Tổng hợp và đánh giá khả năng kháng ung thư đại trực tràng hướng ức chế egfr tyrosin kinase của các chất tương đồng curcumin

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ĐỒN QUỐC HOÀI NAM TỔNG HỢP VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG HƯỚNG ỨC CHẾ EGFR TYROSIN KINASE CỦA CÁC CHẤT TƯƠNG ĐỒNG CURCUMIN LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2022 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ĐOÀN QUỐC HOÀI NAM TỔNG HỢP VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG HƯỚNG ỨC CHẾ EGFR TYROSIN KINASE CỦA CÁC CHẤT TƯƠNG ĐỒNG CURCUMIN NGÀNH: CÔNG NGHỆ DƯỢC PHẨM VÀ BÀO CHẾ MÃ SỐ: 8720202 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS TS TRƯƠNG NGỌC TUYỀN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2022 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực, khách quan chưa công bố cơng trình nghiên cứu khác Nếu khơng nêu trên, tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm Tác giả luận văn Đoàn Quốc Hoài Nam Luận văn Thạc sĩ Dược học - Khoá 2020-2022 TỔNG HỢP VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG HƯỚNG ỨC CHẾ EGFR TYROSIN KINASE CỦA CÁC CHẤT TƯƠNG ĐỒNG CURCUMIN Đoàn Quốc Hoài Nam Người hướng dẫn: PGS TS Trương Ngọc Tuyền Đặt vấn đề Ung thư đại trực tràng (CRC) ung thư phổ biến thứ ba giới thứ năm Việt Nam Thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì (EGFR) xem đích tác động điều trị ung thư nói chung CRC nói riêng Việc kết hợp cấu trúc chung chất tương đồng curcumin kiểu monocarbonyl (MACs) với cấu trúc có nhiều hoạt tính tiềm 1H-pyrazol để hình thành hợp chất hướng nghiên cứu hứa hẹn điều trị CRC thông qua việc ức chế EGFR Đối tượng Phương pháp Đối tượng nghiên cứu: Các MACs chứa 1H-pyrazol đánh khả kháng CRC theo hướng ức chế hoạt động EGFR qua thử nghiệm in vitro in silico Tổng hợp MACs chứa cấu trúc nối cyclohexanon: Các MACs tổng hợp phản ứng ngưng tụ Claisen-Schmidt 1,3-diphenyl-1H-pyrazol-4carbaldehyd (j-n) (E)-2-(phenylmethylen)cyclohexan-1-on (1-4) Độ tinh khiết kiểm tra phương pháp TLC, MP HPLC Cấu trúc hoá học xác định phương pháp IR, HR-MS, 1H-NMR, 13C-NMR ROESY Đánh giá khả gây độc tính dịng tế bào ung thư in vitro: Phương pháp MTT với tế bào SW480, MDA-MB-231 A549 xử lý 72 Đánh giá khả ức chế EGFR protein tyrosin kinase in vitro: Phương pháp phát quang luciferin với EGFRWT, EGFRL858R, HER2 VEGFR2 Đánh giá khả kích hoạt trình apoptosis in vitro SW480: Phương pháp nhuộm Hoechst 33342 (1), nhuộm FITC Annexin V / Propidium iodid (2) xác định hoạt độ caspase-3 (3) với tế bào SW480 xử lý 24 48 Đánh giá khả gây ảnh hưởng lên chu kỳ SW480 in vitro: Phương pháp nhuộm Propidium iodid với tế bào SW480 xử lý 24 48 Đánh giá khả gắn kết với EGFR in silico: Phương pháp mô gắn kết phân tử động lực học phân tử, đánh giá dạng EGFRWT, EGFRL858R, EGFRG719S EGFRG724S Đánh giá hồ sơ dược động học độc tính in silico: Dự đốn SwissADME ADMETlab2.0 Kết Bàn luận Tổng hợp MACs: 18 MACs (j1-n3) với hiệu suất 20,1-88,1%, có độ tinh khiết cao có cấu trúc phù hợp với dự kiến Đánh giá khả gây độc tính dịng tế bào ung thư in vitro: 12 MACs thể độc tính mạnh (IC50 3,22-10,28 µM) Các MACs gồm a2, a4, b1, b2, c1, c2, g2, h1, h2 i2 chọn sử dụng nội dung nghiên cứu Đánh giá khả ức chế EGFR protein tyrosin kinase in vitro: Hợp chất a4 thể khả ức chế mạnh EGFRWT (IC50 15,19 ± 0,84 µM) EGFRL858R (IC50 7,21 ± 1,28 µM) Đánh giá khả kích hoạt trình apoptosis in vitro SW480: Hợp chất a4 kích hoạt q trình apoptosis tế bào SW480, chứng minh làm thay đổi hình thái học, tăng tỷ lệ tế bào apoptosis tăng hoạt động caspase-3 Đánh giá khả gây ảnh hưởng lên chu kỳ SW480 in vitro: Hợp chất a4 bắt giữ tế bào SW480 pha G2/M Đánh giá khả gắn kết với EGFR in silico: Hợp chất a4 trì ổn định trạng thái gắn kết thuận nghịch vị trí gắn kết cạnh tranh ATP dạng EGFR, nhờ vào tương tác hiệu với strand S711-720, vùng lề strand S843-847, đặc biệt liên kết hydro với M793 Phân tích lượng gắn kết tự gợi ý a4 có khả ức chế hoạt động EGFRG719S mạnh so với EGFRL858R EGFRWT Đánh giá hồ sơ dược động học độc tính (ADMET) in silico: Hợp chất a4 dự đốn sở hữu đặc tính ADMET tiềm Kết luận Nghiên cứu tiềm hợp chất a4 khả kháng CRC hướng ức chế EGFR tyrosin kinase R3 H H B R4 R5 A 80 60 50 40 SW480 MDA-MB-231 20 R1 0.5 1.0 1.5 60 50 40 2.5 -5.0 -4.0 -3.0 -2.0 -1.0 0.0 1.0 2.0 3.0 log[Nồng độ, µM] Hoạt tính kích hoạt apoptosis O O N N 2.0 log[Nồng độ, µM] -20 Osi 80 20 A549 -0.5 MACs chứa dây nối aceton (a1-i4) a4 100 Mức độ cảm ứng hoạt tính caspase-3 N N 120 100 Tỷ lệ ức chế (%) O Tỷ lệ ức chế (%) C L858R Hoạt tínhEGFR ức chế EGFRL858R Độc tính tế bào 120 R2 OH O *** *** a4 *** 10.0 5.0 * * 2.5 0.5 *** *** ** 10.0 5.0 24 Hợp chất a4 Nhuộm Hoechst 33342 2.5 Cam 0.5 48 Nồng độ (µM) Khả gắn kết với EGFR R2 K745 K728 C G719S O R3 N N A B R4 R5 R1 w1104 M793 F795 MACs chứa dây nối cyclohexanon (j1-n3) C797 R841 D800 Các từ khoá: chất tương đồng curcumin, 1H-pyrazol, ngưng tụ Claisen-Schmidt, ung thư đại trực tràng, độc tính tế bào, EGFR, apoptosis, chu kỳ tế bào, gắn kết phân tử, động lực học phân tử, ADMET Thesis for Master’s Degree of Pharmacy - Course 2020-2022 SYNTHESIS AND EVALUATION OF ANTI-COLORECTAL CANCER ACTIVITIES OF CURCUMIN ANALOGUES AS EGFR TYROSINE KINASE INHIBITORS Doan Quoc Hoai Nam Supervisor: Assoc Prof Ph.D Truong Ngoc Tuyen Introduction Colorectal cancer (CRC) is the third and the fifth most common cancer in the world and in Vietnam, respectively Epidermal growth factor receptor (EGFR) is considered as a promising target in the treatment of various types of cancer, including CRC A combination of the common structure of MACs with 1H-pyrazole containing multi-biological activities to create novel curcumin analogues could lead to a promising research direction in the treatment of CRC through the inhibition of EGFR Subjects and Methodology Research subjects: MACs containing 1H-pyrazole were evaluated their antiCRC activity targeting EGFR via several in vitro and in silico experiments Synthesis of MACs containing cyclohexanone linker: MACs were synthesized by the condensation between a 1,3-diphenyl-1H-pyrazole-4-carbaldehyde (j-n) and an (E)-2-(phenylmethylene)cyclohexan-1-one (1-4) Their purity was checked by TLC, MP, and HPLC methods Their structure was determined by IR, HR-MS, 1HNMR, 13C-NMR, and ROESY methods Evaluation of in vitro cytotoxicity against cancer cell lines: MTT method with SW480, MDA-MB-231, and A549 cells treated for 72 hours Evaluation of in vitro inhibition against EGFR and tyrosine kinases: Luciferinbased luminescent method with EGFRWT, EGFRL858R, HER2, and VEGFR2 Evaluation of in vitro apoptosis-inducing activity on SW480 cells: Hoechst 33342 staining (1), FITC Annexin V / Propidium iodide staining (2), and identifying the activity of caspase-3 methods with SW480 cells treated for 24 and 48 hours Evaluation of in vitro effect on the SW480 cell’s cycle: Propidium iodide staining method with SW480 cells treated for 24 hours and 48 hours Evaluation of in silico binding ability with EGFR: Molecular docking and molecular dynamics simulation with EGFRWT, EGFRL858R, EGFRG719S, and EGFRG724S Evaluation of in silico prediction of pharmacokinetic and toxicity profile: Predictions were conducted by employing SwissADME ADMETlab2.0 platforms Results and Discussions Synthesis of MACs: 18 MACs (j1-n3) with final yields varying from 20.1 to 88.1%, high purities and spectral data consistent with the designed structures Evaluation of in vitro cytotoxicity against cancer cell lines: 12 MACs demonstrated strong cytoxicities (IC50 3.22-10.28 µM) MACs including a2, a4, b1, b2, c1, c2, g2, h1, h2 and i2 were selected for the subsequent experiment Evaluation of in vitro inhibition of EGFR and tyrosine kinases: Compound a4 demonstrated the greatest inhibitions against EGFRWT (IC50 15.19 ± 0.84 µM) and EGFRL858R (IC50 7.21 ± 1.28 µM) Evaluation of in vitro apoptosis-inducing activity on SW480 cells: Compound a4 induced apoptosis in SW480 cells due to cellular morphological changes, increases in the percentage of apoptotic cells, and increases in caspase-3 activity Evaluation of in vitro effect on the SW480 cell’s cycle: Compound a4 arrested SW480 cells at G2/M phase Evaluation of in silico binding ability with EGFR: Compound a4 maintained its reversible binding state in the ATP binding site of EGFR forms due to its effective interactions with strand S711-720, hinge region and strand S843- 847 , especially the hydrogen bonding with M793 The analysis of free binding energy suggested that a4 could inhibit EGFRG719S more effectively than EGFRL858R and EGFRWT Evaluation of in silico prediction of pharmacokinetic and toxicity (ADMET) profile: Compound a4 was predicted to possess proper ADMET properties Conclusion The research has shown the promising anti-CRC and anti-EGFR activities of compound a4 120 R2 L858R EGFRL858REGFR inhibitory activity Cytotoxicity 120 O R3 N N H H B R4 R5 A 80 60 50 40 SW480 MDA-MB-231 20 R1 -0.5 MACs with acetone linker (a1-i4) 1.0 1.5 2.0 Osi 80 60 50 40 20 A549 0.5 -20 a4 100 %Inhibition C %Inhibition 100 2.5 -5.0 -4.0 -3.0 log[Concentration, µM] -2.0 -1.0 0.0 1.0 2.0 3.0 log[Concentration, µM] Apoptosis-inducing activities Fold increase in caspase-3 activity O O N N OH O *** *** a4 *** 10.0 5.0 * * 2.5 0.5 *** *** ** 10.0 5.0 24 hours Compound a4 Hoechst 33342 staining 2.5 Cam 0.5 48 hours Concentration (µM) Binding mode into EGFR R2 K745 K728 C G719S O R3 N N A B R4 R5 R1 w1104 M793 F795 MACs with cyclohexanon linker (j1-n3) C797 R841 D800 Keywords: curcumin analogues, 1H-pyrazole, Claisen-Schmidt condensation, colorectal cancer, cytotoxicity, EGFR, apoptosis, cell cycle, molecular docking, molecular dynamics, pharmacokinetics MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT i DANH MỤC CÁC BẢNG .vi DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ SƠ ĐỒ vii MỞ ĐẦU Chương TỔNG QUAN 1.1 DỊCH TỄ HỌC UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG 1.2 THỤ THỂ CỦA YẾU TỐ TĂNG TRƯỞNG BIỂU BÌ VÀ ĐÍCH TÁC ĐỘNG TRONG ĐIỀU TRỊ UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG 1.3 CURCUMIN VÀ CÁC CHẤT TƯƠNG ĐỒNG KIỂU MONOCARBONYL 11 1.4 DỊ VÒNG 1H-PYRAZOL 18 1.5 THIẾT KẾ THUỐC DỰA TRÊN CẤU TRÚC 22 1.6 DỰ ĐOÁN HỒ SƠ DƯỢC ĐỘNG HỌC VÀ ĐỘC TÍNH 26 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 27 2.2 TỔNG HỢP CÁC MACs CHỨA CẤU TRÚC NỐI CYCLOHEXANON 32 2.3 ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG GÂY ĐỘC TÍNH TRÊN TẾ BÀO UNG THƯ IN VITRO 37 2.4 ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ EGFR VÀ CÁC PROTEIN TYROSIN KINASE KHÁC IN VITRO 38 2.5 ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KÍCH HOẠT Q TRÌNH APOPTOSIS IN VITRO TRÊN DÒNG TẾ BÀO UNG THƯ ĐẠI TRÀNG SW480 39 2.6 ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG GÂY ẢNH HƯỞNG LÊN CHU KỲ TẾ BÀO UNG THƯ ĐẠI TRÀNG SW480 IN VITRO 42 2.7 ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG GẮN KẾT VỚI EGFR IN SILICO 43 2.8 ĐÁNH GIÁ HỒ SƠ DƯỢC ĐỘNG HỌC VÀ ĐỘC TÍNH IN SILICO 51 2.9 XỬ LÝ THỐNG KÊ VÀ PHÂN TÍCH SỐ LIỆU 51 Chương KẾT QUẢ 53 3.1 TỔNG HỢP CÁC MACs CHỨA CẤU TRÚC NỐI CYCLOHEXANON 53 3.2 KHẢ NĂNG GÂY ĐỘC TÍNH TRÊN TẾ BÀO UNG THƯ IN VITRO CỦA CÁC MACs THỬ NGHIỆM 87 3.3 KHẢ NĂNG ỨC CHẾ EGFR VÀ CÁC PROTEIN TYROSIN KINASE KHÁC IN VITRO CỦA CÁC MACs THỬ NGHIỆM 89 3.4 KHẢ NĂNG KÍCH HOẠT APOPTOSIS IN VITRO TRÊN DÒNG TẾ BÀO UNG THƯ ĐẠI TRÀNG SW480 CỦA HỢP CHẤT a4 89 3.5 KHẢ NĂNG GÂY ẢNH HƯỞNG CHU KỲ TẾ BÀO UNG THƯ ĐẠI TRÀNG SW480 IN VITRO CỦA HỢP CHẤT a4 94 3.6 KHẢ NĂNG GẮN KẾT VỚI EGFR IN SILICO CỦA HỢP CHẤT a4 95 3.7 HỒ SƠ DƯỢC ĐỘNG HỌC VÀ ĐỘC TÍNH CỦA HỢP CHẤT a4 109 Chương BÀN LUẬN 110 4.1 TỔNG HỢP CÁC MACs CHỨA CẤU TRÚC NỐI CYCLOHEXANON 110 4.2 KHẢ NĂNG GÂY ĐỘC TÍNH TRÊN TẾ BÀO UNG THƯ IN VITRO CỦA CÁC MACs THỬ NGHIỆM 114 4.3 KHẢ NĂNG ỨC CHẾ EGFR VÀ CÁC PROTEIN TYROSIN KINASE KHÁC IN VITRO CỦA CÁC MACs THỬ NGHIỆM 116 4.4 KHẢ NĂNG KÍCH HOẠT APOPTOSIS IN VITRO TRÊN DỊNG TẾ BÀO UNG THƯ ĐẠI TRÀNG SW480 CỦA HỢP CHẤT a4 117 4.5 KHẢ NĂNG GÂY ẢNH HƯỞNG CHU KỲ TẾ BÀO UNG THƯ ĐẠI TRÀNG SW480 IN VITRO CỦA HỢP CHẤT a4 118 4.6 KHẢ NĂNG GẮN KẾT VỚI EGFR IN SILICO CỦA HỢP CHẤT a4 119 4.7 HỒ SƠ DƯỢC ĐỘNG HỌC VÀ ĐỘC TÍNH CỦA HỢP CHẤT a4 123 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 124 KẾT LUẬN 124 KIẾN NGHỊ 125 DANH MỤC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ CĨ LIÊN QUAN TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC i DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Ý nghĩa tiếng Anh Ý nghĩa tiếng Việt A Absorbance Độ hấp thu Ac Acetyl Acetyl Acc Hydrogen bond acceptor Nhóm nhận liên kết hydro ADMET Absorbtion - Distribution - Hấp thu - Phân bố - Chuyển hoá Metabolism - Excretion - Toxicity - Thải trừ - Độc tính ADN Deoxyribose nucleic acid Acid deoxyribose nucleic ADP Adenosine diphosphate Adenosin diphosphat ATP Adenosine triphosphate Adenosin triphosphat ARN Ribose nucleic acid Acid ribose nucleic Cam Camptothecin Camptothecin CC Column chromatography Sắc ký cột CRC Colorectal cancer Ung thư đại trực tràng CTPT Chemical formula Công thức phân tử ĐKT Co-crystallization Đồng kết tinh DCM Dichloromethane Dicloromethan DMF N,N-Dimethylformamide N,N-Dimethylformamid DMSO Dimethyl sulfoxide Dimethyl sulfoxid Don Hydrogen bond donor Nhóm cho liên kết hydro DTT 1,4-Dithiothreitol 1,4-Dithiothreitol EGF Epidermal growth factor Yếu tố tăng trưởng biểu bì Ell Ellipticine Ellipticin ii Ký hiệu Ý nghĩa tiếng Anh Ý nghĩa tiếng Việt Erl Erlotinib Erlotinib Et Ethyl Ethyl FBS Fetal bovine serum Huyết bào thai bê FDA Food and Drug Administration Cục quản lý Thực phẩm Dược phẩm Hoa Kỳ FITC Fluorescein isothiocyanate Fluorescein isothiocyanat Gef Gefitinib Gefitinib GLOBOCAN Global cancer observatory HEPES HPLC Báo cáo thực trạng ung thư 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazine Acid 4-(2-hydroxyethyl)-1ethane sulfonic acid piperazin ethan sulfonic High perfomance liquid Sắc ký lỏng hiệu cao chromatography IC50 Half maximal inhibitory Nồng độ ức chế tối đa 50% concentration JBJ JBJ-09-063 JBJ-09-063 LA-GA Lamarckian genetic algorithm Thuật toán di truyền Lamarckian LU Luminescence unit Đơn vị phát quang mAbs Monoclonal antibodies Kháng thể đơn dòng MACs Monocarbonyl analogues of Chất tương đồng curcumin kiểu curcumin monocarbonyl MAPK Mitogen-activated protein kinase Kinase protein kích hoạt mitogen MDs Molecular dynamics simulation Mô động lực học phân tử iii Ký hiệu Ý nghĩa tiếng Anh Ý nghĩa tiếng Việt Me Methyl Methyl MMPBSA Molecular mechanics Poisson- Diện tích bề mặt học phân tử Boltzmann surface area Poisson-Boltzmann MP Melting point Điểm chảy, nhiệt độ nóng chảy MR Molar refractivity Hệ số khúc xạ mol MTT 3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5- 3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]diphenyltetrazolium bromide 2,5-diphenyltetrazolium bromid mw Microwave Vi sóng MW Molecular weight Khối lượng phân tử NMR Nuclear magnetic resonance Cộng hưởng từ hạt nhân s Singlet Đỉnh đơn d Doublet Đỉnh đôi dd Doublet of doublets Đỉnh đôi - đôi t Triplet Đỉnh ba dt Doublet of triplets Đỉnh đôi - ba tt Triplet of triplets Đỉnh ba - ba quint Quintet Đỉnh năm m Multiplet Đỉnh đa mc Center of multiplet Đỉnh đa xác định độ dời hoá học trung tâm J Coupling constant Hằng số ghép NPT Isothermal - isobaric ensemble Cân đẳng nhiệt - đẳng áp iv Ký hiệu Ý nghĩa tiếng Anh Ý nghĩa tiếng Việt NVT Isothermal - isochoric ensemble Cân đẳng nhiệt - đẳng tích Osi Osimertinib Osimertinib PAINS Pan assay interference Chất gây dương tính giả compounds nghiên cứu sàng lọc PBS Photphate buffer saline Nước muối đệm phosphat PDA Photodiode array Dãy diode quang PI3K Phosphatidylinositol 3-kinase Phosphatidylinositol 3-kinase PI Propidium iodide Propidium iodid iPr Isopropyl Isopropyl PS Phosphatidyl serine Phosphatidyl serin PTSA p-Toluenesulfonic acid Acid p-toluensulfonic QSAR Quantitative structure activity Liên quan định lượng cấu trúc relationship tác dụng RMSD Root mean square deviation Độ lệch gốc bình phương RMSF Root mean square fluctuation Độ dao động gốc bình phương ROESY Rotating-frame nuclear Quang phổ tương quan hiệu ứng Overhauser effect correlation Overhauser hạt nhân quay spectroscopy SASA Solvent accessible surface area Diện tích bề mặt tiếp cận dung mơi SDH Succinate dehydrogenase Succinat dehydrogenase TBUT Cancer cell Tế bào ung thư TGF Transformational growth factor Yếu tố tăng trưởng chuyển đổi v Ký hiệu Ý nghĩa tiếng Anh Ý nghĩa tiếng Việt THF Tetrahydrofuran Tetrahydrofuran TIP3P Transferable intermolecular Thế liên phân tử truyền potential with points với điểm TK Tyrosine kinase Tyrosin kinase TKIs Tyrosine kinase inhibitors Chất ức chế tyrosin kinase TLC Thin layer chromatography Sắc ký lớp mỏng TPSA Topological polar surface area Diện tích bề mặt phân cực tR Retention time Thời gian lưu VEGF Vascular endothelial growth Yếu tố tăng trưởng nội mô mạch factor máu X-ray diffraction Phương pháp nhiễu xạ tia X XRD vi DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Tóm tắt hệ TKIs đối kháng EGFR 14 Bảng 2.1 Cấu trúc hóa học MACs sử dụng nghiên cứu 29 Bảng 2.2 Các thông số grid box docking sử dụng giai đoạn docking mù docking tập trung vào vị trí gắn kết cạnh tranh ATP allosteric 45 Bảng 2.3 Các trình gắn kết phân tử vào khoang gắn kết EGFR để đánh giá lại khả tái tạo liệu thực nghiệm 47 Bảng 3.1 Phân bố quần thể TBUT SW480 giai đoạn apoptosis xử lý với hợp chất a4 khoảng thời gian 24 48 93 Bảng 3.2 Mức độ cảm ứng caspase-3 hợp chất a4 xử lý với TBUT SW480 hai khoảng thời gian 24 48 94 Bảng 3.3 Phân bố quần thể tế bào giai đoạn chu kỳ TBUT SW480 xử lý với hợp chất a4 khoảng thời gian 24 48 95 vii DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ SƠ ĐỒ Hình 1.1 Mức độ phổ biến loại ung thư theo GLOBOCAN 2020 Hình 1.2 Tình hình ung thư phổ biến Việt Nam theo GLOBOCAN 2020 Hình 1.3 EGFR kích hoạt hai đường tín hiệu RAS/RAF/ MEK/MAPK PI3K/Akt/mTOR đóng vai trị quan trọng ung thư Hình 1.4 Các thành phần cấu trúc vùng TK EGFR (703-984), vị trí gắn kết ATP vị trí ba đột biến G719S, G724S L858R29-32 Hình 1.5 Curcumin chất tương đồng curcumin kiểu monocarbonyl (MACs) 16 Hình 1.6 Tổng hợp MACs chứa cyclohexanon có khả ức chế hoạt động EGFR TK 17 Hình 1.7 Đa dạng hoạt tính sinh học dị vịng 1H-pyrazol qua diện cấu trúc phân tử số hoạt chất 20 Hình 1.8 Các hoạt chất kháng ung thư chứa dị vòng 1H-pyrazol 21 Hình 2.1 Định hướng thiết kế chất tương đồng curcumin 28 Hình 2.2 Tổng hợp dẫn chất 1,3-diphenyl-1H-pyrazol-4-carbaldehyd (j-n) 33 Hình 2.3 Tổng hợp dẫn chất (E)-2-(phenylmethylen)cyclohexan-1-on (1-4) 34 Hình 2.4 Tổng hợp MACs chứa cấu trúc nối cyclohexanon (j1-n3) 35 Hình 2.5 Đánh