dương quang quý nghiên cứu in silico tác dụng điều trị đái tháo đường type 2 và chống oxy hóa của cây chua me đất hoa vàng oxalis corniculata l

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT AGEs Advanced Glycation End products các sản phẩm glycat hóa bền vững AKT1 RAC-alpha serine/threonine-protein kinase AM1-BCC Austin Model 1 with Bond Charge

TỔNG QUAN

Tổng quan về cây Chua me đất hoa vàng (Oxalis Corniculata L.)

Chua me đất hoa vàng, tên khoa học là Oxalis corniculata L thuộc chi Oxalis, họ Chua me đất Oxalidaceae.[4]

1.1.1 Vị trí phân loại và phân bố

Chua me đất hoa vàng thuộc chi Oxalis L., vị trí phân loại của chi Oxalis L theo

Hệ thống phân loại APG IV [17] như sau :

Bộ Chua me đất (Oxalidales)

Họ Chua me đất (Oxalidaceae)

Về phân bố, chi Oxalis gồm nhiều loài phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, một số ít ở vùng ôn đới ấm [1] Ở Việt Nam, chi này được phát hiện có 4 loài, bao gồm: Chua me đất hoa đỏ (Oxalis deppei Sw.), Chua me núi (Oxalis acetosella L.), Chua me đất hoa vàng (Oxalis corniculata L.) và Chua me đất hoa hồng (Oxalis corymbosa DC.), trong đó Chua me đất hoa vàng là loài phổ biến nhất Chua me đất hoa vàng được coi là loài cây khá quen thuộc ở nước ta vì chúng thường mọc hoang ở khắp nơi, từ vùng núi, trung du, đồng bằng đến trên các đảo Loài này còn được thấy ở châu Âu và các nước khác thuộc khu vực châu Á như Ấn Độ, Trung Quốc và các nước Đông Nam Á [1], [4]

Hình 1.1 Phân bố loài Oxalis corniculata L trên thế giới [68]

Chua me đất hoa vàng là cây thân thảo mọc lan bò trên mặt đất Thân mảnh, hình trụ, hơi có lông, dài 10-50 cm, rộng 0,1-0,3 cm, màu xanh hoặc đỏ nhạt, chia nhiều nhánh nhỏ màu đỏ nhạt; rễ có màu nâu sẫm, mỏng, phân nhánh, mềm mại Lá có cuống dài 2-12 cm, hơi có lông trắng mịn, gồm ba lá chét gần như nhẵn, mềm, mỗi lá chét có một vết lõm thành hình trái tim ngược Mặt trên lá màu xanh lục, mặt dưới lá màu xanh lam với 5 gân chính, nổi rõ, tỏa đều xuất phát từ đỉnh cuống lá, lông chỉ có ở mặt dưới và bìa phiến Cây không có lá kèm Hoa mọc thành tán gồm 2 đến 3 hoa, màu vàng, cuống dài khoảng 2 cm Đài hoa gồm 5 cánh rời nhau, tràng hoa gồm 5 cánh mỏng dài hơn đài Nhị 10, xếp thành 2 vòng, vòng ngoài gồm 5 nhị lép đối diện với cánh hoa, vòng trong là 5 nhị thụ xen kẽ với cánh hoa, chỉ nhị dạng sợi màu trắng dài 0,15-0,25 cm, bao phấn hình thuôn dài gồm 2 ngăn Nhụy hoa có bầu hình trụ, đỉnh thuôn, 5 ô chứa noãn, đầu nhụy màu vàng, mỗi đầu chia nhiều tua nhỏ Quả thuôn dài đỉnh nhọn, vỏ quả mỏng nhăn nheo, màu xanh, có lông khi chín nứt dọc thành các mảnh cong lại, văng hạt đi xa Hạt hình trứng có đầu nhọn hơi dẹt dài 1 mm, màu nâu đỏ, có các đường rãnh ngang [1], [4], [6]

Chua me đất hoa vàng thường mọc lẫn với các loại cây trồng khác ở vườn, ngoài đồng ruộng, trên đồi và nương rẫy Cây ưa sống nơi ẩm và hơi chịu bóng Hàng năm cây con mọc từ hạt xuất hiện vào cuối mùa xuân, sinh trưởng và ra hoa trong mùa hè khoảng tháng 5-7 và lụi dần vào mùa thu, sau khi đã kết quả Tuy nhiên một số cây mọc muộn vào cuối hè hoặc đầu thu sẽ không bị tàn lụi mà tồn tại qua mùa đông [1]

Hình 1.2 Một số hình ảnh của cây Chua me đất hoa vàng (Oxalis corniculata L.) [68]

Các loại thành phần hóa thực vật khác nhau đã được phân lập trong các nghiên cứu trước đây từ Chua me đất hoa vàng như tannin, flavonoid, polyphenol, steroid, alkaloid, tinh dầu, axit béo, glycosid, Các axit béo thiết yếu như acid palmitic, acid linoleic, acid linolenic, acid stearic và acid oleic cũng đã được phát hiện có mặt trong cây này từ các nghiên cứu trước đây Lá cây là nguồn cung cấp lượng lớn vitamin C và caroten Thân và lá cây chứa lượng lớn acid citric và acid tartaric và thân cây chứa acid malic

Nó giàu oxalat như kali oxalat và canxi oxalat Carbohydrate, protein, acid amin, chất xơ và canxi đã được phát hiện trong các chiết xuất methanol và ethanol của cây trong các nghiên cứu trước đây [1], [81] Chiết xuất methanol của cây này được phát hiện giàu các hợp chất phenolic Phân đoạn chloroform của cây này khi được phân tích hóa thực vật đã tiết lộ sự hiện diện của các flavon quan trọng [80] Các thành phần hóa học chi tiết được tổng hợp tại Phụ lục 1

• Tác dụng chống oxy hóa (OXH):

Chua me đất hoa vàng được chứng minh là chứa các chất chống oxy hóa với khả năng chống lại gốc tự do cao như các phenolic và flavonoid Các báo cáo về việc sử dụng Chua me đất hoa vàng với tác dụng chống oxy hóa nổi bật hơn so với các hoạt tính sinh học khác và đã được báo cáo trong các thí nghiệm kiểm tra hoạt tính chống OXH với 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH), Nitric oxid và 2,2'-azino-bis(3- ethylbenzothiazolin-6-sulfonic acid) (ABTS) [80], [83] Trong thử nghiệm DPPH, phân đoạn ethyl acetat cho thấy hoạt tính chống gốc tự do cao nhất, 24% với nồng độ 1 mg/ml [8] Các chiết xuất methanol và nước của Oxalis corniculata cho thấy khả năng chống oxy húa tốt với cỏc giỏ trị IC50 lần lượt là 118 àg/ml và 112 àg/ml [69]

Nhiều nhà nghiên cứu đã báo cáo hoạt tính sinh học của cây Chua me đất hoa vàng trong việc ức chế sự phát triển của các vi khuẩn như Escherichia coli, Salmonella typhi,

Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Shigella dysenteriae, Staphylococcus faecalis, Pseudomonas vesicularis, Aeromonas hydrophilia, Staphylococcus cohnii, Serratia ficaria, Candida albicans, Giardia lamblia, Entamoeba histolytica, Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus epidermis, Salmonella typhimurium và Vibrio cholerae [83]

Các phân tích hóa thực vật của chiết xuất loài này đã phát hiện rằng các flavonoid là thành phần chính mang lại hoạt tính kháng khuẩn của nó [73]

• Tác dụng chống đái tháo đường:

Chiết xuất ethanol của cây Chua me đất hoa vàng đã cho thấy khả năng làm giảm glucose máu ở chuột bạch bị tiểu đường do streptozotocin Kết quả từ nghiên cứu này đã xác nhận tiềm năng hạ đường huyết của cây Chua me đất hoa vàng, tuy nhiên các cơ

5 chế phân tử và tế bào liên quan đến hoạt tính chống tiểu đường của cây chua me đất vẫn chưa được làm rõ [80] Chiết xuất methanol của loài này có khả năng ức chế hoạt động của α-amylase và α-glucosidase với các giá trị IC50 lần lượt là 0,35 và 0,03 mg/ml, cho thấy hiệu quả của cây chua me đất như một tác nhân điều trị đái tháo đường [69] Chiết xuất nước của lá cây Chua me đất hoa vàng đã được thử nghiệm về khả năng ức chế enzyme α-amylase tuyến tụy, ở nồng độ 100 μg/ml, chiết xuất nước cho thấy khả năng ức chế tối đa là 89,27% (giá trị IC50 là 68,08 ± 0,06) [43]

Trong các nghiên cứu trước đây, chiết xuất methanol toàn cây đã được đánh giá về các tính chất chống viêm và chống oxy hóa bằng các phương pháp in vitro, aspirin được sử dụng làm chất chuẩn trong nghiên cứu Kết quả cho thấy hoạt tính chống viêm in vitro thông qua ức chế sự biến tính protein albumin do nhiệt cũng như ổn định màng hồng cầu với các giá trị IC50 lần lượt là 288,04 ± 2,78 μg/ml và 467,14 ± 9,56 μg/ml Hoạt tính proteinase cũng bị ức chế đáng kể bởi chiết xuất này với IC50 là 435,28 ± 5,82 μg/ml [87] Chiết xuất ether dầu hỏa của lá Chua me đất hoa vàng cũng như hợp chất β-sitosterol được phân lập từ chiết xuất này đã được chứng minh có hiệu quả chống viêm và giảm đau trong thử nghiệm đĩa nóng, thử nghiệm gây đau do acid acetic và thử nghiệm gây phù chân do carrageenan trên chuột [26]

• Tác dụng chống ung thư:

Chiết xuất ethanol của Oxalis corniculata thể hiện hoạt tính chống khối u đáng kể ở chuột mắc ung thư với sự giảm số lượng tế bào khối u và thể tích khối u phụ thuộc vào liều lượng Các chiết xuất hữu cơ của Oxalis corniculata có khả năng ngăn chặn sự phát triển và tăng trưởng khối u phụ thuộc vào liều trong các tế bào HepG2 trong các nghiên cứu in vitro với nồng độ ức chế hiệu quả là 0,042 mg/ml [80]

Ngoài ra, Chua me đất hoa vàng còn được báo cáo một số tác dụng sinh học khác như: hoạt tính kháng nấm, kháng amip, làm lành vết thương, tránh thai, chống động kinh, chống tiêu chảy, chống loét dạ dày, tác dụng bảo vệ gan và bảo vệ tim…[80], [83], [87]

1.1.5 Sử dụng trong y học cổ truyền

Bộ phận dùng là lá hoặc toàn cây Chua me đất hoa vàng thu hái vào tháng 6 -7 và thường được dùng tươi, ít khi dùng khô

Về công dụng, cây thường được dùng làm thuốc giải nhiệt do có tính hàn và không độc, chữa xích bạch đới, sát trùng Toàn cây Chua me đất hoa vàng sao vàng sắc uống có thể chữa sốt và chữa lỵ hoặc dùng làm thuốc thông tiểu tiện và chữa viêm niệu đạo [1], [4]

Tổng quan về bệnh Đái tháo đường type 2 và thuốc điều trị

1.2.1 Khái niệm Đái tháo đường (ĐTĐ) hay tiểu đường là một nhóm bệnh chuyển hoá với đặc trưng tăng glucose máu Glucose máu gia tăng do sự tiết insulin bị thiếu hụt hoặc do insulin tác dụng kém, hoặc do cả hai Tăng glucose máu mạn tính trong ĐTĐ dẫn đến những tổn thương, rối loạn chức năng và suy yếu nhiều cơ quan, đặc biệt là mắt, thận, thần kinh, tim, mạch máu [2], [3] Bệnh đái tháo đường được phân loại thành các type, như sau:

• Đái tháo đường type 1: do phá hủy tế bào beta tụy, dẫn đến thiếu insulin tuyệt đối

• Đái tháo đường type 2: do giảm chức năng của tế bào beta tụy tiến triển trên nền tảng đề kháng insulin

• Đái tháo đường thai kỳ: là ĐTĐ được chẩn đoán trong 3 tháng giữa hoặc 3 tháng cuối của thai kỳ và không có bằng chứng về ĐTĐ type 1 và type 2 trước đó

• Thể bệnh chuyên biệt của ĐTĐ do các nguyên nhân khác, như ĐTĐ sơ sinh hoặc ĐTĐ do sử dụng thuốc và hoá chất như sử dụng glucocorticoid, điều trị HIV/AIDS hoặc sau cấy ghép mô…

Trong đó, bệnh đái tháo đường type 2 được đặc trưng bởi sự thiếu hụt insulin tương đối do rối loạn chức năng tế bào β của tuyến tụy và kháng insulin ở các cơ quan đích [18]

1.2.2 Nguyên nhân và cơ chế bệnh sinh Đặc điểm quan trọng nhất trong sinh lý bệnh của đái tháo đường type 2 là có sự tương tác giữa yếu tố gen và yếu tố môi trường:

• Yếu tố môi trường: lối sống, chế độ ăn uống gây dư thừa năng lượng

• Các stress về tâm lý

• Tuổi thọ ngày càng tăng, nguy cơ mắc bệnh càng cao [2]

Về cơ chế bệnh sinh của đái tháo đường type 2, nổi bật là hiện tượng kháng insulin, đồng thời có thể gặp tăng nồng độ insulin trong máu Kháng insulin là tình trạng giảm hoặc mất tính nhạy cảm của cơ quan đích với insulin Kháng insulin chính là nguyên nhân gián tiếp dẫn đến suy giảm chức năng bài tiết insulin của tế bào β đảo tụy do các tế bào này phải tăng tiết insulin bù trừ Ở mức độ tế bào, kháng insulin có thể do các nguyên nhân trước, tại hoặc sau receptor insulin Đối với đái tháo đường type 2, kháng insulin chủ yếu do bất thường trong con đường truyền tín hiệu nội bào của insulin sau khi insulin đã gắn vào receptor [7], [89] (Hình 1.3)

