồn gốc tự nhiên an toàn hơn nhưng khả năng tự nhũ hoá kém hơn [34]

Khi nghiên cứu bào chế hệ tự nhũ hoá trên da, cũng cần chú ý tới nồng độ chất diện hoạt do da cũng nhạy cảm với chất diện hoạt nồng độ cao Phản ứng kích ứng của da khi tiếp xúc với chất hoạt động bề mặt có thể liên quan tới khả năng hoà tan màng lipid của chất hoạt động bề mặt vì thông thường chất diện hoạt được chọn để hoà tan những hoạt chất thân dầu nên chúng cũng có khả năng hoà tan lipid ở lớp sừng Tuy vậy, đặc tính này có thể có lợi trong quá trình vận chuyển hoạt chất qua da nhờ phá vỡ cấu trúc màng lipid ở lớp sừng vốn là rào cản vững chắc đối với hệ phân phối thuốc qua da [58] Do vậy, cần cân nhắc giữa vấn đề kích ứng và tăng cường khả năng thấm qua da để lựa chọn nồng độ chất diện hoạt thích hợp Có thể phối hợp sử dụng nhiều loại chất diện hoạt để làm giảm nồng độ và tăng khả năng tự nhũ hoá [55]

1.2.3.4 Đồng dung môi

Việc bào chế một SEDDS tối ưu thường đòi hỏi nồng độ chất diện hoạt tương đối cao, do đó để giảm nồng độ chất diện hoạt có thể kết hợp cùng với các chất đồng dung môi, đồng diện hoạt Chất đồng diện hoạt cùng với chất diện hoạt làm giảm sức căng bề mặt tới một giá trị rất nhỏ, thậm chí giá trị âm tạm thời Tại giá trị này, bề mặt phân cách pha sẽ được mở rộng để hình thành các giọt phân tán nhỏ và sau đó quá trình hấp thụ, phân bố chất diện hoạt và chất đồng diện hoạt lên bề mặt các giọt làm cho sức căng bề mặt dương trở lại [49] Ngoài ra, việc bổ sung chất diện hoạt trong công thức còn tăng khả năng hoà tan một số hoạt chất thân dầu, giảm thời gian hình thành nhũ tương và điều chỉnh kích thước giọt nhũ tương từ đó làm tăng diện tích vùng hình thành nhũ tương [34], [40]

Một số đồng diện hoạt, đồng dung môi như diethylene glycol monoethyl ether (transcutol), propylen glycol, polyethylen glycol, polyoxyethylen, propylen carbonat,… có thể giúp hoà tan một lượng lớn chất diện hoạt thân nước hoặc hoạt chất thân nước trong nền dầu [55] Tuy nhiên cần tối ưu lượng đồng dung môi đưa vào công thức do tính phân cực và khả năng bay hơi của chúng có thể gây tủa dược chất

1.2.3.5 Các thành phần khác

Việc bổ sung các tác dược trong quá trình xây dựng công thức SEDDS có thể hỗ trợ tạo ra nhũ tương ổn định, thể chất đẹp dễ dàng phối hợp vào các công thức mỹ phẩm, đồng thời góp phần điều chỉnh việc phân phối hoạt chất qua da

Các thành phần khác có thể là chất chống oxy hoá vì một số SEDDS có thành phần pha dầu là những chất béo không no, dễ bị oxy hoá thành peroxyd và các gốc tự do có thể ảnh hưởng tới độ ổn định của chế phẩm và tính an toàn Chất chống oxy hóa thân dầu như α-tocopherol, propyl gallat, ascorbylpalmitat hoặc BHT có thể được sử dụng để ổn định pha dầu của SEDDS [59]

10

1.2.4 Nghiên cứu bào chế hệ tự nhũ hoá

1.2.4.1 Ứng dụng giản đồ pha trong nghiên cứu hệ tự nhũ hoá

Các thành phần của SEDDS và tỷ lệ của chúng ảnh hưởng sâu sắc tới các đặc tính khác nhau của nhũ tương tạo thành như kích thước giọt, chỉ số đa phân tán (PDI), thời gian tự nhũ hoá,… Trong xây dựng công thức bào chế SEDDS, tỷ lệ các thành phần thường được chọn trên cơ sở xây dựng giản đồ pha xác định vùng hình thành vi nhũ tương hoặc nano nhũ tương Mỗi góc của giản đồ đại diện cho 100% mỗi thành phần Vùng tự nhũ hóa là tập hợp các điểm tạo ra nano nhũ tương (kích thước giọt không quá 300 nm), hoặc vi nhũ tương (kích thước giọt không quá 100 nm) Do xây dựng giản đồ bốn pha (hệ bốn thành phần) sẽ tốn nhiều thời gian và khó giải thích nên giản đồ ba pha thường được xây dựng để xác định các vùng khác nhau bao gồm cả vùng vi/nano nhũ tương Trong trường hợp nghiên cứu bốn thành phần trở lên, giản đồ ba pha được sử dụng trong đó một góc thường biểu thị hỗn hợp của hai thành phần như chất diện hoạt/chất đồng diện hoạt, nước/hoạt chất hoặc dầu/hoạt chất [10] Các nghiên cứu thường xây dựng giản đồ ba pha (sau đây gọi tắt là giản đồ pha) theo hai cách sau:

Cách thứ nhất là sử dụng phương pháp chuẩn độ để xây dựng giản đồ pha Hệ thống giản đồ pha gồm ba thành phần trong đó có hai thành phần được bào chế với các tỷ lệ khác nhau là dầu và hỗn hợp chất diện hoạt - đồng diện hoạt (Smix), thành phần thứ ba là nước được thêm từ từ từng giọt vào hỗn hợp dầu và Smix dưới sự khuấy trộn nhẹ nhàng Đánh giá nhũ tương thu được bằng mắt thường và kính hiển vi và xác định lượng nước thêm vào hỗn hợp Vùng hình thành nhũ tương trên giản đồ pha là vùng mà dung dịch trong suốt, đồng nhất hoặc trong mờ [5], [32] Hình 1.2 là giản đồ pha vùng hình thành vi nhũ tương với ba thành phần dầu, Smix và nước [1]

Hình 1.2 Giản đồ pha vùng hình thành nano nhũ tương [1]

Cách thứ hai là sử dụng phương pháp pha loãng, giản đồ pha là hệ của 3 thành phần, dầu, chất diện hoạt và chất đồng diện hoạt Vùng hình thành vi/nano nhũ tương

11 được xác định bằng cách đánh giá kích thước giọt tạo thành sau khi thêm một lượng nước cố định vào hỗn hợp ba thành phần của giản đồ pha [12], [50] Hình 1.3 là giản đồ pha hệ gồm Capryol 90 - Cremophor RH 40 - Transcutol HP [3]

Hình 1.3 Giản đồ pha hệ Capryol 90 - Cremophor RH 40 - Transcutol HP [3] 1.2.4.2 Nghiên cứu tối ưu hoá công thức SEDDS