giá lựa chọn cluster từ docking mù (blind docking) docking tập trung (focused docking) 46 Hình 2.6 Hai giai đoạn q trình mơ gắn kết phân tử 48 Hình 2.7 Bốn giai đoạn q trình MDs 52 Hình 3.1 Kết độc tính ba dòng TBUT MACs thử nghiệm 88 Hình 3.2 Kết khả ức chế EGFRWT, EGFRL858R, HER2 VEGFR2 10 MACs lựa chọn 90 viii Hình 3.3 Thay đổi hình thái học TBUT SW480 xử lý với hợp chất a4 91 Hình 3.4 Cluster chọn vị trí gắn kết ligand ĐKT EGFR TK 96 Hình 3.5 Vị trí gắn kết kiểu gắn kết ligand ĐKT từ re-docking crossdocking tập trung dạng EGFR 98 Hình 3.6 Vị trí gắn kết kiểu gắn kết thuận nghịch không thuận nghịch hợp chất a4 dạng EGFR 99 Hình 3.7 Động lực học dạng apo-EGFRWT/L858R phức hợp tương ứng khoảng 30-100 ns mô 101 Hình 3.8 Động lực học dạng apo-EGFRG719S/G724S phức hợp tương ứng khoảng 30-100 ns mô 105 Hình 3.9 Phân tích tương tác a4 Erl với dạng EGFR mô động lực học phân tử 108 Hình 3.10 Biểu đồ radar biểu diễn đặc tính lý hóa hợp chất a4 109 Hình 4.1 Xác nhận cấu hình (E) dẫn chất 1-4 dựa phổ ROESY 111 Hình 4.2 Xác nhận cấu hình (2E,6E) MACs j1-n3 dựa phổ ROESY 113 Hình 4.3 Tóm tắt nhận xét SAR độc tính TBUT MACs 116 MỞ ĐẦU Ung thư đại trực tràng (CRC), khởi phát đại tràng trực tràng, dạng ung thư phổ biến hầu hết quốc gia Theo GLOBOCAN 2020, CRC ung thư phổ biến đứng hàng thứ ba giới đứng hàng thứ năm Việt Nam, với 16.426 ca mắc, 8.203 ca tử vong có xu hướng ngày phổ biến giới trẻ Mặc dù với việc khám phá phát triển thuốc diễn nhanh, thuốc điều trị ung thư nói chung CRC nói riêng dùng dường chưa đáp ứng tính an tồn, hiệu chọn lọc, trở thành vấn đề tồn chưa thể giải Liệu pháp điều trị dựa vào đích tác động phương pháp hữu hiệu hóa trị liệu để ngăn chặn phát triển lan rộng tế bào ung thư (TBUT), cách hướng mục tiêu đến gen hay protein cụ thể Thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì (EGFR), glycoprotein xuyên màng hoạt động trung gian quan trọng q trình tín hiệu cần thiết cho q trình tăng trưởng phát triển tế bào, đặc biệt TBUT Với vai trò thiết yếu, EGFR xem đích tác động điều trị ung thư nói chung CRC nói riêng Các kháng thể đơn dòng (mAbs) phân tử nhỏ ức chế tyrosin kinase (TKIs) hai cách tiếp cận lâm sàng chủ chốt liệu pháp ức chế EGFR Cho đến nay, hàng trăm TKIs tổng hợp phân loại thành bốn hệ, nhiên đề kháng đột biến EGFR khiến việc điều trị theo liệu pháp gặp nhiều khó khăn thách thức lớn điều trị loại ung thư có liên quan Nhiều nghiên cứu thực để khám phá chất ức chế chuyên biệt EGFR đột biến Ở khía cạnh khác, curcumin, thành phần thân rễ nghệ vàng (Curcuma longa L Zingiberaceae), sở hữu nhiều hoạt tính sinh học kháng ung thư, kháng viêm, kháng HIV, chống oxy hóa, Tuy nhiên với hạn chế tính tan, tính bền, sinh khả dụng,… phát triển thay chất tương đồng monocarbonyl curcumin (MACs) chứa divinyl ceton, nhìn chung làm cải thiện liệu dược động học hoạt tính sinh học so với curcumin Hơn nữa, nay, số lượng MACs chứa dị vòng 1H-pyrazol hạn chế, cấu trúc dị vịng có nhiều hoạt tính sinh học tiềm Do đó, cân nhắc tính khả thi lợi ích tổng hợp tiềm hoạt tính sinh học MACs chứa cấu trúc đa dạng dị vòng 1H-pyrazol, tác giả tiến hành thực đề tài nghiên cứu “Tổng hợp đánh giá khả kháng ung thư đại trực tràng hướng ức chế EGFR tyrosin kinase chất tương đồng curcumin” với mục tiêu: Mục tiêu tổng quát: Đánh giá khả kháng CRC MACs chứa dị vòng 1H-pyrazol, theo hướng ức chế EGFR tyrosin kinase qua thử nghiệm in vitro in silico Mục tiêu cụ thể: Tổng hợp MACs chứa cấu trúc 1,3-diphenyl-1H-pyrazol cấu trúc nối cyclohexanon Sử dụng MACs tổng hợp với 36 MACs nghiên cứu trước cho thử nghiệm Sàng lọc khả kháng ung thư MACs qua thử nghiệm độc tính tế bào dịng TBUT người, gồm TBUT đại tràng SW480, TBUT vú MDA-MB231 TBUT phổi A549, qua lựa chọn MACs gây độc tế bào mạnh hầu hết dòng TBUT, đặc biệt dòng TBUT đại tràng người SW480; Đánh giá khả ức chế hoạt động EGFR tyrosin kinase, bao gồm dạng tự nhiên EGFRWT dạng đột biến EGFRL858R, MACs lựa chọn từ mục tiêu số 2, qua lựa chọn tiếp MACs có khả ức chế EGFR; Đánh giá khả kích hoạt q trình apoptosis MACs tiềm năng, lựa chọn từ mục tiêu số 3, dòng TBUT đại tràng người SW480; Phân tích ảnh hưởng MACs tiềm năng, lựa chọn từ mục tiêu số 3, lên chu kỳ tế bào dòng TBUT đại tràng người SW480; Đánh giá khả gắn kết MACs tiềm năng, lựa chọn từ mục tiêu số 3, với dạng tự nhiên EGFRWT dạng đột biến bắt gặp CRC gồm EGFRL858R, EGFRG719S EGFRG724S phương pháp mô gắn kết phân tử phương pháp động lực học phân tử Dự đốn tính chất dược động học - độc tính MACs tiềm lựa chọn từ mục tiêu số Chương TỔNG QUAN 1.1 DỊCH TỄ HỌC UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG Ung thư tên gọi chung tập hợp bệnh có liên quan, đặc trưng phân chia khơng kiểm sốt tế bào bất thường1 Ung thư đại trực tràng (CRC), có liên quan đến tế bào bất thường khởi phát đại tràng trực tràng, dạng ung thư phổ biến gây tử vong Nguy diễn tiến phát triển CRC đến từ yếu tố môi trường di truyền Theo GLOBOCAN 2020, có tỷ lệ mắc tử vong thay đổi đáng kể vùng giới, nhìn chung, CRC đứng thứ ba, nam giới, đứng thứ hai, nữ giới, số loại ung thư phổ biến nhất, tỷ lệ mắc tử vong nam cao đáng kể so với nữ2 Hàng năm, có xấp xỉ 149.500 ca mắc chẩn đoán, với 104.270 ca ung thư đại tràng phần lại ung thư trực tràng1 Ở Việt Nam, CRC loại ung thư phổ biến đứng hàng thứ tư nam giới đứng hàng thứ ba nữ giới, với số trường hợp mắc tương ứng 8.887 7.539 trường hợp, gồm 9.399 ca ung thư trực tràng 6.448 ca ung thư đại tràng2 1.1.1 Tỷ lệ mắc yếu tố ảnh hưởng Nhìn chung, tỷ lệ mắc vùng địa lý biến động 10 lần, cao Australia, New Zealand, nước châu Âu Bắc Mỹ, thấp nước châu Phi Trung-Nam Á3 Sự khác biệt theo địa lý khác biệt chế độ ăn uống tiếp xúc với môi trường xung quanh, tảng yếu tố di truyền Tình trạng kinh tế xã hội thấp liên quan với nguy phát triển CRC, thói quen lười vận động, chế độ ăn không lành mạnh, hút thuốc, béo phì tỷ lệ khám sàng lọc CRC thấp đóng góp tỷ lệ khơng nhỏ, từ 33 đến 50%, vào nguy khởi phát CRC4 Tuổi tác yếu tố nguy CRC, vốn không phổ biến trước 40 tuổi bắt đầu tăng đáng kể độ tuổi từ 40 đến 50 Sự gia tăng chủ yếu với ung thư phần đại tràng bên trái nói chung ung thư trực tràng nói riêng5 Các lý cho xu hướng nhiều yếu tố tiền sử mắc CRC người thân, tăng lipid máu, béo phì uống rượu bia6 Hầu hết hướng dẫn hành không khuyến nghị sàng lọc người 50 tuổi triệu chứng, trừ có yếu tố tiền sử gia đình hội chứng di truyền7 Tuy nhiên, việc xem xét giảm độ tuổi khám sàng lọc cân nhắc bối cảnh tỷ lệ mắc CRC khởi phát sớm ngày tăng, đặc biệt người độ tuổi từ 40 đến 49 A Vú 2.261.419 (11,7%) Phổi 2.206.771 (11,4%) Đại trực tràng 1.931.590 (10,0%) Ung thư khác 10.389.647 (53,9%) Tuyến tiền liệt 1.414.259 (7,3%) Dạ dày 1.089.103 (5,6%) Tổng cộng: 19.292.789 B Gan 26.418 (14,5%) Ung thư khác 73.996 (40,5%) Phổi 26.262 (14,4%) Vú 21.555 (11,8%) Đại trực tràng 16.426 (9,0%) Dạ dày 17.906 (9,8%) Tổng cộng: 182.563 Hình 1.1 Mức độ phổ biến loại ung thư theo GLOBOCAN 2020 (A) Trên giới (B) Ở Việt Nam2 Mặt khác, CRC dần thay đổi vị trí khởi phát phần bên phải đại tràng với tỷ lệ mắc tăng tương đối cao8 Sự thay đổi phân bố giải phẫu CRC, phần liên quan đến cải thiện chẩn đoán điều trị, khả sàng lọc loại bỏ sớm polyp Nội soi đại tràng có hiệu việc ngăn ngừa CRC phần bên trái so với phần bên phải, góp phần vào thay đổi phân bố CRC Có khả phần khác biệt khía cạnh chất lượng nội soi yếu tố sinh học khác vị trí bên phải bên trái đại tràng8 1.1.2 Tỷ lệ tử vong Tỷ lệ tử vong CRC giảm dần kể từ năm 1980 Hoa Kỳ nhiều nước phương Tây khác1 Sự cải thiện phần nhờ vào việc phát loại bỏ polyp đại tràng, phát CRC giai đoạn sớm, phương pháp điều trị hỗ trợ hiệu Tuy nhiên, việc tỷ lệ tử vong nhìn chung giảm dần, che lấp xu hướng gia tăng tỷ lệ tử vong người trẻ tuổi Sự gia tăng giới hạn người trẻ da trắng với khoảng 1,4% năm (2004-2014) Ngược lại, cá thể da đen chủng tộc khác, tỷ lệ tử vong ổn định giảm nhẹ khoảng thời gian này9 Trái ngược với liệu nước phát triển, tỷ lệ tử vong có xu hướng tiếp tục tăng nhiều quốc gia có nguồn lực sở hạ tầng y tế hạn chế, đặc biệt Trung-Nam Mỹ Đơng Âu, theo GLOBOCAN2 A B Hình 1.2 Tình hình ung thư phổ biến Việt Nam theo GLOBOCAN 2020 (A) So sánh tỷ lệ mắc chuẩn hố theo tuổi giới tính nam nữ (B) So sánh tỷ lệ mắc với tỷ lệ tử vong2 1.2 THỤ THỂ CỦA YẾU TỐ TĂNG TRƯỞNG BIỂU BÌ VÀ ĐÍCH TÁC ĐỘNG TRONG ĐIỀU TRỊ UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG Thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì (EGFR), glycoprotein xuyên màng, chứa vùng gắn kết yếu tố tăng trưởng ngoại bào vùng hoạt động tyrosin kinase (TK) nội bào EGFR họ số bốn họ thụ thể có liên quan đến hoạt động TK đóng vai trị trung gian q trình tín hiệu q trình tăng sinh (proliferation), chết theo chương trình (apoptosis) tế bào di (metastatic) ung thư10 EGFR liên quan đến bốn nhóm phân biệt nhiên với thành phần cấu trúc chung, bao gồm EGFR (HER1/ErbB1), ErbB2 (HER2/neu), ErbB3 (HER3), ErbB4 (HER4)11 Mỗi nhóm họ EGFR đóng vai trò trung gian với khuynh hướng giúp tế bào bình thường tăng trưởng phát triển Sự biểu EGFR thụ thể khác họ (HER2, HER3, HER4) diễn hầu hết ung thư có liên quan đến tế bào biểu mơ, bao gồm CRC Nghiên cứu phân tích tổng hợp (meta-analysis) biểu cao EGFR dự báo cho khả sống sót bệnh nhân CRC EGFR sử dụng dấu cho tế bào khối u di CRC12,13 Phân tích mơ bệnh nhân CRC giai đoạn II cho thấy biểu EGFR có liên quan đến khả sống sót số tiên lượng tái phát CRC14,15 Các yếu tố tăng trưởng, gồm yếu tố tăng trưởng biểu bì (EGF) yếu tố tăng trưởng chuyển đổi (TGF), gắn với EGFR, dạng bất hoạt có cấu trúc đơn, dẫn đến tác động kích hoạt thụ thể qua trình đồng dị dimer hóa16 Sự kích hoạt phosphoryl hóa tự động vùng TK phía tế bào khơi mào cho số đường tín hiệu xi dịng, chẳng hạn RAS/RAF/MEK/MAPK, STAT PI3K/Akt/mTOR, theo dẫn đến q trình tăng sinh, ngăn chặn trình chết theo chương trình (apoptosis) tế bào17 Cụ thể, sau gắn kết với số yếu tố tăng trưởng định vị trí gắn kết ngoại bào, EGFR số thụ thể thuộc họ với EGFR (HER2, HER3, or HER4) xảy trình đồng dimer hoá (EGFR-EGFR) dị dimer hoá (EGFR-HER2, EGFR-HER3 EGFR-HER4), dẫn đến q trình phosphoryl hố phụ thuộc ATP vào số vị trí aminoacid tyrosin định phần cấu trúc nội bào Quá trình phosphoryl hố kích hoạt chương trình truyền tín hiệu phức tạp xảy tế bào chất đến bên nhân tế bào Hình 1.3 EGFR kích hoạt hai đường tín hiệu RAS/RAF/ MEK/MAPK PI3K/Akt/mTOR đóng vai trị quan trọng ung thư Hình vẽ BioRender (https://biorender.com) Hai đường truyền tín hiệu nội bào kích hoạt EGFR đường RAS/RAF/MEK/MAPK - đường đóng vai trị kiểm sốt q trình phiên mã, kiểm sốt chu kỳ tế bào, trình tăng sinh tế bào - đường PI3K/Akt/mTOR - đường kích hoạt loạt tín hiệu chống apoptotic prosurvival (Hình 1.3) Bởi có vai trị quan trọng, EGFR xem đích tác động điều trị ung thư Sự biểu EGFR nhiều khối u người ngực, phổi, đại trực tràng, thận,…18 gây bất lợi điều trị đề kháng với hormon trị liệu, tác nhân độc tế bào liệu pháp xạ trị19 Theo đó, chất ức chế EGFR hướng dẫn toàn cầu khuyến cáo sử dụng phương pháp điều trị đầu tay cho bệnh nhân cho thấy có đột biến EGFR tính an tồn hiệu cao so với liệu pháp hóa trị thơng thường20 1.2.1 Gen biểu EGFR Gen mã hóa EGFR, ErbB-1, hay cịn biết đến HER1, mENA, PIG61 NISBD2, nằm đoạn cánh ngắn p11.2 nhiễm sắc thể số (7p11.2) có tọa độ gen GRCh38 : : 55.019.020 - 55.208.07921 Gen mã hóa EGFR cấu thành 31 exon mã hóa cho glycoprotein xun màng Tổng cộng có chín biến thể đoạn gen mã hóa EGFR dịch mã thành dạng protein EGFR 1.2.2 Vùng hoạt động tyrosin kinase Cấu trúc vùng TK chia thành năm thành phần chính, chúng gồm thùy phía đầu tận N (N-lobe), thùy phía đầu tận C (C-lobe), khoang gắn kết adenosin triphosphat (ATP site), vùng lề (hinge region) vị trí gắn kết allosteric (allosteric site) N-lobe bao gồm năm đoạn phiến gấp β đối song (anti-parallel βsheets) đoạn xoắn α (α-helix), nằm hướng đối diện đến C-lobe thông qua trung gian khoang gắn kết ATP, vị trí gây tác động TK Khoang gắn kết ATP gắn với hai thùy nhờ vào tác động gấp vùng lề hẹp22 Vùng lề chứa năm đơn vị Q791, L792, M793, P794 F795, nguyên tử mạch M793 tham gia vào tương tác với ATP Sự định hướng phân tử ATP vùng gắn kết dựa vào đoạn trình tự chứa aspartat, phenylalanin glycin (DFG motif)23 Trình tự kiểu DFG nằm phía đầu tận N trước đoạn trình tự loop hoạt động đóng vai trị quan trọng hoạt động protein kinase, cụ thể việc hướng đơn vị aspartat đến gắn kết với phân tử ATP định vị ion Mg2+ liên kết với nhóm β- γ-phosphat ATP24,25 Túi gắn kết ATP bao quanh K745, M746, C775, L788, T790, T854 F85626, nhánh bên K745 tương tác với nhóm phosphat ATP, đơn vị đóng vai trị đơn vị chốt chặn vùng TK23 Phân tử ATP, gắn vào vị trí gắn, tương tác với N-lobe mở rộng tương tác với α-helix, qua gây tác động làm thay đổi cấu dạng vùng TK hoạt hóa q trình phosphoryl hóa tự động, q trình có tham gia đơn vị H835, R836, D837, L838, A839, A840, R841 N842 với vai trị dịch chuyển nhóm phosphat từ ATP đến nhóm tyrosin phân tử chất đảm nhận D83723 Một q trình xảy ra, vị trí C-lobe co lại hướng N-lobe qua hoạt hóa thụ thể27 Có thể thấy vị trí gắn kết ATP có tính hoạt động cao ổn định phosphoryl tự động liên tục Đối với CRC, có khoảng 3% trường hợp ghi nhận biểu thể đột biến cấu trúc EGFR, gồm số đột biến vùng gắn kết ngoại bào G63R, E114K, R165Q, R222C, S492R P596L, số đột biến vùng TK K708R, E709K, G719S, G724S L858R28 Hình 1.4 Các thành phần cấu trúc vùng TK EGFR (703-984), vị trí gắn kết ATP vị trí ba đột biến G719S, G724S L858R29-32 1.2.3 Lựa chọn điều trị ức chế EGFR Các kháng thể đơn dòng (mAbs) phân tử nhỏ ức chế hoạt động TK (TKIs) hai hình thức tiếp cận phổ biến liệu pháp ức chế EGFR33 Các mAbs đối kháng 10 EGFR hoạt động chất cạnh tranh gắn kết có chọn lọc với vùng gắn kết ngoại bào EGFR khơng gây kích hoạt thụ thể, qua ngăn cản gắn kết EGF hay TGF bất hoạt hoạt động TK Các TKIs cạnh tranh thuận nghịch với ATP vùng TK EGFR nội bào, ức chế q trình phosphoryl hóa tự động q trình tín hiệu xi dịng34 Kết thuốc gây nên ức chế tăng trưởng TBUT, ức chế tăng sinh hình thành khối u cách ngăn chặn tác nhân tăng sinh tạo TBUT TGFα, VEGF, IL-8, bFGF, ức chế xâm lấn di TBUT Cho đến nay, số mAbs TKIs sử dụng lâm sàng để điều trị ung thư19, nhiên xuất dạng đề kháng với hóa trị liệu, bao gồm dạng nội (sơ cấp) mắc phải (thứ cấp), làm giảm khả đáp ứng liệu pháp đối kháng EGFR35 Kể từ khám phá liệu pháp đối kháng EGFR, hàng trăm TKIs tổng hợp, đánh giá phân loại thành bốn hệ (Bảng 1.1) Dạng đột biến T790M biết đến chế đề kháng TKIs hệ 2, dẫn đến hình thành phát triển TKIs hệ Tuy nhiên khả ứng dụng TKIs lần bị hạn chế trước đề kháng nhanh EGFR qua đột biến C797S TKIs thuộc hệ đời để đánh giá lâm sàng với dạng đột biến này36 Với u cầu phải ổn định q trình phosphoryl hóa tự động cách ức chế chuyển dạng trạng thái monomer (bất hoạt) với dạng dimer (hoạt động), phân tử tác động vào vị trí gắn kết cạnh tranh với ATP hay vị trí bất hoạt vùng TK khơng phù hợp37 Trong đó, vị trí gắn kết allosteric dần xem vị trí tác động tiềm năng32 Các nhóm nghiên cứu độc lập Jia Zhao xác định hai hợp chất EAI045 EAI001 có khả vượt qua đề kháng đột biến EGFR, với khả ức chế hoạt động ATP không cạnh tranh với ATP ngăn q trình phosphoryl hóa tự động38 Khi phân tử gắn vào vị trí allosteric, αC-helix bị dịch chuyển khác với cấu dạng thông thường làm ổn định vùng TK Các hợp chất cho thấy có khả ức chế thể đột biến T790M/L858R khả tương tác vòng thơm thiazol, isoindolin-1on 4-fluorophenol với M790 F856, với tương tác kỵ nước khác với 11 L747, I759, M766, L777 L788, tương tác thuận lợi chủ yếu gây vòng thiazol với aminoacid khoang gắn kết38 1.3 CURCUMIN VÀ CÁC CHẤT TƯƠNG ĐỒNG KIỂU MONOCARBONYL 1.3.1 Khả kháng ung thư tiềm curcumin chất tương đồng Curcumin hay diferuloylmethan, hợp chất polyphenol tự nhiên, thành phần thân rễ Nghệ vàng (Curcuma longa L Zingiberaceae)39, biết đến nghiên cứu hiệu phức hợp CDK/cyclin với chất ức chế tương ứng, q trình tín hiệu p53, RAS Wnt/β-catenin, trình phiên mã NF-κB, họ AP-1 STAT tác nhân phiên mã40 Đến nay, có đến 195 đích tác động phân tử khác curcumin xác định41 Theo đó, curcumin sở hữu nhiều hoạt tính sinh học kháng ung thư42, chống oxy hóa43, kháng khối u44, chống tăng sinh mạch45, kháng viêm46… Mặc dù vậy, curcumin tránh khỏi hạn chế để phát triển thành thuốc, khơng ổn định hóa học, tan nước, sinh khả dụng thấp chuyển hóa nhanh điều kiện sinh lý47 Do đó, hai chiến lược nghiên cứu dựa curcumin (1) tổng hợp chất tương đồng curcumin (2) phát triển hệ chống chuyển giao Các chất tương đồng curcumin tổng hợp với mục đích vượt qua chuyển hóa lần đầu, tăng tính ổn định hóa học, cải thiện hoạt tính sinh học so với curcumin48 Theo đó, cấu trúc ban đầu curcumin, nhóm phenolic khung 1,3diceton vị trí bị chuyển hóa in vitro in vivo, phản ứng oxy hóa thủy phân47 Do đó, phương pháp thay đổi cấu trúc để hình thành chất tương đồng curcumin khác chủ yếu dựa thành phần: (1) vịng thơm; (2) nhóm 1,3diceton (3) liên kết olefin49 (Hình 1.5) 1.3.2 Hợp chất tương đồng curcumin kiểu monocarbonyl Trong số vùng cấu trúc chức tập trung nghiên cứu điều chỉnh curcumin, thành phần β-diceton chất đặc trưng chuyển hóa aldoceto reductase bị chuyển hóa in vivo nhanh chóng50 Sự điều chỉnh cấu trúc thành phần β-diceton đánh dấu hình thành số nhóm chất 12 tương đồng curcumin chứa dây nối năm nguyên tử carbon (five-carbon linker), chất tương đồng kiểu monocarbonyl (MACs) Với thay dây nối hepta-1,6-dien3,5-dion, dây nối penta-1,4-dien-3-on, MACs nhìn chung làm cải thiện liệu dược động học hoạt tính kháng ung thư so với curcumin48 Các MACs nói chung phân thành hai nhóm gồm nhóm MACs đối xứng, với cấu trúc hai vòng thơm/dị vòng thơm giống (i); MACs khơng đối xứng, với cấu trúc hai vịng thơm/dị vịng thơm khác (ii) Xuất phát từ MACs đối xứng với hai vòng benzen đơn giản nối với qua dây nối nguyên tử xuất phát từ aceton, mở rộng việc thay vòng benzen dây nối tương ứng từ dị vòng thơm hay cạnh chứa nguyên tử nitơ, oxy, hay lưu huỳnh ceton đối xứng Tương tự với MAC đối xứng, MAC không đối xứng với hai vòng benzen đơn giản khác qua dây nối nguyên tử xuất phát từ aceton Các MACs không đối xứng tiếp tục phát triển cách thay dây nối từ aceton ceton khác cyclopentanon cyclohexanon 851 Ngoài ra, số cơng bố cịn đề cập đến xuất dị vòng khác cấu trúc MACs quinazolin 252, thiazol 353, imidazol 454, indol 555, imidazo[1,2-a]pyridin 656,… Theo đó, cấu trúc tổng quát hình dung từ MACs tiềm này, bao gồm đơn vị vòng thơm dị vòng thơm, nối với dây nối kiểu penta-1,4-dien-3-on, xem xét khung tối ưu để phát triển loạt MACs tác nhân kháng ung thư tiềm (Hình 1.5) 1.3.3 Khả ức chế hoạt động EGFR chất tương đồng curcumin Cho đến này, lượng lớn chất tương đồng curcumin nghiên cứu nhiều đích tác động khác nhau, có EGFR Năm 