đỗ ngọc quang nghiên cứu bào chế hệ mang thuốc nano chứa andrographolid và đánh giá hoạt tính chống ung thư

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐỖ NGỌC QUANG

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ HỆ MANG

THUỐC NANO CHỨA ANDROGRAPHOLID VÀ ĐÁNH GIÁ

HOẠT TÍNH CHỐNG UNG THƯ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2024

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐỖ NGỌC QUANG

Mã sinh viên: 1901575

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ HỆ MANG

THUỐC NANO CHỨA ANDROGRAPHOLID VÀ ĐÁNH GIÁ

HOẠT TÍNH CHỐNG UNG THƯ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:

1 PGS TS Nguyễn Thạch Tùng 2 TS Dương Thị Thu Hiền

Nơi thực hiện:

1 Bộ môn Bào chế, Khoa BC - CNDP 2 Trường Dược, ĐH Sydney, Úc

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, em xin chân thành cảm ơn PGS TS Nguyễn Thạch Tùng, TS Dương Thị Thu Hiền và TS Ophelia Huang đã tận tình hướng dẫn, quan tâm, giúp đỡ em trong thời gian học tập, nghiên cứu, giúp em trang bị, tích luỹ những nền tảng kiến thức và kĩ năng cần thiết cho quá trình thực hiện khoá luận cũng như hoạt động nghiên cứu sau này

Em xin được cảm ơn tất cả các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên trong Bộ môn Bào chế đã luôn tạo điều kiện để em được thực hiện và hoàn thành khoá luận tại bộ môn Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu và các thầy cô Trường Đại học Dược Hà Nội đã truyền đạt cho em nhiều kiến thức quý báu trong suốt thời gian em học tập tại trường

Xin chân thành cảm ơn các bạn, các anh chị và các em trong nhóm nghiên cứu của thầy Thạch Tùng, đặc biệt là anh Dương Thế Khang, chị Đặng Thị Huế, bạn Phạm An Khánh, Nguyễn Thị Khánh Ly, Phí Quang Minh, Nguyễn Minh Trang, Đặng Thành Vinh và em Trần Thị Vân Giang đã luôn đồng hành, hỗ trợ em trong quá trình làm khoá luận Cuối cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình, bạn bè đã luôn sát cánh, quan tâm, động viên và giúp đỡ em trong suốt thời gian qua

Hà Nội, tháng 06 năm 2024

Sinh viên

Đỗ Ngọc Quang

MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG

1.2.4 Đặc điểm hấp thu của andrographolid 5

1.3 Tổng quan về tổng hợp polyme theo cơ chế gốc tự do 6

1.3.1 Trùng hợp qua trung gian nitroxid (NMP) 6

1.3.2 Trùng hợp gốc chuyển nguyên tử (ATRP) 8

1.3.3 Trùng hợp chuyển mạch thuận nghịch (RAFT Polymerization) 10

1.4 Tổng quan về micell polyme 12

1.4.1 Định nghĩa về micell polyme 12

1.4.2 Ưu nhược điểm của hệ micell polyme 13

1.4.3 Ứng dụng của micell polyme trong hệ phân phối thuốc 14

1.5 Tổng quan về vi nhũ tương 15

1.5.1 Định nghĩa vi nhũ tương 15

1.5.2 Thành phần của vi nhũ tương 15

1.5.3 Ưu nhược điểm của vi nhũ tương 15

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị 17

2.1.1 Nguyên vật liệu 17

2.1.2 Thiết bị 18

2.2 Nội dung nghiên cứu 19

2.2.3 Bào chế và đánh giá hệ micell polyme chứa andrographolid 19

2.2.4 Đánh giá hoạt tính chống ung thư thận trên tế bào nuôi cấy in vitro 19

2.3 Phương pháp nghiên cứu 19

2.3.1 Phương pháp bào chế 19

2.3.2 Phương pháp đánh giá 22

2.3.3 Phương pháp xử lý số liệu 24

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 25

3.1 Xây dựng phương pháp định lượng andrographolid 25

3.1.1 Thẩm định phương pháp định lượng andrographolid bằng quang phổ VIS 25

UV-3.1.2 Thẩm định phương pháp định lượng andrographolid bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao 25

3.2 Xây dựng công thức hệ micell polyme chứa andrographolid 27

3.2.1 Tổng hợp polyme POEGMA-b-PVBA 27

3.2.2 Ảnh hưởng của hàm lượng dược chất và lượng polyme tới kích thước hệ micell polyme 30

3.3 Xây dựng công thức hệ vi nhũ tương chứa andrographolid 32

3.3.1 Sàng lọc các loại tá dược cho công thức vi nhũ tương 32

3.3.2 Xây dựng giản đồ pha 33

3.3.3 Bào chế hệ vi nhũ tương chứa andrographolid 35

3.4 So sánh tác dụng chống ung thư thận trên tế bào nuôi cấy in vitro 36

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 39

Kết luận 39

Kiến nghị 40

TÀI LIỆU THAM KHẢO 41 PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Ý nghĩa

1H-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân - proton ADG Andrographolid

AIBN 2,2’-Azobisisobutyronitril APD Diode thu quang thác CĐDH Chất đồng diện hoạt

CDH Chất diện hoạt CMC Nồng độ tới hạn tạo micell COX-2 Cyclooxygenase-2

CPADB Acid 4-cyano-4-(phenylcarbonothioylthio)pentanoic CTA Tác nhân chuyển chuỗi

DĐVN V Dược Điển Việt Nam V DMSO Dimethyl sulfoxid

FBS Huyết thanh bào thai bò HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao

IC50 Liều gây ức chế 50% KLPT Khối lượng phân tử

KTG Kích thước giọt KTTP Kích thước tiểu phân

LC Lipid chuỗi dài MC Lipid chuỗi trung bình MTPT Môi trường phân tán OEGMA Oligo (ethylen glycol) methyl ether acrylat

P-gp P-glycoprotein PBS Đệm phosphat PEG Polyethylen glycol PLGA Acid poly(lactic-co-glycolic) RAFT Kỹ thuật chuyển mạch thuận nghịch RPMI Môi trường dinh dưỡng Roswell Park Memorial Institute

VBA 3-vinylbenzylaldehyd VNT Vi nhũ tương

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Một số nghiên cứu về ứng dụng micell polyme 14

Bảng 2.1 Các hoá chất sử dụng trong nghiên cứu 17

Bảng 2.2 Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 18

Bảng 3.1 Độ lặp lại và độ ổn định hệ thống của phương pháp phân tích 27

Bảng 3.2 Các công thức bào chế micell polyme chứa andrographolid 30

Bảng 3.3 KTTP và PDI của các mẫu bào chế micell polyme (n=3, TB±SD) 31

Bảng 3.4 Độ tan của andrographolid trong các tá dược (n = 3, TB ± SD) 32

Bảng 3.5 Diện tích vùng tạo thành vi nhũ tương ở các tỉ lệ Smix khác nhau 33

Bảng 3.6 Các công thức bào chế vi nhũ tương chứa andrographolid 35

Bảng 3.7 Kích thước giọt và PDI của các mẫu vi nhũ tương (n=3, TB±SD) 36

Bảng 3.8 Các mẫu chứa andrographolid được tiến hành thử độc tính trên tế bào Renca 36

Hình 1.7 Cấu trúc của tác nhân chuyển mạch (CTA) 11

Hình 1.8 Cấu trúc của micell polyme 13

Hình 3.1 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa mật độ quang và nồng độ ADG trong dung môi methanol 25

Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ ADG 26

Hình 3.3 Các giai đoạn tổng hợp polyme POEGMA-b-PVBA 27

Hình 3.4 Phổ 1H-NMR của tác nhân POEGMA macro-RAFT 28

Hình 3.5 Phổ 1H-NMR của polyme POEGMA-b-PVBA 28

Hình 3.6 Công thức phân tử của polyme POEGMA58-b-VBA12 29

Hình 3.7 Quá trình bao gói NO và gentamicin của polyme POEGMA-b-PVBA 30

Hình 3.8 Quá trình bao gói ADG của POEGMA-b-PVBA 30

Hình 3.9 KTTP và PDI của các mẫu bào chế micell polyme 31

Hình 3.10 Giản đồ pha ở các tỷ lệ Smix khác nhau 34

Hình 3.11 Kích thước giọt và PDI của các mẫu vi nhũ tương 35

Hình 3.12 Tỷ lệ tế bào Renca sống sót sau khi tiếp xúc với polyme và vi nhũ tương trắng 37Hình 3.13 Độc tính của các hệ nano chứa andrographolid với tế bào Renca sau 72h 37

ĐẶT VẤN ĐỀ

Andrographolid (ADG) (KLPT 350,4 g/mol) là thành phần có hoạt tính sinh học

chính trong cây Xuyên Tâm Liên (Andrographis paniculata Wall ex Nees, thuộc họ Ô

rô - Acanthaceae) đã được chứng minh là có hoạt tính ức chế một số loại ung thư trong các nghiên cứu tiền lâm sàng, bao gồm ung thư phổi, vú và ruột [40], [43], [48], [84], [90] Với những kết quả khả quan này, ADG có thể là một hợp chất triển vọng trong điều trị ung thư Trong đề tài này, chúng tôi tập trung vào nghiên cứu tác dụng của ADG với ung thư thận, một loại ung thư có tỷ lệ mắc cao và chưa có nghiên cứu nào công bố Tuy nhiên, việc sử dụng ADG còn hạn chế do hoạt chất này gặp vấn đề về độ tan, độ hoà tan, khả năng thấm, dẫn tới hiệu quả sử dụng tương đối thấp [98]

Trong thời gian gần đây, công nghệ nano đã thể hiện được tiềm năng to lớn trong việc cải thiện nhiều đặc tính của dược chất Các tiến bộ này bao gồm việc tăng độ tan và tốc độ hòa tan của dược chất ít tan, cải thiện sinh khả dụng của thuốc nói chung, bảo vệ dược chất khỏi sự phân hủy, tăng khả năng hướng đích và kiểm soát giải phóng dược chất khi được bao gói trong các chất mang thích hợp [3], [9], [33], [100]

Trong số các phương pháp bào chế tiểu phân nano, sử dụng tiểu phân nano dựa trên lipid và đặc biệt là hệ vi nhũ tương được đánh giá có hiệu quả tương đối cao, phù hợp với các phân tử kỵ nước như ADG do khả năng gia tăng độ tan và tính thấm của dược chất Điều này là nhờ sự kết hợp của lipid, chất diện hoạt, đồng dung môi, và tính tương thích sinh học cao của các thành phần này [21], [74] Ngoài ra gần đây, nhờ những tiến bộ về kỹ thuật trùng hợp, polyme cũng là một hệ chất mang nano tiềm năng bởi sự đa dạng về hình thái, kích thước cũng như sự linh hoạt trong cấu trúc hoá học cho phép tối ưu hoá cho từng hoạt chất có đặc tính lý hoá khác nhau [53], [69], [75] Do vậy, đề tài lựa chọn hai dạng bào chế là vi nhũ tương và micell polyme nhằm so sánh tiềm năng của hai dạng tiểu phân nano trong việc cải thiện độ tan của ADG, từ đó tăng tác dụng chống ung thư

Dựa trên cơ sở trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu bào chế hệ

mang thuốc nano chứa andrographolid và đánh giá hoạt tính chống ung thư” với

các mục tiêu: 1 Nghiên cứu bào chế và đánh giá các đặc tính của hệ micell polyme chứa

andrographolid 2 Nghiên cứu bào chế và đánh giá các đặc tính của hệ vi nhũ tương chứa

andrographolid 3 Đánh giá tác dụng chống ung thư thận của hai hệ mang thuốc nano chứa

andrographolid, so sánh với mẫu nguyên liệu

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về bệnh ung thư

1.1.1 Bệnh ung thư

Ung thư là một nhóm bệnh lý đặc trưng bởi sự phát triển không kiểm soát của các tế bào bất thường trong cơ thể Những tế bào này có khả năng xâm lấn vào các mô lân cận và lan rộng đến các phần khác của cơ thể qua hệ bạch huyết và mạch máu, quá trình này được gọi là di căn Ung thư có thể ảnh hưởng đến hầu hết các bộ phận của cơ thể và thường hình thành các khối u ác tính, khác với các khối u lành tính không lan rộng

Nguyên nhân gây bệnh ung thư thường phức tạp và do nhiều yếu tố Các yếu tố nguy cơ bao gồm di truyền, môi trường, lối sống và các yếu tố sinh học như virus và vi khuẩn Ví dụ, hút thuốc lá là nguyên nhân hàng đầu gây ung thư phổi, trong khi virus HPV có liên quan đến ung thư cổ tử cung Tiếp xúc với các chất gây ung thư như amiăng và bức xạ ion hóa cũng góp phần vào nguy cơ phát triển bệnh [94]

Ung thư là nguyên nhân hàng đầu gây tử vong toàn cầu, với khoảng 10 triệu ca tử vong mỗi năm [94] Các loại ung thư phổ biến nhất bao gồm ung thư vú, với 2,26 triệu ca, ung thư phổi với 2,21 triệu ca, ung thư đại trực tràng với 1,93 triệu ca, và ung thư tuyến tiền liệt với 1,41 triệu ca mắc mới mỗi năm, theo số liệu năm 2020 của WHO [94] Những loại ung thư này không chỉ phổ biến mà còn là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu, ung thư phổi dẫn đầu với 1,8 triệu ca tử vong, theo sau là ung thư đại trực tràng (916.000 ca tử vong) và ung thư gan (830.000 ca tử vong) [94]

1.1.2 Ung thư thận

Ung thư thận ghi nhận 430.000 ca mắc mới trong năm 2020 [93] Đây là loại ung thư phổ biến thứ 9 ở nam giới và phổ biến thứ 14 ở nữ giới Loại ung thư thận phổ biến nhất là ung thư tế bào thận (renal cell carcinoma - RCC), chiếm khoảng 85% tất cả các trường hợp Các loại ung thư thận khác bao gồm ung thư tế bào chuyển tiếp, ung thư tế bào sáng và ung thư sarcoma thận Các phương pháp điều trị ung thư thận đã có nhiều tiến bộ, phù hợp với từng giai đoạn và đặc điểm của khối u, bao gồm:

- Phẫu thuật: phương pháp được ưu tiên hàng đầu nếu có thể, cắt bán phần hoặc toàn bộ thận, tùy thuộc vào kích thước và vị trí của khối u

- Điều trị khối u không phẫu thuật: Đôi khi phẫu thuật không được chỉ định vì đặc điểm của khối u hoặc sức khỏe tổng thể của bệnh nhân Các phương pháp sau đây có thể được đề nghị thay thế bao gồm đốt sóng cao tần (RFA) - sử dụng kim đâm vào khối u và tiêu diệt bằng dòng điện hoặc liệu pháp áp lạnh

- Trị liệu nhắm đích: Sử dụng các chất ức chế yếu tố phát triển biểu mô mạch máu (VEGF) của khối u thận như axitinib, cabozantinib, pazopanib, sorafenib và sunitinib,…

- Liệu pháp miễn dịch: thông qua các interleukin và alpha-interferon FDA đã phê duyệt sự kết hợp của 2 chất ức chế điểm kiểm soát miễn dịch là nivolumab (Opdivo) và ipilimumab (Yervoy), cũng như một chất ức chế khác, pembrolizumab (Keytruda) để điều trị một số bệnh nhân mắc ung thư biểu mô tế bào thận tiến triển