Các phương pháp tối ưu hóa công thức hiện đại, sử dụng Thiết kế Thí nghiệm (DoE) hệ thống, đã được áp dụng rộng rãi trong quá trình phát triển các công thức tự nhũ hóa khác nhau Các phương pháp DoE được sử dụng để cải thiện sự bất thường của một biến số trong mỗi phương pháp Các phương pháp thiết kế thí nghiệm có ưu điểm là giúp tiết kiệm thời gian, chi phí và công sức; linh hoạt và khả năng dự đoán rõ ràng Nhiều loại thiết kế thí nghiệm được sử dụng trong tối ưu hóa, trong đó các thiết kế thí nghiệm đã được áp dụng bao gồm thiết kế mô hình mặt hợp tử tại tâm, thiết kế Box-Benkhen, thiết kế hỗn hợp đơn giản (simplex mixture design) và thiết kế D-Optimal Các yếu tố ảnh hưởng (biến đầu vào) luôn luôn là các thành phần trong SEDDS Các biến đáp ứng (biến đầu ra) gồm kích thước giọt nhũ tương, chỉ số đa phân tán, khả năng giải phóng hoạt chất, tỷ lệ nhũ hóa, tỷ lệ thấm, hấp thu hoạt chất… [52]

1.2.5 Một số phương pháp đánh giá hệ tự nhũ hoá

1.2.5.1 Đánh giá đặc tính lý hoá a Đánh giá trực quan

Trực quan là phương tiện đầu tiên để đánh giá hệ SEDDS, phương pháp này giúp đưa ra những thông tin về khả năng nhũ hóa, tính chất giọt nano nhũ tương và về kết quả phân tán [40]

12

b Kích thước giọt, PDI và thế zeta

Kích thước giọt là một yếu tố quan trọng quyết định mức độ và tốc độ giải phóng hoạt chất cũng như sự ổn định của nhũ tương tạo thành Kích thước giọt của nhũ tương có thể được xác định bằng quang phổ tương quan photon, máy đo thế zeta và phân bố kích thước tiểu phân hoặc kính hiển vi điện tử truyền qua (transmission electron microscopy) [46]

Phân bố kích thước giọt (PDI) là thuật ngữ để mô tả mức độ không đồng nhất của sự phân bố kích thước hạt, có giá trị thay đổi từ 0,0 đến 1,0 PDI càng cao, sự đồng đều phân bố kích thước giọt càng kém và ngược lại, càng gần 0 thì các giọt càng đồng đều Giá trị PDI lớn hơn 0,7 cho thấy rằng mẫu có phân bố kích thước hạt rất rộng và không thích hợp để phân tích bằng kỹ thuật tán xạ ánh sáng động Giá trị PDI nhỏ hơn 0,2 thường được coi là chấp nhận được trong thực tế đối với hạt nano mang polyme Trong các ứng dụng hệ thuốc sử dụng chất mang lipid, chẳng hạn như liposome và nanoliposome, PDI nhỏ hơn 0,3 được coi là chấp nhận được và cho biết một tập hợp đồng nhất của kích thước tiểu phân phospholipid [21]

Thiết bị đo kích thước dựa trên nguyên lý tán xạ ánh sáng động còn cho phép xác định thế zeta, đại lượng đặc trưng cho độ ổn định của hệ phân tán Thế zeta được sử dụng để xác định điện tích của các giọt, giá trị cao của thế zeta thể hiện lực đẩy tĩnh điện mạnh, do đó loại trừ khả năng keo tụ, giúp hình thành các hệ SEDDS ổn định [32]

c Đo độ dẫn

Phép đo độ dẫn điện có thể giúp xác định điểm thêm pha nước tại đó hệ chuyển từ pha dầu liên tục sang pha nước liên tục, điều này giúp theo dõi hiện tượng đảo pha [51]

d Đo chỉ số khúc xạ, độ truyền qua

Chỉ số khúc xạ và phần trăm truyền qua chứng minh độ trong suốt của nhũ tương tạo thành

Chỉ số khúc xạ của SEDDS được đo bằng khúc xạ kế và so sánh với nước Độ truyền qua của hệ được đo ở bước sóng cụ thể bằng cách sử dụng máy quang phổ UV với nước cất làm mẫu trắng, công thức có độ truyền qua > 99% là trong suốt [51]

13 - Loại C: Nhũ tương sữa mịn tạo thành trong vòng 2 phút - Loại D: Nhũ tương màu trắng xám xỉn, hơi dầu, nhũ hóa chậm (lớn hơn 2 phút) - Loại E: Công thức nhũ tương kém hoặc sự nhũ hóa tối thiểu với các giọt dầu

lớn xuất hiện trên bề mặt Mục đích trong các nghiên cứu thường là đạt mức A và mức B Các mức C, D, E thường không được lực chọn [51]

1.2.5.2 Đánh giá độ ổn định nhiệt động học

Nhũ tương tạo thành sau khi SEDDS tự nhũ hóa thường được đánh giá độ ổn định vật lý dưới tác động của nhiệt độ và lực ly tâm Các đặc tính của hệ được đánh giá sau các chu kỳ gồm kích thước giọt, phân bố kích thước giọt [10]

1.2.5.3 Tỷ lệ hoạt chất trong pha dầu

Tỷ lệ hoạt chất trong pha dầu được xác định trên cơ sở định lượng hoạt chất trong nano nhũ tương và trong pha nước Tỷ lệ hoạt chất trong pha dầu (%) được tính theo công thức sau:

Tỷ lệ hoạt chất trong pha dầu (%) = !!"!# !%ũ 'ươ!*! # !

+%" !ướ-!"!# !%ũ 'ươ!* × 100 [41] Trong đó: Xnano nhũ tương là lượng hoạt chất trong nano nhũ tương

1.2.6 Một số nghiên cứu về hệ tự nhũ hoá chứa rutin

Năm 2012, Pal Vishesh Kumar và cộng sự đã thiết kế công thức hệ tự nhũ hoá chứa rutin sử dụng dầu ăn Kết quả thu được từ nghiên cứu này cho thấy rằng bằng cách sử dụng loại và tỷ lệ thích hợp của dầu, chất diện hoạt và chất đồng diện hoạt, rutin có thể dễ dàng tạo thành một SMEDDS với kích thước giọt, độ đục và lượng thuốc giải phóng mong muốn Công thức chứa dầu ăn, Tween 80 và Ca-8 theo tỷ lệ 1:1:8 có giá trị kích thước giọt và độ đục thấp nhất (tương ứng là 30 nm và 1,2 NTU) và lượng thuốc giải phóng cao nhất sau 30 phút (93%) [33]

Năm 2019, Qiang Wang và cộng sự đã phát triển và đánh giá đặc tính của hệ tự nhũ hoá kép không chứa nước (N-SDEDDS) chứa rutin ứng dụng tại chỗ N-SDEDDS được ổn định bởi bentonite kỵ nước và chất diện hoạt không ion hoá Công thức này cho hiệu quả tự nhũ hóa tốt và khi pha loãng với nước tạo thành nhũ tương kép dầu trong dầu trong nước (O/O/W) Hơn nữa, N-SDEDDS chứa rutin có khả năng giải phóng kéo dài (53,79% trong 12 giờ) và ổn định trong 3 tháng ở 4°C và 25°C Sự thấm qua da của N-SDEDDS rutin cao hơn đáng kể (0,211 ± 0,064 µg/(cm2.h)) so với dung dịch nước (0,098 ± 0,015 µg/(cm2.h)) Mức độ lưu giữ rutin trong các lớp da của N-SDEDDS cũng cao hơn (31,16 ± 5,81%) so với dung dịch nước (20,32 ± 3,36%) Nghiên cứu này đã chứng minh N-SDEDDS có thể là một chất mang hiệu quả cho ứng dụng tại chỗ của rutin, một chất kém tan trong nước cũng như trong dầu [61]