2013, nhóm nghiên cứu Qiu cộng (2013) công bố chất tương đồng dẫn chất 4,6bis(styryl)pyrimidin, cho thấy khả gây độc hai dòng tế bào HCT-116 HT-29 cho thấy làm giảm biểu EGFR Y1068 phosphoryl hoá qua thử nghiệm Western Blot57 Năm 2017, nhóm nghiên cứu Sufi cộng tổng hợp chất tương đồng dẫn chất (1E,6E)-1,7-di(1H-indol-3-yl)hepta-1,6dien-3,5-dion, cho thấy khả gây độc tế bào dòng tế bào A549, K562 13 SW480, khả kích hoạt q trình apoptosis tế bào này58 Năm 2018, dẫn chất curcumin-sulfonamid nhóm nghiên cứu Banuppriya cộng tổng hợp cho thấy nhiều hoạt tính đáng kể chống oxy hóa, kháng viêm, kháng ung thư…59 Các dẫn chất tiềm từ nghiên cứu kể dự đốn có khả ức chế EGFR mô gắn kết phân tử Đối với MACs, năm 2013, nhóm nghiên cứu Xu cộng công bố MACs dẫn chất 2,6-bis(benzyliden)cyclohexanon I1-I20, hợp chất I12 tiềm với khả gây độc tính tế bào mạnh hai dịng tế bào HepG2 B16-F10, đồng thời ức chế EGFR in vitro (IC50 0,4 μM) có khả gắn kết tốt với EGFR qua phương pháp gắn kết phân tử Các MACs không đối xứng tổng hợp phản ứng ngưng tụ Claisen-Schmidt (E)-2-(3,5-dimethoxy benzyliden)cyclohexan-1-on với dẫn chất benzaldehyd tương ứng hòa tan dung dịch NaOH 10% EtOH nhiệt độ phòng 30 phút, sau thêm vào 50 mL nước chiết sản phẩm với EtOAc (3 ´ 20 mL) Tinh chế sản phẩm phương pháp sắc ký cột (CC) với dung mơi rửa giải cloroform (Hình 1.6A,C)60 Năm 2017, nhóm nghiên cứu Qin cộng công bố MACs dẫn chất 2,6-bis(arylmethylen)cyclohexanoxim 1a-6a Để tổng hợp MACs này, đầu tiên, hỗn hợp chứa dẫn chất benzaldehyd ceton theo tỷ lệ mol : hoà tan EtOH thêm vào tiếp dung dịch NaOH/EtOH 40%, để khuấy nhiệt độ phòng Kết thúc phản ứng, trung hồ NaOH dư, sau thu lấy sản phẩm thô tinh chế phương pháp kết tinh lại CC Sản phẩm thu tiếp tục phản ứng với NH2OH•HCl EtOH Kết thúc phản ứng, thêm vào hỗn hợp sản phẩm nước cất DCM chiết thu lấy dịch hữu Làm khan MgSO4, sau quay loại dung môi Sản phẩm thô tiếp tục tinh chế phương pháp kết tinh lại CC Các dẫn chất sau đánh giá khả gây độc tế bào dòng tế bào MCF-10A, HT-29, PC-3, A549, Panc-1, MCF-7, H-460 PaCa-2, sau đánh giá tiếp khả ức chế hoạt động EGFR tyrosin kinase in vitro Hợp chất 5a 6a hai dẫn chất oxim có khả ức chế mạnh hoạt động EGFR TK, với IC50 0,05 0,04 μM (Hình 1.6B,C)61 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Bảng 1.1 Tóm tắt hệ TKIs đối kháng EGFR Nhóm Tên dược chất / hoạt chất N O N O O N O HN O Cơ chế tác động Gắn kết cạnh tranh thuận N O nghịch với ATP, ức chế N O Cl phosphoryl hóa dimer HN hóa Bị đề kháng đột F N O O HN HN O Cl N Gắn kết cạnh tranh không N HN O thuận nghịch với ATP Cl F Chỉ nhận diện trạng thái F Afatinib EGFR dimer64,65 Dacomitinib Gắn kết cạnh tranh không N O N N H HN N N Osimertinib O N O F3C N N H N H N N N O thuận nghịch với ATP ức chế dạng đột biến N H Rociletinib O T790M Bị đề kháng đột biến C797S37,66 14 N O N HN N biến T790M62,63 Erlotinib Gefitinib Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Nhóm Tên dược chất / hoạt chất N S N O S O N HN N O O N OH F JBJ-09-063 H N O kết vào vị trí allosteric, ức chế dimer động, ức chế hiệu đột OH EAI-045 Gắn hoá phosphoryl hóa tự HN N F Cơ chế tác động biến L858R / T790M / C797S30,67 Gắn kết cạnh tranh thuận chọn lọc Gây apoptosis N H N O O NH Staurosporin cách kích hoạt caspase-3 Bắt giữ tế bào pha G1 G2 chu kỳ tế bào68-70 15 nghịch với ATP, không Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh III O O II O III O IV HO OH I I Curcumin O Cl O F O F F O O HO Cl OH NO2 N N O F F S S F N N N N N N 16 O O O O O O OH O F O HO HO F O O O O O N N HN O Hình 1.5 Curcumin chất tương đồng curcumin kiểu monocarbonyl (MACs) Cấu trúc phân tử curcumin với cấu trúc gồm vịng thơm (I), nhóm β-diceton (II), liên kết olefin (III) nhóm methylen linh động (IV), với cấu trúc phân tử MACs đối xứng không đối xứng (1-8) số nghiên cứu trước Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh O A O O O O N a O c b R O O Ia R = H; 2-Cl; 3-Cl; 4-Cl; 2-F; 4-F; 2-Br; 3-Br; 4-Br; 3,4-diOH; 2-OMe; 3-OMe; 4-OMe; 3,4-diOMe; 4-OH; 4-Me2N; 3-OH-4-OMe; 4-MeSO2 3-t-Bu-4-OH O B O R4 O a + HO R4 R2 R1 R2 R4 R4 R2 1-8 R 1, R 2, R4 OH O O 1a-8a N N O I12 IC50 (µM) 1,01 (Hep-G2) - 0,71 (A16-F10) 0,40 (EGFR) R4 R2 NO2 O O 5a IC50 (µM) 0,20 (MCF-7) - 0,40 (HT-29) - 0,30 (A549) 0,05 (EGFR) N HO 17 HO OH O R1 = CH2, H, CH(OEt)2; CH2, NO2, NMe2; O, H, CH(OEt)2; O, NO2, NMe2; NMe, H, CH(OEt)2; NMe, NO2, NMe2; NH, H, CH(OEt)2; NH, NO2, NMe2 O C N b R1 R2 I1 - I20 N N NO2 N 6a IC50 (µM) 0,09 (MCF-7) - 0,05 (HT-29) - 0,09 (A549) 0,04 (EGFR) Hình 1.6 Tổng hợp MACs chứa cyclohexanon có khả ức chế hoạt động EGFR TK (A) Theo Xu cộng (2013): (a) morpholin; (b) 3,5-dimethoxy benzaldehyd, HCl; (c) benzaldehyd thế, NaOH/EtOH 10% (B) Theo Qin cộng (2017): (a) NaOH/EtOH 40%; (b) NH2OH•HCl, EtOH (C) Các MACs tiềm từ nghiên cứu Xu (2013) Qin cộng (2017)60,61 18 1.4 DỊ VỊNG 1H-PYRAZOL Các hợp chất chứa dị vịng 1H-pyrazol chứng minh sở hữu nhiều hoạt tính sinh học đa dạng kháng ung thư, kháng viêm, kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virus, giảm đau , thể qua tồn dị vòng cấu trúc phân tử thuốc sử dụng thị trường celecoxib (Celebrex), rimonabant (Acomplia), cimetidin (Tagamet), difenamizol (Pasalin), cefoselis (Wincef) 1.4.1 Khả kháng ung thư các hợp chất chứa dị vòng 1H-pyrazol Đối với khả kháng ung thư, số phân tử thuốc có chứa vịng 1H-pyrazol sử dụng lâm sàng để điều trị ung thư pazopanib (Votrient), ruxolitinib (Jakavi), crizotinib (Xalkori), lorlatinib (Lorbrena) encorafenib (Braftovi) Trong trình tìm kiếm hoạt chất có hoạt tính kháng ung thư, dẫn chất 1H-pyrazolcarboxamid a thiết kế tổng hợp chất chống ung thư tiềm với khả ức chế tăng sinh TBUT A549 hướng ức chế MEK71 Trong đó, dẫn chất 1H-pyrazolcarboxamid b khác chứa nhóm thiol thành phần giúp nhận dạng bề mặt có khả ức chế histon deacetylase (HDAC)72 Các dẫn chất 1H-pyrazol kiểu cinnamamid c hay dẫn chất kết hợp oxindol-pyrazol d phát tác nhân độc tế bào mạnh TBUT MCF-7, A549, B16-F10 HeLa, DU145 có khả ức chế trình tổ hợp sợi vi ống73,74 Để phát triển chất ức chế GGT1 - xúc tác cho enzym tiền mã hóa Ras hay RhoC - dẫn chất tương đồng GGTIDU40 kết hợp với chứa dị vòng 1H-pyrazol e chứng minh có khả gây độc tính mạnh TBUT MDA-MB-231 ức chế GGT175 Một đích tác động khác xác định protein kinase Pim 1-3, bị ức chế dẫn chất indolopyrazol chứa gốc carbazol f76 Dẫn chất 1H-pyrazol g kết hợp với khung cấu trúc benzensulfonamid isatin lại có khả ức chế isotype carbonic anhydrase hCA IX XII77 Ngoài hướng tổng hợp hoạt chất hồn tồn từ nguồn gốc hố dược, hướng tìm kiếm hoạt chất có kết hợp với cấu 19 trúc hợp chất tự nhiên xem xét, chẳng hạn dẫn chất h kết hợp 1Hpyrazol với acid 23-hydroxybetulinic có khả ức chế mạnh tăng sinh TBUT in vitro khả ức chế khối u in vivo ung thư gan H22 khối u ác tính B16 chuột so với acid 23-hydroxybetulinic78 1.4.2 Khả ức chế hoạt động EGFR hợp chất chứa dị vịng 1Hpyrazol Bên cạnh tác động hướng đích lên phân tử sinh học đề cập có liên quan đến khả kháng ung thư, hợp chất chứa dị vòng 1H-pyrazol tiếp tục nghiên cứu hàng loạt đích tác động khác, có EGFR Một số dẫn chất có kết hợp 1H-pyrazol 5-nitroimidazol i nghiên cứu Tao cộng (2016) cho thấy khả ức chế đồng thời EGFR (IC50 0,26 μM) HER2 (IC50 0,51 μM), thể độc tính mạnh TBUT HeLa, MCF-7, HepG2 B16-F10 (IC50 0,13-0,96 μM)79 Một nghiên cứu tương tự Qiu cộng (2012) báo cáo hợp chất chứa 1H-pyrazol kết hợp với dị vòng thiazolinon k cho thấy khả ức chế EGFR (IC50 0,24 μM) HER2 (IC50 1,07 μM), khả ức chế hiệu tăng sinh TBUT MCF-7, B16-F10 HCT-116 (IC50 0,30-0,70 μM)80 Trong đó, dị vịng khác - benzimidazol - nhóm nghiên cứu Akhtar cộng (2018) lựa chọn để kết hợp với 1H-pyrazol, từ tìm hợp chất l với khả ức chế hiệu tăng trưởng TBUT A549 (IC50 2,2 μM) hoạt động EGFR (IC50 0,97 μM), ngồi cịn cho thấy khả bắt giữ TBUT A549 pha G2/M chu kỳ tế bào81 Ngoài liên kết đơn lẻ với dị vòng khác, kết hợp 1H-pyrazol với dị vòng khác dạng hệ ngưng tụ báo cáo, chẳng hạn nghiên cứu Ducray cộng (2008), đó, dẫn chất m chứa hệ ngưng tự 1H-pyrazolo[3,4-d]pyrimidin cho thấy khả gây độc tính mạnh lên TBUT BT474Ca (IC50 17 nM), đồng thời ức chế ngưỡng nM HER2 (IC50 nM) EGFR (IC50 nM)82 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Cl F3C OH N OH O N N O S O NH2 Celecoxib Kháng viêm N N O N H N N N HO O N OH HO N N O N Lonazolac Kháng viêm CDPPB Chống loạn thần Mepirizol Kháng viêm N O O N O N N Cl Cl N N H N N O S N N N HN H N Cl N N O H N OH N N N NH N N N Crizotinib Kháng ung thư N Ruxolitinib Kháng ung thư Cefoselis Kháng khuẩn O O S O H 2N N O H 2N NH2 N OH Fezolamin Chống trầm cảm Isolan Giãn mạch Difenamizol Giảm đau N Cl N 20 O F S N Cl Rimonabant Chống béo phì O O O N NH2 N H Pyrazomycin Kháng virus O N H 2N HN N O H N N N N N N N H 2N N Lorlatinib Kháng ung thư Pazopanib Kháng ung thư Hình 1.7 Đa dạng hoạt tính sinh học dị vịng 1H-pyrazol qua diện cấu trúc phân tử số hoạt chất Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh O N N H N N N O a O F O F SH HN N O F H N Cl F O H N F O Br NH HN N c b d O2N N H N N NH N N H N O O O NH2 NH O O NH S N NH N H e f N O 21 O S H 2N O O HN N N F O g h Cl Cl N F3C N O N N H N NO2 N N O O O N N N Br O i N O N N S k N N N O NH2 Cl l N H N m Hình 1.8 Các hoạt chất kháng ung thư chứa dị vòng 1H-pyrazol Theo hướng ức chế MEK (a), HDAC (b), thành lập vi ống (c d), GGT1 (e), Pim 1-3 (f), hCA IX XII (g), EGFR (i-m) 22 1.5 THIẾT KẾ THUỐC DỰA TRÊN CẤU TRÚC Sự phát triển kỹ thuật XRD, NMR hay cryo-EM cung cấp nhiều chi tiết cấu trúc protein phức hợp protein-ligand Những tiến tạo điều kiện để phát triển chiến lược sử dụng máy tính để bao quát khía cạnh phát triển thuốc nay83, chẳng hạn phương pháp sàng lọc ảo (virtual screening) để xác định hợp chất đích (hit compound) phương pháp tối ưu hóa chất khởi nguồn (lead compound) So sánh với kỹ thuật sàng lọc truyền thống, sàng lọc ảo phương pháp tiếp cận thiết kế thuốc trực tiếp hợp lý, làm giảm đáng kể chi phí cho phương pháp sàng lọc thực nghiệm84 Sàng lọc ảo gồm nhóm phương pháp dựa ligand (ligand-based) dựa cấu trúc (structure-based) Khi tập hợp ligand với hoạt tính biết khơng có thơng tin cấu trúc đích tác động, phương pháp dựa ligand, mơ hình ligand-based pharmacophore hay mơ hình liên quan định lượng cấu trúc - tác dụng (QSAR), sử dụng Đối với phương pháp thiết kế thuốc dựa cấu trúc, mô gắn kết phân tử (molecular docking), thiết kế de novo mô hình structurebased pharmacophore phương pháp phổ biến nhất85 1.5.1 Mô gắn kết phân tử Mô gắn kết phân tử phương pháp sử dụng để mơ hình hóa tương tác đại phân tử (macromolecule) protein enzym thụ thể, acid nucleic ADN ARN, phức hợp đại phân tử,… với phân tử nhỏ (small molecule, ligand) phân tử thuốc hóa dược, mảnh peptid nhỏ,… cấp độ phân tử, từ phân tích đặc tính phân tử khoang gắn kết đích tác động, làm sáng tỏ q trình hóa sinh bản86 Để thực phương pháp gắn kết phân tử, cấu trúc protein phải xác định trước lưu trữ sở liệu Protein Data Bank, Binding MOAD, ReLiBase Trong trường hợp cấu trúc protein chưa xác định, xây dựng cấu trúc mơ hình tương đồng dựa protein với chức tương tự biết (homology modeling) Trong nhiều trường hợp, thơng tin vị trí gắn kết 23 biết trước từ thực nghiệm, cách so sánh với đích tác động khác có chức tương tự, dạng đồng kết tinh với ligand khác Trong trường hợp khơng có thơng tin vị trí gắn kết, khoang gắn kết xác định cách giả định công cụ GRID, POCKET, SurfNet,… phương pháp gắn kết mù (blind docking)87 Cơ chế gắn kết protein-ligand ban đầu dựa lý thuyết “ổ khóa-chìa khóa” (lock-and-key)88, phân tử ligand protein thành phần cứng nhắc (rigid) Lý thuyết “cảm ứng phù hợp” (induced fit)89 đưa sau nêu rõ vị trí gắn kết protein liên tục định hình lại tương tác với ligand trình gắn kết xảy ra, ligand protein nên thành phần linh hoạt (flexible) để mô lại khả gắn kết cách xác Tuy nhiên, xem xét đến giới hạn tài nguyên máy tính, trình gắn kết phổ biến thực phân tử ligand linh hoạt với thụ thể cứng nhắc (half flexible docking) Mặc dù dành nhiều nổ lực để tối ưu hóa khả mơ tính linh hoạt thụ thể, việc gắn kết với thụ thể linh hoạt, với nguyên tử mạch protein (backbone) linh hoạt, thách thức lớn công cụ gắn kết phân tử có90 Về bản, mục đích q trình gắn kết đưa dự đốn cấu trúc phức hợp protein-ligand phương pháp tính tốn, thơng qua hai bước bản, gồm hình thành định hướng cấu dạng phù hợp ligand vị trí gắn kết, hay “pose”, sau xếp hạng pose thông qua điểm số chức (scoring function) Một cách lý tưởng, thuật toán xây dựng pose nên có khả mơ lại phương thức gắn kết thực nghiệm với điểm số cao số cấu dạng tạo thành Việc tìm kiếm pose (searching) thực nhiều thuật toán khác nhau, thuật toán phù hợp (matching)91, xây dựng tăng cường (incremental construction)92, tìm kiếm đồng thời nhiều (multiple copy simultaneous search)93, Monte Carlo94 di truyền (genetic algorithm)95 Song song với trình tìm kiếm, điểm số chức ước tính để chọn pose thích hợp phân tử có khả gắn kết thời gian tính toán hợp lý Các 24 phương pháp ước tính điểm số chức phương pháp dựa vào trường lực (force-field-based)96, kinh nghiệm (empirical)97, dựa kiến thức (knowledgebased)98 đồng thuận (consensus)99 Trong nỗ lực hoàn thiện phương pháp mô gắn kết phân tử, 60 cơng cụ chương trình khác phát triển hai thập kỷ qua, chẳng hạn DOCK, AutoDock, GLIDE, Trong số đó, AutoDock sử dụng nhiều nghiên cứu, với tỷ lệ trích dẫn cao số công bố liên quan đến phương pháp gắn kết phân tử, theo nghiên cứu Sousa (2006)100 AutoDock 4.2 phiên AutoDock, sử dụng thuật toán di truyền (LA-GA) điểm số chức ước tính theo phương pháp dựa vào trường lực cổ điển (classical forcefield-based), lực gắn kết đánh giá dựa tương tác không liên kết điển hình, gồm tương tác tĩnh điện van der Waals (vdW) tính theo biểu thức Coulomb Lennard-Jones tương ứng101 1.5.2 Mô động lực học phân tử Mô động lực học phân tử (MDs) phương pháp mô sử dụng rộng rãi để mơ hình hóa phân tử nhiều lĩnh vực, cách mô tương tác nguyên tử hay phân tử dựa định luật vật lý cơng cụ máy tính102 Trong mối quan hệ gắn kết, cách di chuyển nguyên tử riêng biệt trường nguyên tử lại, MDs thể tính linh hoạt ligand protein hiệu thuật toán khác cho thấy hiệu khả tối ưu hóa cục bộ, mặc mơ tiêu tốn nhiều thời gian tài nguyên máy tính103 Do đó, cách tiếp cận thơng thường sử dụng cơng cụ tìm kiếm cấu trúc ligand trạng thái liên kết ngẫu nhiên với protein vị trí khoang gắn kết, thực tinh vi MDs MDs thực dựa sở lý thuyết định luật Newton để mô tả chuyển động cổ điển nguyên tử Một hệ mô ban đầu cần có tập hợp thơng số vị trí vận tốc ban đầu tất nguyên tử, lực tiềm tàng nguyên tử thuật toán lan truyền Các lực chi phối chuyển động nguyên tử 25 chia thành (1) tương tác nguyên tử liên kết (Ubonded), bao gồm tổng lượng liên kết, sức căng góc liên kết lượng xoay liên kết; (2) tương tác nguyên tử không liên kết (Unon-bonded), bao gồm tương tác tĩnh điện tương tác vdW tính theo phương trình Coulomb LennardJones tương ứng Thuật toán lan truyền sử dụng MDs bao gồm thuật toán khác biệt trung tâm Verlet, dự đoán-sửa chữa (predictor-corrector) tích hợp đối ngẫu (symplectic integrators)103 Có thể nói ứng dụng MDs khả đánh giá tính ổn định cấu trúc bậc hai phân tử sinh học MDs sử dụng rộng rãi để xây dựng chỉnh sửa mơ hình cấu trúc dựa liệu cấu trúc sinh học thực nghiệm thu từ XRD, NMR cryo-EM Đặc biệt, MDs hữu ích việc xác định đáp ứng phân tử sinh học có thay đổi xảy ra, chẳng hạn (1) loại bỏ ligand gắn kết cấu trúc xác định từ thực nghiệm sau mơ để ghi nhận ảnh hưởng loại bỏ lên cấu dạng protein104, hay (2) thay ligand gắn kết ligand khác, thêm ligand vào cấu trúc protein mà ban đầu không gắn kết với ligand105, (3) đột biến nhiều đơn vị aminoacid nhằm giải thích dự đốn ảnh hưởng đột biến106… Trong trường hợp này, thường thực MDs với hệ có khơng xảy thay đổi để xác định khác biệt cách quán Nhiều phần mềm cung cấp chức MDs với chất cốt lõi tương tự, chẳng hạn AMBER, NAMD, GROMACS, CHARMM,… với trường lực sử dụng phổ biến AMBER, CHARMM, GROMOS,… Trong số đó, phần mềm GROMACS cho phép thực xử lý đơn hệ thống máy tính song song107 Để thực MDs GROMACS, cần chuẩn bị tệp liệu tệp hệ thống *.gro, tệp thông số *.mdp, tệp đầu vào nhị phân *.tpr GROMACS có lợi nguồn mở bao gồm nhiều cơng cụ phân tích, từ phân tích quỹ đạo đồ họa mở rộng đến chế độ phân tích thành phần (principal component analysis) cấu trúc108 26 1.6 DỰ ĐOÁN HỒ SƠ DƯỢC ĐỘNG HỌC VÀ ĐỘC TÍNH Các dự án phát triển thuốc thơng thường địi hỏi cơng ty dược phẩm phải đầu tư nhiều thời gian tiền bạc109 Thông thường, dự án có xác suất thành cơng thấp khả để thuốc phát triển thâm nhập vào thị trường dược phẩm tạo lợi nhuận nhỏ, mà số nguyên nhân thường gắn liền với vấn đề an toàn hiệu quả, vốn có liên quan nhiều đến đặc tính hấp thu, phân bố, chuyển hóa, thải trừ độc tính (ADMET) thuốc110,111 Các phương pháp thực nghiệm sử dụng để đánh giá hồ sơ ADMET thuốc làm tiêu tốn nhiều tiền bạc, thời gian, cơng sức thơng thường địi hỏi lượng lớn thử nghiệm động vật111 Giải pháp cho vấn đề đến từ việc áp dụng phương pháp thiết kế thuốc hợp lý cách sử dụng tài nguyên máy tính đại112 Hiện nay, nhiều mơ hình liên quan cấu trúc tác dụng (SAR) hay liên quan định lượng cấu trúc - tác dụng (QSAR) xây dựng phát triển, đặc biệt tích hợp tảng trực tuyến miễn phí, cho phép dự đốn xác đặc tính ADMET phân tử hoạt chất113 Việc sử dụng thử nghiệm in silico giai đoạn phát triển ban đầu hoạt chất giúp ích cho việc sàng lọc hoạt chất có đặc tính không thuận lợi trước bắt đầu thử nghiệm in vitro in vivo112, qua tiết kiệm đáng kể tiền bạc, thời gian, công sức động vật thí nghiệm liên quan đến thử nghiệm, vốn bị lãng phí tập trung nghiên cứu vào đối tượng khơng đảm bảo tính an tồn hiệu sử dụng sau này114 ADMETlab2.0 (https://admetmesh.scbdd.com/) tảng trực tuyến sử dụng rộng rãi để dự đoán đặc tính ADMET chất, bao gồm 17 đặc tính hóa lý, 13 đặc tính hố dược, 23 đặc tính dược động học, 27 đặc tính độc tính quy tắc độc tính liên quan đến 751 kiểu cấu trúc (substructure)115 Bên cạnh đó, SwissADME (http://www.swissadme.ch/) công cụ trực tuyến khác cho phép truy cập miễn phí để dự đốn đặc tính hóa lý, đặc tính hố dược, đặc tính dược động học, đặc tính giống thuốc, đặc biệt sử dụng phương pháp trình bày độc biểu đồ BOILED-Egg biểu đồ radar sinh khả dụng116 27 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU Từ tổng quan MACs tiềm ghép nối với dị vòng 1H-pyrazol khả ức chế phát triển TBUT khả ức chế hoạt động EGFR tyrosin kinase, vào mối liên quan cấu trúc - tác dụng gây độc tế bào từ số nghiên cứu trước tác giả117, nghiên cứu này, tác giả đề nghị sử dụng 36 MACs tổng hợp118-122, với 18 MACs dự kiến tổng hợp thêm chứa cấu trúc 1,3-diphenyl-1H-pyrazol (Bảng 2.1), để đánh giá khả kháng CRC hướng ức chế hoạt động EGFR Các vòng