dương quang quý nghiên cứu in silico tác dụng điều trị đái tháo đường type 2 và chống oxy hóa của cây chua me đất hoa vàng oxalis corniculata l

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

DƯƠNG QUANG QUÝ

NGHIÊN CỨU IN SILICO TÁC DỤNG

ĐIỀU TRỊ ĐÁI THÁO ĐƯỜNG TYPE 2 VÀ CHỐNG OXY HÓA CỦA CÂY CHUA

ME ĐẤT HOA VÀNG

(Oxalis corniculata L.)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2024

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

DƯƠNG QUANG QUÝ

Mã sinh viên: 1901584

NGHIÊN CỨU IN SILICO TÁC DỤNG

ĐIỀU TRỊ ĐÁI THÁO ĐƯỜNG TYPE 2 VÀ CHỐNG OXY HÓA CỦA CÂY CHUA

Nơi thực hiện:

Bộ môn Dược liệu

HÀ NỘI – 2024

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình thực hiện khóa luận, tôi đã nhận được rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ và động viên quý báu từ các thầy cô giáo, gia đình và bạn bè.Tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn đến các thầy cô, bạn bè đã hỗ trợ tôi trong quá trình hoàn thành khóa luận tốt

nghiệp dược sĩ Đầu tiên tôi xin bày tỏ sự kính trọng và biết ơn tới PGS.TS Phạm Thế Hải và TS Nguyễn Thanh Tùng, là những người đã định hướng, trực tiếp dẫn dắt,

động viên và cố vấn để tôi có thể hoàn thành khóa luận tốt nghiệp Hai thầy luôn tận tình chỉ dẫn và giúp đỡ cho tôi từ những kiến thức, kĩ năng cơ bản nhất của việc nghiên cứu Các thầy đã truyền động lực cho tôi để tôi thêm yêu và say mê với con đường nghiên cứu khoa học dược

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến nhóm nghiên cứu gồm các anh cựu sinh viên: anh

Lại Đức Anh K71, anh Lê Đăng Huy K72 và anh Lê Quang Bảo K73 đã chỉ dạy cho

tôi những phương pháp nghiên cứu, giúp đỡ, giảng giải cho tôi những vấn đề khó khăn

trong quá trình nghiên cứu Tôi xin gửi lời cảm ơn đến em Hồ Tuệ Tâm K75 và em Nguyễn Thạch Liên K76 đã hỗ trợ máy tính giúp tôi rút ngắn thời gian thực hiện đề tài

Ngoài ra, tôi cũng muốn bày tỏ lòng biết ơn đến Nhà trường cũng như toàn thể các thầy cô đã giảng dạy, cung cấp kiến thức cho tôi để có thể thực hiện được khóa luận tốt nghiệp này

Và cuối cùng là gia đình tôi, cảm ơn bố mẹ, chị gái và những người bạn của tôi đã luôn chăm sóc, ủng hộ, hỗ trợ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu dưới mái trường Đại học Dược Hà Nội

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 01 tháng 06 năm 2024

Sinh viên

Dương Quang Quý

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1.Tổng quan về cây Chua me đất hoa vàng (Oxalis Corniculata L.) 2

1.1.1 Vị trí phân loại và phân bố 2

1.2.2.Nguyên nhân và cơ chế bệnh sinh 6

1.2.3.Hậu quả và biến chứng của đái tháo đường type 2 7

1.2.4.Các thuốc điều trị đái tháo đường type 2 8

1.2.5.Một số dược liệu trong điều trị đái tháo đường type 2 8

1.3.Tổng quan về gốc tự do và chất chống oxy hóa 9

1.3.1.Gốc tự do 9

1.3.2.Chất chống oxy hóa 10

1.3.3.Hiện tượng stress oxy hóa 11

1.4.Tổng quan về các phương pháp in silico sử dụng trong đề tài 11

1.4.1.Mạng dược lý (network pharmacology) 11

1.4.2.Docking phân tử (molecular docking) 13

1.4.3.Mô phỏng động lực học phân tử (Molecular dynamics, MD) 14

1.4.4.Lý thuyết phiếm hàm mật độ (Density Functional Theory, DFT) 15

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG 17

PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.1 Nguyên liệu, thiết bị 17

2.2 Nội dung nghiên cứu 17

2.3 Phương pháp nghiên cứu 18

2.3.1 Xác định thành phần hóa học của cây Chua me đất hoa vàng và sàng lọc các hợp chất có đặc tính giống thuốc và đạt sinh khả dụng đường uống 19

2.3.2 Thu thập thông tin về đích tác dụng của các thành phần hóa học và đích phân tử của bệnh đái tháo đường type 2 và stress oxy hóa 19

2.3.3 Xây dựng và phân tích mạng tương tác hợp chất – đích và mạng tương tác protein – protein 20

2.3.4 Phân tích làm giàu GO và con đường KEGG 22

2.3.5 Mô phỏng docking phân tử 22

2.3.6 Mô phỏng động lực học phân tử (MD) 23

2.3.7 Tính toán DFT 23

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 25

3.1 Thu thập dữ liệu về thành phần hóa học của Chua me đất hoa vàng và sàng lọc các hợp chất có đặc tính giống thuốc và đạt sinh khả dụng đường uống 25

3.2 Thu thập dữ liệu về đích tác dụng của các hợp chất và đích phân tử của bệnh đái tháo đường type 2 và stress oxy hóa 27

3.3 Xây dựng và phân tích mạng tương tác hợp chất – đích tác dụng 27

3.4 Xây dựng và phân tích mạng tương tác protein – protein (PPIN) 29

3.5 Phân tích làm giàu GO và con đường KEGG 32

3.6 Docking phân tử 40

3.7 Mô phỏng động lực học phân tử (MD) 47

3.8 Tính toán DFT đánh giá khả năng chống oxy hóa 49

3.9 Bàn luận 52

3.9.1 Ưu điểm của phương pháp nghiên cứu 52

3.9.2 Nhược điểm của phương pháp nghiên cứu 53

3.9.3 Tính mới của đề tài 54

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 55TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT

AGEs Advanced Glycation End products (các sản phẩm glycat hóa bền vững) AKT1 RAC-alpha serine/threonine-protein kinase

AM1-BCC Austin Model 1 with Bond Charge Correction (mô hình Austin 1 với hiệu chỉnh điện tích liên kết) APG Angiosperm Phylogeny Group

BC Betweeness Centrality (độ trung tâm) BDE Bond Dissociation Enthalpy (enthalpy phân ly liên kết)

BP Biological Process (quá trình sinh học) cAMP cyclic Adenosine Monophosphate (Adenosine Monophosphate vòng)

CC Closeness Centrality (độ gần) COX-2 Cyclooxygenase-2

CYP450 Cytochrome P450 CHARMM Chemistry at Harvard Macromolecular Mechanics (Hóa học

cơ học phân tử lớn Harvard) DC Degree Centrality (bậc trung tâm) DFT Density Functional Theory (lý thuyết phiếm hàm mật độ)

DL Druglikeness (đặc tính giống thuốc) ĐTĐ Đái tháo đường

ĐTĐT2 Đái tháo đường type 2 EC Eigenvector Centrality (độ trung tâm vector riêng) EGFR Epidermal Growth Factor Receptor (Thụ thể của yếu tố tăng trưởng biểu bì) eNOS Endothelial Nitric Oxide Synthase

FDR False Discovery Rate (tỷ lệ phát hiện sai) FE Fold Enrichment (độ bội làm giàu)

GLUT4 Glucose Transporter 4 (kênh vận chuyển glucose 4) GO Gene Ontology (bản thể học gen)

GPx Glutathione Peroxidase GS Glycogen Synthase

GI Gastrointestinal (đường tiêu hóa) HAT Hydrogen-Atom Transfer (vận chuyển nguyên tử hydro) HIV Human Immunodeficiency Virus (virus gây suy giảm miễn dịch ở người) HOMO Highest Occupied Molecular Orbital (orbital phân tử bị chiếm giữ cao nhất)

IC50 Half maximal inhibitory concentration (Nồng độ ức chế 50% số lượng tế bào) IL-6 Interleukin-6

iNOS Inducible Nitric Oxide Synthase IP Ionization Potential (thể ion hóa) IRS Insulin Receptor Substrate

KEGG Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (bách khoa toàn thư Kyoto về gen và hệ gen)

LAC Local Average Connectivity (độ kết nối trung bình cục bộ) LMWA Low-Molecular-Weight Antioxidants (chất chống oxy hóa phân tử lượng thấp) LUMO Lowest Unoccupied Molecular Orbital (orbital phân tử trống thấp nhất) MAPK Mitogen-Activated Protein Kinase (protein kinase kích hoạt

bởi mitogen) MCODE Molecular Complex Detection (phát hiện phức hợp phân tử)

MD Molecular Dynamics (động lực học phân tử) MEP Molecular Electrostatic Potential (thế tĩnh điện phân tử)

MF Molecular Function (chức năng phân tử) MGAM Maltase-glucoamylase

MM/PB(GB)SA Molecular Mechanics/Poisson-Boltzmann (Generalized Born) Surface Area MOE Molecular Operating Environment

NAMD Nanoscale Molecular Dynamics NC Network Centrality

NPT Number of particles, Pressure, Temperature (số lượng hạt, áp suất, nhiệt độ) OB Oral Bioavailability (sinh khả dụng đường uống)

OMIM Online Mendelian Inheritance in Man

PDB Protein Data Bank (ngân hàng dữ liệu protein) PPIN Protein – Protein Interaction Network (mạng tương tác

protein) PTGS2 Prostaglandin-endoperoxide synthase 2

PTP Protein Tyrosine Phosphatase RAGE Receptor for Advanced Glycation End products (thụ thể của

các sản phẩm glycat hóa bền vững) RMSD Root Mean Square Deviation (độ lệch bình phương trung bình gốc)

RMSF Root Mean Square Fluctuation (độ dao động bình phương trung bình gốc) ROS Reactive Oxygen Species (gốc có oxy hoạt động)

SEA Similarity Ensemble Approach (phương pháp tập hợp tương

đồng) SET Single-Electron Transfer (vận chuyển đơn điện tử) SMILES Simplified Molecular Input Line Entry System (Hệ thống nhập liệu phân tử đơn giản)

TCMSP Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform (Cơ sở dữ liệu và nền tảng

phân tích hệ thống dược lý của y học cổ truyền Trung Quốc) TNF Tumor Necrosis Factor

XO Xanthin Oxidase

5 Bảng 3.3 Top 10 đích tác dụng tiềm năng từ mạng tương tác hợp chất – đích 29

6 Bảng 3.4 Các protein sử dụng trong nghiên cứu docking 40

7 Bảng 3.5 Top 10 hợp chất có ái lực liên kết cao nhất với 4 đích tiềm năng 42

8 Bảng 3.6 Kết quả tính toán năng lượng tự do liên kết của các phức hợp protein – phối tử 49

9 Bảng 3.7 Giá trị năng lượng HOMO và LUMO (eV) của các hợp chất tiềm năng 50

10 Bảng 3.8 Enthalpy phân ly liên kết (BDE) của các nhóm

-OH và thế ion hóa (IP) (kcal/mol) của các hợp chất 51

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

1 Hình 1.1 Phân bố loài Oxalis corniculata L trên thế giới 2 2 Hình 1.2 Một số hình ảnh của cây Chua me đất hoa vàng (Oxalis corniculata L.) 3 3 Hình 1.3 Một số con đường kháng insulin của tế bào 7 4 Hình 1.4 Mô hình tổng quát về nghiên cứu mạng dược lý 12

7 Hình 3.1 Biểu đồ venn thể hiện số lượng đích chung của Chua me đất hoa vàng và hai mô hình bệnh tật 27

9 Hình 3.3 Mạng tương tác protein của 956 đích chung 30 10 Hình 3.4 Mạng tương tác protein của các protein trung tâm 31 11 Hình 3.5 Kết quả phân tích làm giàu GO – chức năng phân tử (MF) 32 12 Hình 3.6 Kết quả phân tích làm giàu GO – thành phần tế bào (CC) 33 13 Hình 3.7 Kết quả phân tích làm giàu GO – quá trình sinh học (BP) 33 14 Hình 3.8 Kết quả phân tích con đường KEGG 35 15 Hình 3.9 Con đường KEGG: tín hiệu AGE-RAGE trong biến chứng tiểu đường 36

17 Hình 3.11 Con đường KEGG: con đường ung thư do các chất hóa

18 Hình 3.12 Biểu đồ nhiệt thể hiện năng lượng liên kết của 60 hợp chất với 9 đích tác dụng tiềm năng 41 19 Hình 3.13 Mô phỏng tương tác 3D và 2D của ba hợp chất có ái lực tốt nhất với protein TNF-α 44 20 Hình 3.14 Mô phỏng tương tác 3D và 2D của ba hợp chất có ái lực

21 Hình 3.15 RMSF của các acid amin trong hai protein của các phức hợp 47 22 Hình 3.16 RMSD của hai phối tử trong các phức hợp theo thời gian 48 23 Hình 3.17 Cấu trúc chung của 6 hợp chất nghiên cứu DFT 49 24 Hình 3.18 HOMO của 6 hợp chất nghiên cứu DFT 50

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Đái tháo đường type 2 là một bệnh rối loạn chuyển hóa ngày càng phổ biến trên toàn thế giới, đặc biệt ở các nước đang phát triển Bệnh này không chỉ gây ra các biến chứng nghiêm trọng về tim mạch, thận, thần kinh mà còn làm giảm chất lượng cuộc sống của người bệnh, đồng thời đặt ra gánh nặng lớn cho hệ thống y tế và kinh tế Hiện nay, mặc dù có nhiều loại thuốc điều trị đái tháo đường type 2, nhưng những hạn chế về hiệu quả, tác dụng phụ và chi phí cao vẫn là những thách thức lớn Do đó, việc tìm kiếm các nguồn dược liệu mới, an toàn và hiệu quả từ thiên nhiên đang trở thành một hướng nghiên cứu quan trọng

Chua me đất hoa vàng (Oxalis corniculata L.), một loài cây dại quen thuộc tại

nhiều vùng quê Việt Nam, đã được sử dụng trong y học cổ truyền để điều trị nhiều bệnh lý khác nhau [1], [4] Các nghiên cứu gần đây cho thấy cây Chua me đất chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học mạnh mẽ, đặc biệt là các chống oxy hóa và chống đái tháo đường type 2 [69], [80] Trong đó chống oxy hóa là một cơ chế quan trọng giúp bảo vệ cơ thể khỏi sự tổn thương của các gốc tự do, từ đó có thể ngăn ngừa và hỗ trợ điều trị nhiều bệnh lý, bao gồm đái tháo đường type 2 [48]

Tuy nhiên, các nghiên cứu về tác dụng điều trị đái tháo đường type 2 và khả năng chống oxy hóa của cây Chua me đất hoa vàng còn rất hạn chế và chưa được khai thác

đầy đủ về cơ chế phân tử Sử dụng phương pháp in silico, tức là ứng dụng các công cụ

tin sinh học, hóa học tính toán và mô hình máy tính để dự đoán và phân tích tác dụng của các hợp chất có hoạt tính sinh học, có thể giúp tiết kiệm thời gian và chi phí nghiên cứu, đồng thời cung cấp những hiểu biết sâu sắc về cơ chế tác dụng của các dược liệu tự nhiên [51], [101]

Xuất phát từ những lý do trên, đề tài “Nghiên cứu in silico tác dụng điều trị đái tháo đường type 2 và chống oxy hóa của cây Chua me đất hoa vàng (Oxalis corniculata

L.)” được thực hiện với hai mục tiêu chính là: 1 Dự đoán và đánh giá các thành phần hóa học của cây Chua me đất hoa vàng có

tiềm năng chống đái tháo đường type 2 và chống oxy hóa 2 Dự đoán các đích phân tử và con đường sinh học liên quan đến tác dụng chống

đái tháo đường type 2 và chống oxy hóa của cây Chua me đất hoa vàng

2

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về cây Chua me đất hoa vàng (Oxalis Corniculata L.)

Chua me đất hoa vàng, tên khoa học là Oxalis corniculata L thuộc chi Oxalis, họ Chua me đất Oxalidaceae.[4]

1.1.1 Vị trí phân loại và phân bố

Chua me đất hoa vàng thuộc chi Oxalis L., vị trí phân loại của chi Oxalis L theo

Hệ thống phân loại APG IV [17] như sau : Giới Thực vật (Plantae)

nhiệt đới, một số ít ở vùng ôn đới ấm [1] Ở Việt Nam, chi này được phát hiện có 4 loài,

bao gồm: Chua me đất hoa đỏ (Oxalis deppei Sw.), Chua me núi (Oxalis acetosella L.), Chua me đất hoa vàng (Oxalis corniculata L.) và Chua me đất hoa hồng (Oxalis

corymbosa DC.), trong đó Chua me đất hoa vàng là loài phổ biến nhất Chua me đất hoa

vàng được coi là loài cây khá quen thuộc ở nước ta vì chúng thường mọc hoang ở khắp nơi, từ vùng núi, trung du, đồng bằng đến trên các đảo Loài này còn được thấy ở châu Âu và các nước khác thuộc khu vực châu Á như Ấn Độ, Trung Quốc và các nước Đông Nam Á [1], [4]

Hình 1.1 Phân bố loài Oxalis corniculata L trên thế giới [68]

3

1.1.2 Đặc điểm thực vật

Chua me đất hoa vàng là cây thân thảo mọc lan bò trên mặt đất Thân mảnh, hình trụ, hơi có lông, dài 10-50 cm, rộng 0,1-0,3 cm, màu xanh hoặc đỏ nhạt, chia nhiều nhánh nhỏ màu đỏ nhạt; rễ có màu nâu sẫm, mỏng, phân nhánh, mềm mại Lá có cuống dài 2-12 cm, hơi có lông trắng mịn, gồm ba lá chét gần như nhẵn, mềm, mỗi lá chét có một vết lõm thành hình trái tim ngược Mặt trên lá màu xanh lục, mặt dưới lá màu xanh lam với 5 gân chính, nổi rõ, tỏa đều xuất phát từ đỉnh cuống lá, lông chỉ có ở mặt dưới và bìa phiến Cây không có lá kèm Hoa mọc thành tán gồm 2 đến 3 hoa, màu vàng, cuống dài khoảng 2 cm Đài hoa gồm 5 cánh rời nhau, tràng hoa gồm 5 cánh mỏng dài hơn đài Nhị 10, xếp thành 2 vòng, vòng ngoài gồm 5 nhị lép đối diện với cánh hoa, vòng trong là 5 nhị thụ xen kẽ với cánh hoa, chỉ nhị dạng sợi màu trắng dài 0,15-0,25 cm, bao phấn hình thuôn dài gồm 2 ngăn Nhụy hoa có bầu hình trụ, đỉnh thuôn, 5 ô chứa noãn, đầu nhụy màu vàng, mỗi đầu chia nhiều tua nhỏ Quả thuôn dài đỉnh nhọn, vỏ quả mỏng nhăn nheo, màu xanh, có lông khi chín nứt dọc thành các mảnh cong lại, văng hạt đi xa Hạt hình trứng có đầu nhọn hơi dẹt dài 1 mm, màu nâu đỏ, có các đường rãnh ngang [1], [4], [6]

Chua me đất hoa vàng thường mọc lẫn với các loại cây trồng khác ở vườn, ngoài đồng ruộng, trên đồi và nương rẫy Cây ưa sống nơi ẩm và hơi chịu bóng Hàng năm cây con mọc từ hạt xuất hiện vào cuối mùa xuân, sinh trưởng và ra hoa trong mùa hè khoảng tháng 5-7 và lụi dần vào mùa thu, sau khi đã kết quả Tuy nhiên một số cây mọc muộn vào cuối hè hoặc đầu thu sẽ không bị tàn lụi mà tồn tại qua mùa đông [1]

Hình 1.2 Một số hình ảnh của cây Chua me đất hoa vàng (Oxalis corniculata L.) [68]

4

1.1.3 Thành phần hóa học

Các loại thành phần hóa thực vật khác nhau đã được phân lập trong các nghiên cứu trước đây từ Chua me đất hoa vàng như tannin, flavonoid, polyphenol, steroid, alkaloid, tinh dầu, axit béo, glycosid, Các axit béo thiết yếu như acid palmitic, acid linoleic, acid linolenic, acid stearic và acid oleic cũng đã được phát hiện có mặt trong cây này từ các nghiên cứu trước đây Lá cây là nguồn cung cấp lượng lớn vitamin C và caroten Thân và lá cây chứa lượng lớn acid citric và acid tartaric và thân cây chứa acid malic Nó giàu oxalat như kali oxalat và canxi oxalat Carbohydrate, protein, acid amin, chất xơ và canxi đã được phát hiện trong các chiết xuất methanol và ethanol của cây trong các nghiên cứu trước đây [1], [81] Chiết xuất methanol của cây này được phát hiện giàu các hợp chất phenolic Phân đoạn chloroform của cây này khi được phân tích hóa thực vật đã tiết lộ sự hiện diện của các flavon quan trọng [80] Các thành phần hóa học chi

tiết được tổng hợp tại Phụ lục 1

1.1.4 Tác dụng sinh học

• Tác dụng chống oxy hóa (OXH): Chua me đất hoa vàng được chứng minh là chứa các chất chống oxy hóa với khả năng chống lại gốc tự do cao như các phenolic và flavonoid Các báo cáo về việc sử dụng Chua me đất hoa vàng với tác dụng chống oxy hóa nổi bật hơn so với các hoạt tính sinh học khác và đã được báo cáo trong các thí nghiệm kiểm tra hoạt tính chống OXH với 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH), Nitric oxid và 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonic acid) (ABTS) [80], [83] Trong thử nghiệm DPPH, phân đoạn ethyl acetat cho thấy hoạt tính chống gốc tự do cao nhất, 24% với nồng độ 1 mg/ml

[8] Các chiết xuất methanol và nước của Oxalis corniculata cho thấy khả năng chống

oxy hóa tốt với các giá trị IC50 lần lượt là 118 µg/ml và 112 µg/ml [69] • Tác dụng kháng khuẩn:

Nhiều nhà nghiên cứu đã báo cáo hoạt tính sinh học của cây Chua me đất hoa vàng

trong việc ức chế sự phát triển của các vi khuẩn như Escherichia coli, Salmonella typhi,

Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Shigella dysenteriae, Staphylococcus faecalis, Pseudomonas vesicularis, Aeromonas hydrophilia, Staphylococcus cohnii, Serratia ficaria, Candida albicans, Giardia lamblia, Entamoeba histolytica, Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus epidermis, Salmonella typhimurium và Vibrio cholerae [83]

Các phân tích hóa thực vật của chiết xuất loài này đã phát hiện rằng các flavonoid là thành phần chính mang lại hoạt tính kháng khuẩn của nó [73]

• Tác dụng chống đái tháo đường: Chiết xuất ethanol của cây Chua me đất hoa vàng đã cho thấy khả năng làm giảm glucose máu ở chuột bạch bị tiểu đường do streptozotocin Kết quả từ nghiên cứu này đã xác nhận tiềm năng hạ đường huyết của cây Chua me đất hoa vàng, tuy nhiên các cơ

5 chế phân tử và tế bào liên quan đến hoạt tính chống tiểu đường của cây chua me đất vẫn chưa được làm rõ [80] Chiết xuất methanol của loài này có khả năng ức chế hoạt động của α-amylase và α-glucosidase với các giá trị IC50 lần lượt là 0,35 và 0,03 mg/ml, cho thấy hiệu quả của cây chua me đất như một tác nhân điều trị đái tháo đường [69] Chiết xuất nước của lá cây Chua me đất hoa vàng đã được thử nghiệm về khả năng ức chế enzyme α-amylase tuyến tụy, ở nồng độ 100 μg/ml, chiết xuất nước cho thấy khả năng ức chế tối đa là 89,27% (giá trị IC50 là 68,08 ± 0,06) [43]

• Tác dụng chống viêm: Trong các nghiên cứu trước đây, chiết xuất methanol toàn cây đã được đánh giá về

các tính chất chống viêm và chống oxy hóa bằng các phương pháp in vitro, aspirin được sử dụng làm chất chuẩn trong nghiên cứu Kết quả cho thấy hoạt tính chống viêm in

vitro thông qua ức chế sự biến tính protein albumin do nhiệt cũng như ổn định màng

hồng cầu với các giá trị IC50 lần lượt là 288,04 ± 2,78 μg/ml và 467,14 ± 9,56 μg/ml Hoạt tính proteinase cũng bị ức chế đáng kể bởi chiết xuất này với IC50 là 435,28 ± 5,82 μg/ml [87] Chiết xuất ether dầu hỏa của lá Chua me đất hoa vàng cũng như hợp chất β-sitosterol được phân lập từ chiết xuất này đã được chứng minh có hiệu quả chống viêm và giảm đau trong thử nghiệm đĩa nóng, thử nghiệm gây đau do acid acetic và thử nghiệm gây phù chân do carrageenan trên chuột [26]

• Tác dụng chống ung thư:

Chiết xuất ethanol của Oxalis corniculata thể hiện hoạt tính chống khối u đáng kể

ở chuột mắc ung thư với sự giảm số lượng tế bào khối u và thể tích khối u phụ thuộc

vào liều lượng Các chiết xuất hữu cơ của Oxalis corniculata có khả năng ngăn chặn sự

phát triển và tăng trưởng khối u phụ thuộc vào liều trong các tế bào HepG2 trong các

nghiên cứu in vitro với nồng độ ức chế hiệu quả là 0,042 mg/ml [80]

Ngoài ra, Chua me đất hoa vàng còn được báo cáo một số tác dụng sinh học khác như: hoạt tính kháng nấm, kháng amip, làm lành vết thương, tránh thai, chống động kinh, chống tiêu chảy, chống loét dạ dày, tác dụng bảo vệ gan và bảo vệ tim…[80], [83], [87]

• Đái tháo đường type 1: do phá hủy tế bào beta tụy, dẫn đến thiếu insulin tuyệt đối • Đái tháo đường type 2: do giảm chức năng của tế bào beta tụy tiến triển trên nền

tảng đề kháng insulin • Đái tháo đường thai kỳ: là ĐTĐ được chẩn đoán trong 3 tháng giữa hoặc 3 tháng

cuối của thai kỳ và không có bằng chứng về ĐTĐ type 1 và type 2 trước đó • Thể bệnh chuyên biệt của ĐTĐ do các nguyên nhân khác, như ĐTĐ sơ sinh hoặc

ĐTĐ do sử dụng thuốc và hoá chất như sử dụng glucocorticoid, điều trị HIV/AIDS hoặc sau cấy ghép mô…

Trong đó, bệnh đái tháo đường type 2 được đặc trưng bởi sự thiếu hụt insulin tương đối do rối loạn chức năng tế bào β của tuyến tụy và kháng insulin ở các cơ quan đích [18]

1.2.2 Nguyên nhân và cơ chế bệnh sinh

Đặc điểm quan trọng nhất trong sinh lý bệnh của đái tháo đường type 2 là có sự tương tác giữa yếu tố gen và yếu tố môi trường:

• Yếu tố di truyền • Yếu tố môi trường: lối sống, chế độ ăn uống gây dư thừa năng lượng • Các stress về tâm lý

• Tuổi thọ ngày càng tăng, nguy cơ mắc bệnh càng cao [2] Về cơ chế bệnh sinh của đái tháo đường type 2, nổi bật là hiện tượng kháng insulin, đồng thời có thể gặp tăng nồng độ insulin trong máu Kháng insulin là tình trạng giảm hoặc mất tính nhạy cảm của cơ quan đích với insulin Kháng insulin chính là nguyên nhân gián tiếp dẫn đến suy giảm chức năng bài tiết insulin của tế bào β đảo tụy do các tế bào này phải tăng tiết insulin bù trừ Ở mức độ tế bào, kháng insulin có thể do các nguyên nhân trước, tại hoặc sau receptor insulin Đối với đái tháo đường type 2, kháng insulin chủ yếu do bất thường trong con đường truyền tín hiệu nội bào của insulin sau

khi insulin đã gắn vào receptor [7], [89] (Hình 1.3)

7

Hình 1.3 Một số con đường kháng insulin của tế bào

1.2.3 Hậu quả và biến chứng của đái tháo đường type 2

Các biến chứng của bệnh đái tháo đường thông thường được chia thành hai loại: biến chứng mạch máu lớn (ví dụ: bệnh tim mạch) và biến chứng mạch máu nhỏ (ví dụ: các biến chứng ảnh hưởng đến thận, võng mạc và hệ thần kinh) [7], [106] Các biến chứng của tiểu đường type 2 rất phổ biến, với một nửa số bệnh nhân mắc tiểu đường typ 2 có các biến chứng mạch máu nhỏ và 27% có các biến chứng mạch máu lớn trong một nghiên cứu quan sát ở 28 quốc gia ở châu Á, châu Phi, Nam Mỹ và châu Âu Dựa trên các nghiên cứu từ các quốc gia phát triển, rủi ro tương đối của các rối loạn mạch máu nhỏ và mạch máu lớn ở bệnh nhân mắc bệnh tiểu đường được ước tính tương ứng là cao hơn ít nhất là 10 - 20 lần và 2 - 4 lần so với người không mắc bệnh tiểu đường Trong đó, biến chứng tim mạch là nguyên nhân hàng đầu dẫn tới tử vong ở bệnh nhân đái tháo đường type 2 và cũng là nguyên nhân lớn nhất gây ra chi phí trực tiếp và gián tiếp cho bệnh nhân Các tình trạng phổ biến cùng tồn tại với bệnh đái tháo đường type 2 (ví dụ như tăng huyết áp và rối loạn lipid máu) là những yếu tố nguy cơ rõ ràng đối với bệnh xơ vữa động mạch và bản thân bệnh tiểu đường cũng có nguy cơ độc lập [11], [106] Ngoài ra các biến chứng khác như hạ đường huyết, hôn mê do nhiễm toan ceton, hôn mê do tăng áp lực thẩm thấu máu, nhiễm trùng, tổn thương khớp, tăng kali máu,… cũng dẫn đến những hậu quả nghiêm trọng cho bệnh nhân

8

1.2.4 Các thuốc điều trị đái tháo đường type 2

Một số nhóm thuốc phổ biến trong điều trị Đái tháo đường type 2: • Insulin

• Sulfonylurea: Tolbutamid, Chlorpropamid, Gliclazid, Glibenclamid,… • Biguanid: Metformin

• Thuốc ức chế α-glucosidase: Acarbose, Voglibose, Miglitol,… • Thiazolidinedion (Glitazone): Pioglitazon, Rosiglitazon, • Thuốc ức chế enzym DPP-4 (Gliptin): Sitagliptin, Vildagliptin, Saxagliptin, • Thuốc đồng vận GLP1: Exenatid, Liraglutid,…

• Thuốc ức chế SGLT-2: Dapagliflozin, Canagliflozin,… • Các thuốc phòng ngừa và điều trị các biến chứng: biến chứng tim mạch (ức chế

men chuyển, các statin, aspirin)…[3], [11] Ngoài ra, các liệu pháp mới đang được nghiên cứu, ví dụ như PTP1B là một protein điều hòa làm giảm của tín hiệu của insulin, do đó các nghiên cứu về chất ức chế hoạt động của nó, hoặc giảm nồng độ protein bằng các antisense oligonucleotide mới đã được chứng minh là tăng cường hoạt động của insulin trong các mô hình tiền lâm sàng Một số nghiên cứu khác về kiểm soát sự bài tiết quá mức của TNFα hoặc interleukin 6 hoặc ngăn chặn hành động của chúng dự kiến sẽ làm tăng cường độ nhạy với insulin [89]

1.2.5 Một số dược liệu trong điều trị đái tháo đường type 2

Ngày càng có nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng các dược liệu và hợp chất thiên nhiên có thể đóng vai trò quan trọng trong việc kiểm soát đái tháo đường type 2 Dưới đây là một số ví dụ về các nghiên cứu đã được báo cáo:

Bảng 1.1 Một số dược liệu và hợp chất thiên nhiên có tác dụng trong ĐTĐ type 2 [76]

epigallocatechin gallat Tăng biểu hiện PPARγ

Các quercetin-glycosid, acid chlorogenic

Ức chế PTP1B

Một gốc tự do được định nghĩa là bất kỳ gốc hóa học nào có khả năng tồn tại độc lập, sở hữu một hoặc nhiều electron chưa ghép đôi [85] Do đó các gốc tự do sinh học là những phân tử rất không ổn định có các electron sẵn sàng phản ứng với nhiều chất hữu cơ khác nhau góp phần làm tổn thương oxy hóa phân tử, tế bào, mô, làm phát sinh nhiều bệnh tật và lão hóa Tuy vậy các gốc tự do cũng có nhiều vai trò sinh lý trong cơ thể, chẳng hạn như xúc tác phản ứng enzym, vận chuyển điện tử trong ty thể, truyền tín hiệu tế bào, kích hoạt các yếu tố sao mã trong nhân, biểu hiện gen và chống lại vi sinh vật Ví dụ, các gốc superoxid và nitric oxid được sản sinh từ bạch cầu hạt trung tính và đại thực bào có ảnh hưởng đến quá trình thực bào, giúp tế bào tiêu diệt vi khuẩn [28] Các gốc tự do thường được phân chia thành hai nhóm chính, đó là: các gốc có oxy hoạt động (reactive oxygen species, ROS) và các gốc có nitrogen hoạt động (reactive nitrogen

species, RNS) (Bảng 1.2) Phần lớn gốc tự do có nguồn gốc nội sinh trong tế bào, được

sản sinh từ ty thể, peroxisome, màng huyết tương, tương bào, các enzym như NO synthase và xanthin oxidase, qua cơ chế viêm, hoạt hóa tế bào miễn dịch, thiếu máu cục bộ, stress tâm thần, ung thư, nhiễm trùng và lão hóa Ngoài ra gốc tự do còn có nguồn ngoại sinh, do chế độ ăn, các loại thuốc, nước - không khí ô nhiễm, ion tia xạ, tia UV, hóa chất, chất độc,…[48]

10 Các gốc có nitrogen hoạt động (RNS)

• Các enzym chống oxy hóa: Chúng bao gồm superoxid dismutase (SOD) khử ion superoxid, catalase có vai trò xử lý hydro peroxid (H2O2) và glutathione peroxidase (GPx) có chức năng khử các peroxid tế bào,…

• Các chất chống oxy hóa phân tử nhỏ (LMWA): bao gồm nhiều hợp chất có khả năng ngăn ngừa tổn thương oxy hóa thông qua tương tác trực tiếp và/hoặc gián tiếp với ROS Cơ chế gián tiếp liên quan đến việc tạo phức với các kim loại chuyển tiếp để ngăn chúng tham gia vào phản ứng Haber-Weiss do kim loại xúc tác Các phân tử hoạt động trực tiếp có các đặc điểm hóa học cho phép chúng cung cấp electron cho gốc oxy hóa để chúng có thể loại bỏ gốc tự do và ngăn nó tấn công các mục tiêu sinh học Chúng bao gồm cả các hợp chất tan trong nước như vitamin C hoặc glutathion và các hợp chất tan trong lipid như vitamin E, các carotenoid, acid lipoic và coenzym Q10… [48], [85] Phần lớn các chất chống oxy hóa phân tử nhỏ là ngoại sinh, tức là được cung cấp từ chế độ ăn uống Mặc dù cơ thể cũng tổng hợp một số chất chống oxy hóa nội sinh, chẳng hạn như glutathion, số lượng các chất chống oxy hóa này là giới hạn và không có hợp chất nào được sản xuất nội sinh chỉ để hoạt động như chất chống oxy hóa Đa số các chất chống oxy hóa phân tử nhỏ, bao gồm cả những chất chống oxy hóa mạnh mẽ như vitamin C, vitamin E, các polyphenol và carotenoid, đều được hấp thụ từ thức ăn [48]

11

1.3.3 Hiện tượng stress oxy hóa

Đối với một hệ thống sinh học, sự cân bằng giữa chất chống oxy hóa và các chất gây oxy hóa như gốc tự do là rất quan trọng Ở trạng thái bình thường, các tế bào cơ thể có khả năng cân bằng trong sản sinh chất oxy hóa và chất chống oxy hóa Khi sự cân bằng này bị phá vỡ sẽ xảy ra một hiện tượng gọi là “stress oxy hóa” (oxidative stress) Stress oxy hóa xảy ra khi có sự mất cân bằng do tăng nhiều gốc tự do hay gốc có oxy hoạt động (ví dụ trong trường hợp viêm mãn tính) và/hoặc giảm chất chống oxy hóa (ví dụ: do các enzyme chống oxy hóa bị đột biến, độc tố, hoặc do giảm lượng tiêu thụ các chất chống oxy hóa tự nhiên) [85]

Về các tổn thương do tình trạng stress oxy hóa, stress oxy hóa sẽ tác động nhiều tới phân tử sinh học, như peroxide hóa lipid, oxid hóa protein, bất hoạt nhiều enzyme, làm biến đổi DNA, giải phóng calci ion từ kho dự trữ trong tế bào, tổn thương tế bào xương, rối loạn nội môi, tổn thương nhiều tế bào, phát sinh nhiều bệnh tật và lão hóa Stress oxy hóa còn tác động đến mạch máu làm biến đổi trương lực mạch máu, tăng tính thấm nội mô, gây xơ hóa mạch [13] Do đó, càng ngày người ta càng ủng hộ cho quan điểm rằng stress oxy hóa đóng vai trò gây ra nhiều bệnh tật khác nhau Ví dụ điển hình như các bệnh ác tính, tiểu đường, xơ vữa động mạch, viêm mạn tính, nhiễm virus gây suy giảm miễn dịch ở người (HIV), tổn thương do thiếu máu cục bộ và ngưng thở khi ngủ [28]

1.4 Tổng quan về các phương pháp in silico sử dụng trong đề tài

1.4.1 Mạng dược lý (network pharmacology)

Nghiên cứu về dược liệu và dược học cổ truyền luôn gặp phải những khó khăn do sự phức tạp của các thành phần có hoạt tính trong dược liệu Có rất nhiều tương tác hiệp đồng và đối kháng giữa các thành phần hóa học khác nhau Hơn nữa, các hợp chất này liên kết với các protein mục tiêu tương ứng một cách tạm thời hoặc yếu và thường phải kết hợp với nhau để điều trị các bệnh theo một phương thức phức tạp Với sự tiến bộ nhanh chóng trong tin sinh học, sinh học hệ thống và khái niệm đa mục tiêu dược lý, khái niệm “mạng dược lý” được Hopkins đưa ra năm 2007, chuyển đổi từ mô hình “một mục tiêu, một thuốc” sang chiến lược “mạng mục tiêu, đa thành phần” đã cung cấp một phương tiện mạnh mẽ cho các nghiên cứu hiện đại về dược liệu và dược học cổ truyền

[39] Mô hình tổng quát về nghiên cứu mạng dược lý được trình bày trong Hình 1.4 Về

cơ bản, nghiên cứu mạng dược lý tập trung vào dự đoán và phân tích mối quan hệ giữa các thành phần hóa học trong cây thuốc với các đích phân tử tiềm năng của mô hình bệnh tật Do đó, bước đầu khi tiến hành nghiên cứu mạng dược lý là thu thập dữ liệu về các thành phần hóa học của cây thuốc và các đích phân tử của mô hình bệnh tật Việc này có thể thực hiện nhờ sự sẵn có của các cơ sở dữ liệu như PubChem, TCMSP, OMIM, Drugbank,…[108] Sau đó dự đoán sự tương tác giữa các hợp chất mà protein mục tiêu,

12 xây dựng mạng lưới tương tác protein-protein (PPI), phân tích và trực quan hóa mạng để tìm ra các nút (node) trung tâm, đóng vai trò quan trọng trong mạng dược lý Đồng thời các con đường sinh học chính được dự đoán, ví dụ như thông qua các phân tích làm giàu như phân tích con đường KEGG (KEGG pathway) [45] và phân tích bản thể học gen (Gene Ontology – GO) [25] Cuối cùng, việc xác thực hay kiểm định mạng được thực hiện để kiểm tra sự dự đoán tương tác giữa các thành phần hoạt động mạnh và các mục tiêu giả định của chúng thông qua các phương pháp như docking phân tử hay các

phương pháp thực nghiệm in vitro và in vivo [63], [108]

Hình 1.4 Mô hình tổng quát về nghiên cứu mạng dược lý [63]

13

1.4.2 Docking phân tử (molecular docking)

Phương pháp mô phỏng docking đã ra đời từ những năm 1980 và hiện được sử dụng rộng rãi trong quá trình thiết kế thuốc dựa trên cấu trúc nhờ khả năng dự đoán chính xác sự hình thành liên kết giữa phối tử (ligand) và receptor [41] Docking không chỉ xác định các liên kết có ý nghĩa mà còn định lượng khả năng tương tác thông qua các hàm tính điểm, từ đó phân loại các liên kết mạnh yếu của các cấu tử [42] Với lợi thế thực hiện trên máy tính, docking phân tử ngày càng được coi là bước khởi đầu cho nghiên cứu thiết kế thuốc hiện đại nhờ tốc độ và độ chính xác ngày càng cao

Docking thực chất là một bài toán tối ưu, tìm vị trí và cấu hình phù hợp nhất của

một phối tử (ligand) gắn kết với protein (Hình 1.5) Về mặt nhiệt động lực học, cấu dạng

phù hợp nhất của phối tử là cấu dạng mà phức hợp tạo ra có năng lượng tự do (∆G) thấp nhất, tương đương với cấu dạng bền nhất sau khi tạo thành liên kết giữa phối tử và protein Để làm được điều đó, các phần mềm docking sử dụng các thuật toán tìm kiếm và hàm tính điểm để tìm ra vị trí và hướng của phối tử sao cho phức hợp protein – phối tử có năng lượng tự do liên kết thấp nhất Thuật toán tìm kiếm được chia theo nhiều nhóm khác nhau tùy vào bản chất của chúng, có thể chia thành 4 nhóm: khớp hình dạng (shape matching), tìm kiếm hệ thống (systematic), tìm kiếm ngẫu nhiên (stochastic) và mô phỏng (simulation method) Trong đó thuật toán tìm kiếm ngẫu nhiên được sử dụng phổ biến hơn cả, bao gồm thuật toán di truyền (genetic algorithm), thuật toán Monte Carlo, tìm kiếm Tabu (Tabu search),… trong số đó chủ yếu là thuật toán di truyền được áp dụng trong một số phần mềm như Autodock, GOLD, DockThor, MolDock [82] Sau khi tìm kiếm, hàm tính điểm sẽ được áp dụng để ước tính năng lượng tự do liên kết của phức hợp và sắp xếp chúng theo thứ tự từ thấp đến cao Năng lượng càng thấp thì phức hợp càng ổn định, ái lực liên kết giữa hợp chất và đích càng lớn [42]

Hình 1.5 Nguyên lý của docking phân tử

14

1.4.3 Mô phỏng động lực học phân tử (Molecular dynamics, MD)

Mô phỏng động lực học phân tử (MD) ghi lại chuyển động của protein và các phân tử sinh học khác với đầy đủ thông tin ở mức độ nguyên tử với độ phân giải tốt, từ đó dự đoán hành vi của mọi nguyên tử trong protein hoặc hệ thống phân tử khác theo thời gian, dựa trên mô hình vật lý chi phối các tương tác giữa các nguyên tử [46] Những mô phỏng này có thể mang lại thông tin về nhiều quá trình phân tử sinh học quan trọng, bao gồm sự thay đổi cấu trúc, liên kết phối tử và cuộn gập của protein, xác định vị trí của tất cả các nguyên tử ở độ phân giải thời gian femto giây Mô phỏng động lực học phân tử (MD) ngày càng có sức ảnh hưởng lớn đối với sinh học phân tử và khám phá thuốc Về mặt định tính, MD có thể cung cấp nhiều thông tin khác nhau để hướng dẫn quá trình tối ưu hóa phối tử Mô phỏng có thể được sử dụng để xác định các tương tác chính mà phối tử tạo ra với túi liên kết từ đó dự đoán sự sắp xếp lại của túi liên kết do phối tử gây ra hoặc để kiểm tra và tinh chỉnh các cấu dạng của các phối tử tiềm năng, cho phép xác định vị trí liên kết và tư thế liên kết của phối tử một cách chính xác hơn [78] Ở cấp độ định lượng, các phương pháp dựa trên mô phỏng MD cung cấp các ước tính chính xác hơn đáng kể về ái lực liên kết (năng lượng tự do) của phối tử với protein cũng như độ ổn định của phức hợp so với các phương pháp tính toán khác như docking [65] Do đó, các mô phỏng động lực học phân tử có thể được sử dụng như một bộ lọc tốn ít chi phí, dựa trên năng lượng liên kết và độ ổn định để đề xuất các ứng cử viên đưa vào thực nghiệm Về nguyên lý, mô phỏng động lực học phân tử dựa trên 2 thành phần thiết yếu, đó là trường lực và thuật toán tích phân Trường lực chứa tất cả thông tin được cho là cần thiết về các đặc tính lý hóa của các tương tác nguyên tử mà ảnh hưởng đến cấu trúc phân tử và động lực học Về cơ bản phương trình của trường lực có dạng:

trong đó thế năng U là một hàm vị trí của mỗi nguyên tử i Phương trình gồm 2 thành phần chính, thể hiện cho 2 loại tương tác: 3 số hạng đầu thể hiện cho tương tác giữa 2 nguyên tử khi có hình thành liên kết (thế năng liên kết) và 2 số hạng cuối thể hiện cho tương tác giữa 2 nguyên tử không liên kết với nhau (thế năng không liên kết) Thế năng liên kết liên quan biến dạng của liên kết (bonds), biến dạng góc (angles) và chuyển động quay của các góc nhị diện (torsions) Thế năng không liên kết mô tả các tương tác tĩnh điện (Coulomb) và tương tác van der Waals giữa các nguyên tử Bằng cách mô tả tất cả đặc điểm này, trường lực có thể cung cấp thông tin giúp thuật toán tích phân xác định

15 được cụ thể vị trí của từng nguyên tử trong hệ Bản chất thuật toán là với vị trí và vận tốc của các nguyên tử tại thời điểm t đã biết, tính toán lực tác dụng trên mỗi nguyên tử bằng trường lực Theo cơ học cổ điển, các lực này sinh ra gia tốc cho mỗi nguyên tử (F⃗ = ma⃗ ), được sử dụng cho việc tích phân các phương trình chuyển động và cập nhật tọa độ và vận tốc mới tại thời điểm t + ∆t, từ đó tạo nên quỹ đạo chuyển động từ thời điểm t đến thời điểm t + ∆t [60]

Về tính toán năng lượng tự do liên kết, mô phỏng động lực học phân tử cho phép mô hình hóa các thay đổi cấu trúc quan trọng đối với quá trình liên kết, dẫn đến việc tính toán các đại lượng nhiệt động lực học liên quan đến ước tính các ái lực liên kết Với những tiến bộ gần đây về khả năng tính toán và độ chính xác, sàng lọc ảo dựa trên MD đã phát triển từ lĩnh vực lý thuyết sang ứng dụng thực tế trong phát triển thuốc Trong đó phương pháp tính toán năng lượng tự do liên kết MM/PB(GB)SA (molecular mechanic/Poisson−Boltzmann (generalized Born) surface area) được áp dụng rộng rãi trong nghiên cứu thiết kế thuốc Phương pháp MM/PB(GB)SA được áp dụng cho phân tử liên kết là phân tử nhỏ, là phương pháp điểm cuối ước tính sự chênh lệch năng lượng tự do liên kết giữa phức hợp protein-phối tử và các thành phần riêng biệt: phối tử và protein đơn lẻ [96] MM/PB(GB)SA cung cấp một giải pháp cân bằng được đặc trưng bởi tính chặt chẽ và độ chính xác tốt hơn so với docking và ít yêu cầu về xử lý, tính toán hơn so với các phương pháp theo lộ trình như các phép biến đổi giả kim (alchemical transformation), phương pháp này yêu cầu thiết lập các thử nghiệm liên quan để lấy mẫu các trạng thái trung gian thông qua việc tách các tương tác phối tử [84]

1.4.4 Lý thuyết phiếm hàm mật độ (Density Functional Theory, DFT)

Vào những năm 1960, lý thuyết phiếm hàm mật độ (DFT) được ra đời Bản chất của lý thuyết xuất phát từ hai giả thuyết có nguồn gốc từ hai bài báo nổi tiếng trên tạp chí Physics Review với khoảng 70.000 trích dẫn cho mỗi bài báo cho tới nay Năm 1964, công bố đầu tiên bởi Walter Kohn và Pierre Hohenberg đã chứng minh rằng: mật độ điện tử n(r) tại điểm r trong không gian là đủ để đặc trưng cho trạng thái năng lượng thấp nhất (hay còn gọi là năng lượng cơ bản) của hệ [38] Định lý này rất quan trọng vì nó chỉ ra rằng chúng ta không cần giải quyết tất cả các hàm sóng của tất cả các điện tử, do đó nó đã giảm lượng tính toán từ 3N chiều không gian của N điện tử (vì mỗi điện tử gồm 3 chiều không gian) xuống còn 3 chiều của mật độ điện tử cho cả hệ Chú ý rằng, trong vật lý hay hoá học thì năng lượng cơ bản là giá trị quan trọng nhất, vì mọi hệ theo tự nhiên thường tồn tại ở xung quanh giá trị năng lượng này Bài báo thứ hai bởi Kohn và Lu Sham năm 1965 đã giải quyết được bài toán của hệ nhiều điện tử khi tìm được phương trình ánh xạ từ mật độ điện tử n(r) tới năng lượng cơ bản của hệ trong một hình thức đơn giản [49] Nhưng hàm mật độ gần đúng được Kohn và Sham sử dụng không đủ chính xác để tính toán năng lượng liên kết hóa học và cấu trúc của các phân tử, vì

16 vậy các nhà hóa học thực nghiệm ít sử dụng nó Tuy nhiên, bắt đầu từ cuối những năm 1980, các nhà vật lý bắt đầu sửa đổi hàm mật độ Kohn-Sham theo cách cải thiện độ chính xác của nó Những nỗ lực này đã dẫn tới thành công của lý thuyết DFT trong thời gian gần đây với giải Nobel hoá học của Kohn và John Pople năm 1998 Trong đó Kohn là người đề xuất phương pháp còn Pople là người đã thực hiện hoá phương pháp vào các mã mô phỏng trên máy tính với phần mềm hóa học tính toán nổi tiếng Gaussian [62]

DFT của Kohn là sự đơn giản hóa tuyệt vời của toán học cơ lượng tử do đó ứng dụng của nó là rất rộng lớn, từ khoa học trái đất, vật lý chất rắn, khoa học vật liệu cho đến cả y dược học Trong đó một ứng dụng quan trọng của tính toán DFT là đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của các hợp chất hóa học Một số chỉ số tính toán được dựa trên lý thuyết phiếm hàm mật độ (DFT) có thể cung cấp thông tin về tính chất chống oxy hóa của các hợp chất Dưới đây là một số chỉ số phổ biến [86]:

Năng lượng HOMO (Highest Occupied Molecular Orbital): đại diện cho khả năng của một phân tử trong việc nhường electron Một hợp chất có năng lượng HOMO cao thường dễ dàng nhường electron hơn, điều này rất quan trọng trong quá trình chống oxy hóa, vì các chất chống oxy hóa hoạt động bằng cách nhường electron để trung hòa các gốc tự do

Chênh lệch năng lượng giữa HOMO và LUMO (HOMO-LUMO gap): Chênh lệch năng lượng giữa HOMO và LUMO (khoảng trống năng lượng) cũng cung cấp thông tin quan trọng về tính chất điện tử và hoạt tính hóa học của phân tử Khoảng trống năng lượng nhỏ thường liên quan đến tính linh hoạt điện tử cao, điều này có thể giúp hợp chất dễ dàng tham gia vào các phản ứng chống oxy hóa

Thế ion hóa (Ionization potential, IP): Chỉ số này liên quan đến cơ chế vận chuyển đơn điện tử (single-electron transfer, SET), trong đó một electron được chuyển từ phân tử chất chống oxy hóa sang gốc tự do (phương trình 1) Do đó, thế ion hóa (IP) càng thấp, việc nhường electron để trung hòa gốc tự do càng dễ dàng [23]

Antox(OH)n → Antox(OH)n+ + e– (1) Enthalpy phân ly liên kết O-H (Bond dissociation enthalpy, BDE): là một thuộc tính quan trọng để đánh giá khả năng chống oxy hóa của một hợp chất nhất định thông qua cơ chế vận chuyển nguyên tử hydro (hydrogen-atom transfer, HAT) Cơ chế HAT đã được thiết lập rằng liên kết O-H càng yếu, hoạt động chống oxy hóa càng cao (phương trình 2) BDE được xác định là sự chênh lệch về nhiệt hình thành giữa phân tử và gốc tương ứng, do đó giá trị BDE càng thấp, hoạt tính chống oxy hóa càng cao [61], [99]

Antox(OH)n → Antox(OH)n-1O• + H• (2)

17

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG

PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu, thiết bị

Cấu trúc tinh thể protein được tải về từ Ngân hàng dữ liệu protein - PDB Cấu trúc 3D của các hợp chất hóa học: PubChem

Cơ sở dữ liệu các bài báo khoa học: PubMed, Google Scholar, Web of Science

Thiết bị, công cụ:

Máy tính cá nhân ASUS A14, hệ điều hành Windows 10 Danh sách các phần mềm và công cụ sử dụng:

MOE 2015.10 Discovery Studio 2021 Client Cytoscape 3.9.1

CytoNCA plugin Microsoft Excel 365 Venny 2.1.0

ShinyGO 0.80 UniProtKB

SwissADME OpenBabel NAMD VMD MolAICal Gaussian 09W PyMOL 2.3.2 CHARMM-GUI

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Tổng quan tài liệu để xác định thành phần hóa học của cây Chua me đất hoa vàng và sàng lọc các hợp chất có đặc tính giống thuốc và đạt sinh khả dụng đường uống

- Thu thập thông tin về đích tác dụng của các thành phần hóa học và đích phân tử của bệnh đái tháo đường type 2 và sự oxy hóa

- Xây dựng và phân tích mạng tương tác hợp chất – đích tác dụng và mạng tương tác protein của các đích chung Phân tích cấu trúc mạng và phân tích làm giàu GO và con đường KEGG, dự đoán các hợp chất và đích tác dụng tiềm năng

- Tiến hành nghiên cứu mô phỏng docking phân tử và động lực học phân tử giữa các hợp chất và đích tác dụng tiềm năng

- Tính toán DFT các chỉ số đánh giá khả năng chống oxy hóa của các hợp chất tiềm năng

Các hợp chất thu thập được sẽ được dự đoán các đặc tính về sinh khả dụng đường uống và đặc tính giống thuốc thông qua các công cụ TCMSP [77] và SwissADME [21] Các hợp chất thỏa mãn một trong hai điều kiện sau đây được xác định là các hợp chất có đặc tính giống thuốc và đạt sinh khả dụng đường uống, được đưa vào các bước nghiên cứu tiếp theo:

• Có chỉ số trên TCMSP bao gồm: giống thuốc (DL) ≥ 0,18 và sinh khả dụng đường uống (OB) ≥ 30% [53], [105];

• Có chỉ số trên SwissADME bao gồm: đặc tính giống thuốc tốt ( ≥ 2 yes) và hấp thu qua đường tiêu hóa (GI absorption) ở mức cao (high) [98], [103]

2.3.2 Thu thập thông tin về đích tác dụng của các thành phần hóa học và đích phân tử của bệnh đái tháo đường type 2 và stress oxy hóa

Thu thập thông tin về đích tác dụng của các thành phần hóa học đã được sàng lọc

Ngày nay, với sự phát triển của khoa học máy tính, đã có khá nhiều các công cụ hỗ trợ việc dự đoán đích tác dụng của một hợp chất có cấu trúc đã biết Trong số đó, SwissTargetPrediction (http://swisstargetprediction.ch/) [22] và Similarity ensemble approach SEA (https://sea.bkslab.org/) [47] là các công cụ dự đoán mục tiêu dựa trên sự tương đồng hóa học giữa chất cần dự đoán với các phối tử đã biết của đích tác dụng Nền tảng phân tích và cơ sở dữ liệu dược lý hệ thống y học cổ truyền Trung Quốc (TCMSP) (https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php) bao gồm tất cả các dược liệu trong dược điển Trung Quốc là một công cụ cung cấp dữ liệu về mục tiêu phân tử cho các hợp chất hóa học trong dược liệu, các mục tiêu này được tổng hợp từ cả thực nghiệm và mô hình dự đoán [77]

Các hợp chất hóa học của Chua me đất hoa vàng đạt tiêu chuẩn giống thuốc đường uống được nhập vào ba công cụ tìm kiếm trên sử dụng mã SMILES và InChIKey Các đích dự đoán được tải về dưới dạng mã gen, được chuẩn hóa bằng UniProtKB (https://www.uniprot.org/), sau đó loại bỏ trùng lặp

20

Thu thập thông tin về đích phân tử của đái tháo đường type 2 và sự stress oxy hóa

Đã có rất nhiều các cơ sở dữ liệu cung cấp thông tin về gen cũng như đích phân tử liên quan đến các mô hình bệnh tật khác nhau Trong nghiên cứu này, bốn cơ sở dữ liệu được sử dụng để thu thập thông tin về đích tác dụng của bệnh bao gồm: Drugbank (https://go.drugbank.com/), GeneCards (https://www.genecards.org/) [88], DisGeNET (https://www.disgenet.org/search) [66], OMIM (https://omim.org/) [10] Các từ khóa được sử dụng để tìm kiếm bao gồm: “type 2 diabetes”, “diabetic complications”, “oxidative”, “free radical”, “reactive oxygen species” Các đích phân tử sau khi thu thập được chuẩn hóa mã gen bằng UniProtKB và xóa trùng lặp

2.3.3 Xây dựng và phân tích mạng tương tác hợp chất – đích và mạng tương tác protein – protein

Xây dựng và phân tích mạng tương tác hợp chất – đích tác dụng

Từ danh sách các đích tác dụng của các hợp chất và danh sách các đích phân tử của bệnh, sử dụng công cụ Venny 2.1.0 để xác định ra các đích chung Sử dụng phần mềm Cytoscape 3.9.1 để trực quan hóa mạng tương tác giữa các hợp chất và các đích chung Plugin CytoNCA [94] được sử dụng để phân tích thông số cấu trúc mạng (các thông số được trình bày cụ thể trong phần Xây dựng mạng tương tác protein - protein) Những hợp chất và đích tác dụng có thông số bậc (degree) cao được coi là các hợp chất và đích tác dụng tiềm năng, được sử dụng cho các bước nghiên cứu tiếp theo

Xây dựng và phân tích mạng tương tác protein - protein

Mã gen của các đích chung được nhập vào cơ sở dữ liệu STRING để thu được mạng tương tác protein – protein của các đích chung Cụ thể, cơ sở dữ liệu STRING (https://string-db.org/) là cơ sở dữ liệu về các tương tác protein - protein đã được biết và được dự đoán Cơ sở dữ liệu STRING chứa thông tin từ nhiều nguồn, bao gồm dữ liệu thử nghiệm, phương pháp dự đoán tính toán và bộ thu thập dữ liệu công cộng Phiên bản STRING 11.5 chứa thông tin về khoảng 67 triệu protein từ hơn 14000 sinh vật Các tương tác protein trong STRING được gán điểm dựa trên tính chất và chất lượng của bằng chứng xảy ra tương tác Mỗi tương tác được gán cho một điểm từ 0 đến 1 tương ứng với xác suất tương tác thực sự tồn tại dựa trên các bằng chứng Điểm tin cậy được xác định là điểm tương tác tối thiểu, sao cho chỉ tương tác trên điểm này mới được đưa vào mạng dự đoán [92] Trong nghiên cứu này, điểm tin cậy được chỉ định là 0,7, tức là mức độ tin cậy cao để thu được mạng gồm những tương tác gần với thực tế nhất

Dữ liệu tương tác protein thu về từ STRING được đưa vào phần mềm Cytoscape để trực quan hóa, sử dụng plugin MCODE để phân tích cụm và sử dụng plugin CytoCNA để phân tích cấu trúc mạng 6 thông số cấu trúc mạng được tính toán bao gồm:

21 Bậc (degree centrality, DC): được xác định bằng số cạnh hay số kết nối mà mỗi nút có Nút càng có nhiều cạnh càng đóng vai trò quan trọng [32]

Độ trung tâm (betweeness centrality, BC): định lượng số lần một nút (v) hoạt

động như một cầu nối trên đường dẫn ngắn nhất kết nối giữa hai nút khác trong

mạng lưới Hệ số này được tính bằng công thức BC(v) = ∑s≠v≠t (σst(v)/σst) với

𝜎𝑠𝑡(𝑣) là tổng số con đường ngắn nhất đi qua 𝑣 giữa 𝑆 và t, 𝜎𝑠𝑡 là tổng số con đường ngắn nhất giữa 2 nút s và t [31]

Độ gần (closeness centrality, CC): đo lường mức độ gần gũi của một nút đến tất cả các nút khác trong mạng Nút có CC cao thường có vị trí trung tâm và có thể tiếp cận các nút khác nhanh chóng hơn so với các nút có CC thấp Chỉ số này được tính bằng

công thức CC(v)= 1)/∑u≠v d(v,u) trong đó n là tổng số nút của mạng, d(v,u) là khoảng

cách ngắn nhất từ nút v đến nút u [32]

Độ trung tâm vector riêng (eigenvector centrality, EC): đo lường tầm quan trọng của một nút trong một mạng lưới không chỉ dựa trên số lượng liên kết trực tiếp mà còn dựa trên chất lượng của các liên kết đó Nói cách khác, một nút sẽ có EC cao nếu nó được kết nối với nhiều nút có độ trung tâm cao EC được tính bằng công thức như sau:

Độ kết nối trung bình cục bộ (local average connectivity, LAC): đo lường mức độ kết nối trung bình của các nút láng giềng, cung cấp thông tin về cấu trúc cục bộ xung quanh một nút cụ thể trong mạng protein Chỉ số LAC cao có thể chỉ ra rằng một nút nằm trong một cụm chức năng hoặc phức hợp protein, nơi các protein tương tác mạnh mẽ để thực hiện các chức năng sinh học cụ thể LAC được tính bằng công thức: 𝐿𝐴𝐶(𝑣) = 1

|𝑁(𝑣)|𝛴𝑢𝜖𝑁(𝑣)𝑘𝑢, trong đó N(v) là tập hợp các nút láng giềng của nút v, |𝑁(𝑣)| số lượng nút láng giềng của nút v (bậc của nút v), ku là bậc của nút u [54]

Sau khi tính toán các thông số mạng, những protein có giá trị các thông số ≥ giá trị trung vị được coi là các protein trung tâm (hub proteins), là những protein đóng vai trò quan trọng trong mạng

22

2.3.4 Phân tích làm giàu GO và con đường KEGG

Danh sách đích chung được sử dụng để phân tích làm giàu Phân tích này thường được thực hiện bằng hai phương pháp: bản thể học gen (Gene Ontology - GO) và con đường KEGG (KEGG pathway) Phương pháp làm giàu GO (GO enrichment) giúp giải thích dữ liệu bằng cách xác định các quá trình sinh học liên quan trong cơ thể từ danh sách các gen biểu hiện khác nhau Trong khi đó, phân tích con đường KEGG hỗ trợ xác định các con đường mà các gen được làm giàu có liên quan [107]

Danh sách mã gen của các đích chung sẽ được đưa vào công cụ trực tuyến ShinyGO 0.80 (http://bioinformatics.sdstate.edu/go/) [33] để phân tích làm giàu GO và con đường KEGG Lựa chọn giá trị giới hạn cho tỷ lệ phát hiện sai FDR là ≤ 0,05, xác định được các chú thích của GO bao gồm chức năng phân tử (MF), thành phần tế bào (CC), quá trình sinh học (BP) của và con đường chuyển hóa KEGG liên quan nhất tới danh sách các đích đưa vào Các thuật ngữ được lựa chọn dựa theo giá trị FDR và được sắp xếp theo thứ tự từ trên xuống dưới theo giá trị độ bội làm giàu (fold enrichment, FE) giảm dần

2.3.5 Mô phỏng docking phân tử

Bước 1: Chuẩn bị cấu trúc phối tử

Cấu trúc hóa học của các thành phần hóa học tiềm năng của Chua me đất hoa vàng được tải xuống từ cơ sở dữ liệu PubChem, sau đó đưa vào phần mềm MOE để tối thiểu hóa năng lượng, cài đặt trường lực AM1-BCC phù hợp

Bước 2: Chuẩn bị protein

Một số protein tiềm năng có cấu trúc tinh thể được xác định bằng phương pháp nhiễu xạ tia X với chất lượng tương đối tốt được lựa chọn để tiến hành docking phân tử Cấu trúc tinh thể của protein được tải xuống từ cơ sở dữ liệu Protein Data Bank (https://www.rcsb.org/) và đưa vào phần mềm MOE để tinh chỉnh cấu trúc protein Quá trình này bao gồm thêm các nguyên tử hydro còn thiếu, xác định trạng thái proton, cài đặt trường lực, xác định túi liên kết của protein

Bước 3: Mô phỏng docking

Tiến hành chạy docking với các thông số cài đặt về trung tâm hoạt động, hàm tính điểm, số cấu dạng khảo sát Điểm số docking (năng lượng liên kết tự do) được tính bởi hàm Affinity dG Đây là một hàm mô tả các thay đổi năng lượng liên kết tự do (dG, kcal/mol) xảy ra khi phối tử tương tác với protein Số lượng cấu dạng được tính toán cho mỗi lần chạy là 100 và giữ lại 10 cấu dạng có năng lượng thấp nhất để phân tích

Bước 4: Đánh giá kết quả

Kết quả docking sẽ được đánh giá dựa theo điểm số docking (năng lượng liên kết tự do) và các tương tác giữa phối tử với protein Tương tác giữa phối tử và protein được

23 trực quan hóa bởi các phần mềm Discovery Studio và Pymol Bên cạnh đó, mỗi protein có một phối tử đồng kết tinh đã biết hoạt tính thực nghiệm được chọn làm chất đối chiếu Cần lưu ý rằng, việc docking lại phối tử đồng kết tinh vào protein (redocking) đã được tiến hành trước khi docking các hợp chất tiềm năng để xác thực phương pháp docking, trong đó có tính đến độ lệch bình phương trung bình gốc (RMSD) và các tương tác chính

2.3.6 Mô phỏng động lực học phân tử (MD)

Kiểm tra tính ổn định của phức hợp

Từ kết quả mô phỏng docking phân tử, các phức hợp chứa phối tử được đánh giá là có ái lực tốt nhất được chọn để thực hiện mô phỏng MD nhằm nghiên cứu độ ổn định của phức hợp và tính toán năng lượng tự do liên kết Tuy nhiên vì sự phức tạp trong các phép tính mô phỏng cùng điều kiện thiết bị và thời gian có hạn, nghiên cứu này chỉ tiến hành thực hiện mô phỏng với một vài chất có điểm số cao nhất Mô phỏng MD được thực hiện bằng cách sử dụng phần mềm NAMD 2.13 [72] và trường lực CHARMM36m Các thông số mô phỏng được tạo bằng công cụ trực tuyến CHARMM-GUI [52], bao gồm hình hộp chữ nhật chứa các phân tử nước được tạo ra phù hợp với kích thước của protein với khoảng cách đến các cạnh là 20 Å, hệ được trung hòa bằng cách thêm các ion NaCl theo phương pháp Monte-Carlo, điều kiện đẳng nhiệt-đẳng áp (NPT) và nhiệt độ 298,15K đã được chọn Mô phỏng động lực học được thực hiện cho phức hợp kéo dài 100ns với 1000 khung hình (frame) Giá trị độ lệch bình phương trung bình gốc (RMSD) được sử dụng để đánh giá mức độ ổn định của phối tử trong phức hợp Cụ thể, RMSD là một thước đo tiêu chuẩn về khoảng cách cấu trúc giữa các tọa độ của phân tử Ngoài ra, dao động bình phương trung bình gốc (RMSF) được dùng để khảo sát sự linh động của các acid amin trong protein RMSF đo độ lệch trung bình của một acid amin theo thời gian so với vị trí đối chứng (thường là vị trí trung bình theo thời gian)

Tính toán năng lượng tự do liên kết

Năng lượng tự do liên kết tương đối của phối tử với thụ thể được tính toán bằng công cụ MolAICal [14], sử dụng phương pháp MM/GBSA [34], [95] Phương pháp này chỉ xét đến trạng thái đầu và trạng thái cuối, sử dụng cơ học phân tử, mô hình Born và khả năng tiếp cận dung môi để tính năng lượng tự do từ các thông tin cấu trúc Công thức tính năng lượng tư do liên kết: ∆Glk = ∆GRL − ∆GR − ∆GL trong đó R là thụ thể, L là phối tử, RL là phức hợp

2.3.7 Tính toán DFT

Một số hợp chất tiềm năng được lựa chọn để tính toán các chỉ số dựa trên lý thuyết phiếm hàm mật độ DFT để đánh giá hoạt tính chống oxy hóa Trong nghiên cứu này, các đặc tính electron của hoạt chất được tính toán và so sánh với acid gallic, là chất có hoạt

24 tính chống oxy hóa điển hình [23] Dạng cấu trúc 3D của các chất được biểu diễn nhờ phần mềm GaussView và sử dụng dữ liệu từ Pubchem Tất cả các giá trị được tính toán dựa trên lý thuyết phiếm hàm mật độ (DFT) thông qua Gaussian 09W Hàm tương quan trao đổi được sử dụng cho các phép tính toán là Becke three-parameter Lee–Yang–Parr (B3LYP) [70] Bộ cơ sở 6-31+G(d,p) được sử dụng cùng với B3LYP dùng trong các phép tính toán này phù hợp với thời gian và chi phí cho phép Tối giản hóa cấu trúc (optimization) và tính toán tần số (frequency) cho các hoạt chất, dạng cation (ArOH+) và dạng gốc tự do (ArO•) của chúng được tính toán ở mức độ lý thuyết B3LYP/6-31+G(d,p) Từ thông tin về tần số dao động điều hòa của các cấu trúc xác nhận không có tần số ảo nào thu được từ các cấu trúc đã được tối ưu hóa Các thông số đều được tính toán ở pha khí, nhiệt độ 298.15K Mật độ electron của dạng trung tính (ArOH) và gốc tự do được thiết lập bởi mức độ lý thuyết B3LYP/6-31+G(d,p) và được trực quan hóa nhờ GaussView

Các thông số đánh giá hoạt tính chống oxy hóa được tính toán bao gồm: Năng lượng HOMO, LUMO, chênh lệch năng lượng HOMO-LUMO, enthalpy phân ly liên kết O-H (BDE), thế ion hóa (IP) Trong đó, BDE và IP được tính theo công thức:

BDE = ΔH(ArO•) + ΔH(H•) - ΔH(ArOH) IP = ΔH(ArOH+) - ΔH(ArOH)

với ΔH(ArOH+), ΔH(ArOH), ΔH(ArO•), ΔH(H•) lần lượt là enthalpy của các dạng tương ứng [23], [75]

25

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Thu thập dữ liệu về thành phần hóa học của Chua me đất hoa vàng và sàng lọc các hợp chất có đặc tính giống thuốc và đạt sinh khả dụng đường uống

Kết quả tổng quan tài liệu thu thập được danh sách gồm 130 hợp chất hóa học của

cây Chua me đất hoa vàng (Oxalis corniculata L.) Danh sách chi tiết tại Phụ lục 1

Sau đó các hợp chất được thu thập mã SMILES và mã InChIKey để tiến hành sàng lọc đặc tính giống thuốc và sinh khả dụng đường uống Kết quả sàng lọc thu được 60 hợp

chất đạt yêu cầu (Bảng 3.1) Các hợp chất này được cấp mã ký hiệu để tiến hành các

bước nghiên cứu tiếp theo

Bảng 3.1 60 hợp chất có đặc tính giống thuốc và đạt sinh khả dụng đường uống

MOL05 5-Hydroxy-7,8-dimethoxyflavon Flavonoid [57], [58]

MOL09 Acid p-hydroxybenzoic Acid benzoic [57], [64],

[102]

MOL12 Apigenin 7,4'-dimethyl ether Flavonoid [87]

MOL16 3,5,2'-Trihydroxy-7,5'-dimethoxyflavon Flavonoid [57], [64]

26

MOL31 1-Linolenoyl lysolecithin Glycerophospholipid [90]

MOL37 5-O-Desmethylnobiletin Carbohydrat [57], [58]

MOL38 5-hydroxy-3,6,7,4'-tetramethoxyflavon Flavonoid [57], [58]

MOL40 2-tert-Butyl-4-isopropyl-5-methylphenol Cumen [27]

MOL42 Carbazic acid,

MOL51 24-Methylenecholest-4-en-3β,6β-diol Steroid [5]

MOL52

Từ kết quả thu thập và sàng lọc, có thể thấy nhóm flavonoid chiếm tỉ lệ về số hợp chất cao nhất trong số 60 hợp chất, cụ thể có 15 hợp chất thuộc nhóm flavonoid (chiếm 25%), các nhóm hợp chất khác như terpenoid, các acid hữu cơ cũng chiếm một tỉ lệ cao; các nhóm còn lại như steroid, alkaloid,… chiếm tỉ lệ nhỏ số hợp chất Tuy chưa thể xác định chính xác hàm lượng của từng nhóm hợp chất do còn thiếu các cơ sở dữ liệu nghiên

cứu, nhưng với một số lượng các hợp chất flavonoid trong Chua me đất hoa vàng (Oxalis

corniculata L.) đạt sinh khả dụng đường uống cũng đã gợi ra tiềm năng về tác dụng của

nhóm chất này

27

3.2 Thu thập dữ liệu về đích tác dụng của các hợp chất và đích phân tử của bệnh đái tháo đường type 2 và stress oxy hóa

Thu thập dữ liệu về đích tác dụng của các hợp chất

Sử dụng các công cụ bao gồm: SwissTargetPrediction, SEA và TCMSP như đã đề cập trong phần phương pháp để thu thập dữ liệu về đích tác dụng của 60 hợp chất tiềm năng sau sàng lọc Các đích tác dụng bao gồm cả những đích đã được xác thực và những đích được dự đoán bằng các mô hình khác nhau Sau khi được chuẩn hóa tên về mã gen và xóa bỏ trùng lặp, thu được tổng cộng 1464 đích tác dụng của 60 hợp chất

Thu thập dữ liệu về đích phân tử của đái tháo đường type 2 và stress oxy hóa

Tiến hành tra cứu và thu thập các gen liên quan đến đái tháo đường type 2 và stress oxy hóa trên các cơ sở dữ liệu Drugbank, GeneCards, DisGeNET và OMIM như phần phương pháp Kết quả thu thập được 3721 gen liên quan đến đái tháo đường type 2 và 2803 gen liên quan đến stress oxy hóa

3.3 Xây dựng và phân tích mạng tương tác hợp chất – đích tác dụng Xác định các đích chung của hợp chất và bệnh

Biểu đồ Venn được sử dụng để tìm ra các đích chung từ danh sách đích tác dụng của hợp chất và đích phân tử của bệnh Kết quả thu được 706 đích chung của Chua me đất hoa vàng và đái tháo đường type 2; 711 đích chung của Chua me đất hoa vàng và sự

oxy hóa; 461 đích chung của Chua me đất hoa vàng và cả hai bệnh (Hình 3.1) Thu thập

tất cả đích chung của Chua me đất hoa vàng với hai mô hình bệnh tật thu được 956 đích chung, các đích này được đưa vào các bước nghiên cứu tiếp theo Danh sách mã gen của

956 đích chung được trình bày chi tiết tại Phụ lục 2

Hình 3.1 Biểu đồ venn thể hiện số lượng đích chung của Chua me đất hoa vàng và hai

mô hình bệnh tật

Chú thích: 60 hợp chất của Chua me đất hoa vàng (Oxalis corniculata): nút hình

thoi, màu vàng; 245 đích của đái tháo đường type 2 (ĐTĐT2): nút hình chữ nhật, màu cam; 250 đích của oxy hóa (OXH): nút hình chữ nhật màu hồng; 461 đích giao của hai bệnh: nút hình chữ nhật, màu xanh lá

29 Tiến hành phân tích mạng bằng thông số bậc (degree centrality, DC) của các nút trong mạng Thu được 10 hợp chất tiềm năng và 10 đích tác dụng tiềm năng là những nút có bậc cao nhất trong mạng (tức là nhiều tương tác nhất) Danh sách cụ thể được

trình bày trong Bảng 3.2 và Bảng 3.3 Sau đó lựa chọn một số hợp chất tiềm năng trong

top 10 để tiến hành tính toán DFT đánh giá khả năng chống oxy hóa

Bảng 3.2 Top 10 hợp chất tiềm năng từ mạng tương tác hợp chất – đích

3.4 Xây dựng và phân tích mạng tương tác protein – protein (PPIN)

Dựa trên cơ sở dữ liệu tương tác protein STRING (https://string-db.org/), mạng tương tác protein-protein được xây dựng cho 956 đích chung Tương tác giữa các protein được phân làm 3 nhóm: (1) các tương tác đã được kiểm chứng, (2) các tương tác dự đoán dựa trên các phương pháp toán học và (3) một số loại tương tác khác Mạng được

30 xây dựng cho các nút với tương tác có độ tin cậy cao, tức giá trị điểm tương tác tối thiểu (minimum required interaction score) ≥ 0,7 Kết quả tạo được mạng tương tác protein

có 911 nút và 9944 cạnh như Hình 3.3

Hình 3.3 Mạng tương tác protein của 956 đích chung

Chú thích: Mỗi chấm tròn trên hình đại diện cho một protein với mã gen tương ứng Kích thước và màu sắc nút càng thể hiện độ lớn của thông số bậc (DC) của mỗi nút

Các nút trong mạng tương tác protein được tính toán 6 thông số như đã mô tả ở phần phương pháp bao gồm: DC, BC, CC, EC, NC, LAC Lọc lấy những nút có giá trị của cả 6 thông số lớn hơn giá trị trung vị, thu được mạng mới bao gồm những protein trung tâm của mạng ban đầu Kết quả sau 2 lần sàng lọc thu được 86 protein trung tâm

(Hình 3.4B, Phụ lục 3), những protein này theo lý thuyết mạng được coi là đóng vai trò

quan trọng nhất trong mạng và được dự đoán là các đích tác dụng tiềm năng

31

Hình 3.4 Mạng tương tác protein của các protein trung tâm

Chú thích: Kích thước và màu sắc nút càng thể hiện độ lớn của thông số bậc (DC) của mỗi nút (A) Mạng sau khi được lọc lần một: 236 protein, 4168 tương tác; (B) Mạng sau khi được

lọc lần hai: 86 nút và 1514 cạnh

Kết quả phân tích cấu trúc mạng protein cho thấy một số đích tác dụng tiềm năng như AKT1, EGFR, TNF, IL-6, MAPK14, Có thể thấy những protein này đều đóng vai trò quan trọng đối với tế bào và cơ thể Trong đó có những chức năng liên quan đến cơ chế bệnh sinh của đái tháo đường type 2 và chống oxy hóa Ví dụ, AKT1 là một thành