14

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu, thiết bị nghiên cứu

2.1.1 Nguyên liệu

Bảng 2.1 Nguyên liệu được sử dụng trong quá trình nghiên cứu

1 Rutin chuẩn 87,1% Viện kiểm nghiệm thuốc trung

17 Plurol oleique CC

25 Acetonitril Fisher - USA Tinh khiết phân tích

15

2.1.2 Thiết bị nghiên cứu

Bảng 2.2 Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu

2 Tế bào khuếch tán tĩnh Franz, Hanson Research Đức 3 Ống siêu ly tâm Amicon Ultra-4 10000 NMWL Đức 4 Máy đo thế zeta và xác định phân bố kích thước tiểu phân

6 Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC Shimadzu Nhật

9 Máy ly tâm lạnh tốc độ cao Hanil Supra R22 Hàn Quốc

2.1.3 Động vật thí nghiệm

Chuột nhắt trắng, đực, khỏe mạnh, cân nặng từ 25-30 g do bộ môn Dược lực cung cấp Chuột trước khi thí nghiệm được nuôi ổn định 1 tuần với các điều kiện phòng thí nghiệm bộ môn Dược lực, bằng thức ăn tiêu chuẩn do Viện vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp và uống nước tự do

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Nghiên cứu tiền công thức

2.2.1.1 Phương pháp định lượng rutin a Định lượng rutin bằng phương pháp đo quang

Ø Xác định đỉnh cực đại hấp thụ của rutin Cân chính xác khoảng 25 mg chất chuẩn rutin hòa tan vào vừa đủ 100 ml methanol thu được dung dịch chuẩn gốc Hút chính xác 10 ml dung dịch chuẩn gốc cho vào bình định mức 100 ml, pha loãng bằng methanol và thu được dung dịch chuẩn A có nồng độ 25 μg/ml

Mẫu trắng: Dung dịch methanol Tiến hành quét độ hấp thụ quang của dung dịch chuẩn A ở dải bước sóng từ 200 - 800 nm với mẫu trắng là methanol Xác định bước sóng tại đỉnh hấp thụ cực đại (λmax)

Ø Xây dựng đường chuẩn: Xây dựng đường chuẩn sự phụ thuộc của độ hấp thụ quang vào nồng độ rutin với tiêu chí đường chuẩn tuyến tính trong khoảng độ hấp thụ quang từ 0,2 đến 0,8 và

16 R2 > 0,99 Sau khi xác định được cực đại hấp thụ của rutin, sử dụng phương pháp đo quang UV - VIS để định lượng rutin

Mẫu chuẩn: Từ dung dịch chuẩn gốc, pha loãng với methanol thành các dung dịch có nồng độ lần lượt là 5 μg/ml; 10 μg/ml; 15 μg/ml; 20 μg/ml; 25 μg/ml

Mẫu trắng: Dung dịch methanol Mẫu thử: Mẫu thử đem lọc qua màng cellulose acetat 0,45 μm và đo ở cực đại hấp thụ Trong trường hợp nếu dung dịch thử có nồng độ thấp, nằm ngoài khoảng thì tiến hành phương pháp thêm chuẩn để được nồng độ dung dịch thử trong khoảng tuyến tính 5 đến 25 μg/ml

Đo độ hấp thụ quang của mẫu chuẩn và mẫu thử ở bước sóng cực đại Xây dựng đường chuẩn và phương trình biểu diễn mối quan hệ giữa độ hấp thụ quang và nồng độ rutin Nồng độ rutin trong mẫu thử được xác định dựa vào phương trình tuyến tính xây dựng

Ø Đánh giá ảnh hưởng của tá dược tới độ hấp thụ quang Tiến hành đo quang tại bước sóng cực đại hấp thu của rutin các dung dịch sau: Mẫu trắng: Methanol

Mẫu placebo: Cân khoảng 1 g mẫu gồm hỗn hợp các thành phần tá dược nghiên cứu, không có hoạt chất

Mẫu thử: Chuẩn bị mẫu thử chứa khoảng 30 mg rutin trong khoảng 1 g tá dược, sau đó pha loãng tới nồng độ thích hợp bằng methanol

b Định lượng rutin bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Ø Điều kiện sắc ký: Điều kiện sắc ký được tham khảo và điều chỉnh dựa theo Dược điển Trung Quốc 2015 chuyên luận rutin: cột sắc ký Agilent C18 (4,6x250 mm, 5 µm); pha động: tiến hành trên hệ dung môi pha động gồm nước tinh khiết và acetonitril tỷ lệ 70:30 - Detector quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng: 360 nm

- Tốc độ dòng: 1 ml/phút - Thể tích tiêm: 20 µl - Nhiệt độ cột: 25 ± 0,5oC - Thời gian chạy: 7 phút - Chuẩn bị mẫu:

- Dung môi pha loãng: methanol dùng cho HPLC - Dung dịch chuẩn gốc: cân chính xác khoảng 200 mg rutin chuẩn cho vào bình định mức 100 ml, thêm 90 ml methanol siêu âm trong khoảng 15 phút, bổ sung thêm MeOH đến vạch để tạo dung dịch chuẩn gốc 2000 μg/ml Lọc qua màng PTFE 0,2 μm trước khi tiêm mẫu vào hệ thống sắc ký

17 Ø Thẩm định phương pháp định lượng dựa trên một số tiêu chí:

- Đánh giá tính thích hợp hệ thống: Tiến hành tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn rutin

(nồng độ 500 μg/ml) Ghi lại thời gian lưu, diện tích peak Yêu cầu: Chênh lệch về thời gian lưu và diện tích peak biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối RSD % của 6 lần không được lớn hơn 2%

- Tính tuyến tính và khoảng xác định: Tiến hành xác lập mối tương quan giữa diện

tích peak với nồng độ của dung dịch rutin chuẩn Dãy dung dịch chuẩn được chuẩn bị bằng cách pha loãng dung dịch chuẩn gốc bằng methanol để được dãy dung dịch chuẩn có nồng độ rutin trong khoảng 5-500 μg/ml Tiến hành sắc ký, xây dựng phương trình hồi quy và xác định hệ số tương quan r Yêu cầu: Đường hồi quy thu được phải có dạng đường thẳng: y= ax + b và giá trị r ≥ 0,995

- Tính đặc hiệu: Tiến hành chạy sắc ký các dụng dịch sau đây theo quy trình phân

tích:

Dung dịch trắng: Dung môi pha mẫu methanol Dung dịch placebo: Cân khoảng 1 g mẫu gồm các thành phần tá dược nghiên cứu và không có hoạt chất cần phân tích

Dung dịch chuẩn: Dung dịch chuẩn rutin 500 µg/ml Dung dịch thử: Chuẩn bị mẫu thử chứa 30 mg rutin hòa tan hoàn toàn trong khoảng 1g tá dược, sau đó pha loãng tới nồng độ thích hợp bằng methanol