phenyl phân tử MACs ký hiệu chữ A, B C để thuận tiện cho việc trình bày kết bàn luận Việc lựa chọn nhóm vịng B, gồm tổ hợp nhóm đẩy electron OH OMe, từ nghiên cứu trước tác giả khả kháng ung thư nhóm chất tương đồng curcumin chứa 1-phenyl-1H-pyrazol117 Nghiên cứu MACs chứa nhóm 4-OH-3-OMe, 3-OH-4-OMe, 3,4,5-triOMe 4-OH-3,5-diOMe vịng B gây độc tính số tế bào ung thư mạnh so với nhóm khác 3,4-diOMe, 2,4-diOMe, 3,4methylendioxy hay 4-NMe2 Ngoài ra, nghiên cứu kết hợp cấu trúc 1,3-diphenyl-1H-pyrazol với nhóm 4-OH-3-OMe, 3-OH-4-OMe 4-OH-3,5-diOMe tạo nên MACs có hoạt tính kháng ung thư tiềm Những kết thu từ nghiên cứu kể tiền đề để tác giả tiếp tục mở rộng cấu trúc MACs chứa 1,3-diphenyl-1H-pyrazol cách mở rộng nhóm vịng A C, trì nhóm có hoạt tính tốt vịng B Trong số MACs sử dụng, 36 MACs tổng hợp từ nghiên cứu trước có cấu trúc nối hai đơn vị vòng thơm xuất phát từ aceton, 18 MACs đề xuất tổng hợp thêm nghiên cứu có chứa cấu trúc nối xuất phát từ cyclohexanon, qua giúp tác giả có thêm thơng tin để đánh giá vai trò ảnh hưởng cấu trúc dây nối khác đến hoạt tính MACs thử nghiệm A B Tác nhân độc tế bào F F N N H N F O H N O O O N Br O N N NH O F O O O N N F O H N O F O O N N NH2 R2 O OH Cl O S C F O N O R3 N N N C A 1,3-Diphenyl-1H-pyrazol Ar B R4 D R5 Chất tương đồng curcumin kiểu monocarbonyl (MACs) HO N R1 N N N O F3C MACs chứa dị vòng 1H-pyrazol N O NO2 O O N O N O O H N 28 O N OH O N Cl O N S N N NO2 HO N O O NO2 OH O N N N OH N O Cl Br Tác nhân ức chế EGFR Hình 2.1 Định hướng thiết kế chất tương đồng curcumin (B, D) chứa dị vòng 1H-pyrazol (A, C) tác nhân kháng ung thư (A, B) hướng ức chế EGFR (C, D) 29 Bảng 2.1 Cấu trúc hóa học MACs sử dụng nghiên cứu Các MACs tổng hợp nghiên cứu trước (a1-i4) R2 C O R3 N N H H B R4 R5 A R1 Các nhóm STT MACs R1 R2 R3 R4 R5 a1 H H OMe OH H a2 H H OH OMe H a3 H H OMe OMe OMe a4 H H OMe OH OMe b1 H F OMe OH H b2 H F OH OMe H b3 H F OMe OMe OMe b4 H F OMe OH OMe c1 H OMe OMe OH H 10 c2 H OMe OH OMe H 11 c3 H OMe OMe OMe OMe 12 c4 H OMe OMe OH OMe 30 Các nhóm STT MACs 13 R1 R2 R3 R4 R5 d1 NO2 H OMe OH H 14 d2 NO2 H OH OMe H 15 d3 NO2 H OMe OMe OMe 16 d4 NO2 H OMe OH OMe 17 e1 NO2 F OMe OH H 18 e2 NO2 F OH OMe H 19 e3 NO2 F OMe OMe OMe 20 e4 NO2 F OMe OH OMe 21 f1 NO2 OMe OMe OH H 22 f2 NO2 OMe OH OMe H 23 f3 NO2 OMe OMe OMe OMe 24 f4 NO2 OMe OMe OH OMe 25 g1 OMe H OMe OH H 26 g2 OMe H OH OMe H 27 g3 OMe H OMe OMe OMe 28 g4 OMe H OMe OH OMe 29 h1 OMe F OMe OH H 30 h2 OMe F OH OMe H 31 h3 OMe F OMe OMe OMe 32 h4 OMe F OMe OH OMe 33 i1 OMe OMe OMe OH H 31 Các nhóm STT MACs 34 R1 R2 R3 R4 R5 i2 OMe OMe OH OMe H 35 i3 OMe OMe OMe OMe OMe 36 i4 OMe OMe OMe OH OMe Các MACs dự kiến tổng hợp thêm nghiên cứu (j1-n3) R2 C O R3 N N B R4 R5 A R1 Các nhóm STT MACs 37 R1 R2 R3 R4 R5 j1 H H OMe OH H 38 j2 H H OH OMe H 39 j3 H H OMe OMe OMe 40 j4 H H OMe OH OMe 41 k1 H F OMe OH H 42 k2 H F OH OMe H 43 k3 H F OMe OMe OMe 44 k4 H F OMe OH OMe 32 Các nhóm STT MACs 45 R1 R2 R3 R4 R5 l1 H OMe OMe OH H 46 l2 H OMe OH OMe H 47 l3 H OMe OMe OMe OMe 48 l4 H OMe OMe OH OMe 49 m1 OMe H OMe OH H 50 m2 OMe H OH OMe H 51 m3 OMe H OMe OMe OMe 52 m4 OMe H OMe OH OMe 53 n2 OMe F OH OMe H 54 n3 OMe F OMe OMe OMe 2.2 TỔNG HỢP CÁC MACs CHỨA CẤU TRÚC NỐI CYCLOHEXANON 2.2.1 Nguyên vật liệu, hố chất dung mơi Các ngun vật liệu, hố chất dung môi mua từ công ty hoá chất Merck, Sigma-Aldrich, Acros, AK Scientific, Fisher Scientific, Energy, Rhawn, Xilong GHTech, sử dụng trực tiếp không qua tinh chế thêm 2.2.2 Trang thiết bị Máy tổng hợp vi sóng CEM Discovery SP, bếp khuấy từ gia nhiệt HEIDOLPH MR Hei-Standard, cân kỹ thuật OHAUS SP6001, cân phân tích SARTORIUS Entris 64i-1S, máy quay HEIDOLPH Hei-CHILL 600, máy bơm nước tuần hoàn VELP JP, tủ sấy MEMMERT UM-500, tủ sấy chân không JEIOTECH OV-12, tủ hút khí độc LV-FH12A, máy lọc nước PALL Cascada I, máy bơm chân không TRP-6, buồng soi UV VILBER-LOURMAT CN-15.LC 33 2.2.3 Phương pháp tổng hợp MACs chứa cấu trúc nối cyclohexanon 2.2.3.1 Tổng hợp dẫn chất 1,3-diphenyl-1H-pyrazol-4-carbaldehyd (j-n) Trong nghiên cứu này, phương pháp tổng hợp dẫn chất 1,3-diphenyl-1Hpyrazol-4-carbaldehyd (j-n) (Hình 2.2) dựa phương pháp đề cập nguyên cứu trước với số thay đổi nhỏ118-123 R2 R2 H 2N O NH R2 N a + NH b N N O R1 Acetophenon R1 Phenylhydrazin j'-n' R1 j-n Hình 2.2 Tổng hợp dẫn chất 1,3-diphenyl-1H-pyrazol-4-carbaldehyd (j-n) R1 = H OMe, R2 = H, F OMe Hóa chất điều kiện: (a) AcOH H2SO4, EtOH, đun hồi lưu; (b) POCl3, DMF, 0-5 °C - 70-80 °C Phản ứng tổng hợp dẫn chất 1-phenyl-2-(1-phenylethyliden)hydrazin (j’-n’) Quy trình chung: Hỗn hợp gồm dẫn chất phenylhydrazin (0,03 mol), dẫn chất acetophenon (0,03 mol; 1,00 equiv) AcOH H2SO4 (3-4 giọt) hoà tan EtOH (15 mL) Hỗn hợp phản ứng khuấy đun hồi lưu 23 Theo dõi phản ứng phương pháp TLC Kết thúc phản ứng, làm nguội bình phản ứng nhiệt độ phịng để sản phẩm kết tinh từ từ, sau lọc, rửa tủa EtOH lạnh Sản phẩm sau sấy khô tiếp tục sử dụng không qua tinh chế thêm Phản ứng tổng hợp dẫn chất 1,3-diphenyl-1H-pyrazol-4-carbaldehyd (j-n) Quy trình chung: Thêm từ từ giọt POCl3 (1,0 mL; 10,70 mmol; 2,14 equiv) vào DMF (4,0 mL; 51,66 mmol; 10,33 equiv) khuấy làm lạnh 05 °C Để hỗn hợp tiếp tục khuấy 0-5 °C 15-30 phút Sau đó, dẫn chất 1-phenyl-2-(1-phenylethyliden)hydrazin (j’-n’) (5,00 mmol) dạng rắn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 34 chia thành phần nhỏ thêm vào hỗn hợp 0-5 °C 30 phút Sau thêm hoàn toàn, hỗn hợp phản ứng để đến nhiệt độ phòng tiếp tục gia nhiệt để nâng nhiệt độ phản ứng lên 70-80 °C 4-5 Theo dõi phản ứng phương pháp TLC Kết thúc phản ứng, hỗn hợp phản ứng làm nguội đến nhiệt độ phòng thêm vào đá nghiền (25-30 mL), vừa thêm vừa khuấy Tiếp tục khuấy hỗn hợp nguội đến nhiệt độ phòng Lọc, rửa tủa tạo thành với nước cất lạnh Sản phẩm thô sau tinh chế phương pháp kết tinh lại EtOH tuyệt đối 2.2.3.2 Tổng hợp dẫn chất (E)-2-(phenylmethylen)cyclohexan-1-on (1-4) O N H O Morpholin c N O R3 O R4 R5 O R3 Benzaldehyd d R4 R5 Cyclohexanon 1-Morpholinocyclohexen 1-4 Hình 2.3 Tổng hợp dẫn chất (E)-2-(phenylmethylen)cyclohexan-1-on (1-4) R3, R4, R5 = 4-OH-3-OMe; 3-OH-4-OMe; 3,4,5-triOMe 4-OH-3,5-diOMe Hóa chất điều kiện: (c) PTSA, mw 110 °C, 300 W; (d) mw 110 °C, 300 W Quy trình chung: Hỗn hợp gồm cyclohexanon (3,93 g; 0,04 mol; 4,00 equiv), morpholin (3,48 g; 0,04 mol; 4,00 equiv), PTSA (0,07 g; 0,40 mmol; 0,04 equiv) Na2SO4 (1,00 g) thêm vào vial 30 mL thực phản ứng 110 °C với công suất 300 W máy tổng hợp vi sóng CEM Discovery SP Sau thời gian này, gạn lấy phần chất lỏng sang vial 30 mL khác chứa sẵn dẫn chất benzaldehyd (0,01 mol) tiếp tục thực phản ứng 110 °C với công suất 300 W 2,5 máy tổng hợp vi sóng CEM Discovery SP (Hình 2.3) Theo dõi phản ứng phương pháp TLC Kết thúc phản ứng, để nguội hỗn hợp nhiệt độ phòng trộn với hỗn hợp gồm dung dịch HCl M (10,0 mL), nước (100,0 mL) EtOAc (100,0 mL) Phần dịch chiết EtOAc tách riêng, phần dịch nước tiếp Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 35 tục chiết tiếp với EtOAc (2 ´ 50,0 mL) Gộp chung dịch chiết EtOAc, rửa với dung dịch NaCl bão hồ, sau làm khan Na2SO4 khan Cô quay phần dịch chiết sau làm khan, phần lại chứa sản phẩm tinh chế phương pháp CC, rửa giải gradient hỗn hợp dung môi n-hexan - EtOAc (12 : ® : 1) 2.2.3.3 Tổng hợp MACs chứa cấu trúc nối cyclohexanon Trong nghiên cứu này, phương pháp tổng hợp dẫn chất 1,3-diphenyl-1Hpyrazol-4-carbaldehyd (j-n) (Hình 2.4) dựa phương pháp đề cập nguyên cứu trước với số thay đổi nhỏ118,119,123 R2 R2 O O R3 O N + N R3 e N N R4 R4 R5 R5 1-4 R1 R1 j1-n3 j-n Hình 2.4 Tổng hợp MACs chứa cấu trúc nối cyclohexanon (j1-n3) R1 = H OMe; R2 = H, F OMe; R3, R4, R5 = 4-OH-3-OMe; 3-OH-4-OMe; 3,4,5-triOMe; 4-OH-3,5-diOMe Hóa chất điều kiện: (e) KOH/EtOH 4% (kl/tt), EtOH, THF, nhiệt độ phòng Quy trình chung: Hỗn hợp gồm dẫn chất 1,3-diphenyl-1H-pyrazol-4-carbaldehyd (j-n) (0,50 mmol) (E)-2-(phenylmethylen)cyclohexan-1-on (1-4) (0,53-0,55 mmol; 1,05-1,10 equiv) hoà tan hỗn hợp gồm EtOH (5,0 mL) THF (3,0 mL) Thêm từ từ dung dịch KOH/EtOH 4% (kl/tt) (5 mL) vào hỗn hợp trên, sau để khuấy qua đêm nhiệt độ phòng Theo dõi phản ứng phương pháp TLC Kết thúc phản ứng, thêm nước (15,0-20,0 mL) dung dịch HCl M (0,8 mL) vào hỗn hợp sản phẩm khuấy Cô quay loại bớt THF cần Kết tủa tạo thành lọc, rửa tủa với EtOH lạnh (5,0 mL) Et2O DCM lạnh Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 36 (2,0-3,0 mL) Sản phẩm thơ tinh chế phương pháp kết tinh lại hỗn hợp EtOAc - EtOH (1 : 1), phương pháp CC, rửa giải gradient hỗn hợp dung mơi n-hexan : EtOAc (8 : ® : 1) 2.2.4 Phương pháp kiểm nghiệm sản phẩm 2.2.4.1 Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) Các hệ dung môi sắc kí sử dụng gồm: (A) n-hexan - EtOAc (4 : 1), (B) nhexan - EtOAc (3 : 1), (C) n-hexan - EtOAc (2 : 1), (D) n-hexan - EtOAc (3 : 2), (E) n-hexan - EtOAc (1 : 1), (F) n-hexan - EtOAc (2 : 3) (G) n-hexan - EtOAc (1 : 3) 2.2.4.2 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) HPLC thực để xác định độ tinh khiết sản phẩm sau tinh khiết hoá, sử dụng hệ thống SHIMADZU Prominence-i LC2030C 3D thuộc Viện Kiểm nghiệm Thuốc TP Hồ Chí Minh Điều kiện sắc ký: (a) Cột sắc ký Gemini C18 (4,6 mm × 250 mm, μm); (b) Nhiệt độ cột 35 °C; (c) Tốc độ dòng 1,0 mL.phút−1; (d) Rửa giải hỗn hợp MeOH - H2O với %MeOH (tt/tt) thay đổi theo gradient: (i) 025 phút: 70% ® 90%, (ii) 25-35 phút: 90% ® 70%; (e) Đầu dò PDA 430 ± nm 2.2.4.3 Phương pháp đo điểm chảy (MP) Các giá trị MP xác định máy đo điểm chảy SANYO Gallenkamp, thuộc Bộ mơn Hóa Hữu Cơ, Khoa Dược, Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh 2.2.4.4 Phương pháp quang phổ hấp thu hồng ngoại (IR) Phổ IR (ATR) đo máy quang phổ hồng ngoại SHIMADZU IRAffinity1S, thuộc Bộ môn Hóa Hữu Cơ, Khoa Dược, Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh 2.2.4.5 Phương pháp phổ khối (MS) Phổ HR-MS (ESI) đo hệ thống SHIMADZU LC-20A ghép nối đầu dò LCMS IT-TOF, thuộc Viện Kiểm nghiệm Thuốc TP Hồ Chí Minh hệ thống AGILENT LC-6545 ghép nối đầu dò 6200 series TOF/6500 series Q-TOF, thuộc Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 37 2.2.4.6 Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) Phổ 1H-NMR, 13C-NMR ROESY đo máy BRUKER Avance II 500 - 125 MHz máy BRUKER AvanceNeo 600 - 150 MHz, thuộc Phòng NMR, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, TP Hà Nội 2.3 ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG GÂY ĐỘC TÍNH TRÊN TẾ BÀO UNG THƯ IN VITRO Thử nghiệm đánh giá khả gây độc tính TBUT in vitro thực Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam 2.3.1 Nguyên vật liệu, hoá chất thuốc thử Các nguyên vật liệu, hoá chất thuốc thử mua từ cơng ty hố chất sinh phẩm Gibco-Invitrogen, Merck Fisher Scientific, sử dụng trực tiếp không qua tinh chế thêm Các dòng TBUT gồm SW480, MDA-MB-231 A549 GS John M Pezzuto, Đại học Long Island, Brookville, New York, Mỹ GS Jeanette A M Maier, Đại học Milan, Ý cung cấp, bảo quản, hoạt hoá nuôi cấy Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam 2.3.2 Trang thiết bị Máy ly tâm, máy vortex, cân phân tích số lẻ SARTORIUS CPA225D, tủ an tồn sinh học, tủ ủ ấm 37 °C, 5% CO2, tủ lạnh, tủ lạnh âm sâu, buồng đếm tế bào Hausser Scientific, kính hiển vi ngược CARL ZEISS Axiovert 40 CFL, máy đo quang phổ AGILENT BioTek ELx808, 2.3.3 Phương pháp đánh giá khả gây độc tính TBUT in vitro Enzym succinat dehydrogenase (SDH) ty thể có tế bào sống chuyển MTT thành tinh thể formazan tan DMSO chứa HCl 0,1 N tạo thành dung dịch màu tím đo độ hấp thu (A) 540 nm, qua phản ánh số lượng tế bào sống mẫu124 Tế bào nuôi cấy môi trường DMEM 37 °C, 5% CO2 đến độ phủ 70-90%, sau chia tế bào vào đĩa 96 giếng với mật độ ´ 103 tế bào/190 µL/giếng ủ 37 °C, 5% CO2 Sau 24 giờ, xử lý tế bào với 10 µL mẫu thử Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 38 nồng độ khác (i) tiếp tục ủ 37 °C, 5% CO2 72 Thực đồng thời mẫu đối chứng dương với nồng độ khác ellipticin (Ell, ii), mẫu đối chứng âm với DMSO 0,5% (iii) mẫu trắng chứa 200 µL mơi trường ni cấy (iv) Sau 72 xử lý với mẫu, môi trường không huyết chứa MTT thêm vào giếng (5 mg/mL), sau để ủ 37 °C Loại bỏ mơi trường có MTT, rửa tế bào với PBS 2-3 lần, hòa tan tinh thể formazan tạo thành DMSO acid hoá đo giá trị độ hấp thu (A) máy đo quang phổ AGILENT BioTek ELx808 540 nm Tỷ lệ ức chế tăng trưởng tế bào (%) nồng độ, lập đường cong phụ thuộc tỷ lệ ức chế theo logarith nồng độ để xác định giá trị IC50 phần mềm GraphPad Prism 9124 2.4 ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ EGFR VÀ CÁC PROTEIN TYROSIN KINASE KHÁC IN VITRO Thử nghiệm đánh giá khả ức chế EGFR protein TK in vitro thực BPS Bioscience Inc., San Diego, California, Hoa Kỳ 2.4.1 Nguyên vật liệu, hóa chất thuốc thử Các nguyên vật liệu, hoá chất thuốc thử mua từ cơng ty hố chất sinh phẩm Gibco-Invitrogen, Merck Fisher Scientific, sử dụng trực tiếp không qua tinh chế thêm Các protein TK gồm EGFRWT, EGFRL858R, HER2 VEGFR2 cung cấp BPS Bioscience Inc., San Diego, California, Hoa kỳ 2.4.2 Trang thiết bị Máy ly tâm, máy vortex, cân phân tích số lẻ SARTORIUS CPA225D, máy đo quang phổ AGILENT BioTek Synergy 2, 2.4.3 Phương pháp đánh giá khả ức chế EGFR protein TK in vitro Sự phosphoryl hóa aminoacid tyrosin chất PTK poly(E4-Y) EGFR / HER2 / VEGFR2 tiêu thụ lượng xác định ATP hỗn hợp phản ứng Lượng ATP lại hỗn hợp tham gia vào chuyển hoá luciferin enzym luciferase để tạo thành oxyluciferin phát quang (luminescence) Giá trị cường độ Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 39 phát quang phản ánh lượng ATP lại hỗn hợp hoạt đính EGFR / HER2 / VEGFR2125-127 Hỗn hợp phản ứng (50 μL) gồm có µL ATP (10 μM), µL chất PTK (0,2 mg/mL), µL mẫu thử nồng độ dự kiến (10X), 20 µL protein TK, 17,0 µL nước 6,0 µL dung dịch đệm Tris pH 7,4 (i) Thực đồng thời mẫu đối chứng dương chứa erlotinib (Erl), osimertinib (Osi) staurosporin (Sta) nồng độ dự kiến thay cho mẫu thử (ii), mẫu đối chứng âm chứa DMSO 1% thay cho mẫu thử (iii), mẫu trắng chứa DMSO 1% dung dịch đệm thay cho mẫu thử protein TK tương ứng (iv) Các phản ứng thực đĩa 96 giếng 30 °C Sau 45 phút, thêm vào hỗn hợp phản ứng 50,0 μL thuốc thử Kinase-Glo MAX, để tránh ánh sáng nhiệt độ phịng 15 phút, sau đo cường độ phát quang (LU) giếng máy đo quang phổ AGILENT BioTek Synergy 2126,127 Từ tỷ lệ ức chế protein TK (%) nồng độ, lập đường cong phụ thuộc tỷ lệ ức chế theo logarith nồng độ để xác định giá trị IC50 phần mềm GraphPad Prism 2.5 ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KÍCH HOẠT Q TRÌNH APOPTOSIS IN VITRO TRÊN DỊNG TẾ BÀO UNG THƯ ĐẠI TRÀNG SW480 Thử nghiệm đánh giá kích hoạt apoptosis TBUT SW480 in vitro thực Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam 2.5.1 Nguyên vật liệu, hoá chất thuốc thử Các nguyên vật liệu, hoá chất thuốc thử mua từ công ty hoá chất sinh phẩm Gibco-Invitrogen, Merck BioVision, sử dụng trực tiếp khơng qua tinh chế thêm Dịng TBUT SW480 bảo quản, hoạt hố ni cấy Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam 2.5.2 Trang thiết bị Máy ly tâm, máy vortex, cân phân tích số lẻ SARTORIUS CPA225D, tủ an toàn sinh học, tủ ủ ấm 37 °C, 5% CO2, tủ lạnh, tủ lạnh âm sâu, buồng đếm tế bào Hausser Scientific, kính hiển vi ngược CARL ZEISS Axiovert 40 CFL, kính hiển vi huỳnh quang OLYMPUS scanR, hệ thống đếm tế bào dòng chảy ACEA NovoCyte Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 40 2000, máy đo quang phổ AGILENT BioTek ELx808 2.5.3 Phương pháp nhuộm tế bào với Hoechst 33342 Sự thay đổi hình thái tế bào diễn trình apoptosis quan sát kính hiển vi huỳnh quang nhuộm với Hoechst 33342128 Tế bào SW480 nuôi cấy môi trường DMEM 37 °C, 5% CO2 đến độ phủ 70-90%, sau chia tế bào vào đĩa 12 giếng với mật độ ´ 105 tế bào/giếng ủ 37 °C, 5% CO2 Sau 24 giờ, xử lý tế bào với hợp chất thử ba nồng độ tương ứng với 50%, 100% 200% IC50, tiếp tục để ủ 37 °C, 5% CO2 24 48 Thực đồng thời mẫu đối chứng dương chứa camptothecin (Cam) 0,5 µM mẫu đối chứng âm chứa DMSO 0,5% thay cho mẫu thử Sau khoảng thời gian này, môi trường nuôi cấy loại bỏ, tế bào rửa với PBS 2-3 lần cố định formaldehyd 4% 30 phút Rửa lại tế bào PBS, sau nhuộm tế bào với dung dịch Hoechst 33342 (0,5 μg/mL), để tránh ánh sáng 10 phút Quan sát ghi nhận thay đổi hình thái học tế bào tế bào kính hiển vi huỳnh quang OLYMPUS scanR 350/461 nm (200-400X)128 2.5.4 Phương pháp nhuộm tế bào với FITC Annexin V / Propidium iodid phân tích phương pháp đếm tế bào dịng chảy Annexin V (AV) có lực cao với phosphatidyl serin (PS) phụ thuộc Ca2+, sử dụng để xác định tế bào apoptosis có PS biểu lộ bề mặt Các tế bào sống với màng nguyên vẹn không bị nhuộm propidium iodid (PI) màng tế bào chết bị tổn thương cho PI thấm qua Các tế bào quần thể nhuộm AV/PI phân loại hệ thống đếm tế bào dòng chảy, chia thành bốn vùng gồm tế bào sống (PI-, AV-), apoptosis sớm (PI-, AV+), apoptosis muộn (PI+, AV+) necrosis (PI+, AV-) 129,130 Tế bào SW480 nuôi cấy môi trường DMEM 37 °C, 5% CO2 đến độ phủ 70-90%, sau chia vào đĩa 12 giếng với mật độ ´ 105 tế bào/giếng ủ 37 °C, 5% CO2 Sau 24 giờ, xử lý tế bào với hợp chất thử ba nồng độ tương ứng với 50%, 100% 200% IC50, tiếp tục để ủ 37 °C, 5% CO2 24 48 Thực đồng thời mẫu đối chứng Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 41 dương chứa camptothecin (Cam) 0,5 µM mẫu đối chứng âm chứa DMSO 0,5% thay cho mẫu thử Sau khoảng thời gian này, môi trường nuôi cấy loại bỏ, tế bào trypsin hóa rửa với PBS 2-3 lần Tái phân bố tế bào 100,0 µL dung dịch đệm HEPES pH 7,4 chứa NaCl 0,14 M CaCl2 2,5 mM Thêm tiếp 5,0 µL FITC AV 1,0 µL PI (1 mg/mL), vortex nhẹ nhàng để tránh ánh sáng 37 °C 15 phút Pha lỗng hỗn hợp 400,0 µL dung dịch đệm tiến hành phân tích khoảng 10.000 tế bào hệ thống đếm tế bào dòng chảy ACEA NovoCyte 2000 phần mềm NovoExpress129,130 2.5.5 Phương pháp đánh giá khả cảm ứng caspase-3 Enzym caspase-3 phân cắt chất Ac-DEVD-pNA để giải phóng p-nitroanilin (pNA) có cực đại hấp thu 405 nm Độ hấp thu (A) đo bước sóng 405 nm tỷ lệ thuận với nồng độ pNA phản ánh hoạt tính caspase-3 mẫu ly giải tế bào131 Tế bào SW480 nuôi cấy môi trường DMEM 37 °C, 5% CO2 đến độ phủ 70-90%, sau chia vào đĩa 12 giếng với mật độ ´ 105 tế bào/giếng ủ 37 °C, 5% CO2 Sau 24 giờ, xử lý tế bào với hợp chất thử ba nồng độ tương ứng với 50%, 100% 200% IC50, tiếp tục để ủ 37 °C, 5% CO2 24 48 (i) Thực đồng thời mẫu đối chứng dương chứa camptothecin (Cam) 0,5 µM (ii) mẫu đối chứng âm chứa DMSO 0,5% (iii) thay cho mẫu thử Sau khoảng thời gian này, môi trường nuôi cấy loại bỏ, tế bào trypsin hóa rửa với PBS 2-3 lần Thu lấy 1-5 ´ 105 tế bào/mẫu để ly giải với 50 μL dung dịch đệm ly giải Ly tâm hỗn hợp 10000 × g phút °C thu lấy phần dịch ly giải phía Điều chỉnh nồng độ protein mẫu 50 µg/50 µL Trộn 50 µL dịch ly giải với 50 μL đệm phản ứng (2X) chứa DTT 10 mM μL DEVD-pNA mM để ủ 37 °C 60 