Hình 1.3 Một số con đường kháng insulin của tế bào

1.2.3 Hậu quả và biến chứng của đái tháo đường type 2

Các biến chứng của bệnh đái tháo đường thông thường được chia thành hai loại: biến chứng mạch máu lớn (ví dụ: bệnh tim mạch) và biến chứng mạch máu nhỏ (ví dụ: các biến chứng ảnh hưởng đến thận, võng mạc và hệ thần kinh) [7], [106] Các biến chứng của tiểu đường type 2 rất phổ biến, với một nửa số bệnh nhân mắc tiểu đường typ

2 có các biến chứng mạch máu nhỏ và 27% có các biến chứng mạch máu lớn trong một nghiên cứu quan sát ở 28 quốc gia ở châu Á, châu Phi, Nam Mỹ và châu Âu Dựa trên các nghiên cứu từ các quốc gia phát triển, rủi ro tương đối của các rối loạn mạch máu nhỏ và mạch máu lớn ở bệnh nhân mắc bệnh tiểu đường được ước tính tương ứng là cao hơn ít nhất là 10 - 20 lần và 2 - 4 lần so với người không mắc bệnh tiểu đường Trong đó, biến chứng tim mạch là nguyên nhân hàng đầu dẫn tới tử vong ở bệnh nhân đái tháo đường type 2 và cũng là nguyên nhân lớn nhất gây ra chi phí trực tiếp và gián tiếp cho bệnh nhân Các tình trạng phổ biến cùng tồn tại với bệnh đái tháo đường type 2 (ví dụ như tăng huyết áp và rối loạn lipid máu) là những yếu tố nguy cơ rõ ràng đối với bệnh xơ vữa động mạch và bản thân bệnh tiểu đường cũng có nguy cơ độc lập [11], [106] Ngoài ra các biến chứng khác như hạ đường huyết, hôn mê do nhiễm toan ceton, hôn mê do tăng áp lực thẩm thấu máu, nhiễm trùng, tổn thương khớp, tăng kali máu,… cũng dẫn đến những hậu quả nghiêm trọng cho bệnh nhân

1.2.4 Các thuốc điều trị đái tháo đường type 2

Một số nhóm thuốc phổ biến trong điều trị Đái tháo đường type 2:

• Sulfonylurea: Tolbutamid, Chlorpropamid, Gliclazid, Glibenclamid,…

• Thuốc ức chế α-glucosidase: Acarbose, Voglibose, Miglitol,…

• Thuốc ức chế enzym DPP-4 (Gliptin): Sitagliptin, Vildagliptin, Saxagliptin,

• Thuốc đồng vận GLP1: Exenatid, Liraglutid,…

• Thuốc ức chế SGLT-2: Dapagliflozin, Canagliflozin,…

• Các thuốc phòng ngừa và điều trị các biến chứng: biến chứng tim mạch (ức chế men chuyển, các statin, aspirin)…[3], [11]

Ngoài ra, các liệu pháp mới đang được nghiên cứu, ví dụ như PTP1B là một protein điều hòa làm giảm của tín hiệu của insulin, do đó các nghiên cứu về chất ức chế hoạt động của nó, hoặc giảm nồng độ protein bằng các antisense oligonucleotide mới đã được chứng minh là tăng cường hoạt động của insulin trong các mô hình tiền lâm sàng Một số nghiên cứu khác về kiểm soát sự bài tiết quá mức của TNFα hoặc interleukin 6 hoặc ngăn chặn hành động của chúng dự kiến sẽ làm tăng cường độ nhạy với insulin [89]

1.2.5 Một số dược liệu trong điều trị đái tháo đường type 2

Ngày càng có nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng các dược liệu và hợp chất thiên nhiên có thể đóng vai trò quan trọng trong việc kiểm soát đái tháo đường type 2 Dưới đây là một số ví dụ về các nghiên cứu đã được báo cáo:

Bảng 1.1 Một số dược liệu và hợp chất thiên nhiên có tác dụng trong ĐTĐ type 2 [76]

Dược liệu Hợp chất Tác dụng

Adhatoda vasica Nees vasicine, vasicinol Ức chế α-glucosidase

(Burm.f.) Nees andrographolid Ức chế α-amylase

Kuntze epigallocatechin gallat Tăng biểu hiện PPARγ

Glycyrrhiza glabra L isoliquiritigenin, liquiritigenin Hạ glucose máu

Fagonia cretica L Các quinovic acid glycosid Ức chế DPP-4

Hedera nepalensis K.Koch lupeol Ức chế DPP-4

Juglans regia L Các kaempferol-glycosid,

Các quercetin-glycosid, acid chlorogenic Ức chế PTP1B

Tổng quan về gốc tự do và chất chống oxy hóa

Các gốc tự do, được biết đến trong hóa học từ đầu thế kỷ XX, ban đầu được sử dụng để mô tả các hợp chất trung gian trong phản ứng hóa học hữu cơ và vô cơ, và đã có nhiều định nghĩa hóa học cho chúng được đề xuất Chỉ đến năm 1954, khi công trình tiên phong của Daniel Gilbert và Rebecca Gersham được công bố, các gốc tự do này mới được đề xuất là những nhân tố quan trọng trong môi trường sinh học và chịu trách nhiệm cho các quá trình gây hại trong tế bào [48]

Một gốc tự do được định nghĩa là bất kỳ gốc hóa học nào có khả năng tồn tại độc lập, sở hữu một hoặc nhiều electron chưa ghép đôi [85] Do đó các gốc tự do sinh học là những phân tử rất không ổn định có các electron sẵn sàng phản ứng với nhiều chất hữu cơ khác nhau góp phần làm tổn thương oxy hóa phân tử, tế bào, mô, làm phát sinh nhiều bệnh tật và lão hóa Tuy vậy các gốc tự do cũng có nhiều vai trò sinh lý trong cơ thể, chẳng hạn như xúc tác phản ứng enzym, vận chuyển điện tử trong ty thể, truyền tín hiệu tế bào, kích hoạt các yếu tố sao mã trong nhân, biểu hiện gen và chống lại vi sinh vật Ví dụ, các gốc superoxid và nitric oxid được sản sinh từ bạch cầu hạt trung tính và đại thực bào có ảnh hưởng đến quá trình thực bào, giúp tế bào tiêu diệt vi khuẩn [28] Các gốc tự do thường được phân chia thành hai nhóm chính, đó là: các gốc có oxy hoạt động (reactive oxygen species, ROS) và các gốc có nitrogen hoạt động (reactive nitrogen species, RNS) (Bảng 1.2) Phần lớn gốc tự do có nguồn gốc nội sinh trong tế bào, được sản sinh từ ty thể, peroxisome, màng huyết tương, tương bào, các enzym như NO synthase và xanthin oxidase, qua cơ chế viêm, hoạt hóa tế bào miễn dịch, thiếu máu cục bộ, stress tâm thần, ung thư, nhiễm trùng và lão hóa Ngoài ra gốc tự do còn có nguồn ngoại sinh, do chế độ ăn, các loại thuốc, nước - không khí ô nhiễm, ion tia xạ, tia UV, hóa chất, chất độc,…[48]

Bảng 1.2 Một số gốc tự do trong hệ thống sinh học

Các gốc có oxy hoạt động (ROS)

10 Các gốc có nitrogen hoạt động (RNS)

Cùng với các gốc tự do, trong cơ thể còn tồn tại các chất chống oxy hóa Trong đó, một chất chống oxy hóa được định nghĩa là một chất ức chế hoặc trì hoãn các tác dụng không mong muốn của phản ứng oxy hóa trong cơ thể [12] Hệ thống các chất chống oxy hóa trong cơ thể thường được phân thành hai nhóm chính, bao gồm: các enzym chống oxy hóa và các chất chống oxy hóa có khối lượng phân tử thấp (low-molecular- weight antioxidants, LMWA)

• Các enzym chống oxy hóa: Chúng bao gồm superoxid dismutase (SOD) khử ion superoxid, catalase có vai trò xử lý hydro peroxid (H2O2) và glutathione peroxidase (GPx) có chức năng khử các peroxid tế bào,…

• Các chất chống oxy hóa phân tử nhỏ (LMWA): bao gồm nhiều hợp chất có khả năng ngăn ngừa tổn thương oxy hóa thông qua tương tác trực tiếp và/hoặc gián tiếp với ROS Cơ chế gián tiếp liên quan đến việc tạo phức với các kim loại chuyển tiếp để ngăn chúng tham gia vào phản ứng Haber-Weiss do kim loại xúc tác Các phân tử hoạt động trực tiếp có các đặc điểm hóa học cho phép chúng cung cấp electron cho gốc oxy hóa để chúng có thể loại bỏ gốc tự do và ngăn nó tấn công các mục tiêu sinh học Chúng bao gồm cả các hợp chất tan trong nước như vitamin C hoặc glutathion và các hợp chất tan trong lipid như vitamin E, các carotenoid, acid lipoic và coenzym Q10… [48], [85] Phần lớn các chất chống oxy hóa phân tử nhỏ là ngoại sinh, tức là được cung cấp từ chế độ ăn uống Mặc dù cơ thể cũng tổng hợp một số chất chống oxy hóa nội sinh, chẳng hạn như glutathion, số lượng các chất chống oxy hóa này là giới hạn và không có hợp chất nào được sản xuất nội sinh chỉ để hoạt động như chất chống oxy hóa Đa số các chất chống oxy hóa phân tử nhỏ, bao gồm cả những chất chống oxy hóa mạnh mẽ như vitamin C, vitamin E, các polyphenol và carotenoid, đều được hấp thụ từ thức ăn [48]

1.3.3 Hiện tượng stress oxy hóa Đối với một hệ thống sinh học, sự cân bằng giữa chất chống oxy hóa và các chất gây oxy hóa như gốc tự do là rất quan trọng Ở trạng thái bình thường, các tế bào cơ thể có khả năng cân bằng trong sản sinh chất oxy hóa và chất chống oxy hóa Khi sự cân bằng này bị phá vỡ sẽ xảy ra một hiện tượng gọi là “stress oxy hóa” (oxidative stress) Stress oxy hóa xảy ra khi có sự mất cân bằng do tăng nhiều gốc tự do hay gốc có oxy hoạt động (ví dụ trong trường hợp viêm mãn tính) và/hoặc giảm chất chống oxy hóa (ví dụ: do các enzyme chống oxy hóa bị đột biến, độc tố, hoặc do giảm lượng tiêu thụ các chất chống oxy hóa tự nhiên) [85]

Về các tổn thương do tình trạng stress oxy hóa, stress oxy hóa sẽ tác động nhiều tới phân tử sinh học, như peroxide hóa lipid, oxid hóa protein, bất hoạt nhiều enzyme, làm biến đổi DNA, giải phóng calci ion từ kho dự trữ trong tế bào, tổn thương tế bào xương, rối loạn nội môi, tổn thương nhiều tế bào, phát sinh nhiều bệnh tật và lão hóa Stress oxy hóa còn tác động đến mạch máu làm biến đổi trương lực mạch máu, tăng tính thấm nội mô, gây xơ hóa mạch [13] Do đó, càng ngày người ta càng ủng hộ cho quan điểm rằng stress oxy hóa đóng vai trò gây ra nhiều bệnh tật khác nhau Ví dụ điển hình như các bệnh ác tính, tiểu đường, xơ vữa động mạch, viêm mạn tính, nhiễm virus gây suy giảm miễn dịch ở người (HIV), tổn thương do thiếu máu cục bộ và ngưng thở khi ngủ [28].