Tiến hành sắc ký và ghi lại giá trị thời gian lưu của các dung dịch

- Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ): Xác định giới hạn phát

hiện và giới hạn định lượng dựa vào tỷ lệ đáp ứng so với nhiễu Việc xác định tỉ lệ đáp ứng trên nhiễu được tiến hành bằng cách so sánh đáp ứng đo được trên mẫu thử có nồng độ chất phân tích thấp đã biết với đáp ứng của mẫu trắng và từ đó tính được nồng độ tối thiểu của chất phân tích có thể phát hiện được Đối với giới hạn phát hiện, tỷ lệ đáp ứng trên nhiễu khoảng 3:1 Đối với giới hạn định lượng, tỷ lệ đáp ứng trên nhiễu thông thường là 10:1

2.2.1.2 Đánh giá đặc tính của rutin nguyên liệu a Định lượng hàm lượng rutin trong nguyên liệu

Tiến hành định lượng hàm lượng rutin trong bột nguyên liêu theo phương pháp HPLC đã trình bày ở mục 2.2.1.1.b

18 Ø Hình ảnh SEM

Xác định hình thái của mẫu rutin nguyên liệu sử dụng kính hiển vi điện tử quét Cách tiến hành: Hình thái rutin được đánh giá sử dụng kính hiển vi điện tử quét FE-SEM S-4800 electron microscope (Hitachi, Japan) Mẫu bột được đặt trên băng dính và phủ bạch kim dưới áp suất âm trong 70 s Các mẫu được chụp bằng bằng máy sử dụng điện áp gia tốc 5,0 kV và độ phóng đại 500 lần

Ø Độ tan trong các môi trường pH khác nhau

Chuẩn bị các môi trường như bảng dưới đây

Bảng 2.3 Môi trường thử độ tan của rutin

pH Môi trường 1,2 Dung dịch HCl 0,1N 4,5 Đệm phosphat 6,8 Đệm phosphat 7,5 Đệm phosphat Tiến hành hòa tan một lượng dư (1000 mg) rutin trong lần lượt 5 ml các môi trường pH khác nhau (pH 1,2; 4,5; 6,8; 7,5) vào ống trong ống falcon 15 ml, lắc trong bể điều nhiệt với nhiệt độ 37 ± 2oC trong 72 giờ, dịch sau đó được ly tâm ở tốc độ 5000 vòng/phút, thu lấy dịch trong, pha loãng bằng methanol đến nồng độ thích hợp

Lọc dịch qua màng lọc cellulose acetat 0,45µm, tiến hành định lượng nồng độ rutin bằng phương pháp HPLC (như mục 2.2.1.1.b)

Ø Mất khối lượng do sấy khô - Sử dụng phương pháp mất khối lượng do làm khô trên cân xác định độ ẩm nhanh Ohais, Thụy Sĩ Rải đều 1 g nguyên liệu rutin vào đĩa cân, đặt nhiệt độ 105oC và đọc kết quả sau 10 phút

Ø Dạng thù hình ở trạng thái rắn - Phổ FTIR

Mẫu nguyên liệu rutin được đánh giá phổ FTIR bằng máy quang phổ FT-IR (Agilent, Mỹ) Quang phổ được ghi lại trên dải tần từ 4000 đến 500 cm−1 với độ phân giải 2 cm−1

- Giản đồ nhiệt DSC Cách tiến hành: Đặc tính nhiệt của mẫu được đánh giá bằng thiết bị DSC PT1000 LINSEIS (Đức) Các mẫu nguyên liệu rutin được đặt trên một vi cốc nhôm và được làm nóng từ 10°C đến 250°C với tốc độ quét 10°C/phút trong điều kiện thổi khí argon với tốc độ 40 mL/phút

- Phổ nhiễu xạ tia X Cách tiến hành: Nhiễu xạ tia X của nguyên liệu rutin thu được bằng máy đo nhiễu xạ tia X có độ phân giải cao (D8 Advance, Brucker, Đức) Mẫu được quét theo

19 các bước 0,02° từ 0° đến 60° (góc nhiễu xạ 2θ) ở 40 kV và được chiếu xạ Cu-Kα ở 150 mA

Ø Điểm nóng chảy

Cách tiến hành: cho một lượng rutin nguyên liệu vào trong ống thủy tinh mao quản, đo nhiệt độ nóng chảy trên thiết bị Melting Point SMP 10 (Bibby Scientific Limited Stone, Anh) Nhiệt độ nóng chảy là thời điểm rutin bị tan chảy Thí nghiệm lặp lại 3 lần, lấy kết quả trung bình

c Độ ổn định của rutin

Ø Trong dung dịch

Tiến hành thử độ ổn định tại nhiệt độ phòng thí nghiệm (27ºC), bảo quản trong lọ thuỷ tinh trung tính 20 ml cho các mẫu rutin nguyên liệu ở trong các dung dịch sau: - Dung dịch 0,04 mg/ml rutin trong nước

- Dung dịch 0,04 mg/ml rutin trong môi trường acid HCl pH 1,2 - Dung dịch 0,04 mg/ml rutin trong môi trường acid NaOH 1,0 N - Dung dịch 0,04 mg/ml rutin trong môi trường acid HCl pH 1,2 - Dung dịch 0,04 mg/ml rutin trong môi trường đệm phosphat pH 4,5 - Dung dịch 0,04 mg/ml rutin trong môi trường peroxid 3%

Sau các thời điểm 1, 2, 4, 24, 168, 336 giờ, tiến hành định lượng lại hàm lượng rutin bằng phương pháp HPLC so với lượng ban đầu

mẫu rutin được chiếu sáng dưới đèn UV sử dụng đèn LED UVC có bước sóng 100 – 280 nm, cường độ LED 60W trong thời gian 7 ngày

- Điều kiện nhiệt khô 80ºC trong 7 ngày - Điều kiện nhiệt khô 105ºC trong 96 giờ

20 Sau thời gian thí nghiệm, các mẫu được xác định lại hàm lượng rutin bằng HPLC, dạng thù hình của từng mẫu cũng được đánh giá bằng phổ nhiễu xạ tia X và giản đồ nhiệt DSC

d Hệ số phân bố dầu nước

Chuẩn bị pha octanol và nước: lấy 50 ml nước và 50 ml octanol trộn vào cốc có mỏ 250 ml, đem khuấy từ qua đêm Chuyển vào ống đong 250 ml, để yên hỗn hợp qua đêm để tách riêng 2 pha octanol và nước

Chuẩn bị mẫu: Cân chính xác khoảng 15 mg rutin vào cốc có mỏ, thêm 3 ml nước và 3 ml octanol đã chuẩn bị vào, lắc trong bể điều nhiệt 48 giờ ở nhiệt độ 37 ± 0,5ºC, ly tâm ở tốc độ 5000 vòng/phút trong 5 phút Lấy riêng từng phần nước và phần octanol, lọc qua màng Cellulose acetat 0,45 µm, pha loãng bằng Methanol, định lượng rutin bằng phương pháp HPLC

Tính kết quả: log P được tính theo công thức sau:

Log P = Log Rutin (octanol)Rutin (nước)Trong đó: Rutin (octanol) là nồng độ rutin trong pha octanol (µg/ml)

Rutin (nước) là nồng độ rutin trong pha nnước (µg/ml)

2.2.2 Nghiên cứu bào chế hệ tự nhũ hoá chứa rutin

2.2.2.1 Lựa chọn tá dược và xây dựng giản đồ pha xác định vùng hình thành nano nhũ tương

a Xác định độ tan bão hoà của rutin trong các tá dược dầu, chất diện hoạt và đồng diện hoạt