phút Song song thực mẫu trắng chứa dịch ly giải đệm phản ứng 2X (iv) Xác định độ hấp thu (A) 405 nm máy đo quang phổ AGILENT BioTek ELx808131 Mức độ chênh lệch độ hấp thu mẫu thử so với mẫu đối chứng âm phản ánh khả cảm ứng caspase-3 chất thử nghiệm Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 42 2.6 ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG GÂY ẢNH HƯỞNG LÊN CHU KỲ TẾ BÀO UNG THƯ ĐẠI TRÀNG SW480 IN VITRO Thử nghiệm đánh giá ảnh hưởng lên chu kỳ TBUT SW480 in vitro thực Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam 2.6.1 Nguyên vật liệu, hoá chất thuốc thử Các nguyên vật liệu, hoá chất thuốc thử mua từ cơng ty hố chất sinh phẩm Gibco-Invitrogen, Merck Fisher Scientific, sử dụng trực tiếp khơng qua tinh chế thêm Dịng TBUT SW480 bảo quản, hoạt hố ni cấy Viện Cơng nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam 2.6.2 Trang thiết bị Máy ly tâm, máy vortex, cân phân tích số lẻ SARTORIUS CPA225D, tủ an toàn sinh học, tủ ủ ấm 37 °C, 5% CO2, tủ lạnh âm sâu, buồng đếm tế bào Hausser Scientific, kính hiển vi ngược CARL ZEISS Axiovert 40 CFL, hệ thống đếm tế bào dòng chảy ACEA NovoCyte 2000, 2.6.3 Phương pháp nhuộm tế bào với propidium iodid phân tích phương pháp đếm tế bào dịng chảy Phân tích chu kỳ tế bào thực cách nhuộm huỳnh quang nhân tế bào với propidium iodid (PI), phân loại dựa huỳnh quang tế bào quần thể phương pháp đếm tế bào dòng chảy Các tế bào lặng im pha G1 có ADN (2n) tương đương với cường độ huỳnh quang 1X Các tế bào pha G2/M có hai ADN (4n) tương đương với cường độ 2X, tế bào pha S (2n-4n) có cường độ huỳnh quang 1X-2X132 Tế bào SW480 nuôi cấy môi trường DMEM 37 °C, 5% CO2 đến độ phủ 70-90%, sau chia vào đĩa giếng với mật độ ´ 105 tế bào/giếng ủ 37 °C, 5% CO2 Sau 24 giờ, xử lý tế bào với hợp chất thử ba nồng độ tương ứng với 50%, 100% 200% IC50, tiếp tục để ủ 37 °C, 5% CO2 24 48 Thực đồng thời mẫu đối chứng âm chứa DMSO 0,5% thay cho mẫu thử Sau khoảng thời Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 43 gian này, môi trường nuôi cấy loại bỏ, tế bào trypsin hố rửa với PBS 2-3 lần, sau cố định dung dịch EtOH/PBS 70% -20 °C Loại bỏ EtOH, rửa tế bào với PBS phân tán tế bào với 450,0 μL PBS Thêm tiếp vào hỗn hợp 5,0 μL RNase A (2,5 mg/mL) 2,5 μL dung dịch PI (1 mg/mL) để ủ tránh ánh sáng 37 °C 30 phút Pha lỗng hỗn hợp 500,0 µL PBS tiến hành phân tích khoảng 10.000 tế bào hệ thống đếm tế bào dòng chảy ACEA NovoCyte 2000 phần mềm NovoExpress132 2.7 ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG GẮN KẾT VỚI EGFR IN SILICO 2.7.1 Trang thiết bị Máy tính Dell PowerEdge DSS8440 sử dụng hệ điều hành Ubuntu 18.04 LTS 64bit, 02 CPU Intel Xeon Gold 6248 3.00 GHz gồm 48 lõi xử lý, nhớ 7.0 TB SSD, RAM 768.0 GB, 08 GPU Nvidia Quadro RTX 8000, thuộc hệ thống High Performance Computing Cluster (HPC Cluster), Oregon State University, Hoa Kỳ 2.7.2 Phương pháp gắn kết phân tử Quá trình gắn kết phân tử (docking) MACs tiềm với dạng EGFR thực AutoGrid-AutoDock 4.2.6 thông qua AutoDockTools 1.5.6133 gắn kết thuận nghịch, AGFR-ADFR 1.2134 gắn kết không thuận nghịch với C797, dựa phản ứng cộng Michael nhóm sulfhydryl (–SH) C797 với nhóm acrylamido Osi hai nhóm enon MACs (Hình 2.6) 2.7.2.1 Chuẩn bị cấu trúc phân tử EGFR hợp chất Cấu trúc EGFR TK chứa vị trí gắn kết cạnh tranh với ATP vị trí allosteric tải từ RCSB PDB (Bảng 2.3) Đối với vị trí gắn kết cạnh tranh ATP, TKIs gồm Erl (EGFRWT - 4HJO)135 Gef (EGFRWT - 4WKQ, EGFRG719S - 2ITO, EGFRL858R - 2ITZ)31,136 sử dụng cho q trình re-docking cross-docking thuận nghịch, cịn Osi (EGFRWT - 6JXT, EGFRL858R - 6JWL)137 sử dụng cho trình cross-docking khơng thuận nghịch Đối với vị trí allosteric, JBJ (EGFRT790M - 7JQX EGFRL858R - 7K1I)138 sử dụng cho trình cross-docking thuận Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 44 nghịch (Bảng 2.3) Trong MOE 2015, tồn cấu trúc ĐKT chỉnh xếp chồng toạ độ không gian EGFRWT (4HJO), toạ độ vị trí gắn kết cạnh tranh ATP Từ đây, vùng khung gian bao trùm cấu trúc EGFR TK hai vị trí gắn kết xác định Cấu trúc dạng đột biến EGFRL858R, EGFRG719S EGFRG724S xây dựng từ cấu trúc EGFRWT Các cấu trúc tiếp tục bổ sung đơn vị thiếu, xác định trạng thái proton hoá pH 7,4 300K tối thiểu hoá lượng trường lực CHARMM27139 Ngoại trừ phân tử w1104 giữ lại, phân tử nước thành phần đồng kết tinh khác loại bỏ Cấu trúc riêng protein ligand ĐK lưu thành file riêng biệt dạng *.pdb Trong AutoDockTools 1.5.6, mở cấu trúc EGFR để thêm tồn ngun tử hydro, tính tốn lại điện tích phần theo Gasteiger-Hückel Lưu lại cấu trúc cuối EGFR dạng *.pdbqt Cấu trúc 3D ligand ĐKT gồm Erl, Gef, Osi, JBJ tải từ RCSB PDB lưu lại dạng *.sdf Các cấu trúc 3D (*.sdf) ligand ĐKT tiếp tục mở Avogadro 1.2.0 để thêm toàn nguyên tử hydro xác định trạng thái proton hố pH 7,4, tính tốn điện tích phần theo GasteigerHuckel tối ưu hóa dạng hình học Cấu trúc 3D MACs xây dựng Avogadro 1.2.0 tối ưu hoá phương pháp với ligand ĐKT140 Lưu cấu trúc thu dạng *.pdb *.mol2 tương ứng Trong AutoDock Tools, cấu trúc thu tiếp tục quy định số liên kết có khả tự quay sở nguyên tử xoay lưu dạng *.pdbqt 2.7.2.2 Mô gắn kết phân tử Trong nghiên cứu này, q trình mơ gắn kết phân tử (docking) tác giả đề xuất chia thành hai giai đoạn gồm (1) docking mù (blind docking) (2) docking tập trung (focused docking) (Bảng 2.2) Ban đầu, giai đoạn docking mù, việc tìm kiếm cấu dạng ligand thực vùng giới hạn tích 72.675 Å3 bao trùm tồn cấu trúc EGFR, qua sơ xác nhận lại vị trí gắn kết ligand ĐKT xác định vị trí gắn kết MACs tiềm thơng qua Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 45 tương tác khơng cộng hố trị (non-covalent), với giả thiết chưa biết rõ vị trí gắn kết ligand Tiếp theo, giai đoạn docking tập trung thực vùng giới hạn tích 18.088 Å3 khu trú quanh vị trí gắn kết xác định được, với mức độ đánh giá cao để xác định cấu dạng gắn kết khơng cộng hố trị tối ưu (Bảng 2.2), sau đánh giá thêm hình thành liên kết cộng hố trị với C797 Osi MACs tiềm Các cấu dạng hình thành tìm kiếm thuật tốn LA-GA Ngồi thông số đánh giá riêng, thông số khác AutoDock 4.2.6 ADFR 1.2 sử dụng mặc định Bảng 2.2 Các thông số grid box docking sử dụng giai đoạn docking mù docking tập trung vào vị trí gắn kết cạnh tranh ATP allosteric Docking tập trung Docking mù Cạnh tranh ATP Allosteric (25, 19, 6) (26, 14, 0) (29, 21, –4) Số điểm cạnh X, Y, Z 105, 105, 125 70, 70, 70 70, 70, 70 Khoảng cách hai điểm 0,375 Å 0,375 Å 0,375 Å 72.675 Å3 18.088 Å3 18.088 Å3 1000 200 200 250.000 lần 2.500.000 lần 2.500.000 lần Toạ độ tâm (x, y, z) Thể tích grid box Số cấu dạng Mức độ đánh giá/cấu dạng Kết trình docking lưu dạng tệp kết *.dlg *.dro chứa thông tin cấu dạng tìm kiếm được, bao gồm cấu trúc lập thể, lượng gắn kết (DG, kcal.mol-1) cấu dạng, phân tích tính tập trung cấu dạng (cluster) dựa giá trị RMSD chúng với ngưỡng phân biệt 2,0 Å Để lựa chọn cấu dạng phù hợp từ kết docking, docking mù, chất trình tìm kiếm cách ngẫu nhiên cấu dạng khoảng khơng gian lớn trải rộng tồn cấu trúc protein, có nhiều cluster (nhóm cấu dạng) tạo thành Do đó, tác giả đề xuất lựa chọn cluster thuộc nhóm 1% cluster Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 46 (i) có khả lặp lại hay số cấu dạng tương đồng cluster nhiều (ii) Trong docking tập trung, cấu dạng tập trung tìm kiếm khoảng khơng gian hẹp, có cluster tạo thành với điểm số chênh lệch nên cluster có khả lặp lại cao hay số cấu dạng tương đồng nhiều lựa chọn Cấu dạng đại diện với lượng gắn kết thấp cluster chọn lưu lại (*.pdbqt) để phân tích (Hình 2.5) Blind Docking 40 30 20 10 -12 Focused Docking 100 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 Cluster ĐiểmSố sốcluster docking (kcal.mol–1) -4 Số cấu dạng Số cấu dạng 50 80 60 40 20 -12.5 -12.0 -11.5 -11.0 -10.5 -10.0 Cluster ĐiểmSố số cluster docking (kcal.mol–1) Hình 2.5 Đánh giá lựa chọn cluster từ docking mù (blind docking) docking tập trung (focused docking) 2.7.2.3 Đánh giá thông số kết gắn kết Cấu dạng ligand ĐKT lựa chọn từ kết gắn kết phải cho thấy khả tái tạo liệu thực nghiệm so sánh với cấu trúc ĐKT, thể qua giá trị RMSD khơng vượt q Å hình thành tương tác tương tự, chứng phương pháp thông số gắn kết phù hợp để sử dụng nghiên cứu khả gắn kết MACs EGFR (Bảng 2.10)141 Cấu dạng tốt ligand phân tích phần mềm MOE 2015 PyMOL 2.3.4142 dựa tương tác chủ yếu gồm liên kết hydro, tương tác phân cực khác cation-pi, proton-pi, pi-pi, tương tác phân cực alkyl-alkyl, pi-alkyl, Các cấu dạng chọn MACs ligand ĐKT tiếp tục sử dụng nghiên cứu MDs Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Bảng 2.3 Các trình gắn kết phân tử vào khoang gắn kết EGFR để đánh giá lại khả tái tạo liệu thực nghiệm Kiểu gắn kết Cấu trúc sử dụng cho docking (PDB ID) Ligand ĐKT để so sánh Docking mù Docking tập trung Re-docka Cross-dockb 4HJO Thuận nghịch Thuận nghịch Erl (4HJO) Gef (4WKQ, 1,85 Å) EGFRWT 4HJO Thuận nghịch (Không) thuận nghịch - Osi (6JXT, 2,31 Å) EGFRWT 4HJO Thuận nghịch Thuận nghịch - JBJ (7JXQ, 1,83 Å) EGFRL858R 4HJOc Thuận nghịch Thuận nghịch Erl (4HJO) Gef (2ITZ, 2,80 Å) EGFRL858R 4HJOc Thuận nghịch (Không) thuận nghịch - Osi (6JWL, 2,55 Å) EGFRL858R 4HJOc Thuận nghịch Thuận nghịch - JBJ (7K1I, 3,20 Å) EGFRG719S/G724S 4HJOd,e Thuận nghịch Thuận nghịch Erl (4HJO) Gef (2ITO, 3,25 Å) EGFRG719S/G724S 4HJOd,e Thuận nghịch (Không) thuận nghịch - Osi (6JXT, 2,31 Å) EGFRG719S/G724S 4HJOd,e Thuận nghịch Thuận nghịch - JBJ (7JXQ, 1,83 Å) Quá trình are-docking bcross-docking thực với ligand ĐKT xây dựng theo mục 2.7.3.1 so sánh kết thu với cấu trúc ligand ĐKT từ cấu trúc ngoặc tương ứng Cấu trúc cEGFRL858R, dEGFRG719S eEGFRG724S xây dựng từ EGFRWT (4HJO) MOE 2015 (-) Không thực 47 EGFRWT Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 48 Hình 2.6 Hai giai đoạn q trình mơ gắn kết phân tử (1) Giai đoạn chuẩn bị để hình thành liệu thông số đầu vào, thực chủ yếu AutoDock Tools 1.5.6; (2) Giai đoạn mô gắn kết, gồm re-docking cross-docking ligand ĐKT, docking MACs, thực chủ yếu AutoDock 4.2.6 ADFR 1.0 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 49 2.7.3 Phương pháp mơ động lực học phân tử Quá trình MDs hợp chất với phân tử EGFR thực GROMACS 2021.2107 thông qua hệ điều hành Ubuntu, thực với cấu trúc EGFR không gắn kết (apo-EGFR), phức hợp EGFR-MACs phức hợp EGFRligand ĐKT để so sánh (Hình 2.7) 2.7.3.1 Q trình mơ động lực học phức hợp hợp chất với EGFR Topology EGFR (*.gro topol.top) xây dựng dựa cấu trúc chuẩn bị mục 2.7.2.1 (*.pdb) trường lực CHARMM36 GROMACS 2021.2143 Sử dụng công cụ CGenFF để xây dựng topology phân tử ligand có cấu dạng chọn từ trình gắn kết phân tử (*.mol2) trường lực CHARMM36143,144 Từ đó, topology phức hợp xây dựng cách bổ sung thêm liệu ligand vào topology EGFR Phức hợp sau đặt hệ mơ dạng khối 12 mặt với điều kiện biên tuần hoàn (PBC - periodic boundary condition) với khoảng cách biên (margin) tối thiểu 1,0 nm Hệ mơ solvat hố theo mơ hình nước TIP3P, trung hồ điện tích ion Na+ ion Cl- tối thiểu hóa lượng với lực tối đa gây không 1000 J.mol– nm–1, số bước thực tối thiểu hóa lượng tối đa 500.000 lần Trước tiến hành MDs, hệ mô trải qua cân đẳng tích - đẳng nhiệt (NVT) để trì nhiệt độ 300 K bể nhiệt Berendsen, cân đẳng nhiệt - đẳng áp (NPT) để trì áp suất bar bể áp Parrinello-Rahman, cân kéo dài ns Cuối cùng, hệ mô giải phóng điều kiện ràng buộc để tiến hành MDs với thời gian 100 ns nhiệt độ 300 K áp suất bar không đổi Cấu trúc hệ mô lưu lại 10,0 ps tệp *.xtc 2.7.3.2 Đánh giá trình mô động lực học Để đánh giá tập hợp cấu trúc hệ lưu thời điểm khác mô tệp *.xtc, hệ mô loại bỏ điều kiện PBC chỉnh lại dựa tính tốn bình phương cực tiểu nguyên tử khung (backbone) protein Mỗi hệ mô đạt cân giai đoạn 30-100 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 50 ns trích xuất để phân tích GROMACS 2021.2 Các giá trị RMSD (module rms), RMSF (module rmsf) bán kính quay Rg (module gyrate) Trong đó, giá trị RMSD riêng EGFR (RMSDP) ligand (RMSDL) tính tốn dựa ngun tử khung protein (backbone) nguyên tử nặng ligand (heavy atoms) tương ứng Giá trị RMSF riêng EGFR (RMSFP) tính tốn theo đơn vị aminoacid, ligand (RMSFL) tính tốn theo ngun tử nặng Tần suất liên kết hydro tính tốn phần mềm VMD 1.9.4, sử dụng điều kiện khoảng cách Don-Acc phải khơng q 3,5 Å góc Acc-Don-H phải không 30°145 Video biểu diễn hệ mô theo thời gian xuất từ tệp *.xtc mô phần mềm PyMOL 2.3.4142 2.7.3.3 Năng lượng gắn kết tự phân tích lượng đóng góp Năng lượng gắn kết tự đóng góp cấu trúc bậc hai vào lượng gắn kết ước tính theo phương pháp MMPBSA146 Q trình tính tốn thực 1000 thời điểm cách 70 ps khoảng 30-100 ns ∆G!"#$"#% = E&& + G'()*+,"(# − T × ∆S (4) Năng lượng học phân tử MACs ligand ĐKT với EGFR (E&& ) ước tính hai thành phần gồm tương tác tĩnh điện (E-)- ) tương tác van der Waals (E*$/ ) theo phương trình (5) E&& = E-)- + E*$/ (5) Năng lượng tự q trình solvat hóa (G'()*+,"(# ) ước tính hai thành phần, lượng solvat hóa phân cực (G0()+1 ) lượng solvat hóa khơng phân cực (G#(# 0()+1 ) theo phương trình (6), sử dụng thông số hai tệp polar.mdp apolar.mdp Trong đó, G0()+1 ước tính theo phương trình Poisson Boltzmann, G#(# 0()+1 ước tính mơ hình SASA G'()*+,"(# = G0()+1 + G#(# 0()+1 (6) Đại lượng entropy khơng tính module g_mmpbsa Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 51 ước tính theo mơ hình Quasi-harmonic theo phương pháp Karplus Kushick147 Module covar sử dụng để xây dựng ma trận phương sai cần thiết cho ligand, protein (Cα) hay phức hợp (Cα + ligand), từ giá trị entropy thành phần xác định module anaeig nhiệt độ 300K Giá trị biến thiên entropy ∆S sau tính theo phương trình (7) ∆S = S01(,-"#3)"%+#$ − 0S01(,-"# + S)"%+#$1 (7) 2.8 ĐÁNH GIÁ HỒ SƠ DƯỢC ĐỘNG HỌC VÀ ĐỘC TÍNH IN SILICO Hồ sơ dược động học độc tính (ADMET) MACs tiềm dự đốn hai tảng trực tuyến gồm ADMETlab2.0 (https://admetmesh.scbdd.com)115 SwissADME (http://www.swissadme.ch)116 Kết dự đoán ghi nhận lưu lại dạng tệp *.csv 2.9 XỬ LÝ THỐNG KÊ VÀ PHÂN TÍCH SỐ LIỆU Kết xử lý, thể dạng giá trị trung bình ± sai số chuẩn (Mean ± SEM) trình bày dạng biểu đồ phù hợp phần mềm GraphPad Prism Các kết đánh giá ý nghĩa thống kê phép kiểm ANOVA yếu tố Hệ tối thiểu hóa lượng (*.gro,*.top,*.edr) GROMACS 2021.2 EGFR 3D tối ưu hóa (*.pdb) MACs / Lig ĐKT docking pose (*.pdbqt) AutoDock Tools 1.5.6 EGFR topology (*.gro, *.itp, *.top) MACs / Lig ĐKT 3D docking pose (*.mol2) Avogadro 1.2.0 Topology Apo / Phức hợp EGFR (*.gro, *.itp, *.top) MACs / Lig ĐKT 3D docking pose (*.mol2) sort_mol2_bonds.pl Đơn vị khối 12 mặt PBC (*.gro, *.top) MACs / Lig ĐKT 3D docking pose (*.str) CGenFF Server Đơn vị khối 12 mặt hydrat hóa (*.gro) MACs / Lig ĐKT 3D (*.pdb , *.prm, *.itp) cgenffcharmm2gmx.py MACs / Lig ĐKT topology (*.gro) GROMACS 2021.2 nvt.mdp CHARMM36 FF Hệ cân NVT (*.gro, *.tpr, *.edr, *.cpt, *.xtc) npt.mdp RMSDL/P , RMSFL/P , Rg , Khoảng cách (*.xvg) Hệ cân NVT (*.gro, *.tpr, *.edr, *.cpt, *.xtc) md.mdp g_mmpbsa Năng lượng gắn kết tự (*.xvg, *.dat) Hệ mô MD (*.gro, *.tpr, *.edr, *.cpt, *.xtc) em.mdp Tần suất liên kết hydro (*.xvg, *.dat) polar.mdp apolar.mdp Pymol 2.3.4 Video mô gắn kết (*.mp4) ions.mdp Đơn vị khối 12 mặt trung hoà điện tích (*.tpr,*.gro) CHARMM36 FF Giai đoạn Giai đoạn Giai đoạn Giai đoạn Hình 2.7 Bốn giai đoạn q trình MDs (1) Giai đoạn hình thành liệu, thơng số đầu vào apo-EGFR phức hợp với EGFR ligand ĐKT MACs; (2) Giai đoạn xây dựng hoàn thiện thành phần hệ mô phỏng; (3) Giai đoạn tiến hành cân MDs; (4) Giai đoạn thực phân tích kết mơ phỏng, tồn thực chủ yếu GROMACS 2021.2 52 VMD 1.9.4 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 53 Chương KẾT QUẢ 3.1 TỔNG HỢP CÁC MACS CHỨA CẤU TRÚC NỐI CYCLOHEXANON 3.1.1 Tổng hợp dẫn chất 1,3-diphenyl-1H-pyrazol-4-carbaldehyd (j-n) 3.1.1.1 Tổng hợp 1,3-diphenyl-1H-pyrazol-4-carbaldehyd 1,3-Diphenyl-1H-pyrazol-4-carbaldehyd (j) CTPT: C16H12ON2 - MW: 248,29 Sản phẩm 1,3-diphenyl-1H-pyrazol-4-carbaldehyd (j) tổng hợp từ phenyl hydrazin (3,24 g; 0,03 mol) acetophenon (3,60 g; 0,03 mol) phản ứng (1), từ 1-phenyl-2-(1-phenylethyliden)hydrazin (j’) (1,05 g; 5,00 mmol) phản ứng (2) theo quy trình mục 2.2.2.1 Hiệu suất: Hiệu suất tồn q trình 87,9%, đó: Phản ứng (1): 5,83 g; 92,4% Phản ứng (2): 1,18 g; 95,1% Cảm quan: Chất rắn màu trắng; tan tốt Et2O, DCM, EtOAc, THF, aceton, DMSO DMF; tan EtOH, MeOH iPrOH; không tan nước MP (°C): 142,8-144,1 Phổ IR (ATR, n cm-1): 3124 (nC-Hpyrazol), 3061 (nC-Hthơm), 2839 (nC-Haldehyd), 1670 (nC=Oaldehyd), 1524 (nC=N) (Phụ lục 1.1.1) Phổ HR-MS (ESI, m/z): [M+H]+ tính tốn: 249,1028; tìm thấy: 249,0990; [M+K]+ tính tốn: 287,0587; tìm thấy: 287,0555 (C16H12ON2) (Phụ lục 1.1.2) Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 54 Phổ 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6, d ppm): 9,99 (s, 1H, H6); 9,31 (s, 1H, H5); 7,99 (d, J = 7,5 Hz, 2H, H2b,6b); 7,93 (dd, J = 1,5 8,0 Hz, 2H, H2a,6a); 7,58 (t, J = 8,0 Hz, 2H, H3a,5a); 7,54-7,48 (m, 3H, H3b,4b,5b); 7,43 (t, J = 7,5 Hz, 1H, H4a) (Phụ lục 1.1.3) Phổ 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6, d ppm): 184,6; 152,7; 138,6; 134,8; 131,2; 129,7; 129,2; 128,7; 128,5; 127,7; 122,1; 119,3 (Phụ lục 1.1.4) Nhận xét: Các kiện thu cho thấy phù hợp với cấu trúc dẫn chất j 3.1.1.2 Tổng hợp 3-(4-fluorophenyl)-1-phenyl-1H-pyrazol-4-carbaldehyd 3-(4-Fluorophenyl)-1-phenyl-1H-pyrazol-4-carbaldehyd (k) CTPT: C16H11FON2 - MW: 266,28 Sản phẩm 3-(4-fluorophenyl)-1-phenyl-1H-pyrazol-4-carbaldehyd (k) tổng hợp từ phenylhydrazin (3,24 g; 0,03 mol) 4-fluoroacetophenon (4,14 g; 0,03 mol) phản ứng (1), từ 1-(1-(4-fluorophenyl)ethyliden)-2-phenylhydrazin (k’) (1,14 g; 5,00 mmol) phản ứng (2) theo quy trình mục 2.2.2.1 Hiệu suất: Hiệu suất tồn q trình 65,7%, đó: Phản ứng (1): 5,07 g; 74,1% Phản ứng (2): 1,18 g; 88,6% Cảm quan: Chất rắn màu trắng; tan tốt Et2O, DCM, EtOAc, THF, aceton, DMSO DMF; tan EtOH, MeOH iPrOH; không tan nước MP (°C): 158,9-160,2 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 55 Phổ IR (ATR, n cm-1): 3127 (nC-Hpyrazol), 3073 (nC-Hthơm), 2839 (nC-Haldehyd), 1670 (nC=Oaldehyd), 1520 (nC=N), 1225 (nC-F) (Phụ lục 1.2.1) Phổ HR-MS (ESI, m/z): [M+H]+ tính tốn: 267,0934; tìm thấy: 267,0930 (C16H11FON2) (Phụ lục 1.2.2) Phổ 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6, d ppm): 9,98 (s, 1H, H6); 9,34 (s, 1H, H5); 8,03 (dd, J = 5,5 8,5 Hz, 2H, H2b,6b); 7,98 (d, J = 7,5 Hz, 2H, H2a,6a); 7,58 (t, J = 7,5 Hz, 2H, H3a,5a); 7,44 (t, J = 7,5 Hz, 1H, H4a); 7,34 (t, J = 9,0 Hz, 2H, H3b,5b) (Phụ lục 1.2.3) Phổ 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6, d ppm): 184,5; 162,8 (d, 1JFC = 237,5 Hz); 151,4; 138,5; 135,5; 130,8 (d, 3JFC = 7,5 Hz); 129,7; 127,7; 122,0; 119,2; 115,5; 115,3 (Phụ lục 1.2.4) Nhận xét: Các kiện thu cho thấy phù hợp với cấu trúc dẫn chất k 3.1.1.3 Tổng hợp 3-(4-methoxyphenyl)-1-phenyl-1H-pyrazol-4-carbaldehyd 3-(4-Methoxyphenyl)-1-phenyl-1H-pyrazol-4-carbaldehyd (l) CTPT: C17H14O2N2 - MW: 278,31 Sản phẩm 3-(4-methoxyphenyl)-1-phenyl-1H-pyrazol-4-carbaldehyd (l) tổng hợp từ phenylhydrazin (3,24 g; 0,03 mol) 4-methoxyacetophenon (4,51 g; 0,03 mol) phản ứng (1), từ 1-(1-(4-methoxyphenyl)ethyliden)-2-phenyl hydrazin (l’) (1,20 g; 5,00 mmol) phản ứng (2) theo quy trình mục 2.2.2.1 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 56 Hiệu suất: Hiệu suất tồn q trình 68,8%, đó: Phản ứng (1): 5,66 g; 78,5% Phản ứng (2): 1,22 g; 87,7% Cảm quan: Chất rắn màu trắng; tan tốt Et2O, DCM, EtOAc, THF, aceton, DMSO DMF; tan EtOH, MeOH iPrOH; không tan nước MP (°C): 141,5-143,1 Phổ IR (ATR, n cm-1): 3125 (nC-Hpyrazol), 3067 (nC-Hthơm), 2837 (nC-Haldehyd), 1670 (nC=Oaldehyd), 1520 (nC=N) (Phụ lục 1.3.1) Phổ HR-MS (ESI, m/z): [M+H]+ tính tốn: 279,1134; tìm thấy: 279,1129 (C17H14O2N2) (Phụ lục 1.3.2) Phổ 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6, d ppm): 9,97 (s, 1H, H6); 9,29 (s, 1H, H5); 7,98 (d, J = 7,5 Hz, 2H, H2a,6a); 7,91 (d, J = 8,5 Hz, 2H, H2b,6b); 7,57 (t, J = 7,5 Hz, 2H, H3a,5a); 7,43 (t, J = 7,5 Hz, 1H, H4a); 7,07 (d, J = 9,0 Hz, 2H, H3b,5b); 3,83 (s, 3H, H7b) (Phụ lục 1.3.3) Phổ 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6, d ppm): 184,5; 160,0; 152,4; 138,6; 135,0; 130,0; 129,7; 127,6; 123,6; 121,9; 119,1; 113,9; 55,2 (Phụ lục 1.3.4) Nhận xét: Các kiện thu cho thấy phù hợp với cấu trúc dẫn chất l 3.1.1.4 Tổng hợp 1-(4-methoxyphenyl)-3-phenyl-1H-pyrazol-4-carbaldehyd 1-(4-Methoxyphenyl)-3-phenyl-1H-pyrazol-4-carbaldehyd (m) CTPT: C17H14O2N2 - MW: 278,31 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 57 Sản phẩm 1-(4-methoxyphenyl)-3-phenyl-1H-pyrazol-4-carbaldehyd (m) tổng hợp từ 4-methoxyphenylhydrazin (4,15 g; 0,03 mol) acetophenon (3,60; 0,03 mol) phản ứng (1), từ 1-(4-methoxyphenyl)-2-(1-phenylethyliden)hydrazin (m’) (1,20 g; 5,00 mmol) phản ứng (2) theo quy trình mục 2.2.2.1 Hiệu suất: Hiệu suất tồn q trình 47,8%, đó: Phản ứng (1): 5,30 g; 73,5% Phản ứng (2): 0,90 g; 65,0% Cảm quan: Chất rắn màu trắng; tan tốt Et2O, DCM, EtOAc, THF, aceton, DMSO DMF; tan EtOH, MeOH iPrOH; không tan nước MP (°C): 122,5-122,7 Phổ IR (ATR, n cm-1): 3118 (nC-Hpyrazol), 3007 (nC-Hthơm), 2835 (nC-Haldehyd), 1664 (nC=Oaldehyd), 1524 (nC=N) (Phụ lục 1.4.1) Phổ HR-MS (ESI, m/z): [M+H]+ tính tốn: 279,1134; tìm thấy: 279,1081; [M+Na]+ tính tốn: 301,0954; tìm thấy: 301,0889 (C17H14O2N2) (Phụ lục 1.4.2) Phổ 1H-NMR (600 MHz, DMSO-d6, d ppm): 9,97 (s, 1H, H6); 9,18 (s, 1H, H5); 7,91 (dd, J = 1,2 8,4 Hz, 2H, H2b,6b); 7,89 (d, J = 9,6 Hz, 2H, H2a,6a); 7,52-7,46 (m, 3H, H3b,4b,5b); 7,11 (d, J = 9,0 Hz, 2H, H3a,5a); 3,82 (s, 3H, H7a) (Phụ lục 1.4.3) Phổ 13C-NMR (150 MHz, DMSO-d6, d ppm): 184,5; 158,6; 152,4; 134,2; 132,1; 131,3; 129,0; 128,6; 128,5; 121,8; 120,8; 114,7; 55,5 (Phụ lục 1.4.4) Nhận xét: Các kiện thu cho thấy phù hợp với cấu trúc dẫn chất m 3.1.1.5 Tổng hợp 3-(4-fluorophenyl)-1-(4-methoxyphenyl)-1H-pyrazol-4- carbaldehyd Sản phẩm 3-(4-fluorophenyl)-1-(4-methoxyphenyl)-1H-pyrazol-4-carbaldehyd (n) tổng hợp từ 4-methoxyphenylhydrazin (4,15 g; 0,03 mol) 4-fluoroaceto phenon (4,14 g; 0,03 mol) phản ứng (1), từ 1-(1-(4-fluorophenyl)ethyliden)2-(4-methoxyphenyl)hydrazin (n’) (1,29 g; 5,00 mmol) phản ứng (2) theo quy trình mục 2.2.2.1 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 58 3-(4-Fluorophenyl)-1-(4-methoxyphenyl)-1H-pyrazol-4-carbaldehyd (n) CTPT: C17H13FO2N2 - MW: 296,30 Hiệu suất: Hiệu suất toàn trình 33,7%, đó: Phản ứng (1): 5,22 g; 67,3% Phản ứng (2): 0,74 g; 50,1% Cảm quan: Chất rắn màu trắng; tan tốt Et2O, DCM, EtOAc, THF, aceton, DMSO DMF; tan EtOH, MeOH iPrOH; không tan nước MP (°C): 105,6-106,2 Phổ IR (ATR, n cm-1): 3117 (nC-Hpyrazol), 3022 (nC-Hthơm), 2828 (nC-Haldehyd), 1672 (nC=Oaldehyd), 1514 (nC=N), 1219 (nC-F) (Phụ lục 1.5.1) Phổ HR-MS (ESI, m/z): [M+H]+ tính tốn: 297,1040; tìm thấy: 297,1060 (C17H13FO2N2) (Phụ lục 1.5.2) Phổ 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6, d ppm): 9,95 (s, 1H, H6); 9,21 (s, 1H, H5); 8,00 (dd, J = 5,5 9,0 Hz, 2H, H2b,6b); 7,89 (d, J = 9,5 Hz, 2H, H2a,6a); 7,34 (t, J = 9,0 Hz, 2H, H3b,5b); 7,11 (d, J = 9,0 Hz, 2H, H3a,5a); 3,82 (s, 3H, H7a) (Phụ lục 1.5.3) Phổ 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6, d ppm): 184,4; 162,6 (d, 1JFC = 250,0 Hz); 158,7; 151,2; 135,0; 132,0; 130,8 (d, 3JFC = 8,8 Hz); 127,8; 121,7; 120,9; 115,5; 115,3; 114,7; 55,5 (Phụ lục 1.5.4) Nhận xét: Các kiện thu cho thấy phù hợp với cấu trúc dẫn chất n Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 59 3.1.2 Tổng hợp dẫn chất (E)-2-(phenylmethylen)cyclohexan-1-on (1-4) 3.1.2.1 Tổng hợp (E)-2-[(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)methylen]cyclohexan-1-on (E)-2-[(4-Hydroxy-3-methoxyphenyl)methylen]cyclohexan-1-on (1) CTPT: C14H16O3 - MW: 232,28 Sản phẩm (E)-2-[(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)methylen]cyclohexan-1-on (1) tổng hợp từ vanilin (1,52 g; 0,01 mol) theo quy trình mục 2.2.2.2 Hiệu suất: 0,69 g; 29,7% Cảm quan: Tinh thể rắn màu trắng đến vàng; tan tốt EtOAc, THF, aceton, EtOH, MeOH, DMSO DMF; tan nước MP (°C): 117,4-118,7 Phổ IR (ATR, n cm-1): 3379 (nO-H), 3011 (nC-Hthơm), 2943 (nC-Hkhông no), 2930, 2872, 2841 (nC-Hno), 1655 (nC=O), 1508 (nC=C) (Phụ lục 2.1.1) Phổ HR-MS (ESI, m/z): [M+H]+ tính tốn: 233,1178; tìm thấy: 233,1187 (C14H16O3) (Phụ lục 2.1.2) Phổ 1H-NMR (600 MHz, DMSO-d6, d ppm): 9,52 (s, 1H, O−H); 7,32 (t, J = 2,1 Hz, 1H, H7b); 7,06 (d, J = 1,8 Hz, 1H, H2b); 6,97 (dd, J = 1,8 8,4 Hz, 1H, H6b); 6,83 (d, J = 8,4 Hz, 1H, H5b); 3,79 (s, 3H, H8b); 2,80 (dt, J = 2,0 6,5 Hz, 2H, H3); 2,41 (t, J = 6,6 Hz, 2H, H6); 1,84-1,80 (m, 2H, H4); 1,72-1,68 (m, 2H, H5) (Phụ lục 2.1.3) Phổ 13C-NMR (150 MHz, DMSO-d6, d ppm): 199,8; 147,8; 147,4; 135,4; 133,5; 126,5; 124,2; 115,5; 114,8; 55,6; 28,4; 23,3; 22,6 (Phụ lục 2.1.4) Nhận xét: Các kiện thu cho thấy phù hợp với cấu trúc dẫn chất Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 60 3.1.2.2 Tổng hợp (E)-2-[(3-hydroxy-4-methoxyphenyl)methylen]cyclohexan-1-on (E)-2-[(3-Hydroxy-4-methoxyphenyl)methylen]cyclohexan-1-on (2) CTPT: C14H16O3 - MW: 232,28 Sản phẩm (E)-2-[(3-hydroxy-4-methoxyphenyl)methylen]cyclohexan-1-on (2) tổng hợp từ isovanilin (1,52 g; 0,01 mol) theo quy trình mục 2.2.2.2 Hiệu suất: 0,71 g; 30,6% Cảm quan: Tinh thể rắn màu vàng nhạt; tan tốt EtOAc, THF, aceton, EtOH, MeOH, DMSO DMF; tan nước MP (°C): 105,8-107,5 Phổ IR (ATR, n cm-1): 3238 (nO-H), 2990 (nC-Hthơm), 2931 (nC-Hkhông no), 2918, 2851 (nC-Hno), 1659 (nC=O), 1560 (nC=C) (Phụ lục 2.2.1) Phổ HR-MS (ESI, m/z): [M+H]+ tính tốn: 233,1178; tìm thấy: 233,1181 (C14H16O3) (Phụ lục 2.2.2) Phổ 1H-NMR (600 MHz, DMSO-d6, d ppm): 9,15 (s, 1H, O-H); 7,24 (s, 1H, H7b); 6,98-6,92 (m, 3H, H2b,5b,6b); 3,80 (s, 1H, H8b); 2,77 (dt, J = 2,0 6,6 Hz, 2H, H3); 2,41 (t, J = 6,6 Hz, 2H, H6); 1,85-1,81 (m, 2H, H4); 1,72-1,68 (m, 2H, H5) (Phụ lục 2.2.3) Phổ 13C-NMR (150 MHz, DMSO-d6, d ppm): 199,8; 148,5; 146,2; 134,8; 134,1; 127,9; 122,9; 117,2; 111,9; 55,6; 28,4; 23,2; 22,6 (Phụ lục 2.2.4) Nhận xét: Các kiện thu cho thấy phù hợp với cấu trúc dẫn chất Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 61 3.1.2.3 Tổng hợp (E)-2-[(3,4,5-trimethoxyphenyl)methylen]cyclohexan-1-on (E)-2-[(3,4,5-Trimethoxyphenyl)methylen]cyclohexan-1-on (3) CTPT: C16H20O4 - MW: 276,33 Sản phẩm (E)-2-[(3,4,5-trimethoxyphenyl)methylen]cyclohexan-1-on (3) tổng hợp từ 3,4,5-trimethoxybenzaldehyd (1,96 g; 0,01 mol) theo quy trình mục 2.2.2.2 Hiệu suất: 1,69 g; 61,2% Cảm quan: Tinh thể rắn màu trắng đến vàng; tan tốt EtOAc, THF, aceton, EtOH, MeOH, DMSO DMF; tan nước MP (°C): 89,4-90,9 Phổ IR (ATR, n cm-1): 3059 (nC-Hthơm), 2936 (nC-Hkhông no), 2859, 2839 (nC-Hno), 1670 (nC=O), 1581 (nC=C) (Phụ lục 2.3.1) Phổ HR-MS (ESI, m/z): [M+H]+ tính tốn: 277,1441; tìm thấy: 277,1443 (C16H20O4) (Phụ lục 2.3.2) Phổ 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6, d ppm): 7,31 (t, J = 2,0 Hz, 1H, H7b); 6,78 (s, 1H, H2b,6b); 3,80 (s, 6H, H8b,10b); 3,70 (s, 3H, H9b); 2,84 (dt, J = 2,0 6,5 Hz, 2H, H3); 2,44 (t, J = 6,5 Hz, 2H, H6); 1,87-1,82 (m, 2H, H4); 1,73-1,68 (m, 2H, H5) (Phụ lục 2.3.3) Phổ 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6, d ppm): 200,6; 153,1; 138,6; 136,5; 135,1; 131,1; 108,5; 60,6; 56,4; 28,8; 23,7; 23,1 (Phụ lục 2.3.4) Nhận xét: Các kiện thu cho thấy phù hợp với cấu trúc dẫn chất Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 62 3.1.2.4 Tổng hợp (E)-2-[(4-hydroxy-3,5-dimethoxyphenyl)methylen]cyclohexan1-on (E)-2-[(4-Hydroxy-3,5-dimethoxyphenyl)methylen]cyclohexan-1-on (4) CTPT: C15H18O4 - MW: 262,31 Sản phẩm (E)-2-[(4-hydroxy-3,5-dimethoxyphenyl)methylen]cyclohexan-1-on (4) tổng hợp từ syringaldehyd (1,82 g; 0,01 mol) theo quy trình mục 2.2.2.2 Hiệu suất: 1,15 g; 43,8% Cảm quan: Tinh thể rắn màu vàng nhạt; tan tốt EtOAc, THF, aceton, EtOH, MeOH, DMSO DMF; tan nước MP (°C): 80,1-81,6 Phổ IR (ATR, n cm-1): 3356 (nO-H), 3018 (nC-Hthơm), 2934 (nC-Hkhông no), 2864, 2837 (nC-Hno), 1655 (nC=O), 1512 (nC=C) (Phụ lục 2.4.1) Phổ HR-MS (ESI, m/z): [M+H]+ tính tốn: 263,1284; tìm thấy: 263,1287 (C15H18O4) (Phụ lục 2.4.2) Phổ 1H-NMR (600 MHz, DMSO-d6, d ppm): 8,87 (s, 1H, O-H); 7,32 (t, J = 2,1 Hz, 1H, H7b); 6,78 (s, 2H, H2b,6b); 3,79 (s, 6H, H8b,9b); 2,84 (dt, J = 2,0 6,6 Hz, 2H, H3); 2,41 (t, J = 6,6 Hz, 2H, H6); 1,83-1,80 (m, 2H, H4); 1,72-1,70 (m, 2H, H5) (Phụ lục 2.4.3) Phổ 13C-NMR (150 MHz, DMSO-d6, d ppm): 199,7; 147,7; 137,0; 135,6; 133,8; 125,4; 108,6; 56,0; 28,3; 23,3; 22,6 (Phụ lục 2.4.4) Nhận xét: Các kiện thu cho thấy phù hợp với cấu trúc dẫn chất Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 63 3.1.3 Tổng hợp MACs chứa cấu trúc nối cyclohexanon (j1-n3) 3.1.3.1 Tổng hợp (2E,6E)-2-[(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)methylen]-6-[(1,3diphenyl-1H-pyrazol-4-yl)methylen]cyclohexan-1-on (2E,6E)-2-[(4-Hydroxy-3-methoxyphenyl)methylen]-6-[(1,3-diphenyl-1H-pyrazol4-yl)methylen]cyclohexan-1-on (j1) CTPT: C30H26N2O3 - MW: 462,55 Sản phẩm j1 tổng hợp từ 1,3-diphenyl-1H-pyrazol-4-carbaldehyd (j) (124,1 mg; 0,50 mmol) (E)-2-[(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)methylen]cyclohexan-1-on (1) (125,4 mg; 0,54 mmol) theo quy trình mục 2.2.2.3, tinh chế phương pháp CC, rửa giải gradient hỗn hợp dung môi n-hexan - EtOAc (8 : ® : 1) Hiệu suất: 80,5 mg; 34,8% Cảm quan: Chất rắn màu vàng; tan tốt aceton, DMSO DMF; tan DCM, EtOAc THF; tan EtOH MeOH; không tan nước HPLC (tR, phút): 4,636 (Độ tinh khiết > 99,99%) (Phụ lục 3.1.6) MP (°C): 186,3-187,7 Phổ IR (ATR, n cm-1): 3510 (nO-H), 3017 (nC-Hthơm), 2936 (nC-Hkhông no), 2859 (nC-Hno), 1653 (nC=O), 1593 (nC=N), 1501 (nC=C) (Phụ lục 3.1.1) Phổ HR-MS (ESI, m/z): [M+H]+ tính tốn: 463,2023; tìm thấy: 463,2034 (C30H26N2O3) (Phụ lục 3.1.2) Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 64 Phổ 1H-NMR (600 MHz, DMSO-d6, d ppm): 9,57 (s, 1H, O−H); 8,80 (s, 1H, H5a); 8,01 (d, J = 7,8 Hz, 2H, H2c,6c); 7,63 (d, J = 7,2 Hz, 2H, H2d,6d); 7,58 (s, 2H, H6a,7b); 7,56-7,53 (m, 4H, H3c,5c,3d,5d); 7,49 (t, J = 7,2 Hz, 1H, H4d); 7,38 (t, J = 7,2 Hz, 1H, H4c); 7,10 (s, 1H, H2b); 7,03 (d, J = 7,8 Hz, 1H, H6b); 6,86 (d, J = 7,8 Hz, 1H, H5b); 3,81 (s, 3H, H8b); 2,91 (mH, 4H, H3,5); 1,80 (quint, J = 5,4 Hz, 2H, H4) (Phụ lục 3.1.3) Phổ 13C-NMR (150 MHz, DMSO-d6, d ppm): 188,0; 153,7; 147,9; 147,5; 139,1; 136,5; 134,8; 133,4; 132,2; 129,6; 128,8; 128,7; 128,6; 127,0; 126,9; 125,8; 124,3; 119,0; 116,6; 115,6; 114,7; 55,7; 28,1; 27,9; 22,2 (Phụ lục 3.1.4) Nhận xét: Các kiện thu cho thấy phù hợp với cấu trúc dẫn chất j1 3.1.3.2 Tổng hợp (2E,6E)-2-[(3-hydroxy-4-methoxyphenyl)methylen]-6-[(1,3diphenyl-1H-pyrazol-4-yl)methylen]cyclohexan-1-on (2E,6E)-2-[(3-Hydroxy-4-methoxyphenyl)methylen]-6-[(1,3-diphenyl-1H-pyrazol4-yl)methylen]cyclohexan-1-on (j2) CTPT: C30H26N2O3 - MW: 462,55 Sản phẩm j2 tổng hợp từ 1,3-diphenyl-1H-pyrazol-4-carbaldehyd (j) (124,1 mg; 0,50 mmol) (E)-2-[(3-hydroxy-4-methoxyphenyl)methylen]cyclohexan-1-on (2) (124,2 mg; 0,53 mmol) theo quy trình mục 2.2.2.3, tinh chế phương pháp kết tinh lại hỗn hợp dung môi EtOAc - EtOH (1 : 1) Hiệu suất: 203,8 mg; 88,1% Cảm quan: Chất rắn màu vàng nhạt; tan tốt aceton, DMSO DMF; tan Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 65 DCM, EtOAc THF; tan EtOH MeOH; không tan nước HPLC (tR, phút): 4,631 (Độ tinh khiết > 99,99%) (Phụ lục 3.2.6) MP (°C): 179,9-181,2 Phổ IR (ATR, n cm-1): 3231 (nO-H), 3057 (nC-Hthơm), 2930 (nC-Hkhông no), 2839 (nC-Hno), 1653 (nC=O), 1593 (nC=N), 1504 (nC=C) (Phụ lục 3.2.1) Phổ HR-MS (ESI, m/z): [M+H]+ tính tốn: 463,2023; tìm thấy: 463,2024 (C30H26N2O3) (Phụ lục 3.2.2) Phổ 1H-NMR (600 MHz, DMSO-d6, d ppm): 9,19 (s, 1H, O-H); 8,80 (s, 1H, H5a); 8,02 (dd, J = 0,9 8,7 Hz, 2H, H2c,6c); 7,63 (dd, J = 1,8 8,4 Hz, 2H, H2d,6d); 7,59 (s, 1H, H6a); 7,57-7,53 (m, 4H, H3c,5c,3d,5d); 7,51 (s, 1H, H7b); 7,49 (tt, J = 1,8 7,5 Hz, 1H, H4d); 7,38 (t, J = 7,5 Hz, 1H, H4c); 7,02 (s, 1H, H2b); 6,98 (s, 2H, H5b, H6b); 3,81 (s, 3H, H8b); 2,92 (t, J = 5,1 Hz, 2H, H5); 2,89 (t, J = 5,1 Hz, 2H, H3); 1,80 (quint, J = 5,7 Hz, 2H, H4) (Phụ lục 3.2.3) Phổ 13C-NMR (150 MHz, DMSO-d6, d ppm): 188,0; 153,6; 148,6; 146,3; 139,1; 136,0; 134,7; 133,9; 132,1; 129,5; 128,7; 128,6; 128,6; 128,6; 128,2; 126,9; 125,9; 122,9; 119,0; 117,2; 116,6; 112,0; 55,6; 28,0; 27,9; 22,1 (Phụ lục 3.2.4) Nhận xét: Các kiện thu cho thấy phù hợp với cấu trúc dẫn chất j2 3.1.3.3 Tổng hợp (2E,6E)-2-[(3,4,5-trimethoxyphenyl)methylen]-6-[(1,3-diphenyl1H-pyrazol-4-yl)methylen]cyclohexan-1-on Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 66 (2E,6E)-2-[(3,4,5-Trimethoxyphenyl)methylen]-6-[(1,3-diphenyl-1H-pyrazol-4yl)methylen]cyclohexan-1-on (j3) CTPT: C32H30N2O4 - MW: 506,60 Sản phẩm j3 tổng hợp từ 1,3-diphenyl-1H-pyrazol-4-carbaldehyd (j) (124,1 mg; 0,50 mmol) (E)-2-[(3,4,5-trimethoxyphenyl)methylen]cyclohexan-1-on (3) (145,5 mg; 0,53 mmol) theo quy trình mục 2.2.2.3, tinh chế phương pháp kết tinh lại hỗn hợp dung môi EtOAc - EtOH (1 : 1) Hiệu suất: 144,5 mg; 57,0% Cảm quan: Chất rắn màu vàng nhạt; tan tốt aceton, DMSO DMF; tan DCM, EtOAc THF; tan EtOH MeOH; không tan nước HPLC (tR, phút): 5,046 (Độ tinh khiết > 99,99%) (Phụ lục 3.3.6) MP (°C): 236,5-237,9 Phổ IR (ATR, n cm-1): 3069 (nC-Hthơm), 2936 (nC-Hkhông no), 2837 (nC-Hno), 1659 (nC=O), 1599 (nC=N), 1499 (nC=C) (Phụ lục 3.3.1) Phổ HR-MS (ESI, m/z): [M+H]+ tính tốn: 507,2285; tìm thấy: 507,2282 (C32H30N2O4) (Phụ lục 3.3.2) Phổ 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6, d ppm): 8,82 (s, 1H, H5a); 8,02 (dd, J = 1,0 8,5 Hz, 2H, H2c,6c); 7,63 (dd, J = 1,5 8,5 Hz, 2H, H2d,6d); 7,59 (s, 1H, H6a); 7,587,54 (m, 5H, H3c,5c,3d,5d,7b); 7,50 (tt, J = 2,0 7,5 Hz, 1H, H4d); 7,39 (t, J = 7,5 Hz, 1H, H4c); 6,83 (s, 2H, H2b,6b); 3,82 (s, 6H, H8b,10b); 3,71 (s, 3H, H9b); 2,97-2,92 (m, 4H, H3,5); 1,82 (quint, J = 6,0 Hz, 2H, H4) (Phụ lục 3.3.3) Phổ 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6, d ppm): 188,1; 153,7; 152,7; 139,1; 138,2; 135,7; 135,6; 134,6; 132,1; 130,9; 129,5; 128,7; 128,7; 128,6; 128,6; 127,0; 126,3; 119,0; 116,5; 108,0; 60,1; 56,0; 28,0; 27,6; 22,1 (Phụ lục 3.3.4) Nhận xét: Các kiện thu cho thấy phù hợp với cấu trúc dẫn chất j3 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 67 3.1.3.4 Tổng hợp (2E,6E)-2-[(4-hydroxy-3,5-dimethoxyphenyl)methylen]-6-[(1,3diphenyl-1H-pyrazol-4-yl)methylen]cyclohexan-1-on (2E,6E)-2-[(4-Hydroxy-3,5-dimethoxyphenyl)methylen]-6-[(1,3-diphenyl-1Hpyrazol-4-yl)methylen]cyclohexan-1-on (j4) CTPT: C31H28N2O4 - MW: 492,58 Sản phẩm j4 tổng hợp từ 1,3-diphenyl-1H-pyrazol-4-carbaldehyd (j) (124,1 mg; 0,50 mmol) (E)-2-[(4-hydroxy-3,5-dimethoxyphenyl)methylen]cyclohexan1-on (4) (138,5 mg; 0,53 mmol) theo quy trình mục 2.2.2.3, tinh chế phương pháp kết tinh lại hỗn hợp dung môi EtOAc - EtOH (1 : 1) Hiệu suất: 64,8 mg; 26,3% Cảm quan: Chất rắn màu vàng đậm; tan tốt aceton, DMSO DMF; tan DCM, EtOAc THF; tan EtOH MeOH; không tan nước HPLC (tR, phút): 4,578 (Độ tinh khiết > 99,99%) (Phụ lục 3.4.6) MP (°C): 239,7-241,1 Phổ IR (ATR, n cm-1): 3522 (nO-H), 2995 (nC-Hthơm), 2947 (nC-Hkhông no), 2841 (nC-Hno), 1655 (nC=O), 1597 (nC=N), 1508 (nC=C) (Phụ lục 3.4.1) Phổ HR-MS (ESI, m/z): [M+H]+ tính tốn: 493,2129; tìm thấy: 493,2141 (C31H28N2O4) (Phụ lục 3.4.2) Phổ 1H-NMR (600 MHz, DMSO-d6, d ppm): 8,91 (s, 1H, O-H); 8,81 (s, 1H, Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 68 H5a); 8,02 (d, J = 8,4 Hz, 2H, H2c,6c); 7,64 (d, J = 8,4 Hz, 2H, H2d,6d); 7,58-7,54 (m, 6H, H6a,7b,3c,5c,3d,5d); 7,50 (tt, J = 7,5 Hz, 1H, H4d); 7,39 (t, J = 7,2 Hz, 1H, H4c); 6,83 (s, 2H, H2b,6b); 3,81 (s, 6H, H8b,9b); 2,97 (t, J = 5,4 Hz, 2H, H5); 2,93 (t, J = 5,4 Hz, 2H, H3); 1,82 (quint, J = 5,7 Hz, 2H, H4) (Phụ lục 3.4.3) Phổ 13C-NMR (150 MHz, DMSO-d6, d ppm): 188,0; 153,6; 147,7; 139,1; 137,2; 136,7; 134,8; 133,7; 132,1; 129,5; 128,7; 128,6; 128,6; 128,6; 126,9; 125,8; 125,6; 119,0; 116,6; 108,6; 56,1; 28,0; 27,8; 22,2 (Phụ lục 3.4.4) Nhận xét: Các kiện thu cho thấy phù hợp với cấu trúc dẫn chất j4 3.1.3.5 Tổng hợp (2E,6E)-2-[[3-(4-fluorophenyl)-1-phenyl-1H-pyrazol-4-yl] methylen]-6-[(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)methylen]cyclohexan-1-on Sản phẩm k1 tổng hợp từ 3-(4-fluorophenyl)-1-phenyl-1H-pyrazol-4carbaldehyd (k) (133,1 mg; 0,50 mmol) (E)-2-[(4-hydroxy-3-methoxyphenyl) methylen]cyclohexan-1-on (1) (124,9 mg; 0,54 mmol) theo quy trình mục 2.2.2.3, tinh chế phương pháp kết tinh lại hỗn hợp EtOAc - EtOH (1 : 1) (2E,6E)-2-[[3-(4-Fluorophenyl)-1-phenyl-1H-pyrazol-4-yl]methylen]-6-[(4hydroxy-3-methoxyphenyl)methylen]cyclohexan-1-on (k1) CTPT: C30H25FN2O3 - MW: 480,54 Hiệu suất: 116,4 mg; 48,4% Cảm quan: Chất rắn màu vàng; tan tốt aceton, DMSO DMF; tan DCM, EtOAc THF; tan EtOH MeOH; không tan nước Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 69 HPLC (tR, phút): 4,611 (Độ tinh khiết > 99,99%) (Phụ lục 3.5.6) MP (°C): 164,9-166,6 Phổ IR (ATR, n cm-1): 3558 (nO-H), 2995 (nC-Hthơm), 2928 (nC-Hkhông no), 2872 (nC-Hno), 1655 (nC=O), 1591 (nC=N), 1518 (nC=C), 1263 (nC-F) (Phụ lục 3.5.1) Phổ HR-MS (ESI, m/z): [M+H]+ tính tốn: 481,1929; tìm thấy: 481,1938 (C30H25FN2O3) (Phụ lục 3.5.2) Phổ 1H-NMR (600 MHz, DMSO-d6, d ppm): 9,52 (s, 1H, O−H); 8,80 (s, 1H, H5a); 8,06 (d, J = 7,2 Hz, 2H, H2c,6c); 7,67 (dd, J = 5,4 8,4 Hz, 2H, H2d,6d); 7,58 (s, 1H, H7b); 7,55 (t, J = 7,2 Hz, 2H, H3c,5c); 7,54 (s, 1H, H6a); 7,39 (t, J = 8,7 Hz, 3H, H4c,3d,5d); 7,11 (d, J = 1,2 Hz, 1H, H2b); 7,03 (dd, J = 1,5 8,1 Hz, 1H, H6b); 6,86 (d, J = 8,4 Hz, 1H, H5b); 3,82 (s, 3H, H8b); 2,92-2,91 (m, 4H, H3,5); 1,80 (quint, J = 6,0 Hz, 2H, H4) (Phụ lục 3.5.3) Phổ 13C-NMR (150 MHz, DMSO-d6, d ppm): 187,9; 162,3 (d, 1JFC = 243,0 Hz); 152,6; 147,9; 147,4; 139,1; 136,5; 135,0; 133,3; 130,7; 130,6; 129,5; 128,6; 126,9; 126,8; 125,4; 124,3; 119,0; 116,4; 115,7 (d, 2JFC = 21,0 Hz); 115,5; 114,8; 55,6; 28,0; 27,8; 22,1 (Phụ lục 3.5.4) Nhận xét: Các kiện thu cho thấy phù hợp với cấu trúc dẫn chất k1 3.1.3.6 Tổng hợp (2E,6E)-2-[[3-(4-fluorophenyl)-1-phenyl-1H-pyrazol-4-yl] methylen]-6-[(3-hydroxy-4-methoxyphenyl)methylen]cyclohexan-1-on Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 70 (2E,6E)-2-[[3-(4-Fluorophenyl)-1-phenyl-1H-pyrazol-4-yl]methylen]-6-[(3hydroxy-4-methoxyphenyl)methylen]cyclohexan-1-on (k2) CTPT: C30H25FN2O3 - MW: 480,54 Sản phẩm k2 tổng hợp từ 3-(4-fluorophenyl)-1-phenyl-1H-pyrazol-4carbaldehyd (k) (133,1 mg; 0,50 mmol) (E)-2-[(3-hydroxy-4-methoxyphenyl) methylen]cyclohexan-1-on (2) (123,7 mg; 0,53 mmol) theo quy trình mục 2.2.2.3, tinh chế phương pháp kết tinh lại hỗn hợp EtOAc - EtOH (1 : 1) Hiệu suất: 137,7 mg; 57,3% Cảm quan: Chất rắn màu vàng nhạt; tan tốt aceton, DMSO DMF; tan DCM, EtOAc THF; tan EtOH MeOH; không tan nước HPLC (tR, phút): 4,603 (Độ tinh khiết > 99,99%) (Phụ lục 3.6.6) MP (°C): 194,7-195,9 Phổ IR (ATR, n cm-1): 3485 (nO-H), 3059 (nC-Hthơm), 2936 (nC-Hkhông no), 2841 (nC-Hno), 1651 (nC=O), 1589 (nC=N), 1504 (nC=C), 1261 (nC-F) (Phụ lục 3.6.1) Phổ HR-MS (ESI, m/z): [M+H]+ tính tốn: 481,1929; tìm thấy: 481,1936 (C30H25FN2O3) (Phụ lục 3.6.2) Phổ 1H-NMR (600 MHz, DMSO-d6, d ppm): 9,18 (s, 1H, O-H); 8,80 (s, 1H, H5a); 8,01 (dd, J = 0,9 8,7 Hz, 2H, H2c,6c); 7,67 (dd, J = 5,7 8,7 Hz, 2H, H2d,6d); 7,55 (tt, J = 1,5 6,8 Hz, 2H, H3c,5c); 7,54 (s, 1H, H6a); 7,51 (s, 1H, H7b); 7,39 (t, J = 8,1 Hz, 3H, H4c,3d,5d); 7,01 (s, 1H, H2b); 6,99 (s, 2H, H5b,6b); 3,81 (s, 3H, H8b); 2,922,88 (m, 4H, H3,5); 1,80 (quint, J = 6,1 Hz, 2H, H4) (Phụ lục 3.6.3) Phổ 13C-NMR (150 MHz, DMSO-d6, d ppm): 188,0 ; 162,3 (d, 1JFC = 246,0 Hz); 152,6; 148,6; 146,3; 139,1; 136,0; 134,9; 133,9; 130,7 (d, 3JFC = 9,0 Hz); 129,5; 128,7; 128,6 (d, 4JFC = 3,0 Hz); 128,2; 127,0; 125,6; 122,9; 119,0; 117,2; 116,5; 115,7 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 71 (d, 2JFC = 21,0 Hz); 112,0; 55,6; 28,0; 27,9; 22,1 (Phụ lục 3.6.4) Nhận xét: Các kiện thu cho thấy phù hợp với cấu trúc dẫn chất k2 3.1.3.7 Tổng hợp (2E,6E)-2-[[3-(4-fluorophenyl)-1-phenyl-1H-pyrazol-4-yl] methylen]-6-[(3,4,5-trimethoxyphenyl)methylen]cyclohexan-1-on (2E,6E)-2-[[3-(4-Fluorophenyl)-1-phenyl-1H-pyrazol-4-yl]methylen]-6-[(3,4,5trimethoxyphenyl)methylen]cyclohexan-1-on (k3) CTPT: C32H29FN2O4 - MW: 524,59 Sản phẩm k3 tổng hợp từ 3-(4-fluorophenyl)-1-phenyl-1H-pyrazol-4carbaldehyd (k) (133,1 mg; 0,50 mmol) (E)-2-[(3,4,5-trimethoxyphenyl) methylen]cyclohexan-1-on (3) (148,9 mg; 0,54 mmol) theo quy trình mục 2.2.2.3, tinh chế phương pháp kết tinh lại hỗn hợp EtOAc - EtOH (1 : 1) Hiệu suất: 125,0 mg; 47,7% Cảm quan: Chất rắn màu vàng nhạt; tan tốt aceton, DMSO DMF; tan DCM, EtOAc THF; tan EtOH MeOH; không tan nước HPLC (tR, phút): 5,009 (Độ tinh khiết > 99,99%) (Phụ lục 3.7.6) MP (°C): 175,8-176,6 Phổ IR (ATR, n cm-1): 3001 (nC-Hthơm), 2937 (nC-Hkhông no), 2839 (nC-Hno), 1659 (nC=O), 1599 (nC=N), 1501 (nC=C), 1233 (nC-F) (Phụ lục 3.7.1) Phổ HR-MS (ESI, m/z): [M+H]+ tính tốn: 525,2191; tìm thấy: 525,2194 Tn thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 72 (C32H29FN2O4) (Phụ lục 3.7.2) Phổ 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6, d ppm): 8,80 (s, 1H, H5a); 8,00 (d, J = 7,5 Hz, 2H, H2c,6c); 7,66 (dd, J = 5,5 8,5 Hz, 2H, H2d,6d); 7,59 (s, 1H, H7b); 7,57-7,53 (m, 3H, H6a,3c,5c); 7,38 (t, J = 8,5 Hz, 3H, H4c,3d,5d); 6,82 (s, 2H, H2b,6b); 3,82 (s, 6H, H8b,10b); 3,71 (s, 3H, H9b); 2,95-2,90 (m, 4H, H3,5); 1,80 (quint, J = 5,5 Hz, 2H, H4) (Phụ lục 3.7.3) Phổ 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6, d ppm): 188,0 ; 162,3 (d, 1JFC = 245,0 Hz); 152,7; 139,0; 138,2; 135,8; 135,6; 134,7; 130,9; 130,7 (d, 3JFC = 8,8 Hz); 129,5; 128,7; 128,6 (d, 4JFC = 3,8 Hz); 127,0; 126,0; 119,0; 116,4; 115,7 (d, 2JFC = 21,3 Hz); 108,0; 60,1; 56,0; 28,0; 27,6; 22,1 (Phụ lục 3.7.4) Nhận xét: Các kiện thu cho thấy phù hợp với cấu trúc dẫn chất k3 3.1.3.8 Tổng hợp (2E,6E)-2-[[3-(4-fluorophenyl)-1-phenyl-1H-pyrazol-4-yl] methylen]-6-[(4-hydroxy-3,5-dimethoxyphenyl)methylen]cyclohexan-1-on (2E,6E)-2-[[3-(4-Fluorophenyl)-1-phenyl-1H-pyrazol-4-yl]methylen]-6-[(4hydroxy-3,5-dimethoxyphenyl)methylen]cyclohexan-1-on (k4) CTPT: C31H27FN2O4 - MW: 510,57 Sản phẩm k4 tổng hợp từ 3-(4-fluorophenyl)-1-phenyl-1H-pyrazol-4carbaldehyd (k) (133,1 mg; 0,50 mmol) (E)-2-[(4-hydroxy-3,5-dimethoxyphenyl) methylen]cyclohexan-1-on (4) (144,2 mg; 0,55 mmol) theo quy trình mục 2.2.2.3, tinh chế phương pháp CC, rửa giải gradient hỗn hợp dung môi n-hexan EtOAc (8 : ® : 1) Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 73 Hiệu suất: 62,9 mg; 24,6% Cảm quan: Chất rắn màu vàng đậm; tan tốt aceton, DMSO DMF; tan DCM, EtOAc, THF, EtOH MeOH; tan nước HPLC (tR, phút): 4,568 (Độ tinh khiết > 99,99%) (Phụ lục 3.8.6) MP (°C): 166,1-167,3 Phổ IR (ATR, n cm-1): 3148 (nO-H), 2990 (nC-Hthơm), 2934 (nC-Hkhông no), 2833 (nC-Hno), 1663 (nC=O), 1595 (nC=N), 1514 (nC=C), 1223 (nC-F) (Phụ lục 3.8.1) Phổ HR-MS (ESI, m/z): [M+H]+ tính tốn: 511,2034; tìm thấy: 511,2040 (C31H27FN2O4) (Phụ lục 3.8.2) Phổ 1H-NMR (600 MHz, DMSO-d6, d ppm): 8,91 (s, 1H, O-H); 8,81 (s, 1H, H5a); 8,01 (dd, J = 0,9 8,7 Hz, 2H, H2c,6c); 7,67 (dd, J = 5,4 9,0 Hz, 2H, H2d,6d); 7,59 (s, 1H, H7b); 7,56 (t, J = 8,1 Hz, 2H, H3c,5c); 7,54 (s, 1H, H6a); 7,39 (t, J = 8,7 Hz, 3H, H4c,3d,5d); 6,83 (s, 2H, H2b,6b); 3,81 (s, 6H, H8b,9b); 2,96 (t, J = 5,4 Hz, 2H, H3); 2,92 (t, J = 5,4 Hz, 2H, H5); 1,81 (quint, J = 5,7 Hz, 2H, H4) (Phụ lục 3.8.3) Phổ 13C-NMR (150 MHz, DMSO-d6, d ppm): 187,9 ; 162,3 (d, 1JFC = 244,5 Hz); 152,6; 147,7; 139,1; 137,2; 136,8; 135,0; 133,6; 130,7 (d, 3JFC = 7,5 Hz); 129,5; 128,6; 127,0; 125,6; 125,5; 119,0; 116,5; 115,7 (d, 2JFC = 22,5 Hz); 108,6; 56,1; 28,0; 27,8; 22,1 (Phụ lục 3.8.4) Nhận xét: Các kiện thu cho thấy phù hợp với cấu trúc dẫn chất k4 3.1.3.9 Tổng hợp (2E,6E)-2-[(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)methylen]-6-[[3-(4methoxyphenyl)-1-phenyl-1H-pyrazol-4-yl]methylen]cyclohexan-1-on Sản phẩm l1 tổng hợp từ 3-(4-methoxyphenyl)-1-phenyl-1H-pyrazol-4carbaldehyd (l) (139,1 mg; 0,50 mmol) (E)-2-[(4-hydroxy-3-methoxyphenyl) methylen]cyclohexan-1-on (1) (124,9 mg; 0,54 mmol) theo quy trình mục 2.2.2.3, tinh chế phương pháp kết tinh lại hỗn hợp EtOAc - EtOH (1 : 1) Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 74 (2E,6E)-2-[(4-Hydroxy-3-methoxyphenyl)methylen]-6-[[3-(4-methoxyphenyl)-1phenyl-1H-pyrazol-4-yl]methylen]cyclohexan-1-on (l1) CTPT: C31H28N2O4 - MW: 492,58 Hiệu suất: 87,5 mg; 35,5% Cảm quan: Chất rắn màu vàng; tan tốt aceton, DMSO DMF; tan DCM, EtOAc THF; tan EtOH MeOH; không tan nước HPLC (tR, phút): 4,569 (Độ tinh khiết > 99,99%) (Phụ lục 3.9.6) MP (°C): 179,3-180,5 Phổ IR (ATR, n cm-1): 3246 (nO-H), 3049 (nC-Hthơm), 2943 (nC-Hkhông no), 2837 (nC-Hno), 1651 (nC=O), 1589 (nC=N), 1502 (nC=C) (Phụ lục 3.9.1) Phổ HR-MS (ESI, m/z): [M+H]+ tính tốn: 493,2129; tìm thấy: 493,2139 (C31H28N2O4) (Phụ lục 3.9.2) Phổ 1H-NMR (600 MHz, DMSO-d6, d ppm): 9,51 (s, 1H, O−H); 8,77 (s, 1H, H5a); 8,00 (d, J = 7,8 Hz, 2H, H2c,6c); 7,57-7,54 (m, 6H, H6a,7b,3c,5c,2d,6d); 7,38 (t, J = 7,2 Hz, 1H, H4c); 7,11 (d, J = 8,4 Hz, 2H, H3d,5d); 7,11 (d, J = 1,8 Hz, 1H, H2b); 7,03 (d, J = 8,4 Hz, 1H, H6b); 6,86 (d, J = 7,8 Hz, 1H, H5b); 3,84 (s, 3H, H7d); 3,82 (s, 3H, H8b); 2,92 (mc, 4H, H3,5); 1,81 (quint, J = 5,1 Hz, 2H, H4) (Phụ lục 3.9.3) Phổ 13C-NMR (150 MHz, DMSO-d6, d ppm): 187,9; 159,6; 153,5; 147,9; 147,4; 139,1; 136,3; 134,5; 133,4; 129,9; 129,5; 128,4; 126,8; 126,8; 126,0; 124,5; 124,3; 118,9; 116,4; 115,5; 114,7; 114,2; 55,7; 55,2; 28,0; 27,8; 22,1 (Phụ lục 3.9.4) Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 75 Nhận xét: Các kiện thu cho thấy phù hợp với cấu trúc dẫn chất l1 3.1.3.10 Tổng hợp (2E,6E)-2-[(3-hydroxy-4-methoxyphenyl)methylen]-6-[[3-(4methoxyphenyl)-1-phenyl-1H-pyrazol-4-yl]methylen]cyclohexan-1-on Sản phẩm l2 tổng hợp từ 3-(4-methoxyphenyl)-1-phenyl-1H-pyrazol-4carbaldehyd (l) (139,1 mg; 0,50 mmol) (E)-2-[(3-hydroxy-4-methoxyphenyl) methylen]cyclohexan-1-on (2) (125,2 mg; 0,54 mmol) theo quy trình mục 2.2.2.3, tinh chế phương pháp kết tinh lại hỗn hợp EtOAc - EtOH (1 : 1) (2E,6E)-2-[(3-Hydroxy-4-methoxyphenyl)methylen]-6-[[3-(4-methoxyphenyl)-1phenyl-1H-pyrazol-4-yl]methylen]cyclohexan-1-on (l2) CTPT: C31H28N2O4 - MW: 492,58 Hiệu suất: 98,7 mg; 40,1% Cảm quan: Chất rắn màu vàng nhạt; tan tốt aceton, DMSO DMF; tan DCM, EtOAc THF; tan EtOH MeOH; không tan nước HPLC (tR, phút): 4,553 (Độ tinh khiết > 99,99%) (Phụ lục 3.10.6) MP (°C): 156,3-157,8 Phổ IR (ATR, n cm-1): 3228 (nO-H), 3063 (nC-Hthơm), 2941 (nC-Hkhông no), 2831 (nC-Hno), 1645 (nC=O), 1582 (nC=N), 1503 (nC=C) (Phụ lục 3.10.1) Phổ HR-MS (ESI, m/z): [M+H]+ tính tốn: 493,2129; tìm thấy: 493,2141 (C31H28N2O4) (Phụ lục 3.10.2) Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 76 Phổ 1H-NMR (600 MHz, DMSO-d6, d ppm): 9,18 (s, 1H, O-H); 8,78 (s, 1H, H5a); 8,00 (dd, J = 0,9 8,7 Hz, 2H, H2c,6c); 7,57 (s, 1H, H6a); 7,56 (d, J = 9,0 Hz, 2H, H2d,6d); 7,55 (t, J = 8,4 Hz, 2H, H3c,5c); 7,50 (s, 1H, H7b); 7,38 (tt, J = 1,2 7,5 Hz, 1H, H4c); 7,11 (d, J = 9,0 Hz, 2H, H3d,5d); 7,01 (s, 1H, H2b); 6,99 (s, 2H, H5b,6b); 3,84 (s, 3H, H7d); 3,81 (s, 3H, H8b); 2,93-2,88 (m, 4H, H3,5); 1,80 (quint, J = 5,7 Hz, 2H, H4) (Phụ lục 3.10.3) Phổ 13C-NMR (150 MHz, DMSO-d6, d ppm): 188,0; 159,6; 153,5; 148,6; 146,3; 139,1; 135,9; 134,5; 134,0; 129,9; 129,5; 128,4; 128,2; 126,8; 126,1; 124,4; 122,9; 118,9; 117,2; 116,4; 114,2; 112,0; 55,6; 55,2; 28,0; 27,9; 22,1 (Phụ lục 3.10.4) Nhận xét: Các kiện thu cho thấy phù hợp với cấu trúc dẫn chất l2 3.1.3.11 Tổng hợp (2E,6E)-2-[(3,4,5-trimethoxyphenyl)methylen]-6-[[3-(4- methoxyphenyl)-1-phenyl-1H-pyrazol-4-yl]methylen]cyclohexan-1-on (2E,6E)-2-[(3,4,5-Trimethoxyphenyl)methylen]-6-[[3-(4-methoxyphenyl)-1-phenyl1H-pyrazol-4-yl]methylen]cyclohexan-1-on (l3) CTPT: C33H32N2O5 - MW: 536,63 Sản phẩm l3 tổng hợp từ 3-(4-methoxyphenyl)-1-phenyl-1H-pyrazol-4carbaldehyd (l) (139,1 mg; 0,50 mmol) (E)-2-[(3,4,5-trimethoxyphenyl) methylen] cyclohexan-1-on (3) (149,8 mg; 0,54 mmol) theo quy trình mục 2.2.2.3, tinh chế phương pháp kết tinh lại hỗn hợp dung môi EtOAc - EtOH (1 : 1) Hiệu suất: 92,7 mg; 34,5% Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 77 Cảm quan: Chất rắn màu vàng nhạt; tan tốt aceton, DMSO DMF; tan DCM, EtOAc THF; tan EtOH MeOH; không tan nước HPLC (tR, phút): 4,961 (Độ tinh khiết > 99,99%) (Phụ lục 3.11.6) MP (°C): 167,3-168,9 Phổ IR (ATR, n cm-1): 3009 (nC-Hthơm), 2940 (nC-Hkhông no), 2837 (nC-Hno), 1657 (nC=O), 1597 (nC=N), 1503 (nC=C) (Phụ lục 3.11.1) Phổ HR-MS (ESI, m/z): [M+H]+ tính tốn: 537,2391; tìm thấy: 537,2393 (C33H32N2O5) (Phụ lục 3.11.2) Phổ 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6, d ppm): 8,78 (s, 1H, H5a); 8,00 (dd, J = 1,0 8,3 Hz, 2H, H2c,6c); 7,59 (s, 1H, H6a); 7,58 (s, 1H, H7b); 7,56 (d, J = 8,5 Hz, 2H, H2d,6d); 7,55 (t, J = 7,5 Hz, 2H, H3c,5c); 7,38 (t, J = 7,3 Hz, 1H, H4c); 7,11 (d, J = 9,0 Hz, 2H, H3d,5d); 6,83 (s, 2H, H2b,6b); 3,84 (s, 3H, H7d); 3,82 (s, 6H, H8b,10b); 3,71 (s, 3H, H9b); 2,97-2,91 (m, 4H, H3,5); 1,81 (quint, J = 5,5 Hz, 2H, H4) (Phụ lục 3.11.3) Phổ 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6, d ppm): 188,1; 159,6; 153,6; 152,7; 139,1; 138,2; 135,7; 135,7; 134,3; 130,9; 129,9; 129,5; 128,5; 126,8; 126,5; 124,4; 118,9; 116,3; 114,2; 107,9; 60,1; 56,0; 55,2; 28,0; 27,7; 22,1 (Phụ lục 3.11.4) Nhận xét: Các kiện thu cho thấy phù hợp với cấu trúc dẫn chất l3 3.1.3.12 Tổng hợp (2E,6E)-2-[(4-hydroxy-3,5-dimethoxyphenyl)methylen]-6-[[3(4-methoxyphenyl)-1-phenyl-1H-pyrazol-4-yl]methylen]cyclohexan-1-on Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 78 (2E,6E)-2-[(4-Hydroxy-3,5-dimethoxyphenyl)methylen]-6-[[3-(4-methoxyphenyl)1-phenyl-1H-pyrazol-4-yl]methylen]cyclohexan-1-on (l4) CTPT: C32H30N2O5 - MW: 522,60 Sản phẩm l4 tổng hợp từ 3-(4-methoxyphenyl)-1-phenyl-1H-pyrazol-4carbaldehyd (l) (139,1 mg; 0,50 mmol) (E)-2-[(4-hydroxy-3,5-dimethoxyphenyl) methylen]cyclohexan-1-on (4) (139,5 mg; 0,53 mmol) theo quy trình mục 2.2.2.3, tinh chế phương pháp CC, rửa giải gradient hỗn hợp dung mơi n-hexan EtOAc (8 : ® : 1) Hiệu suất: 64,2 mg; 24,6% Cảm quan: Chất rắn màu vàng đậm; tan tốt aceton, DMSO DMF; tan DCM, EtOAc, THF, EtOH MeOH; tan nước HPLC (tR, phút): 4,527 (Độ tinh khiết > 99,99%) (Phụ lục 3.12.6) MP (°C): 159,1-160,3 Phổ IR (ATR, n cm-1): 3385 (nO-H), 2999 (nC-Hthơm), 2934 (nC-Hkhông no), 2835 (nC-Hno), 1659 (nC=O), 1593 (nC=N), 1503 (nC=C) (Phụ lục 3.12.1) Phổ HR-MS (ESI, m/z): [M+H]+ tính tốn: 523,2234; tìm thấy: 523,2236 (C32H30N2O5) (Phụ lục 3.12.2) Phổ 1H-NMR (600 MHz, DMSO-d6, d ppm): 8,90 (s, 1H, O−H); 8,78 (s, 1H, H5a); 8,00 (dd, J = 0,9 7,8 Hz, 2H, H2c,6c); 7,58-7,54 (m, 4H, H6a,7b,3c,5c); 7,56 (d, J = 8,4 Hz, 2H, H2d,6d); 7,38 (t, J = 7,2 Hz, 1H, H4c); 7,11 (d, J = 8,4 Hz, 2H, H3d,5d); 6,83 (s, 2H, H2b,6b); 3,84 (s, 3H, H7d); 3,81 (s, 6H, H8b,9b); 2,97 (t, J = 5,4 Hz, 2H, H3); 2,92 (t, J = 5,4 Hz, 2H, H5); 1,82 (quint, J = 5,7 Hz, 2H, H4) (Phụ lục 3.12.3) Phổ 13C-NMR (150 MHz, DMSO-d6, d ppm): 187,9; 159,6; 153,5; 147,7; 139,1; 137,1; 136,6; 134,5; 133,7; 129,9; 129,5; 128,4; 126,8; 126,0; 125,6; 124,5; 118,9; 116,4; 114,2; 108,6; 56,1; 55,2; 28,0; 27,8; 22,2 (Phụ lục 3.12.4) Nhận xét: Các kiện thu cho thấy phù hợp với cấu trúc dẫn chất l4 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 79 3.1.3.13 Tổng hợp (2E,6E)-2-[(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)methylen]-6-[[1-(4methoxyphenyl)-3-phenyl-1H-pyrazol-4-yl]methylen]cyclohexan-1-on Sản phẩm m1 tổng hợp từ 1-(4-methoxyphenyl)-3-phenyl-1H-pyrazol-4carbaldehyd (m) (139,1 mg; 0,50 mmol) (E)-2-[(4-hydroxy-3-methoxyphenyl) methylen]cyclohexan-1-on (1) (125,3 mg; 0,54 mmol) theo quy trình mục 2.2.2.3, tinh chế phương pháp CC, rửa giải gradient hỗn hợp dung môi n-hexan EtOAc (8 : ® : 1) (2E,6E)-2-[(4-Hydroxy-3-methoxyphenyl)methylen]-6-[[1-(4-methoxyphenyl)-3phenyl-1H-pyrazol-4-yl]methylen]cyclohexan-1-on (m1) CTPT: C31H28N2O4 - MW: 492,58 Hiệu suất: 111,0 mg; 45,1% Cảm quan: Chất rắn màu vàng; tan tốt aceton, DMSO DMF; tan DCM, EtOAc, THF, EtOH MeOH; tan nước HPLC (tR, phút): 4,528 (Độ tinh khiết > 99,99%) (Phụ lục 3.13.6) MP (°C): 249,7-251,3 Phổ IR (ATR, n cm-1): 3537 (nO-H), 3062 (nC-Hthơm), 2931 (nC-Hkhông no), 2835 (nC-Hno), 1661 (nC=O), 1585 (nC=N), 1510 (nC=C) (Phụ lục 3.13.1) Phổ HR-MS (ESI, m/z): [M+H]+ tính tốn: 493,2129; tìm thấy: 493,2136 (C31H28N2O4) (Phụ lục 3.13.2) Phổ 1H-NMR (600 MHz, DMSO-d6, d ppm): 9,51 (s, 1H, O−H); 8,71 (s, 1H, Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 80 H5a); 7,92 (d, J = 9,0 Hz, 2H, H2c,6c); 7,62 (dd, J = 1,5 8,1 Hz, 2H, H2d,6d); 7,58 (s, 1H, H6a); 7,57 (s, 1H, H7b); 7,54 (t, J = 7,5 Hz, 2H, H3d,5d); 7,49 (tt, J = 1,8 7,8 Hz, 1H, H4d); 7,11 (d, J = 2,4 Hz, 1H, H2b); 7,10 (d, J = 9,0 Hz, 2H, H3c,5c); 7,03 (dd, J = 1,5 Hz 8,1 Hz, 1H, H6b); 6,85 (d, J = 8,4 Hz, 1H, H5b); 3,83 (s, 3H, H7c); 3,81 (s, 3H, H8b); 2,93-2,90 (m, 4H, H3,5); 1,81 (quint, J = 5,7 Hz, 2H, H4) (Phụ lục 3.13.3) Phổ 13C-NMR (150 MHz, DMSO-d6, d ppm): 187,9; 158,1; 153,2; 147,8; 147,4; 136,3; 134,4; 133,4; 132,7; 132,2; 129,2; 128,7; 128,6; 128,4; 126,8; 125,9; 124,2; 120,6; 116,2; 115,5; 114,7; 114,6; 55,6; 55,5; 28,0; 27,8; 22,1 (Phụ lục 3.13.4) Nhận xét: Các kiện thu cho thấy phù hợp với cấu trúc dẫn chất m1 3.1.3.14 Tổng hợp (2E,6E)-2-[(3-hydroxy-4-methoxyphenyl)methylen]-6-[[1-(4methoxyphenyl)-3-phenyl-1H-pyrazol-4-yl]methylen]cyclohexan-1-on (2E,6E)-2-[(3-Hydroxy-4-methoxyphenyl)methylen]-6-[[1-(4-methoxyphenyl)-3phenyl-1H-pyrazol-4-yl]methylen]cyclohexan-1-on (m2) CTPT: C31H28N2O4 - MW: 492,58 Sản phẩm m2 tổng hợp từ 1-(4-methoxyphenyl)-3-phenyl-1H-pyrazol-4carbaldehyd (m) (139,1 mg; 0,50 mmol) (E)-2-[(3-hydroxy-4-methoxyphenyl) methylen]cyclohexan-1-on (2) (126,6 mg; 0,55 mmol) theo quy trình mục 2.2.2.3, tinh chế phương pháp kết tinh lại hỗn hợp EtOAc - EtOH (1 : 1) Hiệu suất: 177,4 mg; 72,0% Cảm quan: Chất rắn màu vàng nhạt; tan tốt aceton, DMSO DMF; tan Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 81 DCM, EtOAc THF; tan EtOH MeOH; không tan nước HPLC (tR, phút): 4,509 (Độ tinh khiết > 99,99%) (Phụ lục 3.14.6) MP (°C): 229,0-230,3 Phổ IR (ATR, n cm-1): 3422 (nO-H), 3067 (nC-Hthơm), 2951 (nC-Hkhông no), 2833 (nC-Hno), 1659 (nC=O), 1604 (nC=N), 1514 (nC=C) (Phụ lục 3.14.1) Phổ HR-MS (ESI, m/z): [M+H]+ tính tốn: 493,2129; tìm thấy: 493,2137 (C31H28N2O4) (Phụ lục 3.14.2) Phổ 1H-NMR (600 MHz, DMSO-d6, d ppm): 9,18 (s, 1H, O-H); 8,70 (s, 1H, H5a); 7,92 (d, J = 9,0 Hz, 2H, H2c,6c); 7,61 (dd, J = 1,5 8,1 Hz, 2H, H2d,6d); 7,58 (t, J = 1,8 Hz, 1H, H6a); 7,54 (tt, J = 1,4 7,5 Hz, 2H, H3d,5d); 7,53 (s, 1H, H7b); 7,48 (tt, J = 2,4 7,2 Hz, 1H, H4d); 7,10 (d, J = 9,0 Hz, 2H, H3c,5c); 7,01 (s, 1H, H2b); 6,98 (s, 2H, H5b,6b); 3,82 (s, 3H, H7c); 3,81 (s, 3H, H8b); 2,92-2,88 (m, 4H, H3,5); 1,80 (quint, J = 5,7 Hz, 2H, H4) (Phụ lục 3.14.3) Phổ 13C-NMR (150 MHz, DMSO-d6, d ppm): 188,0; 158,2; 153,3; 148,6; 146,3; 135,9; 134,3; 134,0; 132,7; 132,2; 128,7; 128,6; 128,4; 128,4; 128,2; 126,1; 122,9; 120,6; 117,2; 116,2; 114,6; 112,0; 55,6; 55,5; 28,0; 27,9; 22,1 (Phụ lục 3.14.4) Nhận xét: Các kiện thu cho thấy phù hợp với cấu trúc dẫn chất m2 3.1.3.15 Tổng hợp (2E,6E)-2-[(3,4,5-trimethoxyphenyl)methylen]-6-[[1-(4- methoxyphenyl)-3-phenyl-1H-pyrazol-4-yl]methylen]cyclohexan-1-on Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 82 (2E,6E)-2-[(3,4,5-Trimethoxyphenyl)methylen]-6-[[1-(4-methoxyphenyl)-3-phenyl1H-pyrazol-4-yl]methylen]cyclohexan-1-on CTPT: C33H32N2O5 - MW: 536,63 Sản phẩm m3 tổng hợp từ 1-(4-methoxyphenyl)-3-phenyl-1H-pyrazol-4carbaldehyd (m) (139,1 mg; 0,50 mmol) (E)-2-[(3,4,5-trimethoxyphenyl) methylen]cyclohexan-1-on (3) (147,3 mg; 0,53 mmol) theo quy trình mục 2.2.2.3, tinh chế phương pháp kết tinh lại hỗn hợp EtOAc - EtOH (1 : 1) Hiệu suất: 150,7 mg; 56,2% Cảm quan: Chất rắn màu vàng nhạt; tan tốt aceton, DMSO DMF; tan DCM, EtOAc THF; tan EtOH MeOH; không tan nước HPLC (tR, phút): 4,906 (Độ tinh khiết > 99,99%) (Phụ lục 3.15.6) MP (°C): 177,8-179,3 Phổ IR (ATR, n cm-1): 2997 (nC-Hthơm), 2940 (nC-Hkhông no), 2837 (nC-Hno), 1659 (nC=O), 1605 (nC=N), 1514 (nC=C) (Phụ lục 3.15.1) Phổ HR-MS (ESI, m/z): [M+H]+ tính tốn: 537,2391; tìm thấy: 537,2395 (C33H32N2O5) (Phụ lục 3.15.2) Phổ 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6, d ppm): 8,70 (s, 1H, H5a); 7,91 (d, J = 9,0 Hz, 2H, H2c,6c); 7,62 (dd, J = 1,5 8,3 Hz, 2H, H2d,6d); 7,58 (s, 1H, H6a); 7,54 (tt, J = 1,5 7,5 Hz, 2H, H3d,5d); 7,54 (s, 1H, H7b); 7,48 (tt, J = 1,3 7,0 Hz, 1H, H4d); 7,09 (d, J = 9,5 Hz, 2H, H3c,5c); 6,82 (s, 