Tổng quan về các phương pháp in silico sử dụng trong đề tài

1.4.1 Mạng dược lý (network pharmacology)

Nghiên cứu về dược liệu và dược học cổ truyền luôn gặp phải những khó khăn do sự phức tạp của các thành phần có hoạt tính trong dược liệu Có rất nhiều tương tác hiệp đồng và đối kháng giữa các thành phần hóa học khác nhau Hơn nữa, các hợp chất này liên kết với các protein mục tiêu tương ứng một cách tạm thời hoặc yếu và thường phải kết hợp với nhau để điều trị các bệnh theo một phương thức phức tạp Với sự tiến bộ nhanh chóng trong tin sinh học, sinh học hệ thống và khái niệm đa mục tiêu dược lý, khái niệm “mạng dược lý” được Hopkins đưa ra năm 2007, chuyển đổi từ mô hình “một mục tiêu, một thuốc” sang chiến lược “mạng mục tiêu, đa thành phần” đã cung cấp một phương tiện mạnh mẽ cho các nghiên cứu hiện đại về dược liệu và dược học cổ truyền [39] Mô hình tổng quát về nghiên cứu mạng dược lý được trình bày trong Hình 1.4 Về cơ bản, nghiên cứu mạng dược lý tập trung vào dự đoán và phân tích mối quan hệ giữa các thành phần hóa học trong cây thuốc với các đích phân tử tiềm năng của mô hình bệnh tật Do đó, bước đầu khi tiến hành nghiên cứu mạng dược lý là thu thập dữ liệu về các thành phần hóa học của cây thuốc và các đích phân tử của mô hình bệnh tật Việc này có thể thực hiện nhờ sự sẵn có của các cơ sở dữ liệu như PubChem, TCMSP, OMIM, Drugbank,…[108] Sau đó dự đoán sự tương tác giữa các hợp chất mà protein mục tiêu,

12 xây dựng mạng lưới tương tác protein-protein (PPI), phân tích và trực quan hóa mạng để tìm ra các nút (node) trung tâm, đóng vai trò quan trọng trong mạng dược lý Đồng thời các con đường sinh học chính được dự đoán, ví dụ như thông qua các phân tích làm giàu như phân tích con đường KEGG (KEGG pathway) [45] và phân tích bản thể học gen (Gene Ontology – GO) [25] Cuối cùng, việc xác thực hay kiểm định mạng được thực hiện để kiểm tra sự dự đoán tương tác giữa các thành phần hoạt động mạnh và các mục tiêu giả định của chúng thông qua các phương pháp như docking phân tử hay các phương pháp thực nghiệm in vitro và in vivo [63], [108]

Hình 1.4 Mô hình tổng quát về nghiên cứu mạng dược lý [63]

1.4.2 Docking phân tử (molecular docking)

Phương pháp mô phỏng docking đã ra đời từ những năm 1980 và hiện được sử dụng rộng rãi trong quá trình thiết kế thuốc dựa trên cấu trúc nhờ khả năng dự đoán chính xác sự hình thành liên kết giữa phối tử (ligand) và receptor [41] Docking không chỉ xác định các liên kết có ý nghĩa mà còn định lượng khả năng tương tác thông qua các hàm tính điểm, từ đó phân loại các liên kết mạnh yếu của các cấu tử [42] Với lợi thế thực hiện trên máy tính, docking phân tử ngày càng được coi là bước khởi đầu cho nghiên cứu thiết kế thuốc hiện đại nhờ tốc độ và độ chính xác ngày càng cao

Docking thực chất là một bài toán tối ưu, tìm vị trí và cấu hình phù hợp nhất của một phối tử (ligand) gắn kết với protein (Hình 1.5) Về mặt nhiệt động lực học, cấu dạng phù hợp nhất của phối tử là cấu dạng mà phức hợp tạo ra có năng lượng tự do (∆G) thấp nhất, tương đương với cấu dạng bền nhất sau khi tạo thành liên kết giữa phối tử và protein Để làm được điều đó, các phần mềm docking sử dụng các thuật toán tìm kiếm và hàm tính điểm để tìm ra vị trí và hướng của phối tử sao cho phức hợp protein – phối tử có năng lượng tự do liên kết thấp nhất Thuật toán tìm kiếm được chia theo nhiều nhóm khác nhau tùy vào bản chất của chúng, có thể chia thành 4 nhóm: khớp hình dạng (shape matching), tìm kiếm hệ thống (systematic), tìm kiếm ngẫu nhiên (stochastic) và mô phỏng (simulation method) Trong đó thuật toán tìm kiếm ngẫu nhiên được sử dụng phổ biến hơn cả, bao gồm thuật toán di truyền (genetic algorithm), thuật toán Monte Carlo, tìm kiếm Tabu (Tabu search),… trong số đó chủ yếu là thuật toán di truyền được áp dụng trong một số phần mềm như Autodock, GOLD, DockThor, MolDock [82] Sau khi tìm kiếm, hàm tính điểm sẽ được áp dụng để ước tính năng lượng tự do liên kết của phức hợp và sắp xếp chúng theo thứ tự từ thấp đến cao Năng lượng càng thấp thì phức hợp càng ổn định, ái lực liên kết giữa hợp chất và đích càng lớn [42]

Hình 1.5 Nguyên lý của docking phân tử

1.4.3 Mô phỏng động lực học phân tử (Molecular dynamics, MD)

Mô phỏng động lực học phân tử (MD) ghi lại chuyển động của protein và các phân tử sinh học khác với đầy đủ thông tin ở mức độ nguyên tử với độ phân giải tốt, từ đó dự đoán hành vi của mọi nguyên tử trong protein hoặc hệ thống phân tử khác theo thời gian, dựa trên mô hình vật lý chi phối các tương tác giữa các nguyên tử [46] Những mô phỏng này có thể mang lại thông tin về nhiều quá trình phân tử sinh học quan trọng, bao gồm sự thay đổi cấu trúc, liên kết phối tử và cuộn gập của protein, xác định vị trí của tất cả các nguyên tử ở độ phân giải thời gian femto giây Mô phỏng động lực học phân tử (MD) ngày càng có sức ảnh hưởng lớn đối với sinh học phân tử và khám phá thuốc Về mặt định tính, MD có thể cung cấp nhiều thông tin khác nhau để hướng dẫn quá trình tối ưu hóa phối tử Mô phỏng có thể được sử dụng để xác định các tương tác chính mà phối tử tạo ra với túi liên kết từ đó dự đoán sự sắp xếp lại của túi liên kết do phối tử gây ra hoặc để kiểm tra và tinh chỉnh các cấu dạng của các phối tử tiềm năng, cho phép xác định vị trí liên kết và tư thế liên kết của phối tử một cách chính xác hơn [78] Ở cấp độ định lượng, các phương pháp dựa trên mô phỏng MD cung cấp các ước tính chính xác hơn đáng kể về ái lực liên kết (năng lượng tự do) của phối tử với protein cũng như độ ổn định của phức hợp so với các phương pháp tính toán khác như docking [65] Do đó, các mô phỏng động lực học phân tử có thể được sử dụng như một bộ lọc tốn ít chi phí, dựa trên năng lượng liên kết và độ ổn định để đề xuất các ứng cử viên đưa vào thực nghiệm

Về nguyên lý, mô phỏng động lực học phân tử dựa trên 2 thành phần thiết yếu, đó là trường lực và thuật toán tích phân Trường lực chứa tất cả thông tin được cho là cần thiết về các đặc tính lý hóa của các tương tác nguyên tử mà ảnh hưởng đến cấu trúc phân tử và động lực học Về cơ bản phương trình của trường lực có dạng: trong đó thế năng U là một hàm vị trí của mỗi nguyên tử i Phương trình gồm 2 thành phần chính, thể hiện cho 2 loại tương tác: 3 số hạng đầu thể hiện cho tương tác giữa 2 nguyên tử khi có hình thành liên kết (thế năng liên kết) và 2 số hạng cuối thể hiện cho tương tác giữa 2 nguyên tử không liên kết với nhau (thế năng không liên kết) Thế năng liên kết liên quan biến dạng của liên kết (bonds), biến dạng góc (angles) và chuyển động quay của các góc nhị diện (torsions) Thế năng không liên kết mô tả các tương tác tĩnh điện (Coulomb) và tương tác van der Waals giữa các nguyên tử Bằng cách mô tả tất cả đặc điểm này, trường lực có thể cung cấp thông tin giúp thuật toán tích phân xác định

15 được cụ thể vị trí của từng nguyên tử trong hệ Bản chất thuật toán là với vị trí và vận tốc của các nguyên tử tại thời điểm t đã biết, tính toán lực tác dụng trên mỗi nguyên tử bằng trường lực Theo cơ học cổ điển, các lực này sinh ra gia tốc cho mỗi nguyên tử (F⃗ = ma⃗ ), được sử dụng cho việc tích phân các phương trình chuyển động và cập nhật tọa độ và vận tốc mới tại thời điểm t + ∆t, từ đó tạo nên quỹ đạo chuyển động từ thời điểm t đến thời điểm t + ∆t [60]

Về tính toán năng lượng tự do liên kết, mô phỏng động lực học phân tử cho phép mô hình hóa các thay đổi cấu trúc quan trọng đối với quá trình liên kết, dẫn đến việc tính toán các đại lượng nhiệt động lực học liên quan đến ước tính các ái lực liên kết Với những tiến bộ gần đây về khả năng tính toán và độ chính xác, sàng lọc ảo dựa trên MD đã phát triển từ lĩnh vực lý thuyết sang ứng dụng thực tế trong phát triển thuốc Trong đó phương pháp tính toán năng lượng tự do liên kết MM/PB(GB)SA (molecular mechanic/Poisson−Boltzmann (generalized Born) surface area) được áp dụng rộng rãi trong nghiên cứu thiết kế thuốc Phương pháp MM/PB(GB)SA được áp dụng cho phân tử liên kết là phân tử nhỏ, là phương pháp điểm cuối ước tính sự chênh lệch năng lượng tự do liên kết giữa phức hợp protein-phối tử và các thành phần riêng biệt: phối tử và protein đơn lẻ [96] MM/PB(GB)SA cung cấp một giải pháp cân bằng được đặc trưng bởi tính chặt chẽ và độ chính xác tốt hơn so với docking và ít yêu cầu về xử lý, tính toán hơn so với các phương pháp theo lộ trình như các phép biến đổi giả kim (alchemical transformation), phương pháp này yêu cầu thiết lập các thử nghiệm liên quan để lấy mẫu các trạng thái trung gian thông qua việc tách các tương tác phối tử [84]

1.4.4 Lý thuyết phiếm hàm mật độ (Density Functional Theory, DFT)

Vào những năm 1960, lý thuyết phiếm hàm mật độ (DFT) được ra đời Bản chất của lý thuyết xuất phát từ hai giả thuyết có nguồn gốc từ hai bài báo nổi tiếng trên tạp chí Physics Review với khoảng 70.000 trích dẫn cho mỗi bài báo cho tới nay Năm 1964, công bố đầu tiên bởi Walter Kohn và Pierre Hohenberg đã chứng minh rằng: mật độ điện tử n(r) tại điểm r trong không gian là đủ để đặc trưng cho trạng thái năng lượng thấp nhất (hay còn gọi là năng lượng cơ bản) của hệ [38] Định lý này rất quan trọng vì nó chỉ ra rằng chúng ta không cần giải quyết tất cả các hàm sóng của tất cả các điện tử, do đó nó đã giảm lượng tính toán từ 3N chiều không gian của N điện tử (vì mỗi điện tử gồm 3 chiều không gian) xuống còn 3 chiều của mật độ điện tử cho cả hệ Chú ý rằng, trong vật lý hay hoá học thì năng lượng cơ bản là giá trị quan trọng nhất, vì mọi hệ theo tự nhiên thường tồn tại ở xung quanh giá trị năng lượng này Bài báo thứ hai bởi Kohn và Lu Sham năm 1965 đã giải quyết được bài toán của hệ nhiều điện tử khi tìm được phương trình ánh xạ từ mật độ điện tử n(r) tới năng lượng cơ bản của hệ trong một hình thức đơn giản [49] Nhưng hàm mật độ gần đúng được Kohn và Sham sử dụng không đủ chính xác để tính toán năng lượng liên kết hóa học và cấu trúc của các phân tử, vì

16 vậy các nhà hóa học thực nghiệm ít sử dụng nó Tuy nhiên, bắt đầu từ cuối những năm

1980, các nhà vật lý bắt đầu sửa đổi hàm mật độ Kohn-Sham theo cách cải thiện độ chính xác của nó Những nỗ lực này đã dẫn tới thành công của lý thuyết DFT trong thời gian gần đây với giải Nobel hoá học của Kohn và John Pople năm 1998 Trong đó Kohn là người đề xuất phương pháp còn Pople là người đã thực hiện hoá phương pháp vào các mã mô phỏng trên máy tính với phần mềm hóa học tính toán nổi tiếng Gaussian [62]

DFT của Kohn là sự đơn giản hóa tuyệt vời của toán học cơ lượng tử do đó ứng dụng của nó là rất rộng lớn, từ khoa học trái đất, vật lý chất rắn, khoa học vật liệu cho đến cả y dược học Trong đó một ứng dụng quan trọng của tính toán DFT là đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của các hợp chất hóa học Một số chỉ số tính toán được dựa trên lý thuyết phiếm hàm mật độ (DFT) có thể cung cấp thông tin về tính chất chống oxy hóa của các hợp chất Dưới đây là một số chỉ số phổ biến [86]:

Năng lượng HOMO (Highest Occupied Molecular Orbital): đại diện cho khả năng của một phân tử trong việc nhường electron Một hợp chất có năng lượng HOMO cao thường dễ dàng nhường electron hơn, điều này rất quan trọng trong quá trình chống oxy hóa, vì các chất chống oxy hóa hoạt động bằng cách nhường electron để trung hòa các gốc tự do

Chênh lệch năng lượng giữa HOMO và LUMO (HOMO-LUMO gap): Chênh lệch năng lượng giữa HOMO và LUMO (khoảng trống năng lượng) cũng cung cấp thông tin quan trọng về tính chất điện tử và hoạt tính hóa học của phân tử Khoảng trống năng lượng nhỏ thường liên quan đến tính linh hoạt điện tử cao, điều này có thể giúp hợp chất dễ dàng tham gia vào các phản ứng chống oxy hóa

Thế ion hóa (Ionization potential, IP): Chỉ số này liên quan đến cơ chế vận chuyển đơn điện tử (single-electron transfer, SET), trong đó một electron được chuyển từ phân tử chất chống oxy hóa sang gốc tự do (phương trình 1) Do đó, thế ion hóa (IP) càng thấp, việc nhường electron để trung hòa gốc tự do càng dễ dàng [23]

Antox(OH) n → Antox(OH) n + + e – (1) Enthalpy phân ly liên kết O-H (Bond dissociation enthalpy, BDE): là một thuộc tính quan trọng để đánh giá khả năng chống oxy hóa của một hợp chất nhất định thông qua cơ chế vận chuyển nguyên tử hydro (hydrogen-atom transfer, HAT) Cơ chế HAT đã được thiết lập rằng liên kết O-H càng yếu, hoạt động chống oxy hóa càng cao (phương trình 2) BDE được xác định là sự chênh lệch về nhiệt hình thành giữa phân tử và gốc tương ứng, do đó giá trị BDE càng thấp, hoạt tính chống oxy hóa càng cao [61], [99]

NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG

Nguyên liệu, thiết bị

Dữ liệu gen mã hóa các protein từ các cơ sở dữ liệu: GeneCards, OMIM, Drugbank, DisGeNET

Dữ liệu tương tác protein – protein từ cơ sở dữ liệu STRING

Dữ liệu về các đích tác dụng có thể cho hợp chất từ SwissTargetPrediction, SEA, TCMSP

Cấu trúc tinh thể protein được tải về từ Ngân hàng dữ liệu protein - PDB

Cấu trúc 3D của các hợp chất hóa học: PubChem

Cơ sở dữ liệu các bài báo khoa học: PubMed, Google Scholar, Web of Science

Máy tính cá nhân ASUS A14, hệ điều hành Windows 10

Danh sách các phần mềm và công cụ sử dụng:

SwissADME OpenBabel NAMD VMD MolAICal Gaussian 09W PyMOL 2.3.2 CHARMM-GUI

Nội dung nghiên cứu

- Tổng quan tài liệu để xác định thành phần hóa học của cây Chua me đất hoa vàng và sàng lọc các hợp chất có đặc tính giống thuốc và đạt sinh khả dụng đường uống

- Thu thập thông tin về đích tác dụng của các thành phần hóa học và đích phân tử của bệnh đái tháo đường type 2 và sự oxy hóa

- Xây dựng và phân tích mạng tương tác hợp chất – đích tác dụng và mạng tương tác protein của các đích chung Phân tích cấu trúc mạng và phân tích làm giàu GO và con đường KEGG, dự đoán các hợp chất và đích tác dụng tiềm năng

- Tiến hành nghiên cứu mô phỏng docking phân tử và động lực học phân tử giữa các hợp chất và đích tác dụng tiềm năng

- Tính toán DFT các chỉ số đánh giá khả năng chống oxy hóa của các hợp chất tiềm năng

Phương pháp nghiên cứu

Tiến trình thực hiện nghiên cứu được thể hiện tại Hình 2.1

Hình 2.1 Quy trình thực hiện nghiên cứu

2.3.1 Xác định thành phần hóa học của cây Chua me đất hoa vàng và sàng lọc các hợp chất có đặc tính giống thuốc và đạt sinh khả dụng đường uống

Do không có sự sẵn có về thành phần hóa học của Chua me đất hoa vàng trên các cơ sở dữ liệu về cây thuốc và dược liệu, dữ liệu về các hợp chất hóa học trong cây đã được thu thập bằng cách tổng quan từ các bài báo khoa học trong các cơ sở dữ liệu như PubMed, Google Scholar, Web of Science Các hợp chất sau khi được thu thập sẽ được chuẩn hóa tên và thu thập mã SMILES, mã InChIKey dựa trên cơ sở dữ liệu PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/) sau đó được loại bỏ trùng lặp và cấp mã ký hiệu để quản lý

Các hợp chất thu thập được sẽ được dự đoán các đặc tính về sinh khả dụng đường uống và đặc tính giống thuốc thông qua các công cụ TCMSP [77] và SwissADME [21] Các hợp chất thỏa mãn một trong hai điều kiện sau đây được xác định là các hợp chất có đặc tính giống thuốc và đạt sinh khả dụng đường uống, được đưa vào các bước nghiên cứu tiếp theo:

• Có chỉ số trên TCMSP bao gồm: giống thuốc (DL) ≥ 0,18 và sinh khả dụng đường uống (OB) ≥ 30% [53], [105];

• Có chỉ số trên SwissADME bao gồm: đặc tính giống thuốc tốt ( ≥ 2 yes) và hấp thu qua đường tiêu hóa (GI absorption) ở mức cao (high) [98], [103]

2.3.2 Thu thập thông tin về đích tác dụng của các thành phần hóa học và đích phân tử của bệnh đái tháo đường type 2 và stress oxy hóa

Thu thập thông tin về đích tác dụng của các thành phần hóa học đã được sàng lọc

Ngày nay, với sự phát triển của khoa học máy tính, đã có khá nhiều các công cụ hỗ trợ việc dự đoán đích tác dụng của một hợp chất có cấu trúc đã biết Trong số đó, SwissTargetPrediction (http://swisstargetprediction.ch/) [22] và Similarity ensemble approach SEA (https://sea.bkslab.org/) [47] là các công cụ dự đoán mục tiêu dựa trên sự tương đồng hóa học giữa chất cần dự đoán với các phối tử đã biết của đích tác dụng Nền tảng phân tích và cơ sở dữ liệu dược lý hệ thống y học cổ truyền Trung Quốc (TCMSP) (https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php) bao gồm tất cả các dược liệu trong dược điển Trung Quốc là một công cụ cung cấp dữ liệu về mục tiêu phân tử cho các hợp chất hóa học trong dược liệu, các mục tiêu này được tổng hợp từ cả thực nghiệm và mô hình dự đoán [77]

Các hợp chất hóa học của Chua me đất hoa vàng đạt tiêu chuẩn giống thuốc đường uống được nhập vào ba công cụ tìm kiếm trên sử dụng mã SMILES và InChIKey Các đích dự đoán được tải về dưới dạng mã gen, được chuẩn hóa bằng UniProtKB (https://www.uniprot.org/), sau đó loại bỏ trùng lặp

Thu thập thông tin về đích phân tử của đái tháo đường type 2 và sự stress oxy hóa Đã có rất nhiều các cơ sở dữ liệu cung cấp thông tin về gen cũng như đích phân tử liên quan đến các mô hình bệnh tật khác nhau Trong nghiên cứu này, bốn cơ sở dữ liệu được sử dụng để thu thập thông tin về đích tác dụng của bệnh bao gồm: Drugbank (https://go.drugbank.com/), GeneCards (https://www.genecards.org/) [88], DisGeNET (https://www.disgenet.org/search) [66], OMIM (https://omim.org/) [10] Các từ khóa được sử dụng để tìm kiếm bao gồm: “type 2 diabetes”, “diabetic complications”,

“oxidative”, “free radical”, “reactive oxygen species” Các đích phân tử sau khi thu thập được chuẩn hóa mã gen bằng UniProtKB và xóa trùng lặp

2.3.3 Xây dựng và phân tích mạng tương tác hợp chất – đích và mạng tương tác protein – protein

Xây dựng và phân tích mạng tương tác hợp chất – đích tác dụng

Từ danh sách các đích tác dụng của các hợp chất và danh sách các đích phân tử của bệnh, sử dụng công cụ Venny 2.1.0 để xác định ra các đích chung Sử dụng phần mềm Cytoscape 3.9.1 để trực quan hóa mạng tương tác giữa các hợp chất và các đích chung Plugin CytoNCA [94] được sử dụng để phân tích thông số cấu trúc mạng (các thông số được trình bày cụ thể trong phần Xây dựng mạng tương tác protein - protein) Những hợp chất và đích tác dụng có thông số bậc (degree) cao được coi là các hợp chất và đích tác dụng tiềm năng, được sử dụng cho các bước nghiên cứu tiếp theo

Xây dựng và phân tích mạng tương tác protein - protein

Mã gen của các đích chung được nhập vào cơ sở dữ liệu STRING để thu được mạng tương tác protein – protein của các đích chung Cụ thể, cơ sở dữ liệu STRING (https://string-db.org/) là cơ sở dữ liệu về các tương tác protein - protein đã được biết và được dự đoán Cơ sở dữ liệu STRING chứa thông tin từ nhiều nguồn, bao gồm dữ liệu thử nghiệm, phương pháp dự đoán tính toán và bộ thu thập dữ liệu công cộng Phiên bản STRING 11.5 chứa thông tin về khoảng 67 triệu protein từ hơn 14000 sinh vật Các tương tác protein trong STRING được gán điểm dựa trên tính chất và chất lượng của bằng chứng xảy ra tương tác Mỗi tương tác được gán cho một điểm từ 0 đến 1 tương ứng với xác suất tương tác thực sự tồn tại dựa trên các bằng chứng Điểm tin cậy được xác định là điểm tương tác tối thiểu, sao cho chỉ tương tác trên điểm này mới được đưa vào mạng dự đoán [92] Trong nghiên cứu này, điểm tin cậy được chỉ định là 0,7, tức là mức độ tin cậy cao để thu được mạng gồm những tương tác gần với thực tế nhất

Dữ liệu tương tác protein thu về từ STRING được đưa vào phần mềm Cytoscape để trực quan hóa, sử dụng plugin MCODE để phân tích cụm và sử dụng plugin CytoCNA để phân tích cấu trúc mạng 6 thông số cấu trúc mạng được tính toán bao gồm:

21 Bậc (degree centrality, DC): được xác định bằng số cạnh hay số kết nối mà mỗi nút có Nút càng có nhiều cạnh càng đóng vai trò quan trọng [32] Độ trung tâm (betweeness centrality, BC): định lượng số lần một nút (v) hoạt động như một cầu nối trên đường dẫn ngắn nhất kết nối giữa hai nút khác trong mạng lưới Hệ số này được tính bằng công thức BC(v) = ∑ s≠v≠t (σ st (v)/σ st ) với

𝜎𝑠𝑡(𝑣) là tổng số con đường ngắn nhất đi qua 𝑣 giữa 𝑆 và t, 𝜎𝑠𝑡 là tổng số con đường ngắn nhất giữa 2 nút s và t [31] Độ gần (closeness centrality, CC): đo lường mức độ gần gũi của một nút đến tất cả các nút khác trong mạng Nút có CC cao thường có vị trí trung tâm và có thể tiếp cận các nút khác nhanh chóng hơn so với các nút có CC thấp Chỉ số này được tính bằng công thức CC(v)= 1)/∑ u≠v d(v,u) trong đó n là tổng số nút của mạng, d(v,u) là khoảng cách ngắn nhất từ nút v đến nút u [32] Độ trung tâm vector riêng (eigenvector centrality, EC): đo lường tầm quan trọng của một nút trong một mạng lưới không chỉ dựa trên số lượng liên kết trực tiếp mà còn dựa trên chất lượng của các liên kết đó Nói cách khác, một nút sẽ có EC cao nếu nó được kết nối với nhiều nút có độ trung tâm cao EC được tính bằng công thức như sau: xv = 1

𝜆∑ 𝑛 𝑡=1 𝐴 𝑣𝑡 𝑥 𝑡 , trong đó xv là EC của nút v, λ là một hằng số, Avt là phần tử trong ma trận kế 𝐴 biểu thị mối quan hệ giữa nút v và nút t, n là số lượng nút trong mạng [15] Độ trung tâm cộng đồng (network centrality, NC): là một chỉ số mới được nghiên cứu với công thức tính rất phức tạp, dùng để đo lường tầm quan trọng của một nút không chỉ dựa trên số lượng liên kết trực tiếp của nó mà còn dựa trên mức độ liên kết giữa các nút lân cận của nó Nút có NC cao thường nằm ở trung tâm của các cộng đồng liên kết chặt chẽ [97] Độ kết nối trung bình cục bộ (local average connectivity, LAC): đo lường mức độ kết nối trung bình của các nút láng giềng, cung cấp thông tin về cấu trúc cục bộ xung quanh một nút cụ thể trong mạng protein Chỉ số LAC cao có thể chỉ ra rằng một nút nằm trong một cụm chức năng hoặc phức hợp protein, nơi các protein tương tác mạnh mẽ để thực hiện các chức năng sinh học cụ thể LAC được tính bằng công thức:

|𝑁(𝑣)|𝛴 𝑢𝜖𝑁 (𝑣) 𝑘𝑢, trong đó N(v) là tập hợp các nút láng giềng của nút v, |𝑁(𝑣)| số lượng nút láng giềng của nút v (bậc của nút v), ku là bậc của nút u [54]

Sau khi tính toán các thông số mạng, những protein có giá trị các thông số ≥ giá trị trung vị được coi là các protein trung tâm (hub proteins), là những protein đóng vai trò quan trọng trong mạng

2.3.4 Phân tích làm giàu GO và con đường KEGG

Danh sách đích chung được sử dụng để phân tích làm giàu Phân tích này thường được thực hiện bằng hai phương pháp: bản thể học gen (Gene Ontology - GO) và con đường KEGG (KEGG pathway) Phương pháp làm giàu GO (GO enrichment) giúp giải thích dữ liệu bằng cách xác định các quá trình sinh học liên quan trong cơ thể từ danh sách các gen biểu hiện khác nhau Trong khi đó, phân tích con đường KEGG hỗ trợ xác định các con đường mà các gen được làm giàu có liên quan [107]

Danh sách mã gen của các đích chung sẽ được đưa vào công cụ trực tuyến ShinyGO 0.80 (http://bioinformatics.sdstate.edu/go/) [33] để phân tích làm giàu GO và con đường KEGG Lựa chọn giá trị giới hạn cho tỷ lệ phát hiện sai FDR là ≤ 0,05, xác định được các chú thích của GO bao gồm chức năng phân tử (MF), thành phần tế bào (CC), quá trình sinh học (BP) của và con đường chuyển hóa KEGG liên quan nhất tới danh sách các đích đưa vào Các thuật ngữ được lựa chọn dựa theo giá trị FDR và được sắp xếp theo thứ tự từ trên xuống dưới theo giá trị độ bội làm giàu (fold enrichment, FE) giảm dần

2.3.5 Mô phỏng docking phân tử

Bước 1: Chuẩn bị cấu trúc phối tử

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Thu thập dữ liệu về thành phần hóa học của Chua me đất hoa vàng và sàng lọc các hợp chất có đặc tính giống thuốc và đạt sinh khả dụng đường uống