1.1.3 Phương pháp điều trị ung thư

Trong các phương pháp điều trị, hoá trị liệu và điều trị bằng thuốc là phương pháp phổ biến nhất có trong phác đồ của hầu hết các loại ung thư Mặc dù đã có những tiến bộ trong phát triển thuốc chống ung thư, nhưng vẫn còn tồn tại nhiều thách thức Một vấn đề đáng quan ngại là gia tăng khả năng kháng thuốc, khi các tế bào ung thư thích nghi và trở nên kém đáp ứng với điều trị, làm cho các liệu pháp trở nên không hiệu quả theo thời gian Ngoài ra, nhiều loại thuốc chống ung thư gây ra các tác dụng phụ nghiêm trọng và độc tính, ảnh hưởng đến chất lượng cuộc sống và sức khỏe của bệnh nhân [58], [72], [83] Hơn nữa, chi phí cao của các loại thuốc chống ung thư hạn chế bệnh nhân tiếp cận điều trị cần thiết, đặc biệt là ở các quốc gia có thu nhập thấp và trung bình [60], [61], [88]

Giữa quá trình tìm kiếm các phương pháp điều trị hiệu quả, các hợp chất tự nhiên đã và đang thu hút sự chú ý vì những lợi ích trị liệu tiềm năng của chúng Một trong những hợp chất như vậy là andrographolid, một loại lactone diterpenoid hoạt tính sinh

học có nguồn gốc từ cây Xuyên Tâm Liên (Tên khoa học: Andrographis paniculata)

1.2 Tổng quan về andrographolid

1.2.1 Nguồn gốc và cấu trúc hoá học ADG là thành phần diterpen lacton chính trong Xuyên Tâm Liên (Andrographis paniculata Wall ex Nees, thuộc họ Ô rô - Acanthaceae) Bên cạnh ADG, một số thành phần diterpenoid lacton khác trong xuyên tâm liên cũng thể hiện hoạt tính sinh học như

neoandrographolid, 14-deoxy-11,12-didehydroandrographolid, trong đó, ADG có hoạt tính sinh học nổi trội nhất [11], [42]

Cấu trúc phân tử của ADG được thể hiện ở hình 1.1

Hình 1.1 Cấu trúc hoá học của ADG

Tên khoa học: (3E,4S)-3-[2-[(1R,4aS,5R,6R,8aS)-6-hydroxy-5-(hydroxymethyl)- 5,8a-dimethyl-2-methylidene-3,4,4a,6,7,8-hexahydro-1H-naphthalen-1-yl]ethylidene]-4-hydroxyoxolan-2-on

Công thức phân tử: C20H30O5, khối lượng phân tử: 350,4 g/mol

Phổ hồng ngoại: ADG có đỉnh hấp thụ ở số sóng 1727 cm–1 tương ứng với nhóm carbonyl trong vòng α, β–lacton không no và 1672 cm–1 tương ứng với liên kết C=C liên hợp [16]

ADG có thể được định lượng bằng nhiều phương pháp khác nhau, chẳng hạn như phương pháp tạo màu với thuốc thử Kedde [2], sắc ký lỏng hiệu năng cao [46], [105]

1.2.3 Tác dụng dược lý 1.2.3.1 Tác dụng chống viêm

Các nghiên cứu gần đây cho thấy ADG có thể là một tác nhân chống viêm tiềm

bệnh học trên mô hình viêm đại tràng ở chuột [34], ức chế sự biểu hiện của NF-κB, IκBα, và p65, giảm biểu hiện của COX-2 và iNOS, ức chế sự hoạt hoá của con đường truyền tin protein kinase hoạt hoá bởi mitogen (MAPK) [14], [45] Ngoài ra, Ding và các cộng sự đã công bố ADG có khả năng giảm viêm trong mô hình viêm phổi do virus cúm gây ra ở chuột, thông qua sự giảm phosphorylation của STAT1/2 [26] Một số dẫn xuất của andrographolid đã được đánh giá về hiệu quả chống viêm, chẳng hạn như ức chế hoạt động của COX-2 và điều chỉnh các cytokine viêm như TNF-α trong máu người, qua đó ảnh hưởng đến các loại tế bào miễn dịch và điều tiết phản ứng viêm [22]

1.2.3.2 Tác dụng chống ung thư

ADG là một trong những thành phần ức chế khối u chính của Andrographolid thông qua việc kích hoạt, biểu hiện và điều hòa nhiều gen Hoạt chất này ức chế sự phát triển của tế bào ung thư phổi ở người, tế bào ung thư ruột kết ở người, tế bào u xương ở người và các tế bào khối u khác bằng cách ức chế sự tăng sinh tế bào, gây ra quá trình chết theo chu trình trong tế bào khối u và ngăn chặn chu kỳ tế bào Một nghiên cứu chỉ ra rằng ADG đã ức chế sự biểu hiện của Mir-21-5p và thúc đẩy hơn nữa sự biểu hiện của PDCD4 bằng cách ức chế con đường truyền tín hiệu NF-κB trong mô hình chuột

mang gen di căn ung thư vú mmTV-PYMT, ức chế các tế bào ung thư vú McF-7 in vitro

[44] ADG ức chế sự phát triển của tế bào ung thư ruột kết SW-480 bằng bắt giữ các tế bào trong giai đoạn G0/G1 của chu trình tế bào [44], ức chế các tế bào u thần kinh đệm u87-MG ở người bằng cách điều chỉnh sự biểu hiện của các protein liên quan đến quá trình chết theo chu trình caspase-3, Bax và PARP Bcl-2 [14] Ngoài ra, Fan và cộng sự cũng chứng minh ADG ức chế con đường PI3K/AKT có tác dụng ức chế tế bào u gan ở người [14]

1.2.3.3 Tác dụng khác ADG còn được biết tới với nhiều tác dụng khác trên mô hình in vitro như kháng virus [26], [106], kháng khuẩn [81], [91], [103] Trên mô hình in vivo, ADG đã được

nghiên cứu về tác dụng hỗ trợ điều trị đái tháo đường [47], [85], bảo vệ đường tiêu hoá [66], bảo vệ gan [32], bảo vệ tim mạch [78], [95] Gần đây, các thí nghiệm mô phỏng in silico cũng cho thấy ADG có tiềm năng ức chế một số protein quan trọng của virus SARS-CoV-2 [39], [73]

1.2.4 Đặc điểm hấp thu của andrographolid

Mặc dù có nhiều tác dụng sinh học nhưng ADG chưa được sử dụng rộng rãi trong điều trị do sinh khả dụng tuyệt đối của ADG tương đối thấp, chỉ khoảng 2,67% theo đường uống [98] Độ tan kém và tốc độ hoà tan thấp của ADG [18], [99] là các yếu tố ảnh hưởng tới sinh khả dụng, khiến cho nồng độ thuốc không đạt được giá trị tối ưu tại vùng hấp thu là tá tràng và hỗng tràng Mặt khác, tại đó, dưới tác dụng của enzym liên

hợp sulfat, ADG bị chuyển hoá thành 14-deoxy-12-sulfoandrographolid tồn tại ở dạng ion hoá cũng làm giảm hấp thu Khi xuống tới các vùng hỗng tràng-hồi tràng, ADG vẫn có khả năng thấm vào tế bào biểu mô ruột, nhưng bị bơm ngược trở lại lòng ruột bởi các kênh vận chuyển như P-gp và Bcrp [98] Mặt khác, cấu trúc vòng lacton trong ADG có thể bị thuỷ phân dưới tác dụng của acid mạnh, kiềm mạnh hoặc các enzym thuỷ phân lacton (bản chất là các esterase) [27], như vậy môi trường dịch vị với pH acid và enzym thuỷ phân có thể là yếu tố bất lợi đối với độ ổn định của ADG Tuy nhiên, nghiên cứu của Ye và cộng sự cho thấy môi trường dịch vị ít ảnh hưởng tới ADG và đây có lẽ không phải là nguyên nhân dẫn tới sinh khả dụng thấp của hoạt chất này [98]

1.3 Tổng quan về tổng hợp polyme theo cơ chế gốc tự do

Phản ứng trùng hợp gốc tự do (Free radical polymerization) là một trong những phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất để sản xuất thương mại các polyme có trọng lượng phân tử cao với nhiều ưu điểm vượt trội so với trùng hợp ion và trùng hợp phối trí - ion [56] Các yếu tố chính tạo nên tính ưu việt của phản ứng trùng hợp gốc tự do là: (a) có thể được sử dụng với nhiều loại monome; (b) có khả năng tương thích với nhiều nhóm chức và điều kiện phản ứng; (c) đơn giản dễ thực hiện và không tốn kém so với các công nghệ cạnh tranh Tuy nhiên, quy trình thông thường có một số hạn chế đáng chú ý liên quan đến mức độ kiểm soát phân bố trọng lượng phân tử, thành phần và cấu trúc polyme

Sự xuất hiện gần đây của các kỹ thuật trùng hợp gốc kiểm soát mạch (Controlled radical polymerization, gọi tắt là CRP) cho phép kiểm soát rất chính xác quá trình trùng hợp trong khi vẫn giữ được phần lớn tính linh hoạt, tương thích của phản ứng trùng hợp gốc tự do thông thường [12], [49], [50], [56] Các kỹ thuật trùng hợp gốc kiểm soát mạch mới nhận được nhiều sự chú ý nhất là:

1) Trùng hợp qua trung gian nitroxid (Nitroxide-Mediated Polymerization, gọi tắt là NMP)

2) Trùng hợp gốc chuyển nguyên tử (Atom Transfer Radical Polymerization, gọi tắt là ATRP)

3) Trùng hợp chuyển mạch thuận nghịch (Reversible Addition-Fragmentation Transfer Polymerization, gọi tắt là RAFT Polymerization)

1.3.1 Trùng hợp qua trung gian nitroxid (NMP)

Các tác giả đã chỉ ra trong các nghiên cứu của mình rằng các nitroxid tạo thành bởi sự phân ly alcoxyamin có thể được sử dụng làm chất kiểm soát quá trình trùng hợp gốc

Hình 1.2 Cơ chế phản ứng NMP

Trong trùng hợp NMP, mạch hoạt động (Pn•) phản ứng với một gốc bền (X•) tạo thành mạch (Pn-X) Mạch này có thể đứt gãy thuận nghịch để tái tạo gốc tự do Gốc Pn•khi hình thành có thể phản ứng với monome một cách có kiểm soát Gốc bền X. không có khả năng khơi mào phản ứng, do vậy, động học của phản ứng trùng hợp được điều khiển bởi hằng số cân bằng của phản ứng hoạt hóa và giải hoạt bởi hiệu ứng tích tụ gốc tự do [56] Nitroxid đầu tiên được sử dụng để kiểm soát quá trình trùng hợp styren là 2,2,6,6-tetramethyl-1-piperidinyl nitroxid (TEMPO) Tuy nhiên cho đến nay người ta thấy rằng có nhiều bất tiện khi sử dụng các nitroxid họ TEMPO như không thể áp dụng cho các loại monome khác do hợp chất alcoxyamin hình thành (Pn-X) quá bền vững Hơn nữa, phản ứng diễn ra chậm nên cần thực hiện ở nhiệt độ cao (>100 °C) và thường phải tiến hành bằng trùng hợp khối Để đạt hiệu quả tốt, TEMPO (và các gốc tự do bền khác) không được phản ứng với chính nó và các monome khác, cũng như không được tham gia vào các phản ứng phụ, chẳng hạn như với các nguyên tử H ở vị trí β [51]

TEMPO là tác nhân kiểm soát phù hợp cho việc trùng hợp styren nhưng không thích hợp cho các monome khác có hằng số cân bằng thấp hơn Các nitroxid khác đã được tổng hợp nhằm tạo ra những liên kết C-O kém bền hơn Ba cấu trúc của nitroxid được minh họa trong hình 1.3 dưới đây

Hình 1.3 Các nitroxid dùng trong phản ứng NMP

kaddk-add

MPn+1M

NOTMSOTMSRO

TEMPO-TMS

NO

TRIPNO

NO

PO

OEtEtO

DEPN

TEMPO-TMS: Phenylethoxy) piperidin-N-oxyl

trans-2,6–diethyl-2,6-bis(1-trimethylsilanoxyethyl)–1-(1-TRIPNO: 2,2,5-Trimethyl-4-phenyl-3-azahexa-nitroxid DEPN: N-t-Bu-N-[1-Diethylphosphono-(2,2-dimethylpropyl)]-nitroxid

Các nghiên cứu [7], [8] đã chỉ ra rằng nếu thay cacbon bậc ba trong TEMPO bằng cacbon bậc hai thì có thể làm giảm độ bền của gốc nitroxid và cho phép áp dụng đối với quá trình trùng hợp các monome như acrylat, dien và acrylamid

Nhóm nghiên cứu của Steenbock [82] chỉ ra rằng metyl metacrylat (MMA) có thể được trùng hợp với sự có mặt của gốc tự do triazolinyl (với R1, R2, R3, R4 = C6H5-) Tuy nhiên, hiệu quả của các nitroxid này với các monome họ metacrylat chưa thực sự được khẳng định do chỉ số phân tán phân tử khối còn tương đối cao (Mw/Mn~1,6)

Nhóm nghiên cứu của Tordo cũng đã phát triển một số dẫn xuất mới không vòng dạng photphonat N-tert-butyl-1-(diethoxyphotphoryl)-2,2-dimetylpropyl nitroxid (SG1) Nitroxid này cho phép trùng hợp các acrylat, acrylamid, 1,3-dien và acrylonitril với khả năng kiểm soát tốt phân tử khối và chỉ số phân tán

1.3.2 Trùng hợp gốc chuyển nguyên tử (ATRP)

ATRP bắt nguồn từ một phản ứng được dùng rộng rãi trong tổng hợp hữu cơ là phản ứng cộng hợp chuyển gốc tự do Trong kỹ thuật này, có sự chuyển dời nguyên tử halogen từ một halogenua hữu cơ sang một phức kim loại chuyển tiếp dẫn đến sự hình thành gốc tự do hữu cơ Gốc tự do này, sau khi phản ứng với một vài đơn vị monome, nhanh chóng bị giải hoạt do tham gia vào phản ứng thuận nghịch như mô tả trong hình 1.4 và 1.5 Phương pháp này được phát triển bởi Matyjaszewski cùng cộng sự [82] vào năm 1995

Cân bằng động hoạt hóa-giải hoạt có thể được thiết lập theo hai cách Tùy theo mức độ oxi hóa của ion trung tâm cũng như phối tử sử dụng

ATRP thuận: Phức kim loại chuyển tiếp Mncó số oxi hóa thấp Nguyên lý chung của phương pháp ATRP thuận: Nguyên tử halogen (X: Br, Cl) được chuyển từ chất khơi mào dạng ankyl halogenua sang phức của kim loại chuyển tiếp (Mtn = Cu+, Fe2+, Ni2+…) đồng thời giải phóng gốc tự do để khơi mào phản ứng trùng hợp Số oxi hóa của kim loại sẽ tăng lên

Cơ chế phản ứng ATRP thuận được trình bày ở hình 1.4

Hình 1.4 Cơ chế phản ứng ATRP thuận

Hình 1.5 Cơ chế phản ứng ATRP nghịch ATRP nghịch: Phức kim loại chuyển tiếp có số oxi hóa cao

Chất khơi mào được dùng để tạo gốc tự do I• Giai đoạn khơi mào diễn ra giữa gốc tự do P• và phức Mtn+1-X để làm giảm trạng thái oxi hóa của kim loại chuyển tiếp về dạng Mtn và hình thành phân tử tạm thời không hoạt động P-X (mạch ngủ) Các gốc tự do cũng có thể phản ứng với monome để tạo thành mạch hoạt động Các mạch này sẽ phản ứng tiếp với phức Mtn+1-X để tạo ra Mtn và mạch I-Pn-X Cơ chế phản ứng ATRP thuận được trình bày ở hình 1.5

Ưu điểm của phương pháp ATRP (thuận và nghịch) là áp dụng được cho một số lượng lớn monome [57], [89], [96] Tuy nhiên, đối với những monome như acid acrylic, acrylamid, vinyl axetat hay vinyl clorua thì hoạt tính của xúc tác bị giảm mạnh

Nhược điểm chủ yếu của phương pháp ATRP đối với một ứng dụng công nghiệp là việc phải loại bỏ phức kim loại sau phản ứng, gây tốn kém và tốn thời gian

1.3.3 Trùng hợp chuyển mạch thuận nghịch (RAFT Polymerization)

RAFT là phương pháp mới nhất trong các phương pháp trùng hợp gốc kiểm soát mạch Phương pháp này có thể áp dụng với nhiều monome khác nhau trong cả môi trường đồng thể và dị thể RAFT có một số ưu điểm so với các phương pháp polyme hóa gốc tự do có kiểm soát khác, nổi bật nhất là nó có thể ứng dụng đối với nhiều monome như styren, acrylat, metacrylat và các dẫn xuất, tạo ra số lượng phong phú các polyme Hơn nữa, kỹ thuật RAFT được cho là phương pháp thuận tiện và linh hoạt nhất để kiểm soát KLPT, thành phần và cấu trúc polyme [55]

Cơ chế phản ứng trùng hợp chuyển mạch thuận nghịch (RAFT) được trình bày trong hình 1.6

Quá trình trùng hợp RAFT chủ yếu bao gồm năm quá trình [6] Hình 1.6 minh họa các giai đoạn từ khơi mào đến kết thúc 2,2'-azobisisobutyronitrile (AIBN) là chất khơi mào được sử dụng chủ yếu trong phản ứng trùng hợp RAFT [55] Trong giai đoạn đầu tiên của quá trình trùng hợp RAFT, chất khơi mào trở thành gốc tự do Tiếp theo đó, các gốc tự do phản ứng với các monome (M) tạo thành các gốc tự do lan truyền (Pn•) Sau đó các gốc (Pn•) tương tác với tác nhân chuyển mạch tạo thành trạng thái trung gian Trạng thái trung gian này bị phân mảnh tạo thành các hợp chất polyme thiocarbonylthio và các gốc tự do mới (R•) Các gốc R• hình thành này sẽ đi vào giai đoạn tái khơi mào, phản ứng với các monome (M) để tạo ra các gốc mới (Pm•) có khả năng tiếp tục lan truyền Cân bằng nhanh chóng được thiết lập giữa thiocarbonylthio polyme R-C(=S)-SZ và các gốc tự do lan truyền (Pn• và Pm•) đảm bảo tất cả các chuỗi polyme đều phát triển liên tục Giai đoạn kết thúc của quá trình các gốc tự do lan truyền (Pn• và Pm•) kết hợp tạo các sản phẩm polyme không hoạt động

Hình 1.6 Cơ chế phản ứng trùng hợp RAFT

Hình 1.7 Cấu trúc của tác nhân chuyển mạch (CTA)

Trong trùng hợp RAFT ta vẫn cần sử dụng chất khơi mào như trong trùng hợp gốc truyền thống Điểm khác biệt là đưa thêm vào hệ tác nhân chuyển mạch (chain transfer agent, CTA, hay còn gọi là tác nhân RAFT) có tác dụng tạo ra cân bằng giữa mạch hoạt động và mạch không hoạt động Tác nhân RAFT, đóng vai trò thiết yếu trong việc điều

Giai đoạn khơi mào

Chất khơi mào

Giai đoạn chuyển chuỗi thuận nghịch

Giai đoạn tái khơi mào

Giai đoạn cân bằng chuỗi

ZPn

SZ

Liên kết đôi linh động giữa C và S

Nhóm ra đi (R) phải cókhả năng tái khơi mào

hòa quá trình trùng hợp thông qua quá trình chuyển mạch thuận nghịch CTA ảnh hưởng mạnh mẽ đến hiệu quả, động học và nhiệt động lực học Các hợp chất thiocarbonylthio là các CTA hiệu quả nhất Dithioeste, xanthat, dithiocarbamat và trithiocarbonat là bốn hợp chất thiocarbonylthio chiếm ưu thế với cấu trúc tổng quát, R-C(=S)-SZ Đặc biệt, dithioeste và trithiocarbonat có tính linh hoạt khi phản ứng được thực hiện trong điều kiện nước [54] CTA được lựa chọn phải có hoạt tính chuyển mạch phù hợp với monome Các tính chất điện tử (electron) của nhóm hoạt hóa (Z) và đặc tính phân bố electron trong không gian của nhóm R quyết định hoạt tính chuyển mạch của tác nhân RAFT (Hình 1.7) Nhóm Z trong tác nhân RAFT phải dễ phản ứng với nối đôi trong gốc cộng hợp, nhưng không được quá bền, sẽ làm ảnh hưởng đến gốc trung gian Nên chọn nhóm R có khả năng dễ bị thay thế, thích hợp với gốc tự do có trong giai đoạn phát triển mạch, và khả năng khơi mào lại quá trình trùng hợp càng cao càng tốt

Trạng thái cân bằng nhanh chóng giữa các gốc tự do hoạt động (Pn• và Pm•) và các mạch ngủ là điều kiện tiên quyết cho việc hình thành các mạch polyme với kích thước đồng đều Sau phản ứng mỗi mạch polyme đều chứa một nhóm thiocacbonylthio ở cuối mạch, nghĩa là chúng đóng vai trò như một chất chuyển mạch có kích thước lớn Điều này có nghĩa là sau khi monome thứ nhất phản ứng hết, ta có thể cho thêm một monome khác vào hệ để thu được copolyme khối

Ưu điểm chính của phương pháp này là có thể áp dụng cho nhiều loại monome bao gồm cả metacrylat, acrylat, styren và dẫn xuất, và vinyl axetat

Các tác nhân RAFT R-S-C(=S)Z cho phép kiểm soát phân tử khối của polyme, thu được chỉ số phân tán thấp và nhóm chức ở mỗi mạch polyme Mỗi mạch polyme chứa nhóm chức -S-C(=S)Z ở cuối mạch nên có thể dễ dàng hoạt hóa lại cho phép tổng hợp copolyme khối

1.4 Tổng quan về micell polyme

1.4.1 Định nghĩa về micell polyme

Micell polyme là một hệ chất mang nano dựa trên polyme có tính lưỡng thân, có kích thước tiểu phân nằm trong khoảng 10 – 200 nm, trong đó cấu trúc của polyme bao gồm một phần kỵ nước và một phần thân nước (hình 1.8) Trong môi trường nước, khi nồng độ của polyme bằng hoặc vượt quá nồng độ tới hạn tạo micell (CMC), micell polyme được hình thành Phần kỵ nước của polyme sẽ liên kết với nhau, tạo thành lõi của micell, trong khi phần thân nước hướng ra bên ngoài, tạo thành vỏ ngoài của micell [38], [70]

Hình 1.8 Cấu trúc của micell polyme

1.4.2 Ưu nhược điểm của hệ micell polyme 1.4.2.1 Ưu điểm:

- Đa dạng về hình thái, kích thước, đặc tính hoá lý: Các kỹ thuật trung hợp mới cho phép kiểm soát chính xác về KLPT, cấu trúc, hình dạng của polyme, giúp tối ưu hoá phù hợp cho việc bao gói nhiều loại dược chất [53], [69], [75]

- Tăng độ hoà tan của các hoạt chất rất ít tan trong nước: Khi micell được hình thành lõi của micell tạo ra một môi trường vi kỵ nước tương đối Lõi không phân cực, kỵ nước này cung cấp một môi trường thích hợp cho các hợp chất ít tan so với pha nước Các phân tử ít tan được bao gói vào lõi micell giúp tăng cường độ hòa tan [70]

- Kiểm soát giải phóng dược chất: Micell polyme cho phép kiểm soát giải phóng thuốc thông qua thiết kế của copolyme khối, giúp thích ứng với các điều kiện môi trường như enzyme, pH hoặc nhiệt độ [30]

- An toàn và tương thích sinh học: Polymer thường được sử dụng để tạo micell, như PEG, PLGA có độ tương thích sinh học cao và an toàn khi sử dụng trong y tế, đã được cấp phép bởi FDA [36], [107]

1.4.2.2 Nhược điểm

- Tồn dư dung môi hữu cơ độc hại trong quá trình bào chế: Các phương pháp bào chế micell polyme, bao gồm kỹ thuật bay hơi dung môi và thẩm tách, thường yêu cầu sử dụng dung môi hữu cơ để hòa tan polyme và hoạt chất Điều này tiềm ẩn nguy cơ dung môi hữu cơ có thể còn tồn tại trên micell polyme sau quá trình bào

chế, ảnh hưởng đến độ an toàn của sản phẩm [70] - Khả năng tải dược chất chưa cao [70]

- Kém ổn định vật lý trong môi trường in vivo: Polyme có thể bị phá huỷ khi gặp protein huyết tương hoặc enzyme, làm phá vỡ cấu trúc micell [70], [87]

1.4.3 Ứng dụng của micell polyme trong hệ phân phối thuốc

Các micell polyme là hệ vận chuyển thuốc mới có nhiều ưu điểm, chẳng hạn như giảm tác dụng phụ của thuốc, nhắm mục tiêu có chọn lọc, bảo quản ổn định và ổn định khi pha loãng [17], [62] Hơn nữa, chúng có kích thước nano với sự phân bố hẹp [5],

[15] Các micell có thể bảo vệ thuốc chống lại quá trình oxy hóa in vitro và in vivo nhờ

cấu trúc lõi-vỏ của chúng [62], [104] Quan trọng hơn, các micell polyme có thể được chế tạo dành cho các phân tử thuốc thích hợp Bảng 1.1 dưới đây trình bày một số ứng dụng của micell polyme trong hệ phân phối thuốc

Bảng 1.1 Một số nghiên cứu về ứng dụng micell polyme

STT Tên nghiên cứu Kết quả đạt được

1 Nghiên cứu polyme poly(N-

block-poly(vinyl acetat) đóng vai trò chất vận chuyển thuốc có tính kỵ nước [4]

vinylpyrrolidon)-Các micell được hình thành từ polyme PVP-b-PVAc cho thấy khả năng nạp thuốc clofazimin khoảng 20%

kl/kl trong các thí nghiệm in vitro đối với các tế bào ung

thư vú MCF12A và MDA-MB-231 Kích thước của các micell sau khi nạp clofazimin trong PVP90-b-PVAc290khoảng 210 – 220 nm và ổn định trong 16 giờ trong dung dịch đệm PBS ở pH = 7 và 34ºC

2 Các micell polyme giúp ổn định để phát triển IT-147, một công thức thuốc chứa epothilon D [15]

Hiệu suất nạp thuốc epothilon D đạt 90% bằng cách sử dụng copolyme 3 khối (IT-147) Các micell chứa thuốc có đường kính khoảng 75 nm và cho thấy sự giải phóng thuốc phụ thuộc vào độ pH mà không cần kích hoạt enzyme IT-147 cho nồng độ epothilon D trong ngăn huyết tương cao gấp 6 lần so với thuốc tự do

3 Phát triển copolyme của poly(d,l-lactid) và methoxy-

polyethylen glycol làm chất mang dạng micell của paclitaxel [13]

Copolyme 2 khối, với PEG được sử dụng làm một khối và khối còn lại bao gồm poly(D, L-lactid) (PDLLA), copolyme của poly(D, L-lactide-co-caprolacton) (PDLLACL) hoặc poly( glycolide-co-caprolacton) (PGACL), được điều chế bằng cách sử dụng phản ứng trùng hợp mở vòng số lượng lớn PDLLACL–PEG là polyme tối ưu hơn trong quá trình hòa tan paclitaxel so với polyme PDLLA–PEG Các micell được điều chế bằng PDLLA–PEG cho thấy sự phân giải 95% của paclitaxel được nạp trong máu chuột trong vòng 15 giờ

1.5 Tổng quan về vi nhũ tương

1.5.1 Định nghĩa vi nhũ tương

VNT là hệ phân tán vi dị thể, có phân bố KTG nằm trong khoảng từ 10 - 200 nm, được hình thành từ hai chất lỏng không đồng tan, trong đó một chất lỏng là pha phân tán (pha nội, pha không liên tục) được phân tán vào chất lỏng thứ hai là MTPT (pha ngoại, pha liên tục), được ổn định bằng CDH và CĐDH

- Pha nước: Gồm những chất lỏng phân cực như nước, ethanol, PEG, muối và các chất dễ hòa tan hay đồng tan vào nước

- Chất diện hoạt: là các chất có khả năng làm giảm sức căng bề mặt phân cách pha, qua đó giúp hình thành VNT

Các chất diện hoạt hay được sử dụng [1]: • Chất diện hoạt anion: Natri laurylsulfat, natri amoni stearat,… • Chất diện hoạt cation: Cetrimid,…

• Chất diện hoạt không ion hóa: Tween, Span, Cremophor,… • Chất diện hoạt lưỡng tính: Acid amin, lecithin,…

- Chất đồng diện hoạt: Là những alcol, amin, acid, ether mạch 8 – 10 carbon CĐDH hay được sử dụng như ethanol, glycerid, PEG 300, PEG 400, poloxame, Transcutol P, ethylen glycol, propanol [10], [68]

1.5.3 Ưu nhược điểm của vi nhũ tương 1.5.3.1 Ưu điểm:

- Tăng độ tan dược chất: vi nhũ tương giúp tăng độ tan của các dược chất kém tan trong nước, làm cho thuốc dễ dàng hấp thu hơn khi được đưa vào cơ thể [28] - Tăng cường sinh khả dụng: Do kích thước hạt nhỏ và khả năng thấm tốt, vi nhũ

tương dễ dàng thâm nhập qua các màng sinh học và da, giúp tăng cường sinh khả dụng của các dược chất, đảm bảo thuốc được hấp thụ hiệu quả hơn qua các màng sinh học [28]

- Tác dụng tại đích: Kích thước nhỏ của các hạt nano giúp chúng dễ dàng tiếp cận và thâm nhập vào các tế bào đích, tăng hiệu quả điều trị tại vị trí mong muốn [28] - Tính ổn định nhiệt động học: duy trì được tính ổn định trong thời gian dài mà

không bị phân tách, làm tăng thời hạn sử dụng của sản phẩm [28], [41] - Bào chế đơn giản

1.5.3.2 Nhược điểm - Nồng độ cao chất diện hoạt và đồng dung môi: Việc sử dụng vi nhũ tương thường

đòi hỏi nồng độ cao của chất diện hoạt và đồng dung môi, điều này có thể dẫn đến các vấn đề về độc tính và tác dụng phụ nếu không được kiểm soát đúng mức [28] - Khó khăn trong việc xác định tỷ lệ các thành phần trong công thức

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị

2.1.1 Nguyên vật liệu

Các nguyên liệu và hóa chất chính được trình bày ở bảng 2.1

Bảng 2.1 Các hoá chất sử dụng trong nghiên cứu

STT Tên nguyên liệu Nguồn gốc Tiêu chuẩn

1 2,2’-Azobisisobutyronitril Sigma-Aldrich - Mỹ TCNSX

4 Acid 4-Cyano-4-(phenylcarbonothioylthio)

6 Andrographolid (≥ 98%, HPLC) AKScientific - Ấn Độ HPLC 7 Cao xuyên tâm liên (chứa 32,6% andrographolid) Trung Quốc TCNSX

12 Diethyl Ether Anhydrous ChemSupply – Úc TCNSX

STT Tên nguyên liệu Nguồn gốc Tiêu chuẩn

30 Oligo(ethylen glycol) methyl ether methacrylat Sigma-Aldrich - Mỹ TCNSX

33 Dầu khoáng (Nhiệt độ sôi 40 - 60 oC) ChemSupply – Úc TCNSX

Các thiết bị chính được trình bày ở bảng 2.2

Bảng 2.2 Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu

STT Tên thiêt bị Xuất xứ

1 Bình nuôi cấy mô T-25 có ven thông gió Greiner Bio-one Áo

4 Hệ thống quang phổ cộng hưởng từ hạt nhân Varian MR400 Mỹ 5 Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Shimadzu Nhật Bản

7 Máy đo pH để bàn Mettler Toledo SevenCompact S220K Mỹ

13 Máy quang phổ UV-Vis Hitachi U-1800 Mỹ

16 Tủ hút an toàn sinh học LafTech SafeMateEco+ Úc

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Xây dựng phương pháp định lượng andrographolid 2.2.2 Bào chế và đánh giá hệ vi nhũ tương chứa andrographolid 2.2.3 Bào chế và đánh giá hệ micell polyme chứa andrographolid 2.2.4 Đánh giá hoạt tính chống ung thư thận trên tế bào nuôi cấy in vitro

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp bào chế 2.3.1.1 Bào chế hệ micell polyme chứa andrographolid 2.3.1.1.1 Tổng hợp polyme

a Tổng hợp tác nhân macro-RAFT POEGMA

Tác nhân macro-RAFT được tổng hợp theo quy trình đã được công bố [52] Monome oligo (ethylen glycol) methyl ether acrylat (OEGMA) (5,00 g; 1,67 x 10-3 mol), tác nhân RAFT acid 4-cyano-4-(phenylcarbonothioylthio)pentanoic (CPADB) (7,76 x 10-2 g; 2,78 x 10-5 mol) và chất khơi mào 2,2’-Azobisisobutyronitril (AIBN) (4,6 x 10-3g; 2,78 x 10-5 mol) được hòa tan trong 20 mL toluene trong một lọ thuỷ tinh kèm con khuấy từ Lọ sau đó được đậy kín bằng một nắp cao su và sục khí nitơ trong 30 phút để loại bỏ hoàn toàn khí O2 Hỗn hợp phản ứng được được đun nóng ở 70°C Sau 17 giờ, quá trình trùng hợp được kết thúc bằng cách làm lạnh mẫu trong bể nước đá trong 5 phút Polyme POEGMA được tinh chế ba lần bằng cách kết tủa với dầu khoáng (nhiệt độ sôi trong khoảng 40–60°C) sau đó ly tâm (7000 vòng/phút trong 15 phút) và sau đó được sấy khô dưới chân không ở nhiệt độ phòng Các mẫu được lưu trữ ở 4°C cho đến khi cần thiết để tiếp tục mở rộng chuỗi Tỷ lệ chuyển hóa của monome trong quá trình trùng hợp xác định bằng phổ 1H-NMR, bằng cách so sánh cường độ của các đỉnh proton vinyl (6.1 và 5.6 ppm) với đỉnh proton este –OCH2 (4.1 ppm)

Tỷ lệ chuyển hoá của monome được tính theo công thức:

b Tổng hợp polyme hai khối POEGMA-b-PVBA

POEGMA với 58 đơn vị lặp lại (Mn, NMR = 17502 g/mol) được sử dụng như một tác nhân macro-RAFT để mở rộng chuỗi với vinyl benzylaldehyd (VBA) Số lượng đơn vị lặp lại của POEGMA được tính từ tỷ lệ chuyển hóa monome thu được từ 1H-NMR Tác nhân macro-RAFT POEGMA (1,00g; 1,14 x 10-4 mol) và VBA (0,3020g; 2,29 x 10-3 mol) được hòa tan trong 5 mL acetonitril, đậy kín bằng nắp cao su Hỗn hợp phản ứng được sục khí nitơ trong 30 phút trong bể nước đá để loại bỏ hoàn toàn khí O2 Quá trình trùng hợp được thực hiện trong bể dầu ở 70°C qua đêm và kết thúc bằng cách làm lạnh hỗn hợp phản ứng trong đá trong 5 phút Polyme được tinh chế ba lần bằng cách kết tủa trong dung môi diethyl ether dư, sau đó ly tâm (7000 vòng/phút trong 15 phút) và sau đó polyme được sấy khô dưới áp suất giảm ở nhiệt độ phòng Tỷ lệ chuyển hóa VBA được tính từ phổ 1H-NMR của hỗn hợp phản ứng theo phương trình sau:

𝜶𝑽𝑩𝑨 = ∫ 9.8 𝑝𝑝𝑚('( ))

∫ 9.8 𝑝𝑝𝑚('( ))+ ∫ 10 𝑝𝑝𝑚('( )) 𝑥 100%

trong đó đỉnh pic 9,8ppm và 10ppm lần lượt tương ứng với cường độ proton aldehyd

của polyme PVBA và monome VBA

Trọng lượng phân tử của polyme POEGMA-b-PVBA được tính theo phổ 1H-NMR theo công thức:

𝑴𝒏,𝑷𝑶𝑬𝑮𝑴𝑨;𝒃;𝑷𝑽𝑩𝑨 = 𝛼=82 𝑥 [6./012][=82] 𝑥 𝑀3,=82+ 𝑀@, 6./012

trong đó [𝑃𝑂𝐸𝐺𝑀𝐴], 𝑀3,6./012 và [𝑉𝐵𝐴], 𝑀3, =82 lần lượt là số mol và khối lượng phân tử của tác nhân macto-RAFT POEGMA và monome VBA tham gia phản ứng

2.3.1.1.2 Bào chế hệ micell polyme chứa andrographolid

Hệ micell polyme được chuẩn bị như sau: - Cân chính xác lượng polyme POEGMA-b-PVBA rồi hoà tan trong methanol

- Thêm từ từ ADG (đã hoà tan trong dung môi methanol) vào cốc 1, khuấy từ nhẹ nhàng trong 10 phút

- Thêm từng giọt pha hữu cơ (cốc 1) vào pha nước (cốc 2), duy trì tốc độ khuấy chậm qua đêm để đảm bảo methanol bay hơi hoàn toàn thu được hệ micell polyme trong nước Hệ này được bảo quản ở nhiệt độ phòng tới khi sử dụng

2.3.1.2 Bào chế hệ vi nhũ tương chứa andrographolid a Sàng lọc các loại tá dược cho công thức vi nhũ tương

Cho vào mỗi ống ly tâm khoảng 5 g tá dược cần thử độ tan của andrographolid, cho một lượng dư andrographolid vào ống Đậy chặt nắp và cho vào bể lắc điều nhiệt với tốc độ 125 vòng/phút, nhiệt độ 37oC trong 72 giờ Sau đó lấy các ống ra, ly tâm ở tốc độ 6000 vòng/phút trong 10 phút, hút lớp dịch phía trên đem pha loãng bằng methanol tới nồng độ phù hợp và định lượng bằng phương pháp HPLC

b Xây dựng giản đồ pha

Từ độ tan bão hoà của ADG trong các tá dược, lựa chọn tá dược pha dầu, diện hoạt và đồng dung môi có độ hòa tan tốt nhất Xây dựng giản đồ pha bằng phương pháp chuẩn độ Chuẩn bị các hỗn hợp Smix (diện hoạt/đồng dung môi) với các tỉ lệ khác nhau 1:0, 1:2, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1 Mỗi hỗn hợp Smix vừa có, phối hợp với pha dầu (O) theo những tỉ lệ O/Smix lần lượt là 1:9, 2:8, 3:7, 4:6, 5:5, 6:4, 7:3, 8:2, 9:1 Nhỏ từ từ nước vào hỗn hợp O/Smix và lắc nhẹ nhàng, quan sát bằng mắt cảm quan hệ thu được Hệ sẽ chuyển từ trạng thái trong sang đục tương ứng với cấu trúc hóa lý của hệ là vi nhũ tương, nano nhũ tương và nhũ tương thô Ghi lại lượng nước Lặp lại các thí nghiệm với các tỷ lệ khác nhau để lập giản đồ pha [67]

c Bào chế hệ vi nhũ tương chứa andrographolid

Phương pháp bào chế vi nhũ tương ADG được tiến hành như sau: - Chuẩn bị 2 pha dầu và pha nước vào 2 cốc, pha dầu chứa lipid, chất diện hoạt và đồng dung môi, cốc 2 chứa nước vừa đủ cho mỗi công thức

- Đun nóng nhẹ đồng thời cả 2 cốc dùng đũa thủy tinh khuấy nhẹ cốc 1 sao cho hỗn hợp trong cốc 1 thành dung dịch đồng nhất, thêm ADG vào cốc 1 tiếp tục khuấy cho tới khi ADG tan hoàn toàn

- Đổ cốc 2 vào cốc 1, khuấy từ nhẹ nhàng trong 5 phút để thu được vi nhũ tương Trong quá trình bào chế hệ vi nhũ tương ADG, tỷ lệ các thành phần trong công thức có ảnh hưởng quan trọng tới các đặc tính của hệ Vì vậy, để lựa chọn được công thức phù hợp nhất cần tiến hành bào chế các công thức khác nhau và xem xét ảnh hưởng của chúng tới kích thước và độ ổn định của hệ vi nhũ tương ADG

2.3.2 Phương pháp đánh giá 2.3.2.1 Phương pháp định lượng andrographolid a Định lượng andrographolid bằng quang phổ UV-VIS

Dãy dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 0,0100 gam chất chuẩn ADG (chứa

98% ADG), hoà tan và định mức tới 50,0 ml bằng methanol sắc ký, thu được dung dịch S1 với nồng độ 200 μg/ml Pha loãng thích hợp dung dịch S1 bằng methanol sắc kí để thu được các dung dịch chuẩn có nồng độ 25, 20, 15, 10 và 5 μg/ml Tiến hành quét phổ trên thiết bị quang phổ UV-VIS HITACHI U–1800 để xác định bước sóng hấp thụ cực đại của ADG với mẫu nồng độ 10 μg/ml Xác định độ hấp thụ của dãy 5 dung dịch chuẩn và xây dựng khoảng tuyến tính với mẫu trắng là methanol sắc ký

Dung dịch thử: Pha loãng dung dịch thích hợp sao cho nồng độ ADG nằm trong

khoảng 5 đến 25 μg/ml Tiến hành đo độ hấp thụ tại bước sóng hấp thụ cực đại của ADG với mẫu trắng là nền mẫu

b Định lượng andrographolid bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

Điều kiện định lượng ADG bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao được tham khảo từ nghiên cứu của Zhao và cộng sự [105] như sau:

+ Thiết bị: Sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép nối detector UV của Shimadzu + Pha tĩnh: cột C18, kích thước 250 x 4,6 mm, kích thước hạt nhồi 5 μm + Pha động: Methanol-Nước (55:45) (tt/tt) với tốc độ dòng 1 ml/phút + Nhiệt độ cột: 35°C

+ Thể tích tiêm mẫu: 20 μl + Detector UV phát hiện ở bước sóng 225 nm

Dãy dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 0,0100 gam chất chuẩn ADG, hoà

tan và định mức tới 50,0 ml bằng methanol sắc ký, thu được dung dịch S1 với nồng độ khoảng 200 μg/ml Pha loãng dung dịch S1 bằng methanol sắc ký để thu được các dung dịch chuẩn có nồng độ 100, 60, 20, 10 và 1 μg/ml Lọc dung dịch qua màng lọc cellulose acetat 0,45 μm trước khi tiêm vào hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao

Dung dịch thử: Các mẫu nghiên cứu được pha loãng tới nồng độ thích hợp bằng

methanol sắc ký (nếu cần thiết) và lọc qua màng lọc cellulose tái tổ hợp 0,2 μm trước khi tiêm vào hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao

2.3.2.2 Đánh giá kích thước và phân bố kích thước tiểu phân

Các phép đo được thực hiện bằng thiết bị Malvern Zetasizer Nano Series và phần mềm DTS (4 mW, laser He–Ne, bước sóng 633 nm) và một diode thu quang thác (APD) Ánh sáng tán xạ được đo ở góc 175o Nhiệt độ được ổn định ở ±0.1 °C so với nhiệt độ cài đặt Tất cả các mẫu được chuẩn bị trong nước siêu tinh khiết với nồng độ khoảng 0.2

Mẫu đánh giá là vi nhũ tương và micell polyme thu được từ thí nghiệm Sử dụng cuvet nhựa, chỉ số khúc xạ RI là 1,584 và độ hấp thụ là 0,001

2.3.2.3 Phương pháp nuôi cấy và thử độc tính tế bào in vitro a Nuôi cấy tế bào

Đề tài sử dụng dòng tế bào Renca Renca là dòng tế bào biểu mô được phân lập từ thận của chuột đực bị ung thư biểu mô vỏ thận [59] Dòng tế bào Renca được nuôi trong bình nuôi cấy mô T-25 có ven thông gió sử dụng môi trường dinh dưỡng Roswell Park Memorial Institute (RPMI-1640) bổ sung 10% huyết thanh bào thai bò (FBS) Các tế bào được ủ ở 37°C trong môi trường ẩm chứa 5% CO2 và được chia ra bình nuôi cấy mới (passage) sau mỗi 2−3 ngày khi lớp tế bào đạt khoảng 80% độ phủ Mật độ tế bào được xác định bằng cách đếm số lượng tế bào sống sử dụng thuốc nhuộm trypan blue (Sigma-Aldrich) Để chuyển (passage) và cấy tế bào, các tế bào được tách ra khỏi thành bình nuôi cấy bằng dung dịch trypsin 0.05% trong dung dịch đệm PBS, tế bào được nhuộm bằng thuốc nhuộm trypan blue và đưa lên huyết cầu kế (hemocytometer) để đếm mật độ tế bào Tất cả các thí nghiệm được thực hiện sáu lần

b Thử độc tính trên tế bào in vitro

Các tế bào được cấy với mật độ 10000 tế bào mỗi giếng trong các đĩa nuôi cấy 96 giếng chứa 100 μL môi trường tăng trưởng mỗi giếng và ủ ở 37°C trong môi trường 5% CO2 trong 24 giờ Sau đó, môi trường dinh dưỡng được thay thế bằng môi trường mới

(100 μL) chứa các nồng độ khác nhau của polyme POEGMA-b-PVBA, hỗn dịch ADG

và 2 hệ nano ADG với khoảng nồng độ ADG tương đương từ 1 − 200μM, ủ ở 37°C trong môi trường 5% CO2 trong 72 giờ

Sau khi ủ, môi trường nuôi cấy được loại bỏ và độc tính tế bào của các mẫu được đo bằng phương pháp đánh giá sự phát triển tế bào sử dụng thuốc thử Alamar Blue (Alamar Blue assay) Alamar Blue theo dõi môi trường khử của tế bào sống, với hoạt chất là resazurin, tan trong nước, ổn định trong môi trường nuôi cấy, không độc hại và thấm qua màng tế bào [71] Thuốc nhuộm hoạt động như một chất nhận điện tử trung gian trong chuỗi vận chuyển điện tử Nó có thể bị khử bằng NADPH, FADH, FMNH, NADH, cũng như các cytochrome, chuyển từ trạng thái oxy hóa, không huỳnh quang, màu xanh lam sang trạng thái khử, có huỳnh quang, màu hồng [65] Sự thay đổi từ trạng thái oxy hóa sang trạng thái khử cho phép định lượng tế bào sống sót khi đo huỳnh quang hoặc đo quang phổ hấp thụ

Do thuốc nhuộm Alamar blue nhạy cảm với ánh sáng, quy trình nhuộm tế bào được tiến hành ở điều kiện tránh ánh sáng Alamar blue được lọc qua màng lọc 0,45 μm và sau đó được pha loãng với môi trường dinh dưỡng RPMI 1640 theo tỷ lệ 2:8 Các tế bào được nhuộm bởi 100 μL dung dịch Alamar Blue mỗi giếng, sau đó đĩa nuôi cấy được bọc kín tránh ánh sáng và ủ ở 37°C trong 6 giờ Sau đó, độ hấp thụ tại 550 nm tại mỗi