trương thị phương anh nghiên cứu bào chế và đánh giá độ ổn định của hỗn dịch nano lipid retinyl palmitat

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRƯƠNG THỊ PHƯƠNG ANH

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ VÀ ĐÁNH GIÁ ĐỘ ỔN ĐỊNH CỦA HỖN DỊCH NANO

LIPID RETINYL PALMITAT

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2024

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRƯƠNG THỊ PHƯƠNG ANH

HÀ NỘI – 2024

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, em xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS TS Trần Thị

Hải Yến - người thầy đã quan tâm, giúp đỡ và kiên nhẫn chỉ bảo em trong thời gian

nghiên cứu khoa học cũng như thực hiện đề tài khóa luận

Em xin chân thành cảm ơn TS Phạm Lê Minh – người thầy đã tận tình hỗ trợ

em, đưa ra những lời khuyên và giải đáp các thắc mắc, khó khăn mà em gặp phải trong quá trình nghiên cứu

Em xin được gửi lời cảm ơn đến các thầy cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên bộ môn Bào chế, các thầy cô tại Khoa Hoá phân tích và kiểm nghiệm thuốc, Viện Công

nghệ Dược phẩm và Khoa Dược lý - Trường Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ và tạo

nhiều điều kiện thuận lợi để em hoàn thành khóa luận này

Em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu nhà trường và các thầy cô Trường Đại học Dược Hà Nội đã truyền đạt cho em những kiến thức quý báu trong suốt 5 năm học tập tại trường

Xin chân thành cảm ơn các anh, chị, các bạn sinh viên nghiên cứu tại bộ môn Bào chế và Viện Công nghệ Dược phẩm, đặc biệt là em Nguyễn Ngọc Bích đã luôn đồng hành và giúp đỡ em trong quá trình làm khóa luận

Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, cảm ơn những người anh, chị, em, người bạn đã ủng hộ, quan tâm, động viên, giúp đỡ em trong cuộc sống và học tập, giúp em có thêm động lực để học tập, rèn luyện và nghiên cứu tại Trường Đại học Dược Hà Nội

Em rất mong nhận được những nhận xét và góp ý của quý thầy cô để khóa luận có thể được hoàn thiện hơn

Hà Nội, ngày 31 tháng 05 năm 2024

Sinh viên

Trương Thị Phương Anh

MỤC LỤC MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về retinyl palmitat 2

1.1.1 Công thức hóa học, danh pháp 2

1.1.2 Tính chất vật lí, hóa học 2

1.1.3 Độ ổn định 2

1.1.4 Phân bố và chuyển hóa retinyl palmitat trong da 3

1.1.5 Tác dụng của retinyl palmitat trên da 4

1.2 Tổng quan về hệ tiểu phân nano lipid 4

1.2.1 Giới thiệu chung về hệ tiểu phân nano lipid 4

1.2.2 Thành phần 5

1.2.3 Phân loại 6

1.2.4 Phương pháp bào chế 7

1.2.5 Độ ổn định vật lý của hệ tiểu phân nano lipid và các yếu tố ảnh hưởng 9

1.2.6 Một số biện pháp đánh giá đặc tính hệ tiểu phân nano lipid 10

1.3 Ứng dụng hệ tiểu phân nano lipid trong mỹ phẩm 11

1.4 Một số nghiên cứu về hệ tiểu phân nano lipid chứa retinyl palmitat và đánh giá độ ổn định của hỗn dịch nano lipid 12

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2.1 Đối tượng nghiên cứu 14

2.2 Hóa chất, thiết bị và động vật thí nghiệm 14

2.2.1 Hóa chất và nguyên liệu 14

2.2.2 Thiết bị 14

2.3 Nội dung nghiên cứu 15

2.4 Phương pháp nghiên cứu 15

2.4.1 Phương pháp bào chế NLC-RP bằng phương pháp đồng nhất hóa nhờ lực phân cắt lớn kết hợp siêu âm 15

2.4.2 Phương pháp định lượng retinyl palmitat 17

2.4.3 Phương pháp đánh giá một số đặc tính của hỗn dịch NLC-RP 17

2.4.4 Phương pháp đánh giá độ ổn định của hỗn dịch NLC-RP 19

2.4.5 Ứng dụng hệ NLC-RP trong mỹ phẩm - chế phẩm serum gel 19

2.4.6 Phương pháp xử lý số liệu 22

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 23

3.1 Thẩm tra độ tuyến tính của phương pháp định lượng 23

3.1.1 Xác định điểm hấp thụ cực đại 23

3.1.2 Xây dựng đường chuẩn 23

3.2 Khảo sát thông số kĩ thuật và công thức bào chế tiểu phân NLC-RP 23

3.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của các thông số kĩ thuật 23

3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố công thức 26

3.3 Đánh giá hình thái tiểu phân trong hỗn dịch NLC-RP 32

3.4 Đánh giá độ ổn định của hỗn dịch NLC-RP 32

3.4.1 Hình thức 33

3.4.2 KTTP, PDI, thế zeta 33

3.4.3 Phần trăm retinyl palmitat còn lại trong hỗn dịch và hiệu suất nạp 34

3.5 Bào chế serum gel chứa hệ NLC-RP 34

3.5.1 Đánh giá ảnh hưởng của tá dược polymer đến một số tính chất vật lý 35

3.5.2 Ảnh hưởng của tá dược polymer đến khả năng thấm và lưu trữ trong da 38

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

CP Cetyl palmitat

EE Hiệu suất nạp dược chất (Entrapment efficiency)

EP Dược điển Châu Âu (European Pharmacopoeia)

Microscope)

HEC Hydroxyethyl cellulose

LC Khả năng nạp dược chất (Loading capacity)

NLC Hệ mang lipid cấu trúc nano (Nanostructured lipid carrier)

RH Độ ẩm tương đối (Relative humidity)

RP Retinyl palmitat

SLN Hệ tiểu phân nano lipid rắn (Solid lipid nanoparticles)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Một số tá dược dùng cho bào chế nano lipid 6

Bảng 1.2 Một số sản phẩm mỹ phẩm trên thị trường chứa hệ tiểu phân nano lipid 11

Bảng 2.1 Hóa chất và nguyên liệu thí nghiệm 14

Bảng 2.2 Thiết bị thí nghiệm 14

Bảng 2.3 Các thành phần và vai trò trong công thức bào chế NLC-RP 15

Bảng 2.4 Chỉ tiêu và phương pháp đánh giá độ ổn định hỗn dịch NLC-RP 19

Bảng 2.5 Công thức serum gel chứa hệ NLC-RP 20

Bảng 3.1 Độ hấp thụ quang của retinyl palmitat theo nồng độ tại bước sóng 325nm 23 Bảng 3.2 Công thức khảo sát thông số kĩ thuật 24

Bảng 3.8 KTTP, PDI, thế zeta của S3 và S10 sau 1, 7, 14 ngày (n=3, TB ± SD) 28

Bảng 3.9 Thành phần công thức khảo sát nồng độ chất diện hoạt 29

Bảng 3.15 Tỉ lệ tá dược polymer trong các công thức serum gel 35

Bảng 3.16 Kết quả đánh giá cảm quan, độ đồng nhất của các công thức serum gel 35

Bảng 3.17 pH của các công thức serum F2, F6, F10 (n = 3, TB ± SD) 36

Bảng 3.18 KTTP, PDI và thế zeta của hỗn dịch NLC-RP S13, serum gel F2, F6, F10 (n = 3, TB ± SD) 37