Kết quả tổng quan tài liệu thu thập được danh sách gồm 130 hợp chất hóa học của cây Chua me đất hoa vàng (Oxalis corniculata L.) Danh sách chi tiết tại Phụ lục 1 Sau đó các hợp chất được thu thập mã SMILES và mã InChIKey để tiến hành sàng lọc đặc tính giống thuốc và sinh khả dụng đường uống Kết quả sàng lọc thu được 60 hợp chất đạt yêu cầu (Bảng 3.1) Các hợp chất này được cấp mã ký hiệu để tiến hành các bước nghiên cứu tiếp theo

Bảng 3.1 60 hợp chất có đặc tính giống thuốc và đạt sinh khả dụng đường uống

Mã Hợp chất Phân loại TLTK

MOL09 Acid p-hydroxybenzoic Acid benzoic [57], [64],

MOL10 Acid vanillic Acid benzoic [64]

MOL11 Syringic acid Acid benzoic [64]

MOL12 Apigenin 7,4'-dimethyl ether Flavonoid [87]

MOL14 Acid oxalic Acid carboxylic [64]

MOL15 Ethyl gallat Acid benzoic [57], [64]

MOL18 Acid gallic Acid benzoic [64]

MOL35 Sebacic acid Acid béo [90]

MOL40 2-tert-Butyl-4-isopropyl-5-methylphenol Cumen [27]

MOL42 Carbazic acid, 3-(1-propylbutylidene)- ethyl ester Acid carbonic [27]

MOL43 Oxalic acid, allyl nonyl ester Ester [27]

MOL44 Acid palmitic Acid béo [27], [30]

MOL48 Acid sinapic Acid cinnamic [102]

MOL49 Acid p-coumaric Acid cinnamic [102]

MOL50 Acid caffeic Acid cinnamic [102]

MOL51 24-Methylenecholest-4-en-3β,6β-diol Steroid [5] MOL52 1b,5,5,6a-Tetramethyl-octahydro-1-oxa- cyclopropa[a]inden-6-on Keton [30]

MOL58 Acid pyruvic Keto acid [109]

MOL60 Acid malic Hydroxy acid [1]

Từ kết quả thu thập và sàng lọc, có thể thấy nhóm flavonoid chiếm tỉ lệ về số hợp chất cao nhất trong số 60 hợp chất, cụ thể có 15 hợp chất thuộc nhóm flavonoid (chiếm 25%), các nhóm hợp chất khác như terpenoid, các acid hữu cơ cũng chiếm một tỉ lệ cao; các nhóm còn lại như steroid, alkaloid,… chiếm tỉ lệ nhỏ số hợp chất Tuy chưa thể xác định chính xác hàm lượng của từng nhóm hợp chất do còn thiếu các cơ sở dữ liệu nghiên cứu, nhưng với một số lượng các hợp chất flavonoid trong Chua me đất hoa vàng (Oxalis corniculata L.) đạt sinh khả dụng đường uống cũng đã gợi ra tiềm năng về tác dụng của nhóm chất này

Thu thập dữ liệu về đích tác dụng của các hợp chất và đích phân tử của bệnh đái tháo đường type 2 và stress oxy hóa

Thu thập dữ liệu về đích tác dụng của các hợp chất

Sử dụng các công cụ bao gồm: SwissTargetPrediction, SEA và TCMSP như đã đề cập trong phần phương pháp để thu thập dữ liệu về đích tác dụng của 60 hợp chất tiềm năng sau sàng lọc Các đích tác dụng bao gồm cả những đích đã được xác thực và những đích được dự đoán bằng các mô hình khác nhau Sau khi được chuẩn hóa tên về mã gen và xóa bỏ trùng lặp, thu được tổng cộng 1464 đích tác dụng của 60 hợp chất

Thu thập dữ liệu về đích phân tử của đái tháo đường type 2 và stress oxy hóa

Tiến hành tra cứu và thu thập các gen liên quan đến đái tháo đường type 2 và stress oxy hóa trên các cơ sở dữ liệu Drugbank, GeneCards, DisGeNET và OMIM như phần phương pháp Kết quả thu thập được 3721 gen liên quan đến đái tháo đường type 2 và

2803 gen liên quan đến stress oxy hóa.

Xây dựng và phân tích mạng tương tác hợp chất – đích tác dụng

Xác định các đích chung của hợp chất và bệnh

Biểu đồ Venn được sử dụng để tìm ra các đích chung từ danh sách đích tác dụng của hợp chất và đích phân tử của bệnh Kết quả thu được 706 đích chung của Chua me đất hoa vàng và đái tháo đường type 2; 711 đích chung của Chua me đất hoa vàng và sự oxy hóa; 461 đích chung của Chua me đất hoa vàng và cả hai bệnh (Hình 3.1) Thu thập tất cả đích chung của Chua me đất hoa vàng với hai mô hình bệnh tật thu được 956 đích chung, các đích này được đưa vào các bước nghiên cứu tiếp theo Danh sách mã gen của

956 đích chung được trình bày chi tiết tại Phụ lục 2

Hình 3.1 Biểu đồ venn thể hiện số lượng đích chung của Chua me đất hoa vàng và hai mô hình bệnh tật

Mạng tương tác hợp chất – đích tác dụng

Từ dữ liệu về đích tác dụng của 60 hợp chất cùng với 956 đích chung đã xây dựng được mạng tương tác hợp chất – đích tác dụng nhờ công cụ Cytoscape Kết quả thu được mạng với 1016 nút và 6006 cạnh (tương tác) (Hình 3.2)

Hình 3.2 Mạng tương tác hợp chất – đích

Chú thích: 60 hợp chất của Chua me đất hoa vàng (Oxalis corniculata): nút hình thoi, màu vàng; 245 đích của đái tháo đường type 2 (ĐTĐT2): nút hình chữ nhật, màu cam; 250 đích của oxy hóa (OXH): nút hình chữ nhật màu hồng; 461 đích giao của hai bệnh: nút hình chữ nhật, màu xanh lá

29 Tiến hành phân tích mạng bằng thông số bậc (degree centrality, DC) của các nút trong mạng Thu được 10 hợp chất tiềm năng và 10 đích tác dụng tiềm năng là những nút có bậc cao nhất trong mạng (tức là nhiều tương tác nhất) Danh sách cụ thể được trình bày trong Bảng 3.2 và Bảng 3.3 Sau đó lựa chọn một số hợp chất tiềm năng trong top 10 để tiến hành tính toán DFT đánh giá khả năng chống oxy hóa

Bảng 3.2 Top 10 hợp chất tiềm năng từ mạng tương tác hợp chất – đích

TT Mã Hợp chất Bậc (DC)

Bảng 3.3 Top 10 đích tác dụng tiềm năng từ mạng tương tác hợp chất – đích

TT Mã gen Bậc (DC)

Xây dựng và phân tích mạng tương tác protein – protein (PPIN)

Dựa trên cơ sở dữ liệu tương tác protein STRING (https://string-db.org/), mạng tương tác protein-protein được xây dựng cho 956 đích chung Tương tác giữa các protein được phân làm 3 nhóm: (1) các tương tác đã được kiểm chứng, (2) các tương tác dự đoán dựa trên các phương pháp toán học và (3) một số loại tương tác khác Mạng được

30 xây dựng cho các nút với tương tác có độ tin cậy cao, tức giá trị điểm tương tác tối thiểu (minimum required interaction score) ≥ 0,7 Kết quả tạo được mạng tương tác protein có 911 nút và 9944 cạnh như Hình 3.3

Hình 3.3 Mạng tương tác protein của 956 đích chung

Chú thích: Mỗi chấm tròn trên hình đại diện cho một protein với mã gen tương ứng Kích thước và màu sắc nút càng thể hiện độ lớn của thông số bậc (DC) của mỗi nút

Các nút trong mạng tương tác protein được tính toán 6 thông số như đã mô tả ở phần phương pháp bao gồm: DC, BC, CC, EC, NC, LAC Lọc lấy những nút có giá trị của cả 6 thông số lớn hơn giá trị trung vị, thu được mạng mới bao gồm những protein trung tâm của mạng ban đầu Kết quả sau 2 lần sàng lọc thu được 86 protein trung tâm (Hình 3.4B, Phụ lục 3), những protein này theo lý thuyết mạng được coi là đóng vai trò quan trọng nhất trong mạng và được dự đoán là các đích tác dụng tiềm năng

Hình 3.4 Mạng tương tác protein của các protein trung tâm

Chú thích: Kích thước và màu sắc nút càng thể hiện độ lớn của thông số bậc (DC) của mỗi nút (A) Mạng sau khi được lọc lần một: 236 protein, 4168 tương tác; (B) Mạng sau khi được lọc lần hai: 86 nút và 1514 cạnh

Kết quả phân tích cấu trúc mạng protein cho thấy một số đích tác dụng tiềm năng như AKT1, EGFR, TNF, IL-6, MAPK14, Có thể thấy những protein này đều đóng vai trò quan trọng đối với tế bào và cơ thể Trong đó có những chức năng liên quan đến cơ chế bệnh sinh của đái tháo đường type 2 và chống oxy hóa Ví dụ, AKT1 là một thành

32 phần quan trọng trong con đường tín hiệu insulin, ảnh hưởng đến chuyển hóa glucose và độ nhạy insulin [16] Đồng thời, AKT1 có thể bảo vệ tế bào khỏi apoptosis do stress oxy hóa thông qua các con đường chống apoptosis và điều hòa enzyme chống oxy hóa [93] Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng ức chế EGFR có thể trực tiếp bảo vệ chống lại bệnh thận tiểu đường bằng cách ức chế sự xâm nhập của tế bào miễn dịch và stress oxy hóa trong thận, đồng thời cải thiện tình trạng kháng insulin ở đái tháo đường type 2 [56].

Phân tích làm giàu GO và con đường KEGG

Để xác định rõ hơn về chức năng và vai trò sinh học của protein trong mạng, phân tích bản thể học gen GO và phân tích con đường KEGG được tiến hành Cụ thể phân tích làm giàu được thực hiện nhờ công cụ ShinyGO 0.80 với dữ liệu đầu vào là mã gen của 956 đích chung đã được xác định

Phân tích làm giàu GO giúp chú giải chức năng gen của các protein, bao gồm ba phân tích thành phần: chức năng phân tử (GO Molecular Function), thành phần tế bào (GO Cellular Component) và quá trình sinh học (GO Biological Process) Kết quả các phân tích được trình bày dưới dạng biểu đồ tương ứng Hình 3.5, Hình 3.6 và Hình 3.7, danh sách cụ thể được trình bày tại Phụ lục 4 Top 20 các quá trình và chức năng phân tử được sắp xếp theo giá trị giảm dần của độ bội làm giàu (fold enrichment, FE), màu sắc thể hiện giá trị FDR (false discovery rate – tỷ lệ phát hiện sai), kích thước điểm đại diện cho số gen cùng tham gia vào một con đường

Hình 3.5 Kết quả phân tích làm giàu GO – chức năng phân tử (MF)

Hình 3.6 Kết quả phân tích làm giàu GO – thành phần tế bào (CC)

Hình 3.7 Kết quả phân tích làm giàu GO – quá trình sinh học (BP)

Phân tích chức năng phân tử (MF) cho thấy các gen liên quan đến nhiều chức năng đa dạng từ chuyển hóa năng lượng cho đến quá trình tương tác của protein và truyền tín hiệu tế bào Chức năng liên kết với carbonhydrat và phân tử nhỏ (GO:0097367, GO:0036094) có thể liên quan đến khả năng tương tác của protein với các phân tử như đường và các hợp chất liên quan đến chuyển hóa carbohydrat, do đó các protein này có thể đóng vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh lượng glucose trong máu Các chức năng liên quan đến quá trình oxy hóa khử (NAD(P)H dehydrogenase, oxidoreductase) và truyền electron (GO:0003955, GO:0009055, GO:0016491) có thể có tác động đến sự cân bằng oxy hóa khử trong tế bào, do đó các protein có hoạt động này có thể đóng vai trò trong việc giảm thiểu stress oxy hóa

34 Phân tích thành phần tế bào (CC) cho thấy các gen tập trung vào các thành phần và cấu trúc tế bào quan trọng, đặc biệt là những cấu trúc liên quan đến hoạt động hô hấp, chuyển hóa năng lượng và giao tiếp tế bào Sự thay đổi trong thành phần và chức năng của các tế bào này có thể ảnh hưởng đến quá trình truyền tín hiệu giữa các tế bào và cân bằng oxy hóa khử

Phân tích quá trình sinh học (BP) phản ánh các quá trình phản ứng của tế bào với các hợp chất hóa học và các tín hiệu từ môi trường Một số quá trình như phản ứng với các hợp chất hữu cơ và hóa học (GO:0010243, GO:0014070, GO:1901701, GO:190170, GO:0070887) quá trình chuyển hóa hợp chất phân tử nhỏ (GO:0044281) hay phản ứng với tín hiệu nội sinh (GO:0009719) và ngoại sinh (GO:0009605),… cho thấy sự liên quan của các gen với đái tháo đường type 2, khi có sự biến đổi trong cách cơ thể phản ứng với các hợp chất hữu cơ và tín hiệu tế bào, đặc biệt là các chất như glucose và insulin Sự không cân bằng các quá trình này có thể gây ra biến đổi trong quá trình chuyển hóa chất, góp phần vào phát triển của bệnh Bên cạnh đó, các quá trình như phản ứng với hợp chất chứa oxy (GO:1901700) phản ứng với tín hiệu nội sinh (GO:0009719) và ngoại sinh (GO:0009605), sự chết tế bào (GO:0008219, GO:0010941, GO:0012501), phản ứng với các hợp chất hóa học (GO:0070887), đáp ứng với stress (GO:0006950)… phản ánh mối liên quan của các gen với khả năng chống oxy hóa của tế bào cũng như việc sản xuất và loại bỏ các gốc tự do (ROS)