Độ tan của rutin trong các tá dược dầu, chất diện hoạt, chất đồng diện hoạt được xác định bằng các cho lượng dư rutin vào trong 3 ml tá dược đựng trong ống thủy tinh trung tính 20 ml, khuấy trộn bằng máy khuấy từ ở nhiệt độ 25 ± 2ºC trong 72 giờ Sau 72 giờ, lấy mẫu, ly tâm tại 6000 vòng/phút trong 20 phút, lấy lớp dịch phía trên, pha loãng với methanol tới nồng độ thích hợp, lọc qua màng cellulose acetat 0,45 μm định lượng nồng độ hoạt chất bằng phương pháp HPLC mô tả trong mục 2.2.1.1.b

Lấy mẫu nhiều lần, dung dịch được coi là bão hoà khi độ tan của rutin đo được tại hai thời điểm không khác nhau quá 5%

b Nghiên cứu đánh giá tương hợp giữa rutin và tá dược

Khảo sát khả năng tương thích của tá dược với hoạt chất Các tá dược được đánh giá là các tá dược dầu, chất diện hoạt và đồng diện hoạt được chọn Khả năng tương thích của tá dược được đánh giá bằng cách hoà tan rutin trong khoảng 5 ml tá dược đựng trong ống thuỷ tinh 20ml, đậy nắp kín Các mẫu được bảo quản ở 40 ± 0,2ºC, độ ẩm 75 ± 0,5% Sau 1 tuần, 1 tháng, 2 tháng, 3 tháng lấy mẫu ra định lượng lại nồng độ rutin bằng phương pháp HPLC

21

c Xây dựng giản đồ pha xác định vùng hình thành nano nhũ tương

Giản đồ pha là hệ của 3 thành phần, dầu, chất diện hoạt và chất đồng diện hoạt Vùng hình thành nano nhũ tương được xác định bằng cách đánh giá kích thước giọt của nhũ tương tạo thành sau khi thêm một lượng nước cố định vào hỗn hợp 3 thành phần trong giản đồ pha

Giản đồ pha được xây dựng với các hệ tá dược được lựa chọn Hỗn hợp chất diện hoạt - chất đồng diện hoạt (Smix) được chuẩn bị với các tỷ lệ khác nhau 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4 Tiến hành phối hợp pha dầu (O) vào mỗi hỗn hợp Smix vừa tạo ra theo những tỷ lệ O/Smix lần lượt 1:9, 2:8, 3:7, 4:6, 5:5, 6:4, 7:3, 8:2, 9:1 Hỗn hợp thu được đem khuấy trộn bằng máy khuấy từ trong 15 phút, sau đó thêm nước cất (tỷ lệ SEDDS/nước là 1:3), lắc nhẹ nhàng, đánh giá cảm quan các mẫu thu được Những mẫu không tách lớp được pha loãng đến độ pha loãng thích hợp, đo KTG và PDI Lựa chọn những điểm có kết quả KTTP < 200 nm và PDI < 0,5 để xây dựng giản đồ pha xác định vùng hình thành nhũ tương bằng phần mềm CHEMIX School 12.0

2.2.2.2 Phương pháp bào chế hệ tự nhũ hoá và nhũ tương

Bào chế hệ tự nhũ hóa chứa rutin: Cân các tá dược gồm pha dầu, chất diện hoạt và chất đồng diện hoạt theo tỷ lệ trong công thức cho vào cốc thủy tinh có dung tích 10 ml Cân hoạt chất rồi hòa tan trong hỗn hợp trên trong điều kiện khuấy từ với tốc độ 100 vòng/phút, cho đến khi thu được dung dịch trong suốt

Bào chế nhũ tương chứa rutin: Cân chính xác khoảng 150 mg hệ SEDDS vào lọ thủy tinh dung tích 20 ml, thêm 10 ml nước cất vào lọ, khuấy từ nhẹ nhàng khoảng 30 giây – 1 phút để tạo nhũ tương, để ổn định

2.2.3 Đánh giá một số đặc tính của hệ tự nhũ hoá bào chế được

2.2.3.1 Đánh giá kích thước giọt và phân bố kích thước giọt của nhũ tương

Sử dụng thiết bị HORIBA Scientific Nano partical ananlyzer SZ-100 (Anh) để đánh giá KTG và PDI của nhũ tương Các mẫu nhũ tương được chuẩn bị như phương pháp mô tả ở mục 2.2.2.2 Nhũ tương tạo được được pha loãng với tỷ lệ thích hợp sao cho có tốc độ đếm tiểu phân (Count rate) nằm trong khoảng 200-400 kcps Sử dụng cuvet thủy tinh, chỉ số khúc xạ RI là 1,843 và độ hấp thụ là 0,001

2.2.3.2 Đánh giá độ ổn định vật lý của nhũ tương tạo thành

Mẫu nhũ tương được chuẩn bị như phương pháp mô tả ở mục 2.2.2.2 để đánh giá độ ổn định Cho khoảng 2ml nhũ tương vào ống ly tâm, ly tâm 5000 vòng/phút trong thời gian 30 phút Đánh giá cảm quan hệ sau ly tâm Nhũ tương được coi như ổn định khi không có sự tách lớp sau ly tâm

2.2.3.3 Xác định thời gian nhũ hóa

Thời gian yêu cầu cho tự nhũ hóa của SEDDS được đánh giá bằng thiết bị thử độ hòa tan kiểu cánh khuấy Erweka Lấy 1 ml hệ SEDDS thêm vào 500ml nước tinh

22 khiết được duy trì ở nhiệt độ 32 ± 0,5 oC, tốc độ cánh khuấy là 50 vòng/phút Đánh giá cảm quan khi nano nhũ tương được tạo thành trong hoặc trong mờ, đồng nhất bằng mắt thường và ghi lại thời gian

2.2.3.4 Đánh giá phần trăm truyền qua

Mẫu nano nhũ tương được chuẩn bị như phương pháp mô tả ở mục 2.2.2.2 để đánh giá phần trăm truyền qua Mẫu nano nhũ tương được pha loãng 20 lần với nước cất, sau đó đo quang bằng máy đo quang UV-VIS, bước sóng đo tại 650 nm, với mẫu trắng là nước cất [51], [66] Phần trăm truyền qua được xác định bởi công thức:

% Truyền qua = $$

. × 100% Trong đó: Io: Cường độ ban đầu của nguồn sáng

I: Cường độ ánh sáng sau khi qua dung dịch

2.2.3.5 Xác định hiệu suất tự nhũ hoá

Các mẫu nano nhũ tương được chuẩn bị như phương pháp mô tả ở mục 2.2.2.2 Lấy chính xác khoảng 2 ml nano nhũ tương vào ống ly tâm khoảng 10000 vòng/phút trong 10 phút, sau đó hút chính xác khoảng 1 ml phần dịch phía trên vào bình định mức 10 ml, thêm methanol đến vạch, lắc đều, lọc qua màng cellulose acetat 0,45 μm Xác định nồng độ hoạt chất trong mẫu vừa pha bằng phương pháp HPLC ở bước sóng 360 nm Từ đó tính được hàm lượng hoạt chất trong nhũ tương ban đầu Hiệu suất tự nhũ hóa tính bằng công thức:

H = %/

%. × 100%

Trong đó: H1: Hàm lượng hoạt chất định lượng được

H0: Hàm lượng hoạt chất cân

2.2.3.6 Đánh giá khả năng giải phóng và lưu giữ trên da

Thiết kế thử nghiệm khả năng thấm qua da và khả năng lưu giữ trên da của hệ tự nhũ hoá chứa rutin sau khi tham khảo các tài liệu [13], [45], [61]:

v Điều kiện tiến hành: - Thiết bị thử: Tế bào khuếch tán tĩnh Franz, Hanson Research - Màng khuếch tán: Da lưng chuột nhắt khoẻ mạnh đã làm sạch lớp lông và lớp

mỡ dưới da - Môi trường thử: 5 ml đệm phosphat 7,4 - Diện tích tiếp xúc: 1,13097 cm2

- Nhiệt độ thử: 32 ± 0,5ºC - Tốc độ khuấy: 400 rpm - Thể tích mẫu: 0,1 g SEDDS (tương đương với 3 mg rutin) v Cách tiến hành: tiến hành với cỡ mẫu n = 3

23 - Chuẩn bị da lưng chuột: Làm sạch lông bằng dao điện, chú ý không làm xước,

rách da và cắt bằng kẹp panh và dao y tế, lau mặt dưới da 3 lần bằng ethanol để loại lớp mỡ dưới da Rửa lại bằng nước muối sinh lý để loại bỏ tạp bẩn, bảo quản ở nhiệt độ 2 – 8ºC và sử dụng trong 2 ngày Trước khi thử, màng da lưng được ngâm trong nước muối sinh lý 30 phút để hoạt hoá

- Đệm PBS 7,4 được siêu âm để loại bọt khí và đưa vào ngăn nhận, đặt màng da lưng lên trên sao cho phần mặt biểu bì hướng về phía ngăn cho Tại thời điểm t = 0, cân 0,2 g SEDDS (chứa khoảng 6 – 8 mg hoạt chất) vào ngăn cho

- Lấy mẫu ở các thời điểm: 1, 2, 4, 8, 24 h Mỗi thời điểm lấy 0,5 ml từ ngăn cho, đồng thời bổ sung 0,5 ml môi trường thử Mẫu lấy ra được pha loãng tới nồng độ thích hợp rồi định lượng bằng HPLC

- Mẫu trắng: Dung dịch rutin trong nước với nồng độ 0,1 mg/ml - Tính lượng rutin giải phóng được qua da chuột tại thời điểm t theo công thức:

mgp = 𝐶𝑡 × 5 + 0,5 × ∑&#'𝐶𝑖

()' × 100% Trong đó:

mgp : Lượng rutin được giải phóng qua da tại thời điểm t (µg) Ct: Nồng độ hoạt chất trong môi trường nhận tại thời điểm t (µg/ml) Ci: Nồng độ hoạt chất trong môi trường nhận tại thời điểm i (µg/ml) v Đánh giá khả năng lưu giữ trên da:

- Phần da chuột đóng vai trò là màng khuếch tán giữa ngăn cho và ngăn nhận được lấy ra sau khi thử tính thấm, sau đó được làm sạch 2 lần bằng nước muối sinh lý, thấm khô bề mặt Dùng kéo cắt nhỏ miếng da, cho vào ống ly tâm, rồi thêm chính xác 5 ml Methanol, lắc votex trong 30 phút (hoặc đem siêu âm) Sau đó ly tâm 10.000 vòng/phút trong 20 phút, phần dịch thu được lọc qua màng 0,45 µm để loại bỏ tạp và định lượng bằng HPLC

- Lượng hoạt chất lưu giữ trên da trên 1 đơn vị diện tích:

mlưu giữ = *+ố( -ượ01 23&(0 đị0+ -ượ01 đượ67(ệ0 &í6+ &(ế; <ú6 (µg/cm2) Trong đó diện tích tiếp xúc bằng: 1,1304 cm2

2.2.3.7 Xác định tỷ lệ dược chất được nhũ hoá

Sử dụng ống ly tâm siêu lọc Amicon Ultra-4 10000 NMWL (Đức) để tiến hành đánh giá [61] Các mẫu được chuẩn bị như sau: bào chế nano nhũ tương như phương pháp mô tả ở mục 2.2.2.2 Lấy chính xác một lượng nano nhũ tương, pha loãng đến nồng độ thích hợp lần lượt bằng dung môi methanol, định lượng nồng độ hoạt chất trong nano nhũ tương bằng đo quang như phương pháp đã mô tả ở mục 2.2.1.1.a Từ đó tính được hàm lượng hoạt chất trong nano nhũ tương ban đầu (Hàm lượng DC tổng) Sau đó, lấy 3 ml nano nhũ tương vừa tạo thành vào ống ly tâm siêu lọc ly tâm ở tốc độ 2000 vòng/phút trong thời gian 3 phút, thu được pha nước ở phía dưới ống, hút

24 lấy dịch lọc pha loãng tới nồng độ thích hơp bằng methanol Định lượng nồng độ hoạt chất trong pha nước bằng phương pháp đo quang Từ đó tính được hàm lượng hoạt chất trong pha nước (Hàm lượng DC pha nước) Tỷ lệ dược chất được nhũ hóa được tính theo công thức:

Tỷ lệ DC nhũ hoá = >Hàm lượng DC tổng – Hàm lượng DC pha nước?Hàm lượng DC tổng × 100% 2.3 Phương pháp xử lý số liệu, thiết kế thí nghiệm và tối ưu hoá công thức

2.3.2 Phương pháp thiết kế thị nghiệm và tối ưu hoá công thức

Bố trí thí nghiệm và tối ưu hoá công thức bằng phần mềm JMP: Sử dụng phần mềm JMP pro 17 để thiết kế thí nghiệm và tối ưu hoá Các biến đầu ra gồm: Kích thước giọt (KTG), PDI và tỷ lệ dược chất được nhũ hoá

Các biến đầu vào và khoảng biến thiên được lựa chọn trên cơ sở vùng hình thành nano nhũ tương trên giản đồ pha đã xây dựng và mức độ ảnh hưởng của tỷ lệ hoạt chất

25

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Kết quả nghiên cứu tiền công thức

3.1.1 Kết quả xây dựng phương pháp định lượng rutin

3.1.1.1 Phương pháp quang phổ UV-Vis a Xác định điểm hấp thụ cực đại

Tiến hành pha dung dịch rutin chuẩn gốc có nồng độ 250 μg/ml, từ đó pha dung dịch chuẩn có nồng độ 25 µg/ml, quét độ hấp thụ quang ở bước sóng từ 800 nm đến 200 nm Kết quả thu được cho thấy đỉnh hấp thụ cực đại ở bước sóng 360 nm Do đó các nghiên cứu định lượng tiếp theo sẽ tiến hành bằng phương pháp đo quang UV - VIS ở bước sóng 360 nm

b Xây dựng đường chuẩn

Từ dung dịch chuẩn gốc 250 µg/ml pha loãng bằng thành dãy các dung dịch chuẩn có nồng độ: 5; 10; 15; 20; 25 µg/ml Tiến hành đo quang các dung dịch chuẩn có nồng độ 5-25 µg/ml tại bước sóng 360 nm Kết quả được thể hiện trong bảng 1.1 và hình 1.1 – PL1

Nhận xét: hệ số tương quan R2 = 0,9992 (>0,99) cho thấy trong khoảng nồng độ 5 – 25 µg/ml có sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ rutin và độ hấp thụ quang