Bảng 3.19 Lượng dược chất thấm và lưu trữ trong da của các serum F2, F6, F10 (n = 3, TB ± SD) 38

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Cấu trúc phân tử của retinyl palmitat 2

Hình 1.2 Con đường chuyển hóa của retinyl palmitat 3

Hình 1.3 Phân loại hệ NLC theo cấu trúc khung xốp lipid 6

Hình 1.4 Quy trình bào chế hệ tiểu phân nano lipid bằng phương pháp đồng nhất hóa kết hợp siêu âm 7

Hình 2.1 Sơ đồ tóm tắt các giai đoạn bào chế NLC-RP 16

Hình 3.1 Đồ thị biểu diễn độ hấp thụ quang của retinyl palmitat theo nồng độ 23

Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn KTTP và PDI của S1, S2, S3 (n=3, TB± SD) 24

Hình 3.3 Đồ thị biểu diễn KTTP và PDI của S4, S3, S5 (n=3, TB± SD) 25

Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn KTTP, PDI của S6, S7, S3, S8 (n=3, TB ± SD) 26

Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn KTTP và PDI của S4, S5, S6 (n=3, TB± SD) 27

Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn KTTP, PDI và thế zeta của S3, S10 sau 1,7,14 ngày (n=3, TB± SD) 28

Hình 3.7 Đồ thị biểu diễn KTTP và PDI của S12, S10, S13, S14 (n=3, TB± SD) 29

Hình 3.8 Đồ thị biểu diễn KTTP và PDI của S15, S16, S13, S17 (n=3, TB± SD) 31

Hình 3.9 Ảnh chụp FESEM của tiểu phân NLC-RP 32

Hình 3.10 Hình thức hỗn dịch NLC-RP ở các thời điểm khảo sát 33

Hình 3.11 Đồ thị biểu diễn độ nhớt theo tốc độ trượt của các công thức serum gel 36

Hình 3.12 Đồ thị biểu diễn KTTP, PDI và thế zeta của hỗn dịch NLC-RP S13, serum gel F2, F6, F10 (n = 3, TB ± SD) 37

Hình 3.13 Đồ thị biểu diễn lượng dược chất thấm và lưu trữ trên da của các serum F2, F6, F10 (n = 3, TB ± SD) 38

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Các dẫn xuất của vitamin A (retinoids) là nhóm chất được ứng dụng rộng rãi trong mỹ phẩm và dược mỹ phẩm với nhiều công dụng như chống lão hóa da, giúp da mau lành thương tổn, bảo vệ da trước tia UVB, …[44] Trong nhóm này, retinyl palmitat được ưa chuộng hơn cả nhờ sự bền vững và khả năng gây kích ứng thấp hơn các dẫn xuất khác [26], [36] Tuy nhiên, retinyl palmitat có nhược điểm là trọng lượng phân tử lớn (524,9 g/mol) và đặc tính rất thân dầu (log P=15,51) nên khó thấm vào da Cấu trúc mặc dù đã được ester hóa nhưng vẫn có thể bị oxy hóa, đồng phân hóa, phân hủy và gây kích ứng cho da [28], [36]

Để khắc phục những nhược điểm trên, một hướng nghiên cứu tiềm năng là bọc retinyl palmitat trong một hệ mang lipid cấu trúc nano (Nanostructured lipid carrier – NLC) Hệ NLC đã được chứng minh là có khả năng cải thiện độ ổn định hóa học của dược chất, tăng tính thấm dược chất qua da và giảm tác dụng không mong muốn Chúng bám dính và hình thành một lớp màng trên da, tăng hydrat hóa da và từ đó giúp hoạt chất có thể thấm sâu hơn vào da [13], [25], [42] Mặc dù có độ ổn định vật lý tốt hơn các hệ chất mang lipid khác, hệ NLC vẫn có thể bị giảm độ ổn định do hiện tượng kết tụ một phần của các tiểu phân trong quá trình bảo quản [38] Vì vậy, việc theo dõi và đánh giá độ ổn định của hệ là cần thiết để phát hiện những thay đổi về đặc tính lý hóa của hệ nếu có

Để bước đầu góp phần ứng dụng hệ tiểu phân nano lipid chứa retinyl palmitat

trong mỹ phẩm, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu bào chế và đánh giá độ ổn

định của hỗn dịch nano lipid retinyl palmitat” với các mục tiêu:

1 Bào chế được hỗn dịch nano lipid chứa retinyl palmitat 2 Đánh giá được độ ổn định của hỗn dịch nano lipid chứa retinyl palmitat 3 Ứng dụng được hệ nano lipid chứa retinyl palmitat trong chế phẩm serum gel

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1.Tổng quan về retinyl palmitat

1.1.1.Công thức hóa học, danh pháp

All-trans-retinyl palmitat là dẫn xuất ester của vitamin A, thuộc nhóm chất retinoids, được điều chế bằng cách ngưng tụ nhóm carboxy của acid palmitic với nhóm

hydroxy của all-trans-retinol (Hình 1.1)

Hình 1.1 Cấu trúc phân tử của retinyl palmitat

- Công thức phân tử: C36H60O2

- Danh pháp theo IUPAC: [(2E,4E,6E,8E)-3,7-dimethyl-9-(2,6,6-trimethyl

cyclohexen-1-yl)nona-2,4,6,8-tetraenyl] hexadecanoate - Tên gọi khác: vitamin A palmitat, retinol palmitat

cloroform, aceton), chất béo và dầu Không tan trong nước và glycerol [36] o Nhiệt độ nóng chảy: 27 – 29oC [36]

o Nhiệt độ sôi: 607,5oC (tại 760 mmHg) [36]

được sử dụng để tăng tính ổn định của RP [12], [18] Ngoài ra, pH môi trường cũng là một yếu tố ảnh hưởng đến độ ổn định Theo nghiên cứu của Carlotti và cộng sự, độ ổn định của RP trong môi trường gel pH 4,0 và 8,0 kém hơn so với gel pH 5,6 và 7,0 [12]

1.1.4 Phân bố và chuyển hóa retinyl palmitat trong da

Retinyl ester đi vào trong da sẽ được lưu trữ trong các tế bào trước khi tham gia các phản ứng chuyển hóa để duy trì nồng độ cân bằng của retinol trong da Nơi lưu trữ retinyl ester chưa được biết rõ, nhưng có một số chứng cứ cho thấy retinyl ester có thể được lưu trữ trong các giọt lipid trung tính trong tế bào chất Nghiên cứu của Takagawa và Hirosawa năm 1989 đã mô tả hiện tượng tích lũy retinyl palmitat trong các giọt lipid ở các nguyên bào sợi được nuôi cấy trong môi trường có nồng độ retinol tương đương với nồng độ retinol sinh lý trong tế bào [45], bên cạnh đó, sự có mặt của các giọt lipid trung tính trong tế bào keratin cũng đã được chứng minh [16]

Retinyl ester cần phải chuyển hóa thành acid retinoic để có tác dụng sinh học Con đường chuyển hóa diễn ra theo cơ chế oxy hóa, gồm ba giai đoạn như được mô tả ở hình 1.2

Hình 1.2 Con đường chuyển hóa của retinyl palmitat

Retinyl ester nội bào được huy động từ nơi lưu trữ và thủy phân bởi enzym retinyl ester hydrolase (REH) thành retinol [16] Phản ứng nghịch (ester hóa retinol) có thể xảy ra dưới sự xúc tác của enzym lecithin:retinol acyltransferase (LRAT) [21] Giai đoạn chuyển hóa retinol thành retinaldehyde được xúc tác bởi hai họ enzym cytoplasmic alcohol/retinol dehydrogenase (ADHs) hoặc microsomal retinol dehydrogenase (RDHs), cả hai đều phân bố ở lớp nền thuộc lớp thượng bì của da Sau đó, retinaldehyde được oxy hóa thành acid retinoic nhờ các enzym retinaldehyde dehydrogenase (RALDHs) Phản ứng chuyển retinol thành retinaldehyd có thể đảo ngược nhờ enzym RALR, nhưng phản ứng oxy hóa thành acid retinoic chỉ diễn ra theo một chiều [16]

1.1.5.Tác dụng của retinyl palmitat trên da

Tác dụng của các retinoids bôi trên da chủ yếu liên quan đến cơ chế điều hòa biểu hiện gen kích hoạt bởi acid retinoic gắn với thụ thể Các thụ thể này bao gồm nhóm thụ thể acid retinoic (RAR) và nhóm thụ thể retinoid X (RXR), có trên các tế bào keratin ở lớp thượng bì của da Việc kích hoạt chúng giúp điều chỉnh nhiều quá trình sinh học quan trọng của da như tăng sinh và biệt hóa tế bào, liền sẹo và lão hóa, từ đó dẫn đến retinoids dùng trên da có những tác dụng như làm lành vết thương và chống lão hóa Bên cạnh đó, có bằng chứng cho thấy retinyl palmitat có những tác dụng khác trên da mà không thông qua cơ chế trên, ví dụ tác dụng bảo vệ da khỏi tia UV [16], [44]

a Làm lành vết thương

Vitamin A giúp kích thích tái tạo biểu bì, tăng tốc độ quá trình đóng miệng vết thương và phục hồi cấu trúc biểu mô do acid retinoic ảnh hưởng đến sự sản xuất các cytokines, các chất xúc tác di chuyển tế bào keratin và các yếu tố tăng trưởng như TGF-β1 và IGF-1 – là các protein có chức năng kiểm soát sự phát triển, tăng sinh và biệt hóa tế bào Thêm vào đó, acid retinoic còn giúp tăng cường sản xuất các thành phần chất nền ngoại bào như collagen và fibronectin, đồng thời giảm thoái hóa chất nền metalloproteinase [16], [48], [49]

b Chống lão hóa

Acid retinoic có tác dụng chống lão hóa da do hoạt chất này kích thích sinh tổng hợp procollagen và ức chế tổng hợp enzym gây phân hủy collagen, đồng thời thúc đẩy sự tăng sinh và biệt hóa tế bào keratin lớp thượng bì, tăng sản xuất chất nền ngoại bào và tăng sinh mạch máu dưới da [36], [40]; do đó làm tăng độ dày lớp hạ bì và biểu bì,

tăng liên kết giữa các lớp da, góp phần làm giảm nếp nhăn và các biểu hiện lão hóa

c Bảo vệ da trước tia UV

Antille và cộng sự đã báo cáo rằng sử dụng 2% retinyl palmitat bôi trên da một lần mỗi ngày trong 2 ngày có khả năng bảo vệ da khỏi ban đỏ do tia UVB gây ra tương đương với một sản phẩm kem chống nắng có chỉ số SPF là 20 [9] Ngoài ra, retinyl palmitat còn được ứng dụng để bảo vệ ADN khỏi bị phá hủy bởi tia UVB Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng hiệu quả bảo vệ da của retinyl palmitat là do hấp thụ tia UV, không phải do tác dụng lên gen đáp ứng với retinoid [36]

1.2 Tổng quan về hệ tiểu phân nano lipid 1.2.1 Giới thiệu chung về hệ tiểu phân nano lipid

Đầu những năm 1990, nhóm nghiên cứu của Müller cùng cộng sự đã phát triển hệ tiểu phân nano lipid thế hệ thứ nhất gọi là hệ tiểu phân nano lipid rắn (Solid lipid nanoparticles – SLNs), có cấu trúc gồm phần lõi lipid rắn và lớp vỏ chất diện hoạt bao quanh lõi lipid SLN kết hợp các ưu điểm đồng thời khắc phục các nhược điểm của các

hệ mang thuốc sử dụng lipid truyền thống (nhũ tương, liposome) như độ ổn định, khả năng bảo vệ và dung hợp dược chất Tuy nhiên, hệ SLN vẫn gặp phải một số hạn chế như khả năng nạp dược chất không cao do độ tan của dược chất trong lipid rắn thấp, hiện tượng tống xuất dược chất ra khỏi hạt nano do sự biến đổi cấu trúc lipid trong quá trình bảo quản [3], [30]

Các hạn chế này đã dẫn đến việc nghiên cứu và phát triển hệ mang lipid cấu trúc nano (Nanostructured lipid carriers – NLCs) Việc sử dụng đồng thời lipid lỏng và lipid rắn tạo ra khung xốp lipid với nhiều vị trí trống để chứa dược chất, thêm vào đó khả năng hòa tan của dược chất trong lipid lỏng cao hơn lipid rắn giúp cải thiện hiệu suất nạp dược chất và hạn chế tình trạng đẩy dược chất ra khỏi tiểu phân, kiểm soát giải phóng dược chất tốt hơn NLC thể hiện tính ưu việt so với các hệ chất mang lipid khác như dễ sản xuất, độc tính thấp, khả năng nạp dược chất cao và ổn định về mặt vật lý, vì vậy được ứng dụng nhiều trong dược phẩm cũng như mỹ phẩm [3], [30]

1.2.2.Thành phần 1.2.2.1 Dược chất

Dược chất trong hệ nano lipid có thể là dược chất thân dầu hoặc dược chất thân nước Dễ dàng đưa dược chất thân dầu vào hệ nano do những chất này tan tốt trong lipid lỏng Với dược chất thân nước, việc bào chế hệ nano gặp khó khăn do dược chất bị phân tán lại vào pha nước dẫn đến hiệu suất nạp dược chất thấp, giải phóng dược chất nhanh

1.2.2.2 Lipid

Lipid là thành phần chính của hệ tiểu phân nano lipid, bao gồm lipid rắn và lipid lỏng, đóng vai trò là chất mang Thường sử dụng các loại lipid không độc với cơ thể và có cấu tạo gần giống với lipid sinh lý, ví dụ như các acid béo, glycerid, sáp, triglycerid mạch trung bình và các loại dầu lỏng khác [3], [38]