Một phương pháp khác dùng trong phân tích làm giàu chức năng gen, đó là phân tích các quá trình hóa sinh (con đường sinh học, pathway) mà chúng tham gia vào Một công cụ tin sinh học rất hữu ích trong phân tích này, đó là Bách khoa gen và hệ gen của ĐH Kyoto (KEGG) (https://www.genome.jp/kegg/), phân tích con đường KEGG Kết quả của phân tích này thu được danh mục các con đường hóa sinh quan trọng của 956 đích chung Top 50 con đường có FDR tốt nhất được biểu diễn trong Hình 3.8 và trình bày cụ thể tại Phụ lục 5

Danh sách 50 con đường KEGG được liệt kê dưới đây bao gồm nhiều con đường sinh học liên quan đến bệnh lý, tín hiệu tế bào, viêm, chuyển hóa, và các bệnh khác Trong đó có các con đường có liên quan đến cơ chế bệnh sinh của đái tháo đường type

2 Các con đường chính liên quan trực tiếp đến đái tháo đường type 2 bao gồm: con đường tín hiệu AGE-RAGE trong biến chứng tiểu đường (hsa04933), bệnh cơ tim do tiểu đường (hsa05415), kháng insulin (hsa04931), con đường chuyển hóa (hsa01100) Các con đường này đều có FDR cực kỳ thấp, xấp xỉ 10 -40 , cho thấy gần như chắc chắn các đích chung đóng vai trò quan trọng trong các con đường này

Hình 3.8 Kết quả phân tích con đường KEGG

Trong đó con đường tín hiệu AGE-RAGE trong biến chứng tiểu đường có số gen trong các đích chung đóng góp nhiều nhất (50 gen) Cụ thể các sản phẩm glycat hóa bền vững (advanced glycation end products, AGEs) là một nhóm hợp chất phức tạp như N- epsilon-carboxy-methyl-lysine (CML), N-epsilon-carboxy-ethyl-lysine (CEL),… được tạo ra thông qua quá trình glycat hóa không enzyme và quá trình oxy hóa các protein, lipid và axit nucleic, chủ yếu do lão hóa và trong một số điều kiện bệnh lý như tăng đường huyết Thụ thể chính của AGEs, được biết đến với tên gọi RAGE (receptor for advanced glycation end products) Tín hiệu AGE/RAGE kích hoạt nhiều con đường tín hiệu nội bào liên quan đến NADPH oxidase, protein kinase C và các MAPK, sau đó dẫn đến hoạt động của NF-kappaB, dẫn đến thúc đẩy biểu hiện của các cytokine tiền viêm như IL-1, IL-6 và TNF-alpha và một loạt các gen liên quan đến xơ vữa động mạch, quá

36 apoptosis của tế bào Kết quả của các quá trình truyền tín hiệu này được báo cáo là cơ chế có thể khởi đầu các biến chứng của bệnh tiểu đường [36], [100] Hình 3.9 đã được làm nổi bật các đích tác dụng của các hợp chất tiềm năng trên con đường này, một số đích tác dụng điển hình như TNF, IL-6, MAPK14 (p38),…

Hình 3.9 Con đường KEGG: tín hiệu AGE-RAGE trong biến chứng tiểu đường

Chú thích: đích tác dụng của các hợp chất trong Chua me đất hoa vàng được tô màu đỏ

Bên cạnh đó, không thể không nhắc đến con đường kháng insulin, với 48 gen đích tham gia trong con đường này Điều này đưa ra gợi ý về vai trò của Chua me đất hoa vàng trong giảm tình trạng kháng insulin ở bệnh nhân đái tháo đường type 2 Trong sơ đồ Hình 3.10, có thể thấy các hợp chất của Chua me đất hoa vàng được dự đoán tác động vào các con đường kháng insulin như: ức chế con đường truyền tín hiệu TNF thông qua IL-6 và TNF-alpha, tác động và con đường truyền tín hiệu PI3K/Akt, ức chế hoạt động của các phosphatase bao gồm các PTP và PTEN,… từ đó giảm sự phân hủy và ức chế IRS-1, IRS-2, kích hoạt con đường truyền tín hiệu PI3K/Akt, giảm quá trình viêm, giảm sự ức chế enzyme glycogen synthase (GS) Các tác động đó giúp làm giảm tình trạng kháng insulin của tế bào, đồng thời tăng sự di chuyển của GLUT4 đến bề mặt tế bào, dẫn đến tăng hấp thụ glucose vào trong tế bào và tổng hợp glycogen trong cơ xương, cũng như giảm tổng hợp glucose ở gan và tăng tổng hợp glycogen trong gan

Hình 3.10 Con đường KEGG: kháng insulin

Chú thích: đích tác dụng của các hợp chất trong Chua me đất hoa vàng được tô màu đỏ

Ngoài những con đường chính kể trên, còn có một số con đường liên quan gián tiếp đến đái tháo đường type 2 như bệnh gan nhiễm mỡ không do rượu (hsa04932), con đường tín hiệu FoxO (hsa04068), con đường tín hiệu MAPK (hsa04010), con đường tín hiệu cAMP (hsa04024), con đường tín hiệu calcium (hsa04020), lipid và xơ vữa động mạch (hsa05417),…

38 Xét về các con đường liên quan đến stress oxy hóa, có thể thấy các hợp chất trong Chua me đất hoa vàng tác động lên khá nhiều các con đường bệnh sinh của các bệnh có nguồn gốc từ sự phá hủy của gốc tự do hay stress oxy hóa Một số con đường điển hình như:

• Con đường ung thư do các chất hóa học tạo ra ROS (hsa05208): con đường này liên quan trực tiếp đến sự hình thành các gốc tự do có oxy hoạt động (ROS), gây ra stress oxy hóa, tổn thương DNA và các protein, góp phần vào quá trình sinh ung thư Cụ thể, các chất hóa học như kim loại vi lượng hay chất độc hữu cơ tạo ra các gốc có oxy hoạt động (ROS) tùy thuộc vào khả năng mất electron của chúng và ROS cũng được tạo ra do sự cảm ứng của các isoenzym cytochrome P450 khác nhau trong quá trình giải độc các chất này [37] Hình 3.11 biểu diễn các đích tác dụng mà các hợp chất trong Chua me đất hoa vàng được dự đoán tác động lên con đường này Các đích này bao gồm cả các enzyme CYP450 – là tác nhân tạo ra ROS và cả các protein là đích tác động của ROS như các PTP, PTEN, con đường PIK3/Atk,…Từ đó cho thấy dự đoán về tác động toàn diện của Chua me đất hoa vàng đối với sự làm giảm sản xuất ROS và khắc phục những tổn thương do ROS gây ra

• Các con đường liên quan đến đái tháo đường như con đường tín hiệu AGE-RAGE trong biến chứng đái tháo đường (hsa04933), bệnh cơ tim do tiểu đường (hsa05415), kháng insulin (hsa04931): Các con đường này liên quan mật thiết với stress oxy hóa do việc tạo ra ROS dẫn đến stress oxy hóa và viêm mạn tính góp phần vào tiến triển của bệnh đái tháo đường Các đích tác dụng của Chua me đất hoa vàng cho thấy một hướng điều trị tiểu đường khác của loài cây này đó là làm giảm sản sinh các gốc tự do và stress oxy hóa

Docking phân tử

Từ các phân tích mạng hợp chất – đích, mạng tương tác protein và phân tích làm giàu, lựa chọn được những đích phân tử tiềm năng là các protein trung tâm trong mạng và có vai trò sinh học rõ ràng Đồng thời để đảm bảo mô phỏng có kết quả chính xác, những protein được lựa chọn đều phải có cấu trúc tinh thể tia X với độ phân giải tốt, được xác thực trên cơ sở dữ liệu Protein Data Bank (https://www.rcsb.org/), thu được 9 đích tác dụng tiềm năng để nghiên cứu mô phỏng docking phân tử, danh sách cụ thể được trình bày tại Bảng 3.4

Bảng 3.4 Các protein sử dụng trong nghiên cứu docking

TT Mã gen Tên protein Mã

1 AKT1 RAC-alpha serine/threonine-protein kinase 4GV1 1,49 0,27

2 EGFR Thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì

4 TNF Yếu tố hoại tử khối u alpha (Tumor necrosis factor alpha, TNF-α) 2AZ5 2,10 1,87

14 p38 MAP kinase (p38 Mitogen-activated protein kinase) 1A9U 2,50 1,52

7 PTPN1 Protein-tyrosine phosphatase 1B (PTP1B) 1NNY 2,40 0,93

9 XDH Xanthin oxidase (XO) 3NVY 2,00 1,57

Về phối tử, sử dụng 60 hợp chất có đặc tính giống thuốc và đạt sinh khả dụng đường uống của Chua me đất hoa vàng để tiến hành nghiên cứu mô phỏng docking với

9 đích trên Để thẩm định phương pháp docking, việc docking lại (redocking) phối tử đồng kết tinh trong tinh thể protein ban đầu đã được thực hiện Cụ thể, tinh thể protein tải về từ cơ sở dữ liệu PDB được xóa đi phối tử đồng kết tinh, sau đó tải cấu trúc 3D của các phối tử này từ cơ sở dữ liệu Pubchem và tiến hành docking lại vào tinh thể protein với phương pháp đã được trình bày ở Chương 2 Sau khi thu được cấu dạng sau docking của các phối tử, tính toán giá trị độ lệch trung bình gốc (RMSD) của nó so với cấu dạng ban đầu trong tinh thể Kết quả cho thấy cả 9 phức hợp protein – phối tử đều cho giá trị RMSD của kết quả redock nhỏ hơn 2 Å (Bảng 3.4), do đó phương pháp mô phỏng docking được sử dụng là sát với thực tế và có thể dùng để dự đoán thực nghiệm [50], [67]

Hình 3.12 Biểu đồ nhiệt thể hiện năng lượng liên kết của 60 hợp chất với 9 đích tác dụng tiềm năng

Hợp chất AKT1 EGFR IL6 TNF MAPK14 PTGS2 PTPN1 MGAM XDH

42 Điểm số docking (năng lượng liên kết) của các hợp chất với các protein được thể hiện dưới dạng biểu đồ nhiệt (Hình 3.12) và kết quả cụ thể được trình bày tại Phụ lục

6 Từ kết quả điểm số docking có thể thấy hầu hết các hợp chất đều có khả năng tương tác với trung tâm hoạt động của các protein, điều đó được thể hiện qua việc các hợp chất đều cho năng lượng tự do liên kết âm, chỉ có một số rất ít không gắn được vào trung tâm hoạt động của protein (Phụ lục 6) Từ biểu đồ nhiệt, dễ thấy các hợp chất thể hiện ái lực liên kết tốt nhất với hai đích đó là TNF-α (TNF) và α-glucosidase (MGAM), sau đó đến xanthin oxidase (XO) và COX-2 (PTGS2) Danh sách 10 hợp chất có ái lực cao nhất với

4 protein này được trình bày tại Bảng 3.5

Bảng 3.5 Top 10 hợp chất có ái lực liên kết cao nhất với 4 đích tiềm năng

TT TNF-α MGAM XO COX-2

Từ kết quả docking về năng lượng liên kết của các hợp chất với các đích phân tử, có thể thấy một số hợp chất tiềm năng tạo được ái lực tốt với nhiều protein như MOL01, MOL51, MOL03, MOL08, MOL05,… Trong số các hợp chất này, isovitexin (MOL01) đã thể hiện sự nổi bật về năng lượng liên kết với các đích docking, cụ thể isovitexin có trung bình điểm số docking trên 9 đích là -10,06 kcal/mol (ái lực liên kết ở mức độ mạnh), cho thấy tiềm năng của hợp chất này đối với các đích tác dụng chống tiểu đường và chống oxy hóa Ngoài ra, kết quả này khá tương đồng với top 10 hợp chất tiềm năng được dự đoán từ mạng tương tác hợp chất – đích tác dụng, do đó có thể nói kết quả mô phỏng docking đã củng cố thêm độ tin cậy và góp phần xác thực các dự đoán này

43 Sau đây sẽ phân tích cụ thể về tương tác của các hợp chất với đích TNF-α Là một protein được sản xuất chủ yếu bởi đại thực bào, TNF-α được biết với vai trò chính là một cytokin tiền viêm, thúc đẩy sự phát triển của viêm và kích thích phản ứng miễn dịch, nó cũng có thể gây ra tổn thương tế bào và sự chết tế bào (apoptosis) Bên cạnh đó, như đã phân tích TNF-α còn tham gia vào các con đường dẫn đến kháng insulin và biến chứng đái tháo đường Bằng chứng hiện tại cho thấy rằng việc sử dụng TNF-α ngoại sinh ở động vật có thể gây ra kháng insulin và trung hòa TNF-α có thể cải thiện độ nhạy cảm insulin [59] Ngoài ra, TNF-α cũng được chứng minh là góp phần gây ra sự hình thành ROS thông qua một số con đường như kích hoạt NADPH oxidase (NOX), kích hoạt XO, eNOS…[19] Nghiên cứu hoạt tính ức chế TNF-α của các phân tử nhỏ đã chỉ ra cơ chế làm bất hoạt thông qua sự phân ly của một tiểu đơn vị trong cấu trúc trimer TNF-α có hoạt tính sinh lý [35] Kết quả docking cho thấy có đến 45 trên 60 hợp chất có năng lượng liên kết tốt hơn phối tử đồng kết tinh của tinh thể 2AZ5 (chất ức chế SPD304 [27]) (Phụ lục 6) Trong đó, ba chất có ái lực liên kết lớn nhất là isovitexin (MOL01), 24-methylenecholest-4-en-3β,6β-diol (MOL51) và (+)-larixol (MOL34) với năng lượng tự do liên kết lần lượt là -14,81, -13,68 và -13,32 kcal/mol, tương tác của ba hợp chất này với trung tâm hoạt động của TNF-α được trình bày trong Hình 3.13 Phân tích các tương tác của các hợp chất với dimer TNF-α cho thấy chế độ gắn kết của ba hợp chất khá tương đồng với chất ức chế đồng kết tinh, trong đó tương tác chủ yếu là các tương tác kỵ nước với Tyr59 và Tyr119 ở cả hai chuỗi A và B, tương tác với acid amin Tyr119 được coi là quan trọng cho hoạt tính ức chế bởi đó là vị trí tiếp xúc giữa các monomer [35] Bên cạnh đó các hợp chất còn có khả năng tạo được các liên kết hydro với các amino acid như Ser60, Gln61, Gln149, Leu120,… Trong đó do chứa nhiều nhóm hydroxyl nên isovitexin tạo được nhiều liên kết hydro nhất (Hình 3.13) Kết quả này đã cho thấy tiềm năng to lớn đối với ức chế TNF-α của các hợp chất trong Chua me đất hoa vàng

Trong các nghiên cứu trước đó, đã có rất nhiều kết quả chỉ ra rằng isovitexin có khả năng ức chế việc sản xuất các cytokin tiền viêm như TNF-α, IL-6,…[40], [104] do đó kết quả này đã gợi ý thêm về tác dụng ức chế trực tiếp hoạt động của TNF-α bên cạnh ức chế sản xuất Bên cạnh đó kết quả docking cũng cho thấy các hợp chất có khả năng ức chế con đường tín hiệu MAPK thông qua protein p38 MAPK (MAPK14), điều này càng giúp khẳng định tác dụng ức chế sản xuất cytokin tiền viêm của các hợp chất tiềm năng

Hình 3.13 Mô phỏng tương tác 3D và 2D của ba hợp chất có ái lực tốt nhất với protein TNF-α

Về enzym α-glucosidase, do có vai trò quan trọng trong quá trình tiêu hóa carbohydrat nên việc ức chế enzyme này sẽ giúp kiểm soát lượng glucose được hấp thu sau bữa ăn Vốn là một đích tác dụng của các thuốc điều trị đái tháo đường type 2 phổ biến như acarbose, miglitol và voglibose, các nghiên cứu về tác dụng ức chế alpha- glucosidase từ dược liệu và hợp chất thiên nhiên ngày nay đã trở thành một lĩnh vực nghiên cứu quan trọng trong việc tìm kiếm các phương pháp hỗ trợ điều trị mới và an toàn cho bệnh đái tháo đường type 2 Kết quả nghiên cứu docking của 60 hợp chất trong Chua me đất hoa vàng trên enzym α-glucosidase cho thấy tất cả các hợp chất đều có khả năng tương tác với trung tâm hoạt động của enzym với năng lượng liên kết từ khoảng xấp xỉ -4 kcal/mol đến khoảng -12 kcal/mol, trong đó có 35 hợp chất có năng lượng liên kết cao hơn chất đối chiếu acarbose (Phụ lục 6) Trong số đó, ba hợp chất thể hiện năng lượng liên kết cao nhất với trung tâm hoạt động của enzyme đó là isovitexin (MOL01) với -12,38 kcal/mol, 24-methylenecholest-4-en-3β,6β-diol (MOL51) với -10,80 kcal/mol và dillenetin (MOL13) với -10,77 kcal/mol Kết quả này phù hợp với những nghiên cứu thực nghiệm trước đó về tác dụng ức chế alpha-glucosidase của isovitexin [20] Phân tích tương tác của ba hợp chất này cho thấy các hợp chất tương tác với túi liên kết thông qua các tương tác kỵ nước (tương tác pi-pi, pi-alkyl, alkyl) và tương tác hydro với phần trong của túi liên kết, và chủ yếu là tương tác kỵ nước với các amino acid ở phần ngoài của túi (Hình 3.14) Cụ thể, ba hợp chất tạo được các liên kết hydro nhờ các nhóm hydroxyl và carbonyl trên phân tử với các acid amin như Arg1510, Asp1279, Asp1526, Asp1420,… và các tương tác kỵ nước với các acid amin như Trp1369, Phe1560, Trp1355… Phần lớn các acid amin này đều được báo cáo là quan trọng đối với sự ổn định của acarbose trong trung tâm hoạt động của enzyme cũng như hoạt tính ức chế cạnh tranh với các oligosaccharide [74] Từ đó cho thấy tiềm năng ức chế enzym α-glucosidase cũng như tác dụng kiểm soát đường huyết của các hợp chất trong Chua me đất hoa vàng

Ngoài hai protein trên, các hợp chất cũng thể hiện ái lực liên kết khá tốt với các protein XO và COX-2 Số hợp chất thể hiện điểm số docking tốt hơn chất đối chiếu của

XO và COX-2 lần lượt là 27 và 33 hợp chất (Phụ lục 6), thể hiện ái lực liên kết tốt của các hợp chất với trung tâm hoạt động của các enzym này Về mặt tương tác, các hợp chất trong Chua me đất hoa vàng đều tạo được những tương tác quan trọng với các amino acid trong trung tâm hoạt động của cả hai protein (chế độ tương tác của top 3 hợp chất có ái lực cao nhất với XO và COX-2 được trình bày tại Phụ lục 7) Đáng chú ý là cả hai enzym này đều trực tiếp hoặc gián tiếp tham gia sản xuất gốc tự do dẫn đến tình trạng stress oxy hóa, COX-2 còn là enzym đóng vai trò quan trọng gây ra phản ứng viêm Do đó kết quả docking này đã củng cố cho dự đoán về tác dụng chống oxy hóa và điều trị đái tháo đường type 2 của Chua me đất hoa vàng

Hình 3.14 Mô phỏng tương tác 3D và 2D của ba hợp chất có ái lực tốt nhất với protein α-glucosidase

Mô phỏng động lực học phân tử (MD)

Nghiên cứu mô phỏng động lực học phân tử được thực hiện cho 4 phức hợp của 2 protein và 2 phối tử thể hiện ái lực liên kết cao nhất từ kết quả mô phỏng docking phân tử, đó là TNF-α – MOL01, TNF-α – MOL51, α-glucosidase – MOL01 và α-glucosidase – MOL51

Về kết quả thu được, đầu tiên sự ổn định của hai protein được xem xét thông qua chỉ số RMSF của các acid amin trong protein, chỉ số này cho biết mức độ dao động của các acid amin Nghiên cứu docking phân tử trên các protein, đã xác định được các acid amin nằm trong túi liên kết của hai protein Có thể thấy tại biều đồ Hình 3.15, các acid amin của cả hai protein đều ít dao động (hầu hết các acid amin có RMSF < 2 Å), đặc biệt là các acid amin trong túi liên kết đều ổn định Kết quả này cho thấy sự ổn định của các phức hợp được nghiên cứu mô phỏng

Hình 3.15 RMSF của các acid amin trong hai protein của các phức hợp

Tiếp theo, sự ổn định của các phối tử (MOL01 và MOL51) được phân tích từ kết quả mô phỏng MD thông qua giá trị RMSD của các phối tử theo thời gian Tọa độ vị trí của các nguyên tử trong phối tử được so sánh với tọa độ của chính nó tại thời điểm ban

48 đầu của mô phỏng MD (lấy tọa độ gốc là protein) Từ đồ thị Hình 3.16, ta thấy thời điểm ban đầu của mô phỏng, RMSD của phối tử có sự dao động với biên độ khá lớn, điều này có thể được giải thích do cấu dạng ban đầu của phối tử được lấy từ kết quả docking chưa thực sự chính xác cho nên cần một khoảng thời gian để các phối tử xác định được cấu dạng ổn định nhất trong phức hợp Có thể thấy khoảng thời gian cần thiết để ổn định của mỗi phối tử trong mỗi phức hợp là khác nhau, tuy nhiên nhìn chung từ

80 ns trở về sau (20 ns cuối) các phối tử đều đã tạo được cấu dạng gắn kết bền vững với protein và không bị tách rời khỏi trung tâm hoạt động của protein sau thời gian 100 ns

Cụ thể, giá trị RMSD (trung bình ± độ lệch chuẩn) của MOL01 trong phức hợp với TNF- α và α-glucosidase trong 20 ns cuối lần lượt là 8,37 ± 0,55 Å và 2,23 ± 0,27 Å; còn với MOL51 là 4,79 ± 0,42 Å và 5,90 ± 0,34 Å Có thể thấy độ dao động (độ lệch chuẩn) của giá trị RMSD trong 20 ns cuối đều nhỏ hơn 1 Å, chứng tỏ cấu trúc của các phối tử đã ổn định trong phức hợp

Hình 3.16 RMSD của hai phối tử trong các phức hợp theo thời gian

49 Đồng thời với phân tích độ ổn định của phức hợp, tính toán năng lượng tự do liên kết MM/GBSA cũng đã được tiến hành Năng lượng tự do liên kết (∆Glk) được tính cho các cấu dạng ở giai đoạn cuối của mô phỏng MD, tức là khi phức hợp đã đạt đến trạng thái ổn định Bên cạnh đó, năng lượng tự do liên kết của phối tử đồng kết tinh trong mỗi protein cũng được tính toán để so sánh với hai hợp chất tiềm năng Kết quả năng lượng tính toán được trình bày trong Bảng 3.6 Kết quả cho thấy MOL01 có năng lượng tự do liên kết cao hơn phối tử đồng kết tinh, trong khi MOL51 lại cho kết quả thấp hơn một chút Điều này cho thấy tiềm gắn kết rất tốt của isovitexin (MOL01) với TNF-α và α- glucosidase

Bảng 3.6.Kết quả tính toán năng lượng tự do liên kết của các phức hợp protein – phối tử

Protein Phối tử ∆G lk (kJ/mol)

MOL51 -72,47 Đồng kết tinh -85,47 α-glucosidase

Tính toán DFT đánh giá khả năng chống oxy hóa

Do tiềm năng chống oxy hóa của các hợp chất nhóm flavonoid đã được chứng minh cả về mặt lý thuyết lẫn thực nghiệm, cùng với sự phù hợp về khả năng máy móc, thiết bị tính toán cho các cấu trúc hóa học không quá phức tạp của nhóm chất này, cho nên trong phạm vi đề này chỉ tính toán các thông số DFT cho các hợp chất tiềm năng thuộc nhóm flavonoid Cụ thể, trong số 10 hợp chất tiềm năng được sàng lọc từ kết quả phân tích mạng tương tác hợp chất – đích tác dụng có 6 hợp chất flavonoid, các hợp chất này sẽ được tính toán các thông số dự trên lý thuyết DFT như đã mô tả ở phần phương pháp và được so sánh với acid gallic để đánh giá hoạt tính chống oxy hóa Cả 6 hợp chất này đều thuộc phân nhóm flavon, cấu trúc chung của flavon được đánh số tại Hình 3.17

Hình 3.17 Cấu trúc chung của 6 hợp chất nghiên cứu DFT

Kết quả tính toán năng lượng HOMO, LUMO và chênh lệch năng lượng HOMO-LUMO (HOMO-LUMO gap) được thể hiện ở Bảng 3.7 Các giá trị tính toán được cho thấy không có sự khác biệt đáng kể về năng lượng HOMO giữa các hợp chất flavonoid

50 với chất đối chiếu acid gallic, tuy nhiên mức chênh lệch năng lượng HOMO-LUMO của các hợp chất đều nhỏ hơn so với acid gallic, cho thấy khả năng tham gia vào các phản ứng trung hòa gốc tự do cũng như khả năng tương tác với các đích tác dụng của 6 hợp chất này

Bảng 3.7 Giá trị năng lượng HOMO và LUMO (eV) của các hợp chất tiềm năng

Hợp chất HOMO LUMO HOMO-LUMO gap

Hình 3.18 HOMO của 6 hợp chất nghiên cứu DFT

Phân bố mật độ electron của orbital phân tử bị chiếm giữ cao nhất (HOMO) của 6 hợp chất flavonoid được biểu diễn trong Hình 3.18 Hình này cho thấy mật độ electron phân bố ở cả ba vòng, sự phân bố trên vòng A và C gần như giống nhau ở cả 6 hợp chất

Ta có thể thấy rằng chỉ có một phần điện tích rất nhỏ được phân bố trên phân tử đường của isovitexin, sự phân bố mật độ điện tích chủ yếu nằm ở phần aglycon và nó có cấu trúc tương đồng với của apigenin Ngoài ra một nghiên cứu khác cũng đã chỉ ra rằng apigenin và vitexin có sự phân bố mật độ điện tích tương tự nhau và chủ yếu tập trung

51 ở aglycon [71] Ở phân tử MOL05, có thể nhận thấy rằng HOMO tập trung chủ yếu ở vòng A rồi tới C, chỉ có một phần rất nhỏ không đáng kể phân bố ở vòng B, phù hợp với cấu trúc không có nhóm -OH phenol ở vòng B của hợp chất này

Kết quả tính toán năng lượng enthalpy phân ly liên kết O-H (BDE) và thế ion hóa (IP) được thể hiện tại Bảng 3.8 Trong nghiên cứu này chúng tôi tính toán giá trị BDE cho nhóm 4-OH của acid gallic và lấy làm giá trị đối chiếu do tính khử của nhóm phenol ở carbon số 4 của acid gallic được coi là mạnh nhất bởi nó tạo được gốc ArO• bền nhất và có giá trị BDE thấp nhất [44] Theo giả thuyết về cơ chế vận chuyển nguyên tử hydro (HAT), do giá trị BDE càng thấp, khả năng oxy hóa càng cao cho nên các hợp chất được xét tới đều có giá trị BDE thấp hơn so với acid gallic do đó đều cho thấy tiềm năng chống oxy hóa tốt Trong đó, chất có giá trị BDE thấp nhất được tính toán là MOL08 cho thấy khả năng chống các gốc tự do theo cơ chế HAT dễ dàng nhất, rồi tới MOL01, MOL17 và MOL02 Các hợp chất còn lại có khả năng chống oxy hóa thấp hơn, với giá trị BDE tính được ở mức độ lý thuyết B3LYP/6-31+G(d,p) tương tự như acid gallic

Bảng 3.8 Enthalpy phân ly liên kết (BDE) của các nhóm -OH và thế ion hóa (IP)

(kcal/mol) của các hợp chất

Ta có thể thấy rằng đối với apigenin (MOL17), isovitexin (MOL01) và iristectorigenin A (MOL08) nhóm 4’-OH có giá trị năng lượng phân ly thấp nhất, nghĩa là khả năng cho nguyên tử hydro từ nhóm -OH phenol ở vị trí 4’ từ vòng B dễ dạng hơn so với việc tách hydro ở vị trí 5-OH và 7-OH của vòng A Giá trị BDE của hai nhóm -

OH vòng A cao hơn so với vòng B có thể được giải thích do sự có mặt của liên kết đôi ở vị trí 2, 3 và nhóm carbonyl ở C4 làm tăng mật độ electron trên vòng A khiến cho các nhóm -OH trở nên ít hoạt động hơn Ngoài ra, sự có mặt của liên kết hydro nội phân tử giữa nhóm 4-oxo và 5-OH là lý do khiến cho giá trị BDE của 5-OH lớn hơn so với 7-

OH Khi so sánh BDE của isovitexin với aglycon của nó là apigenin, giá trị BDE của 4'-

OH isovitexin là 81,12 kcal/mol, thấp hơn một chút so với apigenin (81,97 kcal/mol), khoảng 0,85 kcal/mol, tương tự với 5-ArOH, thấp hơn 1,5 kcal/mol, nhưng 7-OH

52 isovitexin lại có giá trị BDE cao hơn so với của apigenin, khoảng 0,33 kcal/mol Điều này có thể là do sự tạo thành liên kết hydro giữa nhóm 7-OH của aglycon và cặp electron tự do của oxy trong phân tử đường glucose, khiến cho việc tách nguyên tử hydro của nhóm 7-OH trở nên khó khăn hơn

Các giá trị IP tính toán được được thể hiện ở Bảng 3.8 Theo lý thuyết cơ chế vận chuyển một electron (SET), thế ion hóa (IP) cũng là thông số có thể dùng để đánh giá khả năng chống oxy hóa; giá trị IP càng thấp, quá trình cho electron càng dễ dàng hơn

So với acid gallic, tất cả các hợp chất được đều có giá trị IP thấp hơn so với giá trị IP của acid gallic (180,62 kcal/mol) Trong đó iristectorigenin A (MOL08) có giá trị IP thấp nhất trong 6 hợp chất được nghiên cứu, kết hợp với kết quả tính toán BDE có thể thấy MOL08 là một chất có hoạt tính chống oxy hóa rất tốt

Theo kết quả tra cứu các nghiên cứu tính toán DFT trước đó của 6 hợp chất này, cho thấy mới chỉ có apigenin (MOL17) đã được tính toán các thông số BDE, IP đánh giá khả năng chống oxy hóa và cho kết quả khá tương đồng với kết quả của nghiên cứu này [71] Các hợp chất isovitexin (MOL01) và acacetin (MOL02) đã được tính toán năng lượng HOMO, LUMO với kết quả không có nhiều sự khác biệt với các giá trị trong

Bảng 3.7, tuy nhiên chưa có nghiên cứu tính toán BDE và IP [9], [24] Các hợp chất còn lại theo kết quả tìm kiếm của chúng tôi gần như chưa từng được nghiên cứu tính toán DFT Trong số 6 hợp chất được nghiên cứu, 3 hợp chất phổ biến là isovitexin (MOL01), acacetin (MOL02) và apigenin (MOL17) đã được chứng minh hoạt tính chống oxy hóa trong nhiều nghiên cứu in vitro và đều cho thấy khả năng dọn dẹp gốc tự do tốt [55], [79], [91] Điều này giúp tăng độ tin cậy của các kết quả tính toán đồng thời làm nổi bật tiềm năng chống oxy của các hợp chất chưa được nghiên cứu nhiều bao gồm iristectorigenin A (MOL08), 5-hydroxy-7,8-dimethoxyflavon (MOL05) và 5-hydroxy-3,6,7,4'-tetramethoxyflavon (MOL38) Như vậy các nghiên cứu tính toán DFT trên đã góp phần làm rõ cơ chế cũng như vai trò của một số hợp chất nhóm flavonoid trong Chua me đất hoa vàng về tác dụng chống oxy hóa của loài cây này.

Bàn luận

3.9.1 Ưu điểm của phương pháp nghiên cứu

Nhìn chung các nghiên cứu in silico đều có ưu điểm nổi bật là tiết kiệm chi phí, thời gian và công sức một cách đáng kể khi các thao tác nghiên cứu được thực hiện nhờ các công cụ máy tính Với sự phát triển của khoa học máy tính, khoa học dữ liệu và trí tuệ nhân tạo, nhiều phần mềm tính toán, cơ sở dữ liệu lớn có thể được tiếp cận một cách dễ dàng, từ đó cung cấp một lượng tài nguyên lớn với chi phí thấp phục vụ các nghiên cứu in silico ở quy mô lớn

53 Phương pháp mạng dược lý (network pharmacology) cung cấp một cái nhìn bao quát về tác dụng của dược liệu nhờ dự đoán cơ chế tác dụng của các hợp chất trong dược liệu trên một quy mô lớn các đích tác dụng Phương pháp này giúp chúng ta dễ dàng dự đoán đa mục tiêu phân tử, đa con đường, đa bệnh mà các hợp chất trong Chua me đất hoa vàng có khả năng tác động đến

Phương pháp docking giúp dự đoán một cách nhanh chóng về khả năng gắn kết của hợp chất với một đích phân tử cụ thể Việc mô phỏng được chế độ tương tác đã cung cấp một cái nhìn sâu sắc về cơ chế hoạt động của các hợp chất ở mức độ phân tử, điều mà các nghiên cứu thực nghiệm rất khó để thực hiện được

Phương pháp mô phỏng động lực học phân tử (MD) được đánh giá là có độ chính xác cao, giúp xác thực kết quả của nghiên cứu docking Phương pháp tính toán năng lượng tự do liên kết MM/GBSA là phương pháp đơn giản và tiết kiệm thời gian so với các phương pháp tính năng lượng tự do liên kết khác

Phương pháp tính toán DFT cho phép phân tích chi tiết các tính chất lượng tử của các hợp chất, bao gồm mật độ electron, năng lượng quỹ đạo phân tử (HOMO và LUMO), và các thông số khác liên quan đến khả năng chống oxy hóa của các hợp chất trong Chua me đất hoa vàng

Sự kết hợp của các phương pháp trên đã cung cấp một nền tảng nghiên cứu in silico mạnh mẽ và toàn diện Bên cạnh đó, hầu hết các bước thực hiện nghiên cứu này đều có thể sử dụng máy tính cá nhân với cấu hình cơ bản, không đòi hỏi thiết bị máy móc phức tạp, tạo điều kiện thuận lợi để tiến hành nghiên cứu

3.9.2 Nhược điểm của phương pháp nghiên cứu

Việc xây dựng và phân tích các mạng dược lý phức tạp có thể dẫn đến sai lệch do thiếu thông tin hoặc dữ liệu không đầy đủ Dữ liệu về các tương tác protein-protein hay các dữ liệu về đích tác dụng của các hợp chất trong Chua me đất hoa vàng đều có sự kết hợp của kết quả dự đoán và thực nghiệm do đó không thể chính xác 100% Hơn nữa, có thể thấy mạng được xây dựng với lượng dữ liệu lớn trở nên quá phức tạp và khó phân tích, dẫn đến việc xác định mục tiêu điều trị chính và các con đường sinh học gặp nhiều khó khăn

Phương pháp docking trong nghiên cứu này giả định cấu trúc của protein là cứng nhắc, chỉ có phối tử linh động, điều này có thể không phản ánh đúng điều kiện môi trường sinh lý tự nhiên khi mọi nguyên tử, phân tử đều chuyển động hỗn loạn không ngừng

Mô phỏng động lực học phân tử đòi hỏi thời gian và tài nguyên tính toán rất lớn, đặc biệt khi mô phỏng các phức hợp trong thời gian đủ dài (100 ns) để nhận xét được sự ổn định của phức hợp Cũng chính vì lý do này, chỉ có 4 phức hợp protein – phối tử tiềm năng nhất được thực hiện mô phỏng MD trong số rất nhiều các phức hợp đã được nghiên

54 cứu docking phân tử Điều này đã làm giảm đi độ mạnh trong kết quả dự đoán tiềm năng của các hợp chất còn lại so với 2 hợp chất được nghiên cứu MD

Tương tự như MD, tính toán DFT đòi hỏi tài nguyên tính toán lớn, đặc biệt khi áp dụng cho các hệ thống lớn có nhiều electron, do đó trong nghiên cứu này tính toán DFT chỉ được áp dụng cho một số hợp chất flavonoid có cấu trúc tương đối đơn giản Việc này vô tình đã bỏ qua tiềm năng chống oxy hóa của các hợp chất khác, làm giảm đi tính toàn diện của nghiên cứu

3.9.3 Tính mới của đề tài

Về mặt phương pháp, việc áp dụng công nghệ in silico trong nghiên cứu dược liệu từ cây Chua me đất hoa vàng là một hướng đi mới, giúp tiết kiệm thời gian và chi phí so với các phương pháp truyền thống Điều này cũng cho phép nghiên cứu sâu hơn vào cơ chế tác động ở cấp độ phân tử Đối với các kết quả nghiên cứu trước đó, Chua me đất hoa vàng (Oxalis corniculata L.) là một loài thực vật khá phổ biến, nhưng các nghiên cứu chi tiết về tác dụng dược lý của nó, đặc biệt trong điều trị đái tháo đường type 2 và chống oxy hóa, còn khá hạn chế Việc nghiên cứu đề tài này đã cung cấp thêm thông tin mới về tiềm năng dược liệu của loài cây này Đề tài này đã nghiên cứu đồng thời tác dụng điều trị đái tháo đường type 2 và chống oxy hóa của Chua me đất hoa vàng So với các nghiên cứu khác thường tập trung vào một khía cạnh dược lý cụ thể, việc nghiên cứu tác dụng kép sẽ mở rộng hiểu biết về lợi ích toàn diện của loài cây này, từ đó có thể ứng dụng trong việc phát triển phương pháp điều trị đa mục tiêu

Kết quả của đề tài nghiên cứu này đã đề xuất được các hợp chất tiềm năng cùng các đích tác dụng chống đái tháo đường type 2 và chống oxy hóa của Chua me đất hoa vàng Từ đó cung cấp một cơ sở khoa học nhất định cho việc phát triển các nghiên cứu tiếp theo cũng như việc ứng dụng tiềm năng của Chua me đất hoa vàng trong nghiên cứu phát triển thuốc và các sản phẩm giúp bảo vệ sức khỏe cộng đồng

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN

Từ các kết quả đã trình bày, đề tài đã hoàn thành được hai mục tiêu:

1 Đã dự đoán và đánh giá tiềm năng của 60 hợp chất hóa học trong Chua me đất hoa vàng (Oxalis corniculata L.) Kết quả docking cho thấy 60 hợp chất này đều có khả năng tương tác với một số đích phân tử liên quan đến đái tháo đường type 2 và stress oxy hóa Trong đó hai hợp chất tạo được ái lực cao nhất với các protein là isovitexin và 24- methylenecholest-4-en-3β,6β-diol đã được nghiên cứu mô phỏng động lực học phân tử và kết quả cho thấy sự ổn định của các phức hợp sau 100 ns 6 hợp chất nhóm flavonoid đã được tính toán các thông số DFT đánh giá khả năng chống oxy hóa và đều cho thấy tiềm năng chống oxy hóa tốt hơn chất đối chiếu acid gallic

2 Đã dự đoán được 956 đích tác dụng của Chua me đất hoa vàng liên quan tới đái tháo đường type 2 và stress oxy hóa, sàng lọc mạng tương tác protein-protein thu được 86 protein trung tâm mạng Kết hợp với phân tích mạng hợp chất – đích tác dụng và phân tích làm giàu GO và KEGG, lựa chọn được 9 đích tác dụng tiềm năng cho nghiên cứu docking Trong đó hai đích có ái lực cao nhất với các hợp chất là TNF-α và α- glucosidase Phân tích các con đường sinh học liên quan đến các đích tác dụng cho thấy một số con đường là mục tiêu chủ yếu của Chua me đất hoa vàng bao gồm các con đường kháng insulin, con đường hấp thu và chuyển hóa carbohydrat, các con đường liên quan đến biến chứng tiểu đường, các con đường ung thư và bệnh lý thần kinh do gốc tự do gây ra

KIẾN NGHỊ Để tiếp tục phát triển các kết quả của đề tài, chúng tôi xin đưa ra các đề xuất sau: