trần thị minh thu đánh giá khả năng kháng biofilm staphylococcus aureus của cao chiết lá ổi psidium guajava l và cao chiết nhục đậu khấu myristica fragrans houtt

Đánh giá khả năng kháng biofilm của các phân đoạn cao chiết nhục đậu khấu.. aureus gặp rất nhiều khó khăn, không chỉ do sự đa dạng của các yếu tố độc lực, vi khuẩn kháng thuốc kháng sin

TỔNG QUAN

Tổng quan về biofilm của Staphylococcus aureus

1.1.1 Tổng quan về Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus được xác định lần đầu tiên vào năm 1884 bởi

Anton Rosenbach [7, 8] Theo Từ khóa phân loại Bergey (2001), S aureus được xếp vào: Giới: Procaryotae; Ngành: Firmicutes; Lớp: Firmibacteria; Họ: Microccocaceae; Chi: Staphylococcus; Loài: Staphylococcus aureus [9]

Hình 1.1 Hình ảnh vi khuẩn Staphylococcus aureus Trái: hình ảnh trên kính hiển vi; Phải: hình ảnh trên kính hiển vi điện tử

S aureus là vi khuẩn Gram dương không di động, được đặc trưng bởi cỏc cầu khuẩn riờng lẻ cú đường kớnh từ 0,5 đến 1,5 àm, là vi khuẩn kỵ khớ đa dạng [9] Tụ cầu vàng phát triển tối ưu ở 37°C và pH7,4 [10] S aureus có thể chịu được nhiệt độ cao tới 60ºC trong vòng 30 phút [11]

S aureus được phân biệt với các loài tụ cầu khác trên cơ sở sắc tố vàng của khuẩn lạc, kết quả dương tính của các phép thử coagulase, lên men đường mannitol và deoxyribonuclease [12]

Tụ cầu vàng là một trong những mầm bệnh chính gây nhiễm trùng bệnh viện và cộng đồng S aureus có thể gây ra nhiều bệnh như nhiễm trùng da và mô mềm, viêm nội tâm mạc nhiễm khuẩn, viêm tủy xương, viêm phổi, nhiễm khuẩn huyết, [10]

3 Theo độ nhạy cảm với thuốc kháng sinh, S aureus có thể được chia thành Staphylococcus aureus nhạy cảm với methicillin (MSSA) và Staphylococcus aureus kháng methicillin (MRSA) Tính kháng này được tạo ra bởi một gen mã hóa protein gắn với penicillin 2a hoặc 2′ (PBP2a hoặc PBP2′) (mecA) được tích hợp vào thành phần nhiễm sắc thể của S aureus nhạy cảm với methicillin

MRSA đã nhanh chóng trở thành mầm bệnh kháng thuốc xảy ra thường xuyên nhất được xác định ở nhiều nơi trên thế giới, bao gồm Châu Âu, Hoa Kỳ, Bắc Phi, Trung Đông và Đông Á Trong những thập kỷ gần đây, do sự tiến hóa của vi khuẩn và tình trạng lạm dụng kháng sinh, tỷ lệ nhiễm MRSA tăng trên toàn thế giới và việc điều trị chống nhiễm trùng do MRSA ngày càng trở nên khó khăn hơn [10]

Biofilm được định nghĩa là một cộng đồng vi sinh vật (VSV) gồm các tế bào nằm trong chất nền các chất cao phân tử ngoại bào mà chúng đã tạo ra Chất nền này được cấu tạo từ polysaccharid, ADN ngoại bào (eDNA) và protein với cấu trúc sắp xếp, tỷ lệ phần trăm, số lượng phụ thuộc nhiều vào điều kiện hình thành [13, 14]

1.1.2.2 Các giai đoạn hình thành biofilm của S aureus

Sự hình thành biofilm của S aureus có thể được chia thành ba giai đoạn chính: (1) gắn ban đầu, (2) tăng sinh tế bào và sản xuất chất nền ngoại bào, (3) tách tế bào và hình thành biofilm mới [13, 15]

Giai đoạn gắn ban đầu: S aureus có thể bám dính trên cả bề mặt sinh học và nhân tạo để hình thành biofilm Sự gắn kết của tế bào S aureus với bề mặt xảy ra thông qua thông qua các protein bề mặt liên kết với các protein nền vật chủ (fibrinogen, fibronectin, vitronectin…) hoặc tương tác kỵ nước với bề mặt phi sinh học [13, 15]

4 Giai đoạn tăng sinh tế bào và sản xuất chất nền ngoại bào: Trong giai đoạn này, các VSV sau khi bám dính sẽ phát triển bằng cách tăng sinh Ngoài ra, tế bào tiết ra các chất cao phân tử bao gồm polysaccharid và protein Các chất cao phân tử từ tế bào chết được cho là đóng góp vào chất nền biofilm Đáng chú ý nhất trong số đó là protein và ADN, sau khi giải phóng khỏi tế bào chết được gọi là ADN ngoại bào (eDNA) [13, 15]

Giai đoạn hình thành biofilm và tách tế bào: VSV phát triển, cấu trúc và hình thành biofilm Sau đó, sự tách tế bào diễn ra do sự thoái hóa của chất nền biofilm do protease và sự phá vỡ biofilm bởi các chất hoạt động bề mặt Sự phá vỡ, tách rời biofilm đi kèm với quá trình sản sinh các biofilm mới Các tiểu phần vi khuẩn được tách ra có thể di chuyển, bám dính ở vị trí mới và tạo một biofilm khác [13, 15]

Hình 1.2 Các giai đoạn hình thành biofilm của S aureus [15]

1.1.2.3 Thành phần của biofilm S aureus

Biofilm của S aureus là một cộng đồng vi khuẩn S aureus, nằm trong chất nền các hợp chất cao phân tử ngoại bào bao gồm polysaccharid (poly-β-1,6-N-acetyl-D-glucosamin - PNAG), ADN ngoại bào (eDNA) và protein có nguồn gốc từ sự ly giải các tế bào vi khuẩn chết [16]

5 Poly-β-1,6-N-acetyl-D-glucosamin (PNAG): còn được gọi là chất kết dính liên bào polysaccharid (PIA), là thành phần chính của các chất cao phân tử ngoại bào Việc sản xuất PIA phụ thuộc vào operon kết dính nội bào (ica), bao gồm các gen icaA, icaD, icaB và icaC icaA là N-acteylglucosamin transferase, cùng với icaD đã được chứng minh là tạo ra oligomer N- acetylglucosamin Sự phát triển của chuỗi phụ thuộc vào sự hiện diện của icaC, một protein màng, với vai trò vận chuyển PIA ra ngoài màng tế bào icaB, nằm trên bề mặt vi khuẩn, là PIA deacetylase, với vai trò gắn PIA vào màng tế bào [13, 16] PIA đóng vai trò quan trọng trong quá trình bám dính, hình thành biofilm và né tránh miễn dịch, đề kháng với các chất kháng khuẩn [9], [13]

Protein: nhiều protein được coi là thành phần quan trọng trong quá trình gắn kết và phát triển chất nền biofilm Chúng bao gồm các protein liên kết bề mặt như protein A, protein liên kết fibrinogen (FnBPA và FnBPB), protein bề mặt S aureus (SasG), protein liên kết biofilm (Bap) và yếu tố đông tụ B (ClfB) Ngoài ra, các protein nội bào đã được xác định trong chất nền biofilm [3] eDNA: eDNA trong chất nền biofilm của S aureus có chức năng cung cấp sự ổn định cho biofilm eDNA này có nguồn gốc từ sự ly giải các tế bào vi khuẩn chết [14] Do đặc tính cao phân tử và anion của ADN, eDNA dễ dàng tương tác với nhiều phân tử bề mặt khác, góp phần hình thành chất nền ngoại bào [13]

1.1.2.4 Các bệnh liên quan đến biofilm của S aureus

Trong số nhiều loại nhiễm khuẩn có thể gây ra bởi S aureus, những loại liên quan đến biofilm gây nên rất nhiều thách thức trong điều trị do sự đề kháng của tụ cầu với hệ thống miễn dịch của vật chủ và các phương pháp điều trị kháng sinh [15]

Nhiễm khuẩn thiết bị cấy ghép

S aureus đã được biết là vi khuẩn lây nhiễm và hình thành biofilm gây nhiễm khuẩn mạn tính thường xuyên nhất trên catheter, stent, thiết bị cấy ghép

6 chỉnh hình, máy thở…[16] Thông thường, các thiết bị này được phủ bởi chất nền vật chủ, tạo điều kiện cho sự gắn kết ban đầu và hình thành biofilm của S aureus [15]

Tổng quan về một số dược liệu sử dụng trong đề tài

1.2.1 Tổng quan về ổi ( Psidium guajava L.)

Theo Flowering Plants (2009), vị trí phân loại của ổi được tóm tắt như sau [29]:

Phân lớp Hoa Hồng - Rosidae

1.2.1.2 Đặc điểm thực vật Ổi là cây nhỡ, cao 3-6 mét Thân có vỏ mỏng, trơn nhẵn, khi già bong ra từng mảng Cành non vuông, có lông mềm, cành già hình trụ, nhẵn Lá mọc đối, hình trái xoan hoặc hình trứng, dài 9-11cm, rộng 3-6cm, gốc tròn, đầu tù hơi nhọn, mặt trên màu lục sẫm, mặt dưới nhạt có gân nổi rõ Hoa màu trắng, mọc đơn độc hoặc tập trung 2-3 hoa ở kẽ lá, cuống có lông mịn; đài nhỏ có ống, 4-5 răng không đều, tràng 5 cánh dày, có lông mềm; nhị rất nhiều, xếp thành nhiều dãy, chỉ nhị rời, bao phấn có trung đới rộng; bầu hạ, dính vào ống đài, 5 ô Quả mọng, hình cầu hoặc hình trứng, khi chín màu vàng, ruột màu đỏ, trắng hoặc vàng, hạt rất nhiều, hình bầu dục [30]

Hình 1.3 Đặc điểm hình thái của Ổi [31]

1.2.1.3 Phân bố, sinh thái Ở Việt Nam, ổi là dạng cây ăn quả phổ biến, được trồng hầu như khắp các địa phương, cả vùng đồng bằng lẫn ở miền núi, trừ vùng cao trên 1500m Cây ưa sáng, sinh trưởng phát triển tốt trong vùng khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới Giới hạn về nhiệt độ từ 15º-45ºC, nhiệt độ tốt nhất cho cây sinh trưởng và cho nhiều quả là từ 23º-28ºC; lượng mưa 1000-2000 mm/năm Ổi ra hoa quả nhiều năm Cụm hoa thường xuất hiện trên những cành non mới ra cùng năm Thụ phấn nhờ gió hoặc côn trùng Vòng đời có thể tồn tại 40-60 năm Mùa hoa vào tháng 3-4; mùa quả vào tháng 8-9 [30]

1.2.1.4 Thành phần hóa học và một số hoạt tính sinh học đặc trưng

Lá ổi chứa catechol, tanin loại pyrrogallol ( 8 – 15%) và tinh dầu Tùy theo từng loại ổi, hàm lượng tinh dầu trong lá từ 0,2 – 0,31% Thành phần tinh dầu lá ổi gồm d-limonen và dl-limonen, β- caryophylen, sesquiterpen alcol 2 vòng và sesquiterpen alcol bậc 4 Lá ổi còn chứa sáp, nhựa, đường, caroten, các vitamin B1, B2, B6, niacin và vitamin C, β- sitosterol, quercetin, các arabiosid của guaijaverin và avicularin, một số các acid triterpen như acid ursolic, oleanolic, cratagolic, guaijavolic và các acid ellagic và amritosid [30]

Theo Barbalho và cộng sự, thành phần hóa học chính của lá ổi (Psidium guajava) là isoflavonoid, hợp chất phenolic, rutin, catechin, epicatechin, kaempferol và naringenin Các bộ phận khác nhau của cây đã cho thấy các hoạt động trị liệu khác nhau như chống oxy hóa, chống co thắt, bảo vệ gan, giảm đau, chống viêm, chống tiêu chảy, chống đau bụng, có tiềm năng trong việc chống ung thư, trị đái tháo đường và cho hoạt động kháng khuẩn chống lại S aureus, S Typhi , E coli và P aeruginosa [32]

Kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thị Bích Thuyền và cộng sự cho thấy thành phần hóa học của cao chiết acetone lá ổi có 3-Ethyl-3-buten-2-one (24,92%), Methyl 1- methylpropyl ketone (12, 17%), 3-Methylcyclopentanone (8,67%), Caryophyllene (9,3%) Caryophyllene có hàm lượng khá cao (9,3%),

13 là một sesquiterpene vòng tự nhiên, là thành phần cấu tạo trong các loại tinh dầu đặc biệt là tinh dầu đinh hương, caryophyllene được công bố là chất chống ung thư, kháng khuẩn và chống oxy hóa Ngoài ra trong cao ổi còn có thành phần Cis, trans- Nerolidol (0,57%), một trong những thành phần có trong hoa ngọc lan tây với tác dụng ức chế khuẩn Staphylococcus aureus Một số thành phần khác (Epiglobulol 0,42%, Alloaromadendrene oxide-(1) 0,53%, Germacrene B 0,63%, Delta.Cadinene 0,51%) là những chất có trong thành phần của thực vật góp phần vào khả năng kháng khuẩn [33]

1.2.2 Tổng quan về nhục đậu khấu ( Myristica fragrans Houtt.)

Theo Flowering Plants (2009), vị trí phân loại của nhục đậu khấu được tóm tắt như sau [29]:

Phân lớp Ngọc Lan - Magnoliidae

Họ Nhục đậu khấu - Myristicaceae

Cây nhỡ hoặc cây to, cành non hình tròn, vỏ ngoài nhăn nheo, hơi có khía, màu nâu xám Lá mọc so le, có cuống ngắn, hình bầu dục hoặc hình mác, dài 5 – 15 cm, rộng 3 – 7 cm, gốc tròn, đầu nhọn, mặt trên nhẵn, mặt dưới phủ lông tơ, dày hơn ở lá non và có gân nổi rất rõ Cụm hoa đực dài 1 – 3 cm, mọc ở kẽ lá gồm 3 – 20 hoa; lá bắc rất nhỏ, bao hoa hình trứng, có lông, chia 3 thùy (đôi khi 4); nhị xếp thành cột có đế dày, nhẵn, bao phấn thuôn; cụm hoa cái

14 mọc ở kẽ lá gồm 1 – 2 hoa, lá bắc rõ, bao hoa hình trứng rộng, có lông ở mặt ngoài, chia 3 thùy ở đầu, bầu có lông mịn, 1 ô Quả thường đơn độc, có cuống ngắn, đôi khi mang bao hoa tồn tại; hạt hình trứng có áo và nhân màu trắng [30]

Hình 1.4 Đặc điểm hình thái của Nhục đậu khấu [34]

Nhục đậu khấu có nguồn gốc ở vùng đảo Molucca ở Thái Bình Dương, được nhập trồng vào đất liền ở khắp vùng nhiệt đới Nam Á và Đông – Nam Á Ở Việt Nam cây chủ yếu được trồng ở các tỉnh phía nam Nhục đậu khấu là cây nhiệt đới, thích nghi cao với điều kiện khí hậu nóng và ẩm, lượng mưa hàng năm từ 1500 – 3000mm Cây sinh trưởng tốt ở vùng thấp, không thích hợp với vùng núi trên 750m, rụng lá mùa khô, thụ phấn nhờ gió hoặc côn trùng Khi quả chín lấy hạt tươi gieo ngay, đạt tỷ lệ nảy mầm từ 92 – 98% Sau 2 tháng tỷ lệ này giảm xuống chỉ còn 7% Cây con ở vườn ươm sau một năm mới đem trồng [30]

1.2.2.4 Thành phần hóa học và một số hoạt tính sinh học đặc trưng

Myristica fragrans được đặc trưng bởi một số thành phần hóa học bao gồm lignans, neolignans, diphenylalkanes, phenylpropanoit, terpenoit, ankan, axit béo, este của axit béo và một vài thành phần nhỏ như steroid, saponin,

15 triterpenoid và flavonoid Dịch chiết từ nhục đậu khấu (M Fragrans) và các thành phần hóa học của nó có nhiều tác dụng sinh học khác nhau, như chống viêm, chống oxy hóa, kháng khuẩn, kháng nấm, chống béo phì, chống đái tháo đường và chống ung thư, giảm đau, bảo vệ tim mạch, [35]

Các chất chuyển hóa sơ cấp (carbohydrate, lipid/axit béo và protein) chiếm tới 80% trọng lượng của hạt nhục đậu khấu khô trong khi phần còn lại bao gồm các chất chuyển hóa thứ cấp có bản chất hóa học đa dạng Chúng bao gồm các loại tinh dầu (terpen và phenylpropanoid) và các hợp chất phenolic (axit caffeic, ferulic và protocatechuic, lignans/neolignans, và diarylalaknes) là thành phần chính Polyphenol và sắc tố (catechin, epicatechin, falvonoid và cyanidin) cũng có mặt [36]

Một số nghiên cứu về tác dụng kháng biofilm S aureus của cao chiết dược liệu

Trên thế giới, đã có một số nghiên cứu về tác dụng kháng biofilm S aureus của cao chiết dược liệu

Zeng và cộng sự đã đánh giá tác dụng của cao chiết Polygonum chinense đối với biofilm của S aureus 29213 Biofilm của S aureus 29213 được tạo trên các phiến kính Kết quả khi kiểm tra bằng SEM cho thấy sự tăng trưởng biofilm giảm đáng kể ở các nhóm có cao chiết Polygonum chinense so với nhóm chứng

Số lượng tế bào và chất nền ngoại bào của biofilm giảm đáng kể và các tế bào nằm rải rác trong các mẫu có cao chiết Ngoài ra, tổng số vi khuẩn giảm rõ rệt khi nồng độ cao chiết Polygonum chinense tăng lên Quan sát bằng CLSM cho thấy bề mặt của nhóm chứng gồ ghề và tín hiệu huỳnh quang của vi khuẩn sống rất mạnh Khi được xử lý bằng dịch chiết Polygonum chinense, sinh khối biofilm của S aureus giảm rõ rệt Khi nồng độ cao chiết Polygonum chinense tăng lên, các polysaccharide ngoại bào và tế bào vi khuẩn trong biofilm giảm đi Bên cạnh đó, sự ức chế hình thành biofilm S aureus của cao chiết

Polygonum chinense được đánh giá bằng cách nhuộm và đo hấp thụ với tím tinh thể Kết quả đã chứng minh rằng cao chiết nước của Polygonum chinense

L có tác dụng ức chế sự hình thành biofilm, tác dụng này phụ thuộc vào nồng độ Tác dụng ức chế hình thành biofilm rõ rệt khi nồng độ cao chiết Polygonum chinense đạt 0,25 mg/mL Các kết quả này khẳng định hoạt tính kháng biofilm

S aureus của cao chiết Polygonum chinense [37]

Wang và cộng sự đã đánh giá tác dụng của dịch chiết vỏ quả bạch quả (Ginkgo biloba) (Ginkgo biloba exocarp extract – GBEE) đối với biofilm của MRSA Biofilm của chủng MRSA lâm sàng được tạo trên đĩa 96 giếng Tác dụng của GBEE đối với sự hình thành biofilm của MRSA và sự phá vỡ biofilm trưởng thành được xác định bằng phương pháp nhuộm và đo hấp thụ với tím tinh thể Quan sát đĩa 96 giếng và kết quả độ hấp thụ cho thấy lượng biofilm giảm khi tăng nồng độ GBEE Ngoài ra, hình ảnh trên kính hiển vi cho thấy rằng khi tăng nồng độ GBEE, diện tích khoảng trống càng lớn, số lượng vi sinh vật trong biofilm càng nhỏ Những dữ liệu này gợi ý rằng GBEE ức chế sự hình thành biofilm của S aureus Các thử nghiệm phá vỡ biofilm trưởng thành cho thấy ở nồng độ 12 μg/mL, GBEE đã phá vỡ các biofilm được tạo sẵn của S aureus Kính hiển vi điện tử quét (SEM) được sử dụng để quan sát những thay đổi của biofilm và xác minh thêm tác dụng ức chế của GBEE trên biofilm của

MRSA Kết quả cho thấy số lượng tế bào giảm rõ rệt và không có sự hình thành biofilm trong nhóm được thêm GBEE [38]

Lakshmana Prabu và cộng sự đã đánh giá tác dụng kháng biofilm của dịch chiết P guajava trên biofilm của các chủng MRSA Biofilm của MRSA được tạo trên phiến kính Tác dụng kháng biofilm của dịch chiết P guajava được đánh giá cả về mặt định tính và định lượng bằng kính hiển vi và phương pháp nhuộm và đo hấp thụ với tím tinh thể Kính hiển vi được sử dụng như một phương pháp định tính Với mẫu chứng, hầu hết các khu vực được bao phủ bởi biofilm bao gồm các cụm vi khuẩn Với các mẫu có dịch chiết, quan sát thấy

17 các tế bào không tập hợp Phương pháp nhuộm và đo hấp thụ với tím tinh thể cho thấy có sự giảm đáng kể (P 25% giá trị RF (đánh giá mức độ chuyển hóa của VSV sống) so với mẫu chứng dương ở cùng điều kiện được coi như mẫu có khả năng diệt S aureus trong biofilm Kết quả cho thấy trong 300 mẫu thực hiện sàng lọc, có 11 mẫu, chiếm tỷ lệ 3,6%, có khả năng diệt S aureus trong biofilm, ở dạng đơn lẻ hoặc kết hợp với kháng sinh Trong đó, có 5 mẫu có khả năng diệt S aureus trong biofilm ở dạng đơn lẻ Khi kết hợp với kháng sinh, gần như tất cả các mẫu trên đều tăng cường khả năng diệt khuẩn [6]

Có thể thấy rằng, dược liệu là nguồn cung cấp các hoạt chất kháng biofilm rất tiềm năng Tại Việt Nam, các nghiên cứu về tác dụng kháng biofilm

S aureus còn rất hạn chế Do đó, đề tài này được thực hiện với mục tiêu tìm ra phân đoạn của cao chiết ổi và nhục đậu khấu có tác dụng kháng biofilm S aureus Từ đó tạo tiền đề cho việc tìm ra các hoạt chất mới có hoạt tính kháng biofilm của S aureus

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Đối tượng nghiên cứu

Vi sinh vật: Staphylococcus aureus ATCC 33591

Chủng chuẩn ATCC được cung cấp bởi Phòng nghiên cứu dược lý phân tử và tế bào (FACM) - Đại học công giáo Louvain, Vương quốc Bỉ Chủng được lưu trữ trong tủ -80ºC tại phòng thí nghiệm của Bộ môn Hóa sinh – Trường Đại học Dược Hà Nội

Lá ổi được thu hái ở xã Đông Hải, huyện Quỳnh Phụ, tỉnh Thái Bình, thu lá bánh tẻ của cây ổi trồng được 5 năm tuổi trở lên, không phun thuốc bảo vệ thực vật trong 1 năm trước khi thu hái Lá ổi được thu hái vào thời điểm 7-9 giờ buổi sáng, vào tháng 9-10 dương lịch

Nhục đậu khấu được sử dụng trong nghiên cứu có nguồn gốc từ Trung Quốc, nhập khẩu bởi công ty TNHH Đông Dược Tân Lợi Nhục đậu khấu đạt các chỉ tiêu chất lượng của Dược điển Trung Quốc 2015 bộ 1, bộ 4 (Phụ lục 2)

Cao lá ổi, các phân đoạn từ cao lá ổi; cao nhục đậu khấu, các phân đoạn từ cao nhục đậu khấu được chiết xuất tại Bộ môn Kỹ thuật Hóa dược và Chiết xuất – Trường Đại học Dược Hà Nội

Mẫu dược liệu (lá ổi hoặc hạt nhục đậu khấu) được rửa sạch, sấy khô và nghiền nhỏ đến kích thước thích hợp Bột dược liệu được chiết với ethanol 96% bằng phương pháp ngâm nóng thu dịch chiết ethanol Dịch ethanol được cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu cao ethanol tổng Phân tán cao ethanol tổng trong một lượng nước thích hợp và chiết phân bố lỏng – lỏng lần lượt với các dung môi hữu cơ có độ phân cực tăng dần thu các cao phân đoạn tương ứng

Sơ đồ chiết xuất thu cao tổng và chiết phân bố các cao phân đoạn của mẫu lá ổi và hạt nhục đậu khấu được thể hiện trong hình 2.1 và 2.2

Hình 2.1 Sơ đồ chiết xuất cao tổng và cao phân đoạn từ lá ổi

Hình 2.2 Sơ đồ chiết cao tổng và cao phân đoạn từ hạt nhục đậu khấu

Sau khi thử hoạt tính kháng biofilm S aureus của các mẫu cao chiết và phân đoạn, phân đoạn có hoạt tính tốt sẽ được chiết xuất thành các phân đoạn nhỏ để tiếp tục tiến hành thử hoạt tính

Các hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu được liệt kê trong bảng 2.1

Bảng 2.1 Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu

STT Hóa chất Hãng – nước sản xuất

1 Môi trường lỏng Tryptic Soy (TSB) Merck – Đức

2 Dimethyl sulfoxide (DMSO) Fisher chemical

4 Tím tinh thể Sigma-Aldrich

5 Môi trường thạch Tryptic Soy Agar (TSA) Chuẩn bị từ peptone, cao thịt, NaCl, thạch bột

6 Dung dịch đệm phosphate pH 7.4

Chuẩn bị từ NaCl, KCl,

7 Natri clorid, glucose Trung Quốc

Thành phần các môi trường:

Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu được liệt kê trong bảng 2.2

Bảng 2.2 Trang thiết bị sử dụng trong nghiên cứu

STT Trang thiết bị, máy móc Xuất xứ

1 Cân kỹ thuật Satorius – Đức

2 Cân phân tích Satorius – Đức

3 Tủ lạnh Sanyo – Nhật Bản

6 Tủ cấy vô khuẩn BioAir – Italy

7 Nồi hấp tiệt khuẩn 50L ALP – Nhật Bản

9 Pipet 1000-200; 200-20; 20-1 àl Nichiryo – Nhật Bản

10 Pipet đa kênh AHN – Đức

11 Hộp đựng đầu típ loại 1000 μl, 200μl Hàn Quốc

12 Đĩa 96 giếng SPL – Hàn Quốc

13 Máy đọc vi đĩa 96 giếng huỳnh quang-UV Varioskan Lux/

14 Máy quang phổ UV-VIS Hitachi U5100 - Nhật

16 Dụng cụ thủy tinh: bình nón, cốc có mỏ, ống đong, đĩa petri… Trung Quốc

Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Đánh giá khả năng kháng biofilm của các phân đoạn cao chiết lá ổi

 Đánh giá khả năng kháng vi khuẩn S aureus của các phân đoạn cao chiết lá ổi

 Đánh giá khả năng kháng biofilm của các phân đoạn cao chiết lá ổi, trong

3 điều kiện thực nghiệm: cao dược liệu dạng đơn, kết hợp với moxifloxacin (Mxf) và vancomycin (Van)

 Lựa chọn phân đoạn có hoạt tính tốt để chiết xuất thành các phân đoạn nhỏ, tiếp tục tiến hành thử hoạt tính kháng khuẩn, kháng biofilm

2.2.2 Đánh giá khả năng kháng biofilm của các phân đoạn cao chiết nhục đậu khấu

 Đánh giá khả năng kháng vi khuẩn S aureus của các phân đoạn cao chiết nhục đậu khấu

 Đánh giá khả năng kháng biofilm của các phân đoạn cao chiết nhục đậu khấu, trong 3 điều kiện thực nghiệm: cao dược liệu dạng đơn, kết hợp với moxifloxacin và vancomycin

 Lựa chọn phân đoạn có hoạt tính tốt để chiết xuất thành các phân đoạn nhỏ, tiếp tục tiến hành thử hoạt tính kháng khuẩn, kháng biofilm.

Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp đánh giá khả năng kháng khuẩn bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch

Phương pháp này dựa trên khả năng đối kháng của các chất kháng khuẩn với vi khuẩn chỉ thị (S aureus) trên môi trường nuôi cấy Chất kháng khuẩn có trong mẫu thử có khả năng khuếch tán trong môi trường thạch và tác động lên vi khuẩn chỉ thị Mẫu thử chứa chất kháng khuẩn kháng được vi khuẩn chỉ thị sẽ xuất hiện vòng kháng khuẩn xung quanh giếng thạch

Mỗi đĩa thạch chứa môi trường TSA được trải đều hỗn dịch S aureus

33591 trong PBS (1,5x10 6 CFU/mL) Sau đó, mỗi đĩa thạch được đục tạo giếng cú đường kớnh 6 mm và nhỏ 100 àl dung dịch chất thử Giếng giữa là chứng DMSO tương ứng với nồng độ DMSO tồn dư ở giếng có nồng độ lớn nhất Đường kính vòng vô khuẩn xung quanh giếng thạch được đo bằng thước đo

23 đơn vị mm sau 24 giờ ủ mẫu ở 37ºC [42] Cụ thể thí nghiệm được mô tả như hình 2.3

Hình 2.3 Mô tả thiết kế thí nghiệm đánh giá hoạt tính kháng khuẩn bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch

2.3.2 Phương pháp nuôi cấy tạo biofilm của S aureus

Chuẩn bị hỗn dịch VSV trong PBS, đo quang ở bước sóng 600nm (OD

= 0,5) Pha loãng 100 lần trong TGN để có nồng độ vi khuẩn 0,005 ở OD600nm (tương đương 10 7 CFU/mL) Cho vào mỗi giếng thể tích 200 μl/giếng hỗn dịch VSV đã pha loãng, các giếng ở rìa đĩa cho 200 μl TGN Ủ ở 37°C trong 24 giờ [43]

2.3.3 Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng biofilm của cao dược liệu

Biofilm 24 giờ của S aureus trong TGN được sử dụng để đánh giá hoạt tính kháng biofilm của cao dược liệu Thí nghiệm được thực hiện trong 3 điều kiện là cao dược liệu ở dạng đơn, kết hợp với moxifloxacin (Mxf) nồng độ 1,5mg/L và kết hợp với vancomycin (Van) nồng độ 20mg/L Nồng độ cao dược liệu được sử dụng là 100mg/L

Sau khi loại bỏ môi trường nuôi cấy, thêm môi trường TGN, TGN-Mxf, TGN-Van cho mẫu chứng; ba môi trường tương tự sẽ được kết hợp với cao dược liệu nồng độ 100 mg/L để làm mẫu thử

24 Biofilm này sẽ tiếp tục được ủ ở 37°C trong 24 giờ Sau 24 giờ, biofilm được đánh giá về 2 chỉ tiêu là tổng sinh khối biofilm (nhuộm và đo hấp thụ với tím tinh thể (crystal violet - CV) và lượng VSV sống trong biofilm (đánh giá gián tiếp thông qua chuyển hóa resazurin thành resorufin và trực tiếp bằng phương pháp cấy đếm trên đĩa thạch) [43] Đánh giá lượng VSV sống trong biofilm

 Lượng VSV sống được đánh giá trực tiếp bằng phương pháp cấy đếm CFU trên đĩa thạch

Mẫu cần đếm số lượng CFU sẽ được rửa nhẹ nhàng 2 lần với cùng thể tớch 200àl PBS Cho 200àl nước cất vụ khuẩn vào mỗi giếng, hỳt và nhả với pipet tối thiểu 20 lần để tách rời hoàn toàn các khuẩn lạc Mẫu sau đó sẽ được pha loãng trong PBS trên đĩa 96 giếng theo cơ số log10 đến nồng độ phù hợp Khuẩn lạc sẽ được đếm trên đĩa thạch TSA sau khi cấy trải và ủ 24 giờ ở 37℃ Nồng độ được chọn là nồng độ có từ 30-300 khuẩn lạc trên đĩa Lượng VSV trong mẫu được tính toán dựa trên số lượng khuẩn lạc trên đĩa và nồng độ pha loãng, được biểu thị dưới dạng log10 CFU/mL Trong thí nghiệm đánh giá hoạt tính kháng biofilm, mẫu thử được thực hiện trên cùng đĩa với mẫu chứng (không bổ sung kháng sinh, cao chiết), lượng VSV của mẫu thử được so sánh với mẫu chứng thông qua giá trị log10 CFU/mL [44]

 Lượng VSV sống được đánh giá gián tiếp thông qua khả năng chuyển hóa resazurin (không huỳnh quang) thành resorufin (phát huỳnh quang) của VSV sống

Mẫu cần đánh giá khả năng chuyển hóa resazurin thành resorufin sẽ được rửa 2 lần với PBS Mẫu sau đó sẽ được ủ với 200 μl resazurin nồng độ 10 mg/L trong nước cất vô khuẩn, trong 30 phút ở nhiệt độ phòng, tránh ánh sáng Sau

30 phút ủ, mẫu sẽ được đo cường độ huỳnh quang trên máy đọc vi đĩa Varioskan Lux với bước sóng kích thích và phát xạ tương ứng là 560 và 590nm Kết quả được so sánh theo tỷ lệ phần trăm với mẫu chứng [43]

25 Đánh giá tổng lượng sinh khối biofilm

Tổng lượng sinh khối biofilm sẽ được đánh giá thông qua việc nhuộm và đo hấp thụ với tím tinh thể (crystal violet - CV) Mẫu biofilm sẽ được rửa nhẹ với 2 lần PBS, loại lượng PBS còn sót lại bằng giấy thấm Biofilm sau đó sẽ được sấy khô để cố định ở 60℃ trong tối thiểu 2 giờ Mẫu sẽ được nhuộm với tím tinh thể (nồng độ 50 mg/L) trong vòng 15 phút ở nhiệt độ phòng, tránh ánh sáng Sau đó, các mẫu biofilm sẽ được loại CV dư và rửa nhẹ nhàng với nước

RO CV sẽ được hòa tan trong acid acetic 66% trong vòng 1 tiếng, tránh ánh sáng Các đĩa mẫu sẽ được đi đo hấp thụ UV tại bước sóng 570nm [43]

Sơ đồ quy trình đánh giá số lượng VSV sống trong biofilm và tổng sinh khối biofilm được biểu thị trong hình 2.4

Hình 2.4 Sơ đồ quy trình đánh giá các chỉ tiêu của biofilm

Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần độc lập Số liệu thí nghiệm thô được xử lý bằng phần mềm Excel 2016 Sử dụng các hàm phổ thông của Excel 2016 (hàm AVERAGE, hàm STDEVA), số liệu được trình bày dưới dạng trung bình ± sai số chuẩn

Xử lý thống kê cũng như biểu diễn kết quả trên phần mềm GraphPad 4.0

Sử dụng One-way ANOVA và T-test, giá trị p < 0,05 được coi là có ý nghĩa thống kê

KẾT QUẢ

Đánh giá khả năng kháng biofilm S aureus của cao chiết lá ổi các phân đoạn

3.1.1 Đánh giá khả năng kháng biofilm S aureus của cao chiết lá ổi các phân đoạn EtOH, n -hexan, CH 2 Cl 2 , EtOAc, H 2 O

3.1.1.1 Đánh giá hoạt tính kháng vi khuẩn S aureus

Thực hiện khảo sát hoạt tính kháng khuẩn các cao phân đoạn cao chiết lá ổi ở các nồng độ 10mg/mL, 5mg/mL, 2mg/mL, 1mg/mL, 0,5mg/mL bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch Kết quả được biểu thị ở bảng 3.1

Hình 3.1 Hình ảnh vòng vô khuẩn của cao chiết lá ổi các phân đoạn Bảng 3.1 Đường kính vòng vô khuẩn (mm) của cao chiết lá ổi các phân đoạn

Từ kết quả đánh giá vòng vô khuẩn, có thể thấy các phân đoạn EtOH, n- hexan, CH2Cl2, EtOAc có hoạt tính kháng khuẩn ở nồng độ 10mg/mL, DMSO ở nồng độ thử nghiệm không ảnh hưởng đến kết quả vòng vô khuẩn Phân đoạn

H2O không có hoạt tính kháng khuẩn ở cả 5 nồng độ thử nghiệm Phân đoạn n- hexan cho vòng vô khuẩn từ nồng độ 1mg/mL Kích thước vòng vô khuẩn ở nồng độ 5 và 10mg/mL của phân đoạn EtOAc là lớn nhất

3.1.1.2 Đánh giá hoạt tính kháng biofilm S aureus

Thực hiện đánh giá hoạt tính kháng biofilm của cao chiết lá ổi các phân đoạn EtOH, n-hexan, CH2Cl2, EtOAc, H2O trong 3 điều kiện khác nhau: môi trường TGN, TGN kết hợp moxifloxacin nồng độ 1,5mg/L, TGN kết hợp vancomycin nồng độ 20mg/L Các kết quả được so sánh với mẫu chứng (không bổ sung dược liệu, kháng sinh) trên cùng đĩa 96 giếng

Hình 3.2 Tỉ lệ % giá trị tổng sinh khối biofilm sau khi tiếp xúc với cao chiết lá ổi các phân đoạn

TGN co ntro l EtOH EtOAc CH 2Cl

TGN + Mxf co ntr ol co ntr ol MXF Et OH

TGN + Van co ntr ol co ntr ol Va n

29 Kết quả nhuộm và đo hấp thụ với tím tinh thể cho thấy cao chiết lá ổi các phân đoạn EtOH, n-hexan, CH2Cl2, EtOAc, H2O đều không làm giảm tổng sinh khối của biofilm so với mẫu chứng, trong cả điều kiện có bổ sung kháng sinh, hoặc không bổ sung kháng sinh

Tỉ lệ % giá trị huỳnh quang RF của biofilm sau khi tiếp xúc với cao chiết lá ổi các phân đoạn được biểu thị ở bảng 3.2

Bảng 3.2 Tỉ lệ % giá trị huỳnh quang RF của biofilm sau khi tiếp xúc với cao chiết lá ổi các phân đoạn

RF % Chứng EtOH EtOAc CH 2 Cl 2 n -hexan H 2 O

108,0 ± 2,9 Kết quả chuyển hóa resazurin chỉ ra phân đoạn n-hexan làm giảm khả năng chuyển hóa resazurin mạnh nhất So với mẫu chứng, phân đoạn này làm giá trị RF giảm 40,2% khi sử dụng đơn, 64,1% khi kết hợp với moxifloxacin, 50,4% khi kết hợp với vancomycin (các giá trị được tính toán bằng cách lấy giá trị RF% của mẫu chứng trừ đi giá trị RF% của mẫu thử)

Hai phân đoạn EtOAc, CH2Cl2 có làm giảm khả năng chuyển hóa resauzurin nhưng tác dụng kém hơn phân đoạn n-hexan So với mẫu chứng, hai phân đoạn này lần lượt làm giá trị RF giảm 31% và 18,2% ở dạng đơn, giảm 27,9%-41,1% khi kết hợp với kháng sinh Phân đoạn EtOH và H2O không làm giảm giá trị RF so với mẫu chứng

Lượng VSV trong biofilm (log10 CFU/mL) sau khi tiếp xúc với cao chiết lá ổi các phân đoạn được biểu thị ở bảng 3.3

Bảng 3.3 Lượng VSV trong biofilm (log 10 CFU/mL) sau khi tiếp xúc với cao chiết lá ổi các phân đoạn log 10

CFU/mL Chứng EtOH EtOAc CH 2 Cl 2 n -hexan H 2 O

8,44 ± 0,07 Kết quả đánh giá lượng VSV sống bằng cấy đếm CFU đã chỉ ra cao phân đoạn n-hexan có hoạt tính diệt VSV trong biofilm tốt nhất trong các phân đoạn Phân đoạn này có khả năng diệt 0,62 log10 CFU/mL ở dạng đơn, 1,06 log10

CFU/mL khi kết hợp với moxifloxacin, 0,63 log10 CFU/mL khi kết hợp với vancomycin (các giá trị được tính toán bằng cách lấy giá trị CFU của mẫu chứng trừ đi giá trị CFU của mẫu thử) Sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê

Hình 3.1 Tỉ lệ % giá trị huỳnh quang RF và số lượng VSV trong biofilm (log 10

CFU/ml) sau khi tiếp xúc với phân đoạn n-hexan cont rol cont rol M X F cont rol Van n- hexan n- hexan+M

R F % co nt ro l co nt ro l M

X F co nt ro l V an n- he xa n n- he xa n+ M X F n- he xa n+ V an 7

9 p < 0.01 lo g C F U /m l co ntr ol co ntr ol M xf co ntr ol Va n

RF% co ntr ol co ntr ol Mx f co ntr ol Va n CH2

3.1.2 Đánh giá khả năng kháng biofilm S aureus của các phân đoạn O1.1- O1.7 của phân đoạn n -hexan

Với phân đoạn có tác dụng tốt nhất n-hexan, tách được 7 phân đoạn nhỏ là O1.1, O1.2, O1.3, O1.4, O1.5, O1.6, O1.7 theo sơ đồ phân lập được thể hiện trên hình 3.3

Hình 3.3 Sơ đồ phân lập các phân đoạn nhỏ của cao chiết n-hexan từ lá ổi

Tiến hành thử hoạt tính kháng biofilm của các phân đoạn nhỏ này tương tự như thử với các phân đoạn lớn

3.1.2.1 Đánh giá hoạt tính kháng vi khuẩn S aureus

Thực hiện khảo sát hoạt tính kháng khuẩn các cao phân đoạn O1.1-O1.7 của phân đoạn n-hexan ở các nồng độ 10mg/mL, 5mg/mL, 2mg/mL, 1mg/mL, 0,5mg/mL bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch Kết quả vòng vô khuẩn được biểu thị ở bảng 3.4

Bảng 3.4 Đường kính vòng vô khuẩn (mm) của các phân đoạn O1.1-O1.7

Hình 3.4 Hình ảnh vòng vô khuẩn của các phân đoạn O1.1-O1.7

Từ đường kính vòng vô khuẩn của các phân đoạn O1.1-O1.7, có thể thấy phân đoạn O1.1, O1.2, O1.3 không có hoạt tính kháng khuẩn kể cả ở nồng độ 10mg/mL Bốn phân đoạn O1.4, O1.5, O1.6, O1.7 có hoạt tính kháng khuẩn ở cả 5 nồng độ thử nghiệm Đường kính vòng vô khuẩn của phân đoạn O1.7 là lớn nhất ở bất kỳ nồng độ nào Qua đó có thể sơ bộ đánh giá, phân đoạn O1.7 có hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất trong 7 phân đoạn

3.1.2.2 Đánh giá hoạt tính kháng biofilm S aureus

Hình 3.5 Tỉ lệ % giá trị tổng sinh khối biofilm sau khi tiếp xúc với các phân đoạn O1.1-O1.7

Kết quả cho thấy các phân đoạn O1.1-O1.7 của phân đoạn n-hexan đều không làm giảm tổng sinh khối của biofilm so với mẫu chứng

Tỉ lệ % giá trị huỳnh quang RF của biofilm sau khi tiếp xúc với các phân đoạn O1.1–O1.7 được biểu thị ở bảng 3.5

Bảng 3.5 Tỉ lệ % giá trị huỳnh quang RF của biofilm sau khi tiếp xúc với các phân đoạn O1.1–O1.7

TGN co ntro l n-h ex an O1 1 O1 2 O1 3 O1 4 O1 5 O1 6 O1 7 0

TGN + Mxf con tro l con tro l M xf n- hex an O1.1 O1.2 O1.3 O1.4 O1.5 O1.6 O1.7 0

TGN + Van con tro l con tro l Va n n- hex an O1.1 O1.2 O1.3 O1.4 O1.5 O1.6 O1.7 0

34 Kết quả đánh giá chuyển hóa resazurin cho thấy ba phân đoạn O1.1, O1.2, O1.3 không làm giảm khả năng chuyển hóa resazurin, kể cả ở dạng đơn hay kết hợp với kháng sinh Bốn phân đoạn O1.4, O1.5, O1.6, O1.7 có tác dụng làm giảm khả năng chuyển hóa resazurin tốt So với mẫu chứng, các phân đoạn này khi sử dụng dạng đơn có khả năng giảm 42.4 – 64% giá trị RF, khi kết hợp với kháng sinh có khả năng giảm 44.4 – 63.7% giá trị RF

Lượng VSV trong biofilm (log10 CFU/ml) sau khi tiếp xúc với các phân đoạn O1.1–O1.7 được biểu thị trong bảng 3.6

Bảng 3.6 Lượng VSV trong biofilm (log 10 CFU/ml) sau khi tiếp xúc với các phân đoạn O1.1–O1.7 log 10

Kết quả cấy đếm CFU cho thấy 3 phân đoạn O1.1, O1.2, O1.3 không có tác dụng diệt VSV trong biofilm Bốn phân đoạn O1.4, O1.5, O1.6, O1.7 có tác dụng kháng biofilm tốt Ở dạng đơn, 4 phân đoạn này làm giảm 0,76 – 0,98 log10 CFU/ml so với mẫu chứng không kháng sinh Khi kết hợp với Moxifloxacin nồng độ 1,5mg/L, các phân đoạn này làm giảm 1,56 – 2,11 log10

Kết hợp với Moxifloxacin nồng độ 1,5mg/L làm tăng tác dụng diệt VSV trong biofilm của cả 4 phân đoạn so với sử dụng dạng đơn, sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê

Hình 3.6 Lượng VSV trong biofilm (log 10 CFU/mL) sau khi tiếp xúc với phân đoạn O1.4-O1.7 dạng đơn và khi kết hợp với Mxf

Tác dụng của các phân đoạn O1.4, O1.5, O1.6, O1.7 khi sử dụng đơn hay kết hợp với Vancomycin không tốt hơn phân đoạn n-hexan trong cùng điều kiện thực nghiệm Tuy nhiên, khi kết hợp với Mxf, tác dụng diệt VSV trong biofilm của 4 phân đoạn này tốt hơn so với phân đoạn n-hexan Sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê

Hình 3.7 Lượng VSV trong biofilm (log 10 CFU/mL) sau khi tiếp xúc với phân đoạn n-hexan và các phân đoạn O1.4-O1.7 cont rol cont rol MXF O1.4 O1.4+

7 8 9 p