2H, H2b,6b); 3,82 (s, 3H, H7c); 3,82 (s, 6H, H8b,10b); 3,71 (s, 3H, H9b); 2,95-2,90 (m, 4H, H3,5); 1,81 (quint, J = 5,5 Hz, 2H, H4) (Phụ lục 3.15.3) Phổ 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6, d ppm): 188,0; 158,2; 153,3; 152,7; 138,2; 135,7; 135,6; 134,1; 132,7; 132,2; 130,9; 128,7; 128,6; 128,4; 128,4; 126,5; 120,6; 116,1; 114,5; 107,9; 60,1; 55,9; 55,4; 28,0; 27,6; 22,1 (Phụ lục 3.15.4) Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 83 Nhận xét: Các kiện thu cho thấy phù hợp với cấu trúc dẫn chất m3 3.1.3.16 Tổng hợp (2E,6E)-2-[(4-hydroxy-3,5-dimethoxyphenyl)methylen]-6-[[1(4-methoxyphenyl)-3-phenyl-1H-pyrazol-4-yl]methylen]cyclohexan-1-on Sản phẩm m4 tổng hợp từ 1-(4-methoxyphenyl)-3-phenyl-1H-pyrazol-4carbaldehyd (m) (139,1 mg; 0,50 mmol) (E)-2-[(4-hydroxy-3,5-dimethoxyphenyl) methylen]cyclohexan-1-on (4) (143,7 mg; 0,55 mmol) theo quy trình mục 2.2.2.3, tinh chế phương pháp kết tinh lại hỗn hợp EtOAc - EtOH (1 : 1) (2E,6E)-2-[(4-Hydroxy-3,5-dimethoxyphenyl)methylen]-6-[[1-(4-methoxyphenyl)3-phenyl-1H-pyrazol-4-yl]methylen]cyclohexan-1-on (m4) CTPT: C32H30N2O5 - MW: 522,60 Hiệu suất: 52,4 mg; 20,1% Cảm quan: Chất rắn màu vàng đậm; tan tốt aceton, DMSO DMF; tan DCM, EtOAc THF; tan EtOH MeOH; không tan nước HPLC (tR, phút): 4,468 (Độ tinh khiết > 99,99%) (Phụ lục 3.16.6) MP (°C): 208,3-209,5 Phổ IR (ATR, n cm-1): 3482 (nO-H), 3011 (nC-Hthơm), 2930 (nC-Hkhông no), 2833 (nC-Hno), 1663 (nC=O), 1603 (nC=N), 1510 (nC=C) (Phụ lục 3.16.1) Phổ HR-MS (ESI, m/z): [M+H]+ tính tốn: 523,2234; tìm thấy: 523,2244 (C32H30N2O5) (Phụ lục 3.16.2) Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 84 Phổ 1H-NMR (600 MHz, DMSO-d6, d ppm): 8,90 (s, 1H, O-H); 8,71 (s, 1H, H5a); 7,92 (d, J = 9,0 Hz, 2H, H2c,6c); 7,62 (dd, J = 0,9 8,1 Hz, 2H, H2d,6d); 7,58 (s, 1H, H6a); 7,57 (s, 1H, H7b); 7,54 (tt, J = 1,5 7,5 Hz, 2H, H3d,5d); 7,49 (tt, J = 1,5 7,2 Hz, 1H, H4d); 7,10 (d, J = 9,0 Hz, 2H, H3c,5c); 6,83 (s, 2H, H2b,6b); 3,83 (s, 3H, H7c); 3,81 (s, 6H, H8b,9b); 2,96 (t, J = 5,4 Hz, 2H, H3); 2,91 (t, J = 5,4 Hz, 2H, H5); 1,81 (quint, J = 5,7 Hz, 2H, H4) (Phụ lục 3.16.3) Phổ 13C-NMR (150 MHz, DMSO-d6, d ppm): 188,0; 158,2; 153,3; 147,7; 137,1; 136,6; 134,4; 133,7; 132,7; 132,3; 128,7; 128,6; 128,4; 128,4; 126,0; 125,7; 120,6; 116,2; 114,6; 108,6; 56,1; 55,5; 28,0; 27,8; 22,2 (Phụ lục 3.16.4) Nhận xét: Các kiện thu cho thấy phù hợp với cấu trúc dẫn chất m4 3.1.3.17 Tổng hợp (2E,6E)-2-[[3-(4-fluorophenyl)-1-(4-methoxyphenyl)-1Hpyrazol-4-yl]methylen]-6-[(3-hydroxy-4-methoxyphenyl)methylen]cyclohexan-1on (2E,6E)-2-[[3-(4-Fluorophenyl)-1-(4-methoxyphenyl)-1H-pyrazol-4-yl]methylen]6-[(3-hydroxy-4-methoxyphenyl)methylen]cyclohexan-1-on (n2) CTPT: C31H27FN2O4 - MW: 510,57 Sản phẩm n2 tổng hợp từ 3-(4-fluorophenyl)-1-(4-methoxyphenyl)-1Hpyrazol-4-carbaldehyd (n) (148,2 mg; 0,50 mmol) (E)-2-[(3-hydroxy-4methoxyphenyl)methylen]cyclohexan-1-on (2) (125,3 mg; 0,54 mmol) theo quy trình mục 2.2.2.3, tinh chế kết tinh lại hỗn hợp EtOAc - EtOH (1 : 1) Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 85 Hiệu suất: 154,8 mg; 60,6% Cảm quan: Chất rắn màu vàng; tan tốt aceton, DMSO DMF; tan DCM, EtOAc THF; tan EtOH MeOH; không tan nước HPLC (tR, phút): 4,499 (Độ tinh khiết 99,84%) (Phụ lục 3.17.6) MP (°C): 218,3-219,6 Phổ IR (ATR, n cm-1): 3244 (nO-H), 3005 (nC-Hthơm), 2928 (nC-Hkhông no), 2832 (nC-Hno), 1647 (nC=O), 1578 (nC=N), 1510 (nC=C), 1256 (nC-F) (Phụ lục 3.17.1) Phổ HR-MS (ESI, m/z): [M+H]+ tính tốn: 511,2034; tìm thấy: 511,2038 (C31H27FN2O4) (Phụ lục 3.17.2) Phổ 1H-NMR (600 MHz, DMSO-d6, d ppm): 9,18 (s, 1H, O-H); 8,70 (s, 1H, H5a); 7,91 (d, J = 9,0 Hz, 2H, H2c,6c); 7,65 (dd, J = 5,4 8,4 Hz, 2H, H2d,6d); 7,54 (s, 1H, H6a); 7,50 (s, 1H, H7b); 7,38 (t, J = 9,0 Hz, 2H, H3d,5d); 7,10 (d, J = 9,0 Hz, 2H, H3c,5c); 7,01 (s, 1H, H2b); 6,99 (s, 2H, H5b,6b); 3,82 (s, 3H, H7c); 3,81 (s, 3H, H8b); 2,91-2,88 (m, 4H, H3,5); 1,80 (quint, J = 5,7 Hz, 2H, H4) (Phụ lục 3.17.3) Phổ 13C-NMR (150 MHz, DMSO-d6, d ppm): 187,9; 162,3 (d, 1JFC = 244,5 Hz); 158,2; 152,3; 148,6; 146,3; 135,9; 134,5; 133,9; 132,7; 130,7 (d, 3JFC = 9,0 Hz); 128,7 (d, 4JFC = 2,5 Hz); 128,4; 128,2; 125,8; 122,9; 120,6; 117,2; 116,1; 115,7 (d, 2JFC = 21,0 Hz); 114,6; 112,0; 55,6; 55,5; 28,0; 27,9; 22,1 (Phụ lục 3.17.4) Nhận xét: Các kiện thu cho thấy phù hợp với cấu trúc dẫn chất n2 3.1.3.18 Tổng hợp (2E,6E)-2-[[3-(4-fluorophenyl)-1-(4-methoxyphenyl)-1Hpyrazol-4-yl]methylen]-6-[(3,4,5-trimethoxyphenyl)methylen]cyclohexan-1-on Sản phẩm n3 tổng hợp từ 3-(4-fluorophenyl)-1-(4-methoxyphenyl)-1Hpyrazol-4-carbaldehyd (n) (148,2 mg; 0,50 mmol) (E)-2-[(3,4,5-trimethoxy phenyl)methylen]cyclohexan-1-on (3) (152,3 mg; 0,55 mmol) theo quy trình mục 2.2.2.3, tinh chế phương pháp kết tinh lại hỗn hợp EtOAc - EtOH (1 : 1) Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 86 (2E,6E)-2-[[3-(4-Fluorophenyl)-1-(4-methoxyphenyl)-1H-pyrazol-4-yl]methylen]6-[(3,4,5-trimethoxyphenyl)methylen]cyclohexan-1-on (n3) CTPT: C33H31FN2O5 - MW: 554,62 Hiệu suất: 131,8 mg; 47,5% Cảm quan: Chất rắn màu vàng nhạt; tan tốt aceton, DMSO DMF; tan DCM, EtOAc THF; tan EtOH MeOH; không tan nước HPLC (tR, phút): 4,875 (Độ tinh khiết > 99,99%) (Phụ lục 3.18.6) MP (°C): 176,2-177,7 Phổ IR (ATR, n cm-1): 2997 (nC-Hthơm), 2943 (nC-Hkhông no), 2837 (nC-Hno), 1655 (nC=O), 1599 (nC=N), 1514 (nC=C), 1242 (nC-F) (Phụ lục 3.18.1) Phổ HR-MS (ESI, m/z): [M+H]+ tính tốn: 555,2297; tìm thấy: 555,2300 (C33H31FN2O5) (Phụ lục 3.18.2) Phổ 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6, d ppm): 8,72 (s, 1H, H5a); 7,91 (d, J = 9,0 Hz, 2H, H2c,6c); 7,65 (dd, J = 5,5 9,0 Hz, 2H, H2d,6d); 7,58 (s, 1H, H7b); 7,55 (s, 1H, H6a); 7,38 (t, J = 8,8 Hz, 2H, H3d,5d); 7,10 (d, J = 9,5 Hz, 2H, H3c,5c); 6,83 (s, 2H, H2b,6b); 3,83 (s, 3H, H7c); 3,82 (s, 6H, H8b,10b); 3,71 (s, 3H, H9b); 2,95 (t, J = 5,3 Hz, 2H, H3); 2,91 (t, J = 5,3 Hz, 2H, H5); 1,81 (quint, J = 5,5 Hz, 2H, H4) (Phụ lục 3.18.3) Phổ 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6, d ppm): 188,0; 162,3 (d, 1JFC = 250,0 Hz); Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 87 158,2; 152,7; 152,3; 138,2; 135,8; 135,6; 134,4; 132,6; 130,9; 130,7 (d, 3JFC = 8,8 Hz); 128,7; 128,5; 126,2; 120,6; 116,1; 115,7 (d, 2JFC = 22,5 Hz); 114,6; 108,0; 60,1; 55,9; 55,5; 28,0; 27,6; 22,1 (Phụ lục 3.18.4) Nhận xét: Các kiện thu cho thấy phù hợp với cấu trúc dẫn chất n3 3.2 KHẢ NĂNG GÂY ĐỘC TÍNH TRÊN TẾ BÀO UNG THƯ IN VITRO CỦA CÁC MACs THỬ NGHIỆM Kết độc tính ba dịng TBUT SW480, MDA-MB-231 A549 sau 72 xử lý với MACs thử nghiệm đối chứng dương Ell, thông qua giá trị IC50 (µM) trình bày hình 3.1 phụ lục Đối chứng dương Ell với khả gây độc tính mạnh SW480, MDA-MB-231 A549 (IC50 1,38-1,71 µM), cho thấy hoạt động ổn định thử nghiệm phù hợp với lý thuyết148 Nhìn chung từ kết độc tính ba dịng TBUT, sơ nhận định có 27 số 54 MACs thử nghiệm khơng có tác động đáng kể đến tăng trưởng ba dòng TBUT (d1-d4, e1-e4, f1-f4, g4, h3, i3, i4, j3, k3, l1-l4, m2-m4, n2 n3 với IC50 > 100 µM) Đối với 27 MACs cịn lại, có 12 MACs thể khả gây độc tính mạnh (a2, a4, b1, b2, c1, c2, g1, g2, h1, h2, i1 i2 với IC50 3,2210,28 µM), bên cạnh 04 MACs khác thể độc tính tương đối mạnh (a1, b4, c3 c4 với IC50 7,39-25,01 µM) 11 MACs cịn lại ức chế tăng trưởng TBUT mức độ trung bình đến yếu (a3, b3, g3, h4, j1, j2, j4, k1, k2, k4 m1 với IC50 25,46-94,93 µM) Đối với tác động dòng TBUT, 27 MACs gây độc tính tế bào đáng kể nhìn chung có xu hướng gây độc tính mạnh TBUT đại tràng SW480 TBUT vú MDA-MB-231 so với TBUT phổi A549 MACs có khả gây độc tính mạnh đồng ba dịng TBUT hợp chất a2, a4, b2, c1, c2, g1, g2, h2 i2 (IC50 4,44-8,37 µM) Căn vào giá trị IC50 (µM) dịng TBUT, đặc biệt TBUT SW480, MACs gồm a2, a4, b1, b2, c1, c2, g2, h1, h2 i2 lựa chọn để tiếp tục đánh giá qua thử nghiệm sinh học khác Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh A SW480 MDA-MB-231 A549 a1 a2 a3 a4 b1 b2 b3 b4 c1 c2 c3 c4 d1 d2 d3 d4 e1 e2 e3 e4 f1 f2 f3 f4 g1 g2 g3 SW480 MDA-MB-231 A549 g4 h1 h2 h3 h4 i1 i2 i3 i4 j1 j2 j3 j4 k1 k2 k3 k4 l1 l2 l3 l4 m1 m2 m3 m4 n2 n3 IC50 (µM) 3,22 20 B 40 SW480 120 60 MDA-MB-231 > 100 80 A549 88 IC50 (µM) 100 80 60 40 20 a1 a2 a3 a4 b1 b2 b3 b4 c1 c2 c3 c4 g1 g2 g3 h1 h2 h4 i1 i2 j1 j2 j4 k1 k2 k4 m1 *** Ell Hình 3.1 Kết độc tính ba dịng TBUT MACs thử nghiệm (A) Biểu đồ nhiệt mô tả mức độ gây độc tính dựa giá trị IC50 (B) So sánh khả gây độc tính dựa giá trị IC50 MACs với đối chứng dương Ell, khơng tính đến MACs khơng thể độc tính đáng kể (IC50 > 100 µM) *p < 0,05 so với giá trị IC50 MACs thử nghiệm (a1-n3) Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 89 3.3 KHẢ NĂNG ỨC CHẾ EGFR VÀ CÁC PROTEIN TYROSIN KINASE KHÁC IN VITRO CỦA CÁC MACs THỬ NGHIỆM Kết khả ức chế EGFRWT, EGFRL8858R, HER2 VEGFR2 10 MACs thử nghiệm với đối chứng dương Erl (EGFRWT), Osi (EGFRL858R) Sta (HER2/VEGFR2) trình bày hình 3.2 phụ lục Đối chứng dương Erl, Osi Sta sử dụng có khả ức chế mạnh protein TK tương ứng, cho thấy hoạt động ổn định thử nghiệm phù hợp với lý thuyết68,149,150 Nhìn chung MACs thử nghiệm có khả ức chế protein TK thử nghiệm nồng độ µM, khả ức chế EGFRL858R EGFRWT cao so với HER2 VEGFR2 Hợp chất a4 có khả ức chế cao số MACs thử nghiệm EGFRWT EGFRL858R, giá trị IC50 hợp chất hai dạng EGFR xác định Giá trị IC50 hợp chất a4 cho thấy hợp chất có khả ức chế EGFRWT EGFRL858R mức độ µM, 15,19 7,21 µM, có khả chọn lọc EGFRL858R cao gấp khoảng lần so với EGFRWT (Hình 3.2) Mặc dù MACs lựa chọn thể phần khả ức chế protein TK khảo sát, hợp chất a4 thể khả ức chế đáng kể nhất, chủ yếu EGFRL858R Chính vậy, hợp chất a4 lựa chọn để tiếp tục nghiên cứu thử nghiệm 3.4 KHẢ NĂNG KÍCH HOẠT APOPTOSIS IN VITRO TRÊN DỊNG TẾ BÀO UNG THƯ ĐẠI TRÀNG SW480 CỦA HỢP CHẤT a4 3.4.1 Đánh giá ảnh hưởng hình thái học hợp chất a4 lên TBUT SW480 Kết khả kích hoạt apoptosis hợp chất a4 thơng qua phương pháp nhuộm Hoechst 33342 thể hình 3.3 Ảnh chụp hình thái học TBUT SW480 cho thấy rằng, xử lý với a4 nồng độ 10 µM µM hai khoảng thời gian khảo sát 24 48 giờ, nhiều tế bào SW480 có dấu hiệu tượng nhiễm sắc thể cô đặc (chromatin condensation) ADN phân mảnh (DNA fragmentation) Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh EGFRL858R EGFRWT 120 HER2 VEGFR2 100 80 60 100 Erl IC50 9,47 ± 0,40 nM 60 50 40 IC50 15,19 ± 0,84 µM 2.0 3.0 Sta, 300 nM Sta, 30 nM Sta, nM a4 Osi 100 80 -5.0 -4.0 -3.0 -2.0 -1.0 0.0 1.0 log[Nồng độ, µM] Erl, 0.3 nM Erl, nM Erl, 30 nM Osi, nM Osi, 10 nM Osi, 100 nM i2, μM h2, μM h1, μM EGFRL858R 120 Tỷ lệ ức chế (%) a4 20 g2, μM c2, μM C EGFRWT 120 90 IC50 1,22 ± 0,17 nM ** c1, μM a2, μM B * b2, μM * 20 * b1, μM * Tỷ lệ ức chế (%) 40 a4, μM Tỷ lệ ức chế (%) A 80 60 50 40 20 IC50 7,21 ± 1,28 µM -5.0 -4.0 -3.0 -2.0 -1.0 0.0 1.0 log[Nồng độ, µM] 2.0 3.0 Hình 3.2 Kết khả ức chế EGFRWT, EGFRL858R, HER2 VEGFR2 10 MACs lựa chọn (A) So sánh tỷ lệ ức chế (%) 10 MACs EGFRWT, EGFRL858R, HER2 VEGFR2 nồng độ µM (B, C) Giá trị IC50 (µM) hợp chất a4 EGFRWT, so sánh với đối chứng dương Erl (B), EGFRL858R, so sánh với đối chứng dương Osi (C) *p < 0,05 so với giá trị MACs khác Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 91 A a4 - 10 μM a4 - μM Cam - 0,5 μM B a4 - 10 μM a4 - 2,5 μM Đối chứng âm a4 - μM Cam - 0,5 μM a4 - 2,5 μM Đối chứng âm Hình 3.3 Thay đổi hình thái học TBUT SW480 xử lý với hợp chất a4 Trong khoảng thời gian: (A) 24 (B) 48 giờ, so sánh với đối chứng dương Cam đối chứng âm DMSO 0,5% Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 92 Trong đó, đối chứng dương Cam sử dụng nồng độ 0,5 µM có khả kích hoạt q trình apoptosis TBUT SW480, cho thấy hoạt động ổn định thử nghiệm phù hợp với lý thuyết151 Như vậy, kết thử nghiệm nhuộm Hoescht 33342 hợp chất a4 có khả kích hoạt q trình apoptosis TBUT SW480 phụ thuộc nồng độ (dose-dependent) hai khoảng thời gian khảo sát 24 48 3.4.2 Đánh giá khả kích hoạt q trình apoptosis hợp chất a4 lên TBUT SW480 Kết khả kích hoạt apoptosis hợp chất a4 TBUT SW480 thông qua phương pháp nhuộm AV/PI phân tích đếm tế bào dịng chảy, thể bảng 3.1 phụ lục 6, cho thấy a4, đặc biệt nồng độ 10 µM, có khả kích hoạt q trình apoptosis TBUT SW480 thay đổi theo thời gian Cụ thể, khoảng thời gian 24 giờ, tỷ lệ tế bào apoptosis cao trường hợp tế bào xử lý với a4 10 µM (13,26%), cao so với đối chứng âm (5,74%) đối chứng dương Cam 0,5 µM (7,59%), tỷ lệ giảm xử lý TBUT SW480 với a4 µM (4,91%) 2,5 µM (7,97%) Các tế bào apoptosis mẫu khoảng thời gian chủ yếu biểu pha apoptosis sớm, chiếm 90% tế bào apoptosis Mặt khác, tỷ lệ tế bào necrosis cho thấy tăng nhẹ TBUT SW480 xử lý với a4 (3,33-7,93%) Cam (6,09%) so với đối chứng âm (3,84%) Sau 48 giờ, hợp chất a4 10 µM gây tỷ lệ TBUT SW480 apoptosis cao (15,08%) so với nồng độ µM (6,37%) 2,5 µM (8,56%) Trong đó, đối chứng dương Cam cho thấy kích hoạt mạnh q trình apoptosis làm tăng mạnh tỷ lệ tế bào apoptosis (36,58%), so với đối chứng âm (6,84%) Có thể thấy trình kích hoạt apoptosis TBUT SW480 gây a4 Cam quan sát thấy tỷ lệ tế bào apoptosis mẫu thử tăng theo thời gian, tỷ lệ tế bào pha apoptosis muộn tăng lên, chiếm 20% tế bào apoptosis, so với mẫu đối chứng âm có tỷ lệ tế bào apoptosis không thay đổi đáng kể hai khoảng thời gian 24 48 Mặt khác, sau 48 xử lý, tỷ lệ tế bào necrosis Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 93 mẫu a4 (2,27-3,76%) Cam (4,93%) so với mẫu đối chứng âm (3,73%) không cho thấy khác biệt đáng kể, chứng tỏ chế gây chết TBUT SW480 hợp chất a4 Cam theo đường apoptosis151 Bảng 3.1 Phân bố quần thể TBUT SW480 giai đoạn apoptosis xử lý với hợp chất a4 khoảng thời gian 24 48 Thời điểm 48 Thời điểm 24 Tỷ lệ tế bào (%) Sống Apoptosis sớm Apoptosis muộn Necrosis Đối chứng âm 90,42 5,49 0,25 3,84 a4, 10 µM 78,81 12,30 0,96 7,93 a4, µM 89,80 4,75 0,16 5,28 a4, 2,5 µM 88,71 7,62 0,33 3,33 Cam, 0,5 µM 86,32 7,07 0,52 6,09 Đối chứng âm 89,43 4,77 2,07 3,73 a4, 10 µM 82,49 11,02 4,06 2,43 a4, µM 89,87 4,59 1,78 3,76 a4, 2,5 µM 89,17 6,78 1,78 2,27 Cam, 0,5 µM 58,49 29,61 6,97 4,93 3.4.3 Đánh giá khả cảm ứng caspase-3 hợp chất a4 lên TBUT SW480 Kết khả cảm ứng caspase-3 TBUT SW480 gây hợp chất a4 thể bảng 3.2 Nhìn chung, khả cảm ứng caspase-3 mẫu thử hai khoảng thời gian cao có ý nghĩa thống kê so với đối chứng âm Đối chứng dương Cam có khả làm tăng cường cảm ứng caspase-3 hai khoảng thời gian, cho thấy hoạt động ổn định thử nghiệm151 Sau khoảng thời gian 24 giờ, hoạt tính caspase-3 tăng mạnh TBUT SW480 xử lý với a4 10 µM (2,37 lần), cao so với đối chứng dương Cam nồng độ 0,5 µM (1,20 lần), giảm nồng độ µM (1,49 lần) 2,5 µM (1,17 lần) Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 94 Bảng 3.2 Mức độ cảm ứng caspase-3 hợp chất a4 xử lý với TBUT SW480 hai khoảng thời gian 24 48 Tỷ lệ cảm ứng caspase-3 so sánh với đối chứng âm Thời điểm 24 Thời điểm 48 a4, 10 µM 2,37 ± 0,24*** 1,71 ± 0,06*** a4, µM 1,49 ± 0,08*** 1,52 ± 0,13*** a4, 2,5 µM 1,17 ± 0,05* 1,48 ± 0,10** Cam, 0,5 µM 1,20 ± 0,06* 2,92 ± 0,22*** *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001 so với mẫu đối chứng âm Sau 48 thử nghiệm, a4 cho thấy khả cảm ứng caspase-3 mạnh nồng độ thử nghiệm cao (1,71 lần) giảm dần nồng độ thấp (1,50 lần), nhiên thấp so với đối chứng dương Cam (2,92 lần) 3.5 KHẢ NĂNG GÂY ẢNH HƯỞNG CHU KỲ TẾ BÀO UNG THƯ ĐẠI TRÀNG SW480 IN VITRO CỦA HỢP CHẤT a4 Kết đánh giá ảnh hưởng hợp chất a4 lên chu kỳ TBUT SW480 thông qua phương pháp nhuộm PI phân tích đếm tế bào dịng chảy, thể bảng 3.3 phụ lục Trong hai khoảng thời gian 24 48 giờ, hợp chất a4 nồng độ 10 µM làm thay đổi chu kỳ TBUT SW480 theo hướng làm tăng tỷ lệ tế bào pha G2/M (21,90% 22,16% tương ứng) so với đối chứng âm (12,88% 15,35% tương ứng) Tại thời điểm 24 giờ, hợp chất a4 nồng độ µM 2,5 µM có khả bắt giữ TBUT SW480 pha G2/M tương tự nồng độ 10 µM (20,40% 18,47% tương ứng) Trong sau 48 xử lý với a4 nồng độ µM 2,5 µM, khơng có khác biệt đáng kể phân bố quần thể TBUT SW480 pha phát triển chu kỳ tế bào so với đối chứng âm Kết cho thấy phù hợp với khả ức chế EGFR khả kích hoạt q trình apoptosis a4 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 95 Bảng 3.3 Phân bố quần thể tế bào giai đoạn chu kỳ TBUT SW480 sub-G1 G0/G1 S G2/M super-G2 ThờI điểm 24 Đối chứng âm 0,71 41,63 43,78 12,88 1,00 a4, 10 µM 0,20 41,53 33,89 21,90 2,48 a4, µM 1,68 40,22 35,51 20,40 2,19 a4, 2,5 µM 0,13 43,45 36,29 18,47 1,66 ThờI điểm 48 xử lý với hợp chất a4 khoảng thời gian 24 48 Tỷ lệ tế bào (%) Đối chứng âm 2,45 39,78 41,37 15,35 1,05 a4, 10 µM 2,78 37,16 34,49 22,16 3,41 a4, µM 1,32 40,15 42,61 14,38 1,54 a4, 2,5 µM 0,66 40,28 47,27 9,62 2,17 3.6 KHẢ NĂNG GẮN KẾT VỚI EGFR IN SILICO CỦA HỢP CHẤT a4 3.6.2 Mô gắn kết phân tử 3.6.2.1 Khảo sát lại vị trí gắn kết ligand ĐKT Cấu dạng đại diện cluster chọn vị trí gắn kết chúng dự đốn từ trình docking mù trình bày hình 3.4 Kết cho thấy cấu dạng chọn tập trung vào vị trí vị trí gắn kết tương tự ligand ĐKT, cụ thể Erl, Osi Gef vị trí cạnh tranh ATP với JBJ vị trí allosteric Tuy nhiên, định hướng số cấu dạng tương đồng với cấu trúc ĐKT, giải thích ligand có 7-10 liên kết tự quay tạo nhiều cấu dạng khác Với mức độ đánh giá 250.000 lần/cấu dạng, việc đánh giá theo thuật tốn LA-GA khơng xác mà địi hỏi phải đánh giá dài hơn, thực q trình docking tập trung152 3.6.2.2 Mơ lại khả gắn kết ligand ĐKT Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 96 Cấu dạng đại diện cho cluster chọn lưu lại, sau xếp chồng với cấu dạng ĐKT tương ứng ban đầu theo bảng 2.3 Theo đó, giá trị RMSD (1) tính tốn dựa vị trí tương đối tồn nguyên tử nặng phân tử Tuy nhiên, khoang gắn kết mở khoang gắn kết cạnh tranh ATP, ligand Erl, Gef Osi cấu trúc ĐKT có phần dây nhánh O-alkyloxy N-alkylamino linh động tiếp xúc với dung môi, có phần khung nhân thơm nằm sâu vị trị gắn kết hình thành tương tác chủ yếu Do đó, giá trị RMSD (2) tính tốn vị trí tương đối nguyên tử nặng thuộc phần cấu trúc sau loại phần dây nhánh cần xem xét đến Hình 3.4 Cluster chọn vị trí gắn kết ligand ĐKT EGFR TK (A) Erl, (B) Osi, (C) Gef, (D) JBJ Màu TKI tương ứng với EGFR thích hình Tn thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 97 Thơng tin cấu dạng đại diện, lượng gắn kết, giá trị RMSD tương tác hình thành chúng với aminoacid khoang gắn kết tương ứng trình bày hình 3.5-3.6 phụ lục 8.1-8.2 Các kết re-docking crossdocking ligand ĐKT cho thấy phù hợp phần mềm, phương pháp thông số sử dụng việc tái tạo liệu thực nghiệm (xem thêm mục 4.6.1) Do đó, khả gắn kết thuận nghịch không thuận nghịch hợp chất a4 với dạng EGFR tiếp tục nghiên cứu phương pháp gắn kết phân tử với phương pháp thông số trường hợp ligand ĐKT 3.6.2.3 Khảo sát mô khả gắn kết hợp chất a4 Hợp chất a4 trước tiên khảo sát vị trí gắn kết EGFR TK phương pháp docking mù thuận nghịch, sau tiếp tục đánh giá kĩ qua phương pháp docking tập trung thuận nghịch không thuận nghịch