Phương trình đường chuẩn: y = 0,0348x – 0,0349 Trong đó: y là độ hấp thụ quang của dung dịch có nồng độ x (µg/ml)

c Đánh giá ảnh hưởng của tá dược tới độ hấp thụ quang

Tiến hành đánh giá ảnh hưởng của tá dược tới độ hấp thụ quang thu được kết quả thể hiện trong bảng 1.2 – PL1

Nhận xét: Kết quả cho thấy tại bước sóng 360 nm, mẫu placebo có tỷ lệ độ hấp

thụ so với mẫu thử nhỏ hơn 1%, chứng tỏ tá dược không ảnh hưởng tới độ hấp thụ quang của rutin ở bước sóng 360 nm

Kết luận: Có thể sử dụng phương pháp đo quang ở bước sóng 360 nm để định

lượng rutin trong quá trình nghiên cứu sàng lọc và xây dựng công thức bào chế

3.1.1.2 Phương pháp HPLC a Tính thích hợp hệ thống

Tiến hành sắc ký 6 lần dung dịch rutin chuẩn có nồng độ 500 µg/ml, kết quả thể hiện trong bảng 1.3 – PL1

Nhận xét: Độ lệch chuẩn tương đối RSD của diện tích peak và thời gian lưu

của 6 lần tiêm mẫu dưới 2%

b Tính đặc hiệu

Thời gian lưu của dung dịch trắng, dung dịch placebo, dung dịch chuẩn, dung dịch thử được thể hiện trong bảng 1.4 – PL1

26

Nhận xét: Kết quả cho thấy các mẫu trắng, placebo không có peak tại thời gian

lưu của peak rutin trong dung dịch chuẩn và dung dịch thử, cho thấy phương pháp có tính đặc hiệu cao

c Khoảng nồng độ tuyến tính

Để khảo sát sự tuyến tính giữa nồng độ rutin và diện tích peak, các dung chuẩn có nồng độ 5 – 500 µg/ml được chuẩn bị và tiêm sắc ký Kết quả thể hiện trong bảng 1.5 và hình 1.2 – PL1

Nhận xét: Giá trị R2 = 0,9992 (>0,99) cho thấy trong khoảng nồng độ khảo sát có sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ rutin trong mẫu chuẩn với diện tích peak Khoảng tuyến tính này phù hợp để định lượng rutin trong các tá dược, dung dịch vi nhũ tương Do đó, nồng độ rutin trong mẫu thử có thể được xác định bằng cách so sánh với đường chuẩn có nồng độ trong khoảng 5 – 500 µg/ml

d Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)

Bằng phương pháp dựa vào tỷ số giữa tín hiệu (S) và nhiễu (N) đã xác định được giới hạn phát hiện của phương pháp LOD = 0.05 μg/ml và giới hạn định lượng của phương pháp LOQ = 0.165 μg/ml

3.1.2 Đánh giá đặc tính của rutin nguyên liệu

3.1.2.1 Định lượng hàm lượng rutin trong nguyên liệu

Tiến hành định lượng hàm lượng rutin bằng phương pháp HPLC như đã mô tả ở mục 2.2.1.1.b Kết quả hàm lượng rutin trong nguyên liệu là 95,4%

3.1.2.2 Một số đặc tính của rutin nguyên liệu a Một số đặc tính vật lý của bột rutin nguyên liệu

Bảng 3.1 Một số đặc tính vật lý của rutin nguyên liệu

2 Phân bố kích thước Hạt có kích thước trung bình là 125µm,

trong đó: Dv(10) = 7,94 µm; Dv(50) = 80,8 µm; Dv(90) = 312 µm

3 Hình ảnh SEM Hình 1.11 – PL1 4 Mất khối lượng do làm khô 4,59% ± 0% 5 Điểm nóng chảy 174,7 – 192,8ºC

27 - Điểm nóng chảy của rutin nguyên liệu vào khoảng 174,7 – 192,8 ºC Nhiệt độ này khá gần với peak điểm thu nhiệt trên giản đồ DSC và cũng khá tương đồng với nghiên cứu trước đó [63]

b Độ tan trong các môi trường pH khác nhau

Độ tan của rutin trong các môi trường được thể hiện trong bảng 1.6 – PL1

Nhận xét: Độ tan của rutin tăng dần theo giá trị pH của dung dịch, rutin tan tốt

trong kiềm loãng và kém tan trong dung dịch có pH acid Một số nghiên cứu trước đó cũng chỉ ra điều tương tự [66] điều này có thể giải thích do sự thay đổi tính phân cực của rutin khi thay đổi pH, ở pH kiềm rutin phân cực và ưa nước hơn và ngược lại, trong điều kiện pH acid rutin tồn tại chủ yếu ở dạng phân tử và kém tan hơn [67] Dựa vào kết quả này có thể chọn lựa môi trường thử độ hoà tan của các chế phẩm chứa rutin hoặc chọn lựa pH thích hợp cho các dạng bào chế khác nhau

Giản đồ phân tích nhiệt quét vi sai (DSC) cho thấy bột rutin nguyên liệu có peak thu nhiệt ở khoảng 183 – 194ºC là điểm nóng chảy của rutin nguyên liệu [65], [2]

Ở phổ nhiễu xạ tia X cho thấy rutin nguyên liệu có nhiều pic nhiễu xạ, các đỉnh pic đặc trưng tại các vị trí (12,369º; 8,534º; 5,950º; 4,033º; 3,404º; 3,336º) giống với phổ nhiễu xạ tia X của rutin chuẩn, chứng tỏ rutin nguyên liệu có độ tinh khiết cao

Kết luận: Rutin nguyên liệu tồn tại ở trạng thái tinh thể

d Tính hút ẩm

Tiến hành đánh giá tính hút ẩm của bột rutin nguyên liệu theo phương pháp đã nêu ở mục 2.2.1.2b

Kết quả độ hút ẩm của bột rutin nguyên liệu được thể hiện ở bảng 1.7 – PL1

Nhận xét: Bột khô rutin nguyên liệu khá hút ẩm, chỉ sau khoảng 4 giờ hàm ẩm

trong nguyên liệu đã tăng lên hơn 10,19% sau 24 giờ tăng nhẹ lên 14,48 % Tính hút ẩm có vai trò quan trọng trong độ ổn định vật lý và hoá học của rutin nguyên liệu như tốc độ hoà tan trong các tá dược, phân huỷ hoá học… Ngoài ra còn có thể ảnh hưởng đến độ ổn định vật lý của hệ tự nhũ hoá bào chế được Vì vậy trong quá trình bào chế và bảo quản cần chú ý đến độ ẩm của môi trường

28

3.1.2.3 Độ ổn định của rutin a Trong dung dịch

Tiến hành đánh giá độ ổn định của rutin trong dung dịch theo phương pháp đã nêu ở mục 2.2.1.2c Kết quả được thể hiện trong bảng 1.8 và hình 1.10 – PL1

Nhận xét: rutin bền trong các môi trường nước, đệm phosphat pH 4,5 và đệm

phosphat pH 6,8 trong 24 giờ Sau 7 ngày, rutin chỉ ổn định trong dung dịch nước, đệm phosphat pH 4,5 và đệm phosphat pH 6,8 còn trong các môi trường HCl 1N (pH 1,2), NaOH 1N và peroxyd 3% rutin bị phân huỷ khá đáng kể Sau 14 ngày, rutin bị phân huỷ hoàn toàn trong tất cả môi trường Dễ dàng nhận thấy ở môi trường acid rutin kém bền, bị phân huỷ nhanh sau 1 giờ chỉ còn 76,33%, sau 24 giờ còn 50% và hầu như bị phân huỷ hết sau 168 h Trong môi trường kiềm NaOH 1N, nồng độ rutin giảm dần trong 24 giờ chỉ còn 62,50% và phân huỷ hết sau 2 tuần Điều này có thể giải thích do xảy ra phản ứng proton hoá nhóm OH phenol của rutin bị kiềm phân huỷ thành acid phenolic dẫn đến sự giảm nồng độ của rutin [66] Ở trong môi trường peroxyd 3%, nồng độ rutin giảm chậm trong 1 tuần có thể giải thích do rutin bị peroxyd oxy hoá một phần, tuy nhiên flavonoid tự nhiên có khả năng loại bỏ oxy hoạt động mạnh mẽ với cơ chế tương tự acid ascorbic và alpha-tocopherol [7], nên peroxyd trong dung dịch bị loại đi khiến nồng độ rutin sau không thay đổi nhiều trong 7 ngày

Từ kết quả nghiên cứu độ ổn định, cần tránh phối hợp trong môi trường nước do kém ổn định, và tránh phối hợp với các tá dược có tính acid hoặc kiềm mạnh, trong quá trình bào chế nên hoà tan/phân tán trong các tá dược dầu hoặc trong các hệ chất mang ổn định hơn

b Trạng thái rắn

Kết quả hàm lượng của rutin so với ban đầu trong các điều kiện khác nhau được thể hiện trong bảng 1.9 – PL1 và phổ nhiễu xạ tia X, giản đồ nhiệt DSC của các mẫu rutin được thể hiện trong hình 1.12 và 1.13 – PL1

Nhận xét:

Trong các điều kiện bị tác động nhiệt độ dưới 105ºC, hàm ẩm cao và ánh sáng UV thì rutin nguyên liệu không thay đổi trạng thái kết tinh thể hiện qua hình ảnh phổ nhiễu xạ tia X Kết quả định lượng cho thấy hàm lượng rutin nguyên liệu thay đổi không nhiều khi nhiệt độ thấp (≤ 40ºC), ở nhiệt độ 80ºC hàm lượng rutin giảm khoảng còn 86,79% sau 1 tuần, ở nhiệt độ 105ºC hàm lượng rutin giảm còn 86,02% sau 4 ngày Giản đồ nhiệt DSC của các mẫu trừ mẫu bảo quản ở điều kiện 105ºC đều không xuất hiện peak lạ cho thấy ở nhiệt độ thấp hơn 80ºC rutin khá ổn định ở trạng thái rắn Ở mẫu rutin trong điều kiện 105ºC, mặc dù các đỉnh tinh thể đặc trưng trong phổ nhiễu xạ tia X không có sự thay đổi so với rutin nguyên liệu, nhưng ở giản đồ nhiệt DSC pic thu nhiệt có sự dịch chuyển lớn so với rutin nguyên liệu (giảm từ 183-194ºC xuống

29 còn 38-42ºC) Vậy để đánh giá chắc chắn xem rutin ở nhiệt độ này có sự biến đổi về mặt hoá học hay không nên có thêm các phương pháp đánh giá như phổ FTIR để quan sát đáp ứng của các nhóm chức dưới bức xạ tia hồng ngoại

Với kết quả nghiên cứu thu được, trong quá trình nghiên cứu bào chế cần chú ý kiểm soát điều kiện nhiệt độ không quá 80 oC

3.1.2.4 Hệ số phân bố dầu nước

Tiến hành theo phương pháp đã mô tả ở mục 2.2.1.2.d Kết quả được thể hiện trong bảng 3.2 dưới đây

Bảng 3.2 Hệ số phân bố dầu nước của rutin

lLog P -1,2525 -1,0273 -0,1332 -1,1377 0,1127

Nhận xét: Hệ số phân bố dầu nước của rutin nguyên liệu có giá trị log P =

-1,1373 ± 0,1127 Như vậy, với log P < 1,72 rutin được phân loại thuộc nhóm thấm kém [31]

3.2 Kết quả nghiên cứu xây dựng công thức bào chế hệ tự nhũ hoá chứa rutin

3.2.1 Kết quả lựa chọn tá dược và xây dựng giản đồ pha xác định vùng hình thành nano nhũ tương

3.2.1.1 Độ tan bão hoà của rutin trong các tá dược dầu, chất diện hoạt và chất đồng diện hoạt

Để lựa chọn được loại tá dược dầu, chất diện hoạt và chất đồng diện hoạt, cần thiết phải đánh giá độ hòa tan bão hóa của dược chất trong các tá dược làm cơ sở lựa chọn loại tá dược dầu, chất diện hoạt, chất đồng diện hoạt phù hợp mang được lượng dược chất cần thiết trong hệ Tiến hành xác định độ tan của rutin trong các tá dược: acid oleic, Transcutol, Span 80, Labrafil, PEG 80, Tween 80, Cremophor, Capryol 90, PEG 400, Acrysol, Capmul MCM EP, dầu parafin, ethanol tuyệt đối, Lauroglycol 90, Plurol oleique CC 497, Carbitol

Kết quả độ tan của rutin trong các tá dược được trình bày trong bảng 2.1 – PL2 và hình 3.1 dưới đây

Nhận xét: Trong nhóm tá dược thân dầu, độ tan của rutin trong Capryol 90 là

lớn nhất Trong số nhóm tá dược chất diện hoạt, độ tan của rutin trong Cremophor RH 40 và Tween 80 là lớn nhất Trong nhóm tá dược đồng dung môi, độ tan của rutin trong PEG 400 và Transcutol CG là lớn nhất

Kết luận: Sau khi sàng lọc, tá dược được lựa chọn để đánh giá khả năng tương

hợp với hoạt chất là: - Dầu: Capryol 90 - Chất diện hoạt: Tween 80, Cremophor RH 40 - Đồng dung môi: Transcutol CG, PEG 400

3.2.1.2 Kết quả nghiên cứu đánh giá tương hợp giữa hoạt chất và tá dược

Khi phối hợp hoạt chất với tá dược cần quan tâm đến độ ổn định của hoạt chất trong các tá dược đó Nhờ vậy, có thể lựa chọn được hệ SEDDS có thể mang hoạt chất ổn định nhất Tá dược được gọi là tương hợp với hoạt chất khi kết quả định lượng hoạt chất trong khoảng thời gian khảo sát nằm trong khoảng 95-105% so với hàm lượng ban đầu Tiến hành đánh giá tương hợp của rutin trong các tá dược Capryol 90, Cremophor RH40, Tween 80, Transcutol CG và PEG 400 theo phương pháp mô tả ở mục 2.2.2.1.b

v Độ ổn định của rutin trong tá dược ở điều kiện thường

0.000.050.100.150.20Acid oleic

ParafinCapryol 90Dầu hướng dươngDầu đậu nànhDầu oliu

Độ tan (mg/ml)

Span 80Tween 80Cremophor RH 40AcrysolLabrafil M 1994 CSCapmul MCM EP

Độ tan (mg/ml)

Lauroglycol 90Plurol oleique CC 497

PEG 80PEG 400EtOHCarbiolTranscutol CG

Độ tan (mg/ml)