1.2.2.3 Chất diện hoạt

Chất diện hoạt có tính lưỡng thân nên sẽ hấp thụ lên bề mặt phân cách, làm giảm năng lượng tự do bề mặt và do đó làm giảm sức căng bề mặt giữa hai pha Chất diện hoạt đóng hai vai trò quan trọng trong quá trình hình thành hệ tiểu phân nano lipid, đó là tạo nhũ tương và ổn định các hạt nano lipid sau khi làm lạnh Phần lớn các nghiên cứu sử dụng các chất diện hoạt thân nước như các Polysorbate, Poloxamer,… tuy nhiên các chất diện hoạt thân dầu (Span) hay lưỡng tính (Lecithin) cũng được ứng dụng để bào chế hệ NLC [38]

Ngoài ra, hệ NLC còn có thể chứa các thành phần khác như các muối vô cơ, polymer anion, các chất biến đổi bề mặt như acid hyaluronic, polyethylene glycol và các dẫn xuất [3], [38]

Một số nguyên liệu thường sử dụng trong bào chế hệ tiểu phân nano lipid được trình bày trong bảng 1.1

Bảng 1.1 Một số tá dược dùng cho bào chế nano lipid

Lipid rắn

Tristearin, stearic acid, cetyl palmitat, Precirol® ATO 5, Compritol® 888 ATO, Dynasan® 116, Dynasan® 118, Softisan® 154, Cutina® CP, Imwitor® 900 P, Geleol®, Gelot® 64

Lipid lỏng

Tryglycerid mạch trung bình (MCT), oleic acid, squalene, isopropyl myristate,vitamin E, Transcutol® HP, Labrafil Lipofile® WL 1349, Labrafac® PG, Lauroglycol® FCC, Capryol® 90

Chất diện hoạt

Natri deoxycholate, natri glycocholate, natri oleate, Pluronic® F68, Pluronic® F127, các Tween, các Span, Brij 78, Myrj 52, Polyglycerol methyl glucose distearate, Lecithin, Phospholipon

Thành phần khác

- Muối vô cơ, polymer anion: mono-octyl phosphat, mono-decyl phosphat, natri hexadecyl phosphat, natri dextran sulphat

- Chất biến đổi bề mặt: acid hyaluronic, PEG, Poloxamer, Poloxamin và các dẫn xuất PEG khác

1.2.3.Phân loại

Dựa vào cấu trúc khung xốp lipid bên trong, NLC được chia làm ba loại [38]:

Hình 1.3 Phân loại hệ NLC theo cấu trúc khung xốp lipid [19]

a Loại I hay loại "tinh thể không hoàn hảo"

NLC loại I được cấu tạo bởi hỗn hợp lipid rắn – thường sử dụng hỗn hợp triglycerid của các acid béo bão hòa hoặc chưa bão hòa với chuỗi carbon dài – phối hợp với lượng nhỏ dầu Sự sắp xếp lộn xộn của các lipid rắn khác nhau tạo nên khung xốp lipid rắn với nhiều vùng khuyết lipid lỏng Các vùng khuyết là vị trí phù hợp để nạp dược chất thân dầu trong tiểu phân

b Loại II hay loại “vô định hình”

Các hạt nano lipid loại II tồn tại ở trạng thái rắn nhưng không kết tinh mà lõi lipid đông tụ ở trạng thái vô định hình Loại NLC này giảm thiểu sự tống xuất thuốc bằng cách duy trì tính đa hình của cấu trúc lipid Bào chế NLC loại II bằng cách trộn lipid rắn với một số lipid lỏng như hydroxyoctacosanylhydroxy stearat, isopropyl palmitat hay triglycerid mạch trung bình

c Loại III hay loại “nhũ tương kép”

NLC loại III là loại dầu trong lipid trong nước, được tạo thành từ hỗn hợp lipid lỏng phối hợp với một lượng vừa đủ lipid rắn Ở nhiệt độ cao, lipid rắn nóng chảy hòa trộn với dầu tạo pha lipid lỏng đồng nhất Khi để nguội hoặc làm lạnh, sự tách pha xảy ra, dẫn đến hình thành các ngăn nano dầu nhỏ trong khung xốp lipid rắn Dược chất được nạp vào các ngăn nano dầu cho phép kiểm soát giải phóng thuốc và ngăn ngừa rò rỉ thuốc

1.2.4.Phương pháp bào chế 1.2.4.1 Phương pháp đồng nhất hóa nhờ lực phân cắt lớn và siêu âm

a Nguyên tắc

Pha dầu đun chảy đã hòa tan hoạt chất được phối hợp từ từ vào pha nước chứa chất diện hoạt, đem đồng nhất hóa ở tốc độ cao để tạo thành nhũ tương sau đó siêu âm để giảm kích thước giọt Để nguội hoặc làm lạnh trong điều kiện phù hợp sẽ hình thành các tiểu phân nano lipid [3], [38] Hình 1.4 minh họa các bước trong quy trình bào chế hệ tiểu phân nano lipid bằng phương pháp này

Hình 1.4 Quy trình bào chế hệ tiểu phân nano lipid bằng phương pháp đồng nhất hóa

kết hợp siêu âm

b Ưu nhược điểm

Ưu điểm của phương pháp đồng nhất hóa nhờ lực phân cắt lớn và siêu âm là đơn giản, dễ thực hiện ở quy mô phòng thí nghiệm, tránh phải sử dụng dung môi hữu cơ và chất diện hoạt ở nồng độ cao [38] Các nghiên cứu thực hiện bởi các nhóm nghiên cứu khác nhau đã chỉ ra rằng việc kết hợp khuấy trộn và siêu âm ở nhiệt độ cao sẽ cho hệ tiểu phân ổn định hơn [27] Tuy nhiên phương pháp này có nhược điểm là tăng nguy cơ nhiễm tạp kim loại khi tăng thời gian siêu âm và tiểu phân được bào chế có phân bố KTTP rộng [38]

1.2.4.2.Một số phương pháp bào chế khác

a Đồng nhất hóa ở áp suất cao

Nguyên tắc: Trong thiết bị đồng nhất hóa áp suất cao, chất lỏng sẽ được đẩy qua

một khe hẹp kích thước vài micromet dưới áp suất 100 – 2000 bar Có hai kĩ thuật là đồng nhất hóa nóng và đồng nhất hóa lạnh, cả hai đều có bước chuẩn bị là đun chảy lipid rồi hòa tan hoặc phân tán dược chất vào pha dầu Sau đó, hỗn hợp dược chất – lipid được phân tán vào pha nước chứa chất diện hoạt ở cùng nhiệt độ, sau đó đem đồng nhất hóa ở áp suất cao

Phương pháp này có những ưu điểm như phân tán tiểu phân hiệu quả, bào chế được hệ có hàm lượng lipid cao và đặc biệt là dễ nâng cấp quy mô, do vậy được lựa chọn bởi nhiều nhóm nghiên cứu và công ty dược Nhược điểm là tốn nhiều năng lượng và tạo ra các tiểu phân có phân bố kích thước rộng, tính chất kết tinh phức tạp [3], [38]

b Nhũ hóa – khuếch tán dung môi

Nguyên tắc: Phương pháp này sử dụng các dung môi có thể tan một phần với

nước như ethyl acetat, alcol benzylic, butyl lactat Khi nhũ tương dầu/nước được trộn lẫn với một lượng thừa nước thì pha dầu sẽ hóa rắn do sự khuếch tán dung môi hữu cơ vào pha phân tán Dung môi được loại bỏ bằng phương pháp siêu lọc hoặc đông khô [47]

Phương pháp này cho tiểu phân nano lipid có kích thước nhỏ và chỉ số phân bố hẹp, nhưng nhược điểm là hàm lượng lipid thấp và có nguy cơ tồn dư dung môi hữu cơ gây độc tính [38]

c Nhũ hóa – bốc hơi dung môi

Nguyên tắc: Lipid và hoạt chất được hòa tan trong dung môi hữu cơ không đồng

tan với nước (cloroform, cyclohexan), sau đó được phân tán vào pha nước chứa chất nhũ hóa để tạo nhũ tương D/N Bốc hơi dung môi dưới áp suất giảm, lipid và hoạt chất kết tủa tạo thành lipid rắn [3]

Phương pháp này không có giai đoạn nào cần xử lý nhiệt nên thích hợp với các dược chất nhạy cảm với tác động của nhiệt, tuy nhiên chỉ bào chế được hệ có hàm lượng

lipid thấp, phải sử dụng dung môi hữu cơ và có thể gây ra kết tụ tiểu phân nếu không nhanh chóng bốc hơi dung môi [38]

Ngoài các phương pháp kể trên, hệ NLC còn được bào chế bằng các phương pháp khác như: phương pháp kết tủa do thay đổi dung môi, phương pháp đông tụ, phương pháp sử dụng dung môi siêu tới hạn, phương pháp nhiệt pha đảo, phương pháp tạo nhũ tương kép [3]

1.2.5 Độ ổn định vật lý của hệ tiểu phân nano lipid và các yếu tố ảnh hưởng

Hệ NLC có bản chất là hỗn dịch với pha phân tán là các hạt nano lipid trong môi trường phân tán là nước Vì vậy, độ ổn định vật lý của hệ liên quan tới những yếu tố ảnh hưởng đến độ ổn định vật lý của hỗn dịch

1.2.5.1 Điện thế bề mặt

Điện thế bề mặt đóng vai trò quan trọng trong việc đảm bảo độ ổn định của hệ theo cơ chế tĩnh điện do ảnh hưởng đến lực đẩy tĩnh điện giữa các tiểu phân [38] Tuy nhiên thực tế không xác định được giá trị của điện thế bề mặt mà chỉ có thể xác định được thế zeta – là điện thế chênh lệch giữa bề mặt trượt và lớp trung tính của môi trường phân tán Nếu thế zeta giảm xuống dưới một ngưỡng nào đó (phụ thuộc vào hệ cụ thể), lực hút giữa các tiểu phân sẽ vượt quá lực đẩy, khi đó các tiểu phân sẽ tiến gần và kết tụ với nhau Thế zeta bị ảnh hưởng bởi pH môi trường, nồng độ và hóa trị của các ion trong môi trường phân tán [3], [38]

1.2.5.2 Tính thấm của bề mặt tiểu phân

Để hỗn dịch được hình thành và ổn định về trạng thái phân tán, phải gây thấm cho các tiểu phân rắn để chúng phân tán đều vào môi trường lỏng và không kết tập lại với nhau Với hỗn dịch nano lipid, các chất diện hoạt trong công thức đóng vai trò là chất gây thấm, có tác dụng làm giảm góc tiếp xúc của dung môi và bề mặt tiểu phân, tăng tính thân nước bề mặt tiểu phân giúp giảm kết tụ Bên cạnh đó, các chất diện hoạt cả ion hóa và không ion hóa có thể tương tác với bề mặt tiểu phân và do đó ảnh hưởng đến độ lớn của thế zeta [1], [38]

1.2.5.3 Kích thước tiểu phân, tỷ trọng hai pha và độ nhớt môi trường phân tán

Ảnh hưởng của các yếu tố này ảnh hưởng đến tốc độ sa lắng (sedimentation) hoặc kết váng (creaming) của hỗn dịch được minh họa bởi hệ thức Stokes:

V = 2r

2(d1-d2)g9ηTrong đó V – vận tốc tách các tiểu phân pha phân tán khỏi môi trường phân tán, d1 – tỷ trọng của pha phân tán, d2 – tỷ trọng môi trường phân tán, r – bán kính tiểu phân, η – độ nhớt môi trường phân tán, g – gia tốc trọng trường

Hỗn dịch càng ổn định khi vận tốc tách các tiểu phân càng nhỏ, tức khi KTTP càng bé, chênh lệch tỷ trọng càng nhỏ và độ nhớt môi trường phân tán càng lớn [1]

1.2.6 Một số biện pháp đánh giá đặc tính hệ tiểu phân nano lipid 1.2.6.1 Hình thái

Hình thái bên ngoài của tiểu phân nano được quan sát bằng các kính hiển vi điện tử hiện đại như:

- Kính hiển vi điện tử quét (SEM): là một phương pháp để quan sát trực tiếp các tiểu phân nano, có khả năng phóng đại từ 10 – 300.000 lần, cung cấp thông tin về sắp xếp cấu trúc, phân bố không gian, hình ảnh bề mặt tiểu phân

- Kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM): cho hình ảnh rõ hơn SEM về hình thái, cấu trúc tinh thể, số lượng và hướng của tiểu phân

- Kính hiển vi lực nguyên tử (AFM): cung cấp các thông tin về hình thái, kích thước, kết cấu bề mặt của tiểu phân, có thể đánh giá trên một khoảng KTTP rộng và trong nhiều môi trường khác nhau [3]

1.2.6.2.Kích thước tiểu phân và chỉ số đa phân tán

Kích thước tiểu phân (KTTP) là một trong số những thông số cơ bản nhất của tiểu phân nano, là yếu tố quyết định khả năng phân bố và lưu giữ tiểu phân nano ở cơ quan đích, đồng thời là một thông số quan trọng trong đánh giá độ ổn định vật lý [38]

Phương pháp tán xạ ánh sáng động (Dynamic light scattering – DLS) là phương pháp phổ biến nhất để xác định KTTP và PDI Khi chiếu chùm tia laser vào hỗn dịch chứa các tiểu phân có kích thước khác nhau sẽ thu được mức độ tán xạ ánh sáng khác nhau KTTP được xác định bằng cách phân tích sự dao động của cường độ ánh sáng tán xạ Ngoài KTTP, phép đo này còn đưa ra kết quả về độ đồng nhất của phân bố KTTP, được biểu diễn bằng chỉ số đa phân tán (Polydispersity Index – PDI) PDI từ 0,1 đến 0,25 được coi là phân bố hẹp, trên 0,5 là phân bố rộng [3], [46]

1.2.6.3 Thế zeta

Thế zeta được định nghĩa là sự chênh lệch thế giữa lớp chất lỏng tĩnh liên kết với bề mặt tiểu phân và môi trường phân tán Trong thực nghiệm, hệ phân tán nano ổn định theo cơ chế tĩnh điện học có giá trị tuyệt đối của thế zeta nằm trong khoảng 30 đến 60 mV, còn với hệ tiểu phân được ổn định bởi cả hai cơ chế tĩnh điện học và cản trở không gian (steric) thì giá trị này lớn hơn 20 mV là chấp nhận được Giá trị tuyệt đối của thế zeta nhỏ hơn 5 mV thường dẫn đến các hiện tượng không bền [14], [46] Do đó, thế zeta là một công cụ quan trọng để phát hiện sự thay đổi đặc tính bề mặt của tiểu phân nano và giúp dự đoán độ ổn định của hệ

Nguyên tắc cơ bản của việc đo thế zeta dựa trên tần số chuyển động của hạt nano trong vùng điện trường quan sát được nhờ nhiễu xạ tia laser Khi đặt một điện trường lên hệ, tiểu phân sẽ di chuyển về phía điện cực trái dấu với vận tốc tỉ lệ với thế zeta [3]

1.2.6.4 Hiệu suất nạp và khả năng nạp dược chất

Hiệu suất nạp dược chất (EE) và khả năng nạp dược chất (LC) là các thông số quan trọng liên quan đến khả năng bao gói, bảo vệ dược chất của hệ cốt lipid và khả năng giải phóng dược chất khỏi hệ cốt EE và LC phụ thuộc vào độ tan của dược chất trong lipid, độ tan dược chất trong môi trường phân tán chứa chất diện hoạt, trạng thái kết tinh của lipid và quy trình bào chế hệ nano lipid [8]

Nguyên tắc của hầu hết các phương pháp đo hiệu suất nạp là tách các tiểu phân nano khỏi môi trường phân tán bằng một phương pháp tách vật lý và dựa trên việc định lượng phần dược chất tự do để xác định gián tiếp phần dược chất được nạp vào tiểu phân nano Các phương pháp tách thường được sử dụng là thẩm tích, siêu li tâm, lọc gel hay lọc màng [3]

1.2.6.5 Thành phần, tương tác hóa học và trạng thái kết tinh

Có thể sử dụng các phương pháp như phổ hồng ngoại, phương pháp phân tích nhiệt vi sai (DSC) hoặc phương pháp phổ nhiễu xạ tia X (XRD) [3]

1.3 Ứng dụng hệ tiểu phân nano lipid trong mỹ phẩm

Việc sử dụng hệ tiểu phân nano lipid trong các sản phẩm mỹ phẩm mang đến những ưu điểm như:

- Cải thiện độ ổn định hóa học cho hoạt chất, làm chậm quá trình phân hủy hoạt chất bằng các con đường quang hóa, thủy phân, oxy hóa [13]

- Giữ ẩm, hydrat hóa da do tạo thành lớp màng lipid trên bề mặt da, giúp ngăn mất nước qua da đồng thời củng cố hàng rào lipid tự nhiên của da [17] - Tăng khả năng thấm và lưu giữ dược chất trên da do có khả năng bám chặt trên

tế bào lớp sừng và tăng hydrat hóa da [17] - Kiểm soát giải phóng dược chất [13]

Một số sản phẩm mỹ phẩm lưu hành trên thị trường chứa hệ SLN hoặc NLC được liệt kê trong bảng 1.2

Bảng 1.2 Một số sản phẩm mỹ phẩm trên thị trường chứa hệ tiểu phân nano lipid [34]

Cutanova Cream Nano Repair Q10 Intensive Serum NanoRepair Q10 Cutanova Cream NanoVital Q10

Coenzym Q10, polypeptid

Dr Rimpler GmbHWedemark (Đức)

SURMER Crème Legère Nano-Protection SURMER Crème Riche Nano-Restructurante SURMER Elixir du Beauté Nano-Vitalisant

Dầu hạt Kukui, pseudopeptid, một số chiết xuất thực vật khác

Lancray International S.A Paris (Pháp) NanoLipid Restore CLR

Nanolipid Q10 CLR Nanolipid Basic CLR NanoLipid Repair CLR

Coenzym Q10, dầu hạt nho đen, dầu Manuka

Chemisches Laboratorium Dr Kurt Richter, (Đức)

IOPE SuperVital: Cream Serum, Eye cream Extra moist softener, Extra moist emulsion

Coenzym Q10, acid béo ω-3, ω-6

Amore Pacific Corp (Hàn Quốc) Swiss Cellular White Illuminating Eye Essence

Swiss Cellular White Intensive Ampoules

Glycoprotein, chiết xuất rễ Nhân sâm một số chiết xuất thực vật khác

Laboratoires La Prairie SA Zurich, (Thụy Sĩ)

Olivenol Anti Falten Pflegekonzentrat Olivenol Augenpflegebalsam

Dầu oliu, Panthenol, Tocopheryl Acetat Protein sữa thủy phân, Caffein

Dr Theiss Naturwaren GmbH, Homburg (Đức)

1.4 Một số nghiên cứu về hệ tiểu phân nano lipid chứa retinyl palmitat và đánh giá độ ổn định của hỗn dịch nano lipid

Năm 2014, Akram Pezeshki và cộng sự đã nghiên cứu bào chế hệ NLC chứa retinyl palmitat bằng phương pháp đồng nhất hóa nóng ở áp suất cao, sử dụng lipid rắn là Precirol ATO 5, lipid lỏng là octyl octanoate và chất diện hoạt là Poloxamer Nghiên cứu đã khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất diện hoạt đến KTTP, PDI, hiệu suất nạp và độ ổn định của hệ Các chỉ tiêu đánh giá độ ổn định là KTTP và hiệu suất nạp dược chất Kết quả cho thấy công thức sử dụng 6% Poloxamer cho KTTP nhỏ nhất (74 nm), phân bố kích thước tiểu phân hẹp (Span = 1,069), hiệu suất nạp hoạt chất lên đến 98,7% và ổn định ở 250C trong 60 ngày [31]

Vào năm 2018, Sham AlZahabi MSc và cộng sự đã nghiên cứu bào chế hệ NLC chứa retinyl palmitat và so sánh với hệ SLN sử dụng cùng lipid lỏng là dầu hạt xương rồng (prickly pear seed oil) và cùng phương pháp bào chế là đồng nhất hóa áp suất cao Các thông số đánh giá bao gồm KTTP, PDI, thế zeta, hiệu suất nạp hoạt chất, giải phóng

hoạt chất in vitro và khả năng thấm ex vivo Các công thức cũng được theo dõi độ ổn

định về KTTP và PDI trong 6 tuần Kết quả cho thấy, NLC thể hiện tính ưu việt hơn SLN ở tất cả các thông số Các tiểu phân NLC có KTTP khoảng 215–244 nm và PDI

<0,3 Thử nghiệm giải phóng hoạt chất in vitro cho thấy giải phóng hoạt chất của NLC

thấy các công thức có thể giải phóng từ 200–400 μg và lưu giữ trên da từ 0,5–1,25 μg hoạt chất sau 24h Công thức NLC tối ưu có KTTP và PDI lần lượt là 236,8 nm và 0,24 khi mới bào chế và 265,3 nm và 0,27 sau 6 tuần [7]

Năm 2019, Pedzisai A Makoni cùng cộng sự đã tiến hành nghiên cứu đánh giá độ ổn định ngắn hạn của hỗn dịch nano lipid (SLN và NLC) chứa Efavirenz (một hoạt chất kháng HIV), sử dụng tá dược lipid là glyceryl monostearat, Transcutol® HP và chất diện hoạt là Tween 80 Các thông số quy trình và công thức được tối ưu hóa bằng thiết kế thí nghiệm Box-Behnken Nghiên cứu độ ổn định được thực hiện trong 8 tuần ở các điều kiện 25°C/60% RH và 40 °C/75% RH, các chỉ tiêu đánh giá bao gồm KTTP, PDI, thế zeta và hiệu suất nạp Kết quả cho thấy công thức SLN và NLC tối ưu có kích thước nhỏ (< 100 nm), PDI < 0,5, |thế zeta| > 20 mV và hiệu suất nạp >90% Trong thời gian khảo sát, hỗn dịch nano lipid bảo quản ở 25°C/60% RH có KTTP và thế zeta tăng nhẹ, PDI hầu như không đổi, trong khi đó KTTP, thế zeta của hỗn dịch bảo quản ở 40°C/75% RH tăng mạnh đồng thời PDI thay đổi đáng kể Điều này có nghĩa là hỗn dịch nano lipid ổn định hơn ở điều kiện 25 °C/60% RH so với điều kiện 40°C/75% RH khi bảo quản trong 8 tuần [24]

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

- Hệ nano lipid chứa retinyl palmitat - Serum chứa hệ nano lipid retinyl palmitat 2.2 Hóa chất, thiết bị và động vật thí nghiệm

2.2.1 Hóa chất và nguyên liệu

Bảng 2.1 Hóa chất và nguyên liệu thí nghiệm

1 Retinyl palmitat 1 MIU/G DSM (Thụy Sĩ) EP 11 2 Cetyl palmitat CRODA (Anh) EP 11 3 Glyceryl monostearat Trung Quốc TCCS

5 Poloxamer 188 Trung Quốc TCCS 6 Cremophor RH40 Trung Quốc TCCS 7 Myrj™ S100 (PEG-100 stearat) CRODA (Anh) EP 11 8 Triglycerid mạch trung bình Trung Quốc TCCS 9 Ethanol 96% Việt Nam DĐVN V 10 Hydroxyethyl cellulose Hàn Quốc TCCS 11 Carbopol 934 Trung Quốc TCCS 12 Gôm xanthan Trung Quốc TCCS 13 Hydroxypropylmethyl cellulose E6 Trung Quốc TCCS

3 Máy đồng nhất hóa tốc độ cao Unidrive X1000 Đức 4 Máy đồng nhất hóa bằng siêu âm Qsonica Q500 Hoa Kỳ 5 Thiết bị phân tích kích thước Zetasizer nano ZS90 Malvern Anh 6 Máy li tâm lạnh tốc độ cao Hanil Supra R22 Anh 7 Máy quang phổ UV-Vis Hitachi U-5100 Nhật Bản 8 Máy đo FESEM S-4800 Hitachi Nhật Bản 9 Máy đo pH Mettler Toledo Đức 10 Bể siêu âm Wise Clean Hàn Quốc 11 Máy đo tính lưu biến Discovery Hybrid Rheometer HR10 Anh 12 Thiết bị đánh giá giải phóng qua màng Hanson Research Đức 13 Cân phân tích Satorius AG Gottingen Đức 14 Tủ sấy, tủ lạnh, cân kĩ thuật, nhiệt kế, các dụng cụ thủy tinh

và các dụng cụ khác

2.2.3 Động vật thí nghiệm

Chuột nhắt trắng chủng Swiss, khỏe mạnh, cân nặng từ 25-30g được nuôi trong phòng thí nghiệm Dược lý trường đại học Dược Hà Nội ở điều kiện phòng thí nghiệm trong 1 tuần trước khi tiến hành thực nghiệm, được cho ăn bằng thức ăn tiêu chuẩn và uống nước tự do

2.3 Nội dung nghiên cứu

- Bào chế hệ nano lipid chứa retinyl palmitat và đánh giá một số đặc tính của hệ nano lipid: hình thái, kích thước tiểu phân, chỉ số đa phân tán, thế zeta, hiệu suất nạp và khả năng nạp thuốc

- Đánh giá độ ổn định của hệ nano lipid chứa retinyl palmitat

- Ứng dụng hệ nano lipid retinyl palmitat trong chế phẩm serum gel và đánh giá ảnh

hưởng của tá dược polymer đến một số đặc tính của serum

2.4 Phương pháp nghiên cứu 2.4.1 Phương pháp bào chế NLC-RP bằng phương pháp đồng nhất hóa nhờ lực

phân cắt lớn kết hợp siêu âm

Tiến hành bào chế hỗn dịch NLC-RP bằng phương pháp đồng nhất hóa nhờ lực phân cắt lớn kết hợp siêu âm theo công thức và các bước như sau:

Bảng 2.3 Các thành phần và vai trò trong công thức bào chế NLC-RP

1 Retinyl palmitat RP Hoạt chất 2 Cetyl palmitat CP Lipid rắn 3 Glyceryl monostearate GMS Lipid rắn, chất ổn định

4 Triglycerid mạch trung bình MCT Lipid lỏng 5 Chất diện hoạt thân nước Chất ổn định 6 Nước tinh khiết Môi trường Mô tả các bước bào chế:

- Chuẩn bị pha lipid: cân các thành phần glyceryl monostearat, cetyl palmitat và triglycerid mạch trung bình theo công thức Đun nóng hỗn hợp ở nhiệt độ khoảng 70oC đến khi nóng chảy hoàn toàn thì thêm retinyl palmitat, khuấy từ nhẹ nhàng để thu được hỗn hợp đồng nhất

- Chuẩn bị pha nước: cân chất diện hoạt, hòa tan trong lượng nước tinh khiết theo công thức Đun nóng pha nước lên 75oC

- Tạo tiền nhũ tương: phối hợp từ từ pha lipid vào pha nước, đồng nhất hóa ở tốc độ 20000 rpm trong thời gian 10 phút bằng máy đồng nhất hóa tốc độ cao, kết hợp duy trì nhiệt độ ở 70 – 80oC

- Siêu âm tiền nhũ tương bằng siêu âm đầu dò với biên độ 40% trong 5 phút - Làm lạnh nhanh bằng cách ngâm trong nước đá trong 15 phút

- Sau khi hỗn dịch đã ổn định về nhiệt độ phòng, bổ sung nước tinh khiết bù vào phần đã bị bay hơi trong quá trình bào chế

Sơ đồ tóm tắt các giai đoạn:

2.4.2 Phương pháp định lượng retinyl palmitat

Định lượng retinyl palmitat bằng quang phổ hấp thụ UV-VIS với các điều kiện cụ thể tham khảo [4], kết hợp với điều chỉnh trong quá trình thực nghiệm

a Xác định bước sóng hấp thụ cực đại

Cân chính xác khoảng 18,18 mg hoạt chất (tương đương với khoảng 10 mg retinyl palmitat), hòa tan vào vừa đủ 100 ml ethanol 96%, thu được dung dịch chuẩn gốc có nồng độ 100 μg/ml Hút chính xác 1 ml dung dịch trên cho vào bình định mức 10 ml, định mức bằng ethanol 96% thu được dung dịch có nồng độ 10 μg/ml Tiến hành quét độ hấp thụ quang của dung dịch ở dải bước sóng từ 200-800 nm Từ đó xác định

được bước sóng hấp thụ cực đại của retinyl palmitat dựa vào hình ảnh quang phổ

b Xây dựng đường chuẩn

- Mẫu chuẩn: từ dung dịch chuẩn gốc ở trên, pha loãng bằng ethanol 96% thành các dung dịch chuẩn có nồng độ lần lượt là 4 μg/ml, 6 μg/ml, 8 μg/ml, 10 μg/ml,

12 μg/ml, 15 μg/ml - Mẫu trắng: ethanol 96%

Tiến hành đo độ hấp thụ quang của các dung dịch chuẩn và xây dựng đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa độ hấp thụ và nồng độ retinyl palmitat

2.4.3 Phương pháp đánh giá một số đặc tính của hỗn dịch NLC-RP 2.4.3.1 Đánh giá hình thức hỗn dịch NLC-RP

Yêu cầu: Hỗn dịch tạo thành có màu trắng ngà, đồng nhất và không có các tiểu

phân kích thước lớn quan sát được bằng mắt thường

2.4.3.2 Đánh giá kích thước tiểu phân (KTTP), chỉ số đa phân tán (PDI), thế zeta

a Đánh giá KTTP và PDI

Tiến hành: Pha loãng hỗn dịch NLC-RP bằng nước tinh khiết sao cho số lượng

photon được phát hiện mỗi giây (count rate) đạt giá trị 200–400 (Kcps) Tiến hành đo KTTP, chỉ số đa phân tán PDI của hỗn dịch trên thiết bị Zetasizer Nano ZS90 ở nhiệt độ 25 ± 2oC, góc đo 90o, sử dụng cuvet nhựa

Đánh giá kết quả: Zaverage, PDI Chỉ số Zaverage có giá trị tương đương với KTTP trung bình của mẫu khi giá trị PDI nhỏ (từ 0 đến 0,3) Khi PDI lớn (>0,5) thì chỉ số Zaverage không có ý nghĩa, cần dựa vào các pic trên đồ thị phân bố KTTP để so sánh kích

thước các mẫu

b Đánh giá thế zeta

Phân tán hỗn dịch thu được vào nước tinh khiết đến độ pha loãng thích hợp Tiến

hành đo thế zeta bằng thiết bị Zetasizer Nano ZS90 và cuvet đo thế zeta

2.4.3.3 Đánh giá hiệu suất nạp

a Phương pháp định lượng hoạt chất nạp trong NLC

Sử dụng phương pháp siêu li tâm để tách các tiểu phân nano khỏi môi trường phân tán và định lượng phần dược chất tự do để xác định gián tiếp phần dược chất được nano hóa

- Xác định lượng retinyl palmitat toàn phần trong hỗn dịch: o Mẫu thử: cân chính xác khoảng 0,5 g hỗn dịch NLC-RP, phân tán vào khoảng 40

ml ethanol, đun cách thủy ở khoảng 600C trong 30 phút để phá vỡ cấu trúc hệ nano, làm lạnh về nhiệt độ phòng, thêm ethanol vừa đủ 50 ml, làm lạnh ở nhiệt độ thấp để lipid tủa lại Tiến hành ly tâm ở 20000 vòng/phút trong 30 phút, hút lấy phần dịch trong, lọc qua màng 0,45 µm Pha loãng phần dịch lọc bằng ethanol 96% tới nồng độ thích hợp nằm trong khoảng 4-15 μg/ml, sau đó đem đo độ hấp thụ quang để tính toán kết quả dựa vào đường chuẩn đã xây dựng

o Mẫu trắng: ethanol 96% - Xác định lượng hoạt chất tự do:

o Mẫu thử: Cân chính xác khoảng 0,5 g hỗn dịch NLC-RP vào bình định mức 10ml, định mức bằng nước tinh khiết Đem hỗn dịch vừa pha loãng đi siêu li tâm ở tốc độ 20000 rpm trong 30 phút ở 20oC, sau đó đem lọc thô để loại các tiểu phân NLC chứa hoạt chất đã bị kết tụ Pha loãng phần dịch lọc bằng ethanol 96% tới nồng độ thích hợp nằm trong khoảng 4-15 μg/ml, sau đó đem đo độ hấp thụ quang để tính toán kết quả dựa vào đường chuẩn đã xây dựng

10 x 100%

- Hiệu suất nạp dược chất (EE) được tính theo công thức:

EE (%) =

mRP toàn phần - mRP tự domRP toàn phần x 100% - Khả năng nạp dược chất (LC) được tính theo công thức:

LC (%) =

mRP toàn phần - mRP tự domRP toàn phần+ mlipid x 100%

Trong đó: - mRP cân là khối lượng retinyl palmitat dùng để bào chế hỗn dịch (g)

- mmẫu là khối lượng mẫu đã lấy (g)

là khối lượng retinyl palmitat toàn phần trong mẫu (g)

- mRP tự do là khối lượng retinyl palmitat tự do (g)

- mlipid là tổng khối lượng tá dược lipid đã sử dụng (g)

2.4.3.4 Đánh giá hình thái tiểu phân NLC-RP

Sử dụng kính hiển vi điện tử quét trường phát xạ (FESEM)

Nguyên tắc: Trong cột chân không (p=1×10-7 Pa), các điện tử sơ cấp được tập trung lại và điều chỉnh hướng bằng các ống kính điện tử để tạo ra một chùm tia hẹp bắn phá vật liệu Tại các điểm bị bắn phá phát ra các điện tử thứ cấp Tốc độ và góc của các điện tử thứ cấp đại diện cho cấu trúc vật liệu được một dectector ghi lại và tạo thành một tín hiệu điện tử Tín hiệu này tiếp tục được khuếch đại và biến đổi thành hình ảnh quét hoặc một hình ảnh kỹ thuật số

Chuẩn bị mẫu: cho 1 giọt hỗn dịch NLC-RP lên đế carbon rồi đem sấy khô

trong tủ sấy chân không Mẫu sau đó được phủ một lớp Platin để tăng độ dẫn diện rồi đưa vào buồng chứa mẫu

2.4.4 Phương pháp đánh giá độ ổn định của hỗn dịch NLC-RP 2.4.4.1 Nguyên liệu thử

- Hỗn dịch NLC – RP được bảo quản trong lọ thủy tinh loại 1 có đậy nắp cao su, bọc kín bằng giấy nhôm

Bảng 2.4 Chỉ tiêu và phương pháp đánh giá độ ổn định hỗn dịch NLC-RP

Hình thức Cảm quan (mục 2.4.3.1) Kích thước tiểu phân, chỉ số đa phân tán

2.4.5 Ứng dụng hệ NLC-RP trong mỹ phẩm - chế phẩm serum gel

Hệ tiểu phân nano lipid ở dạng hỗn dịch lỏng không phù hợp để sử dụng trực tiếp trên da nên thường được đưa vào các dạng bào chế như kem, gel để tăng khả năng bám dính và lưu giữ [34] Ngoài hai dạng bào chế truyền thống trên, cũng đã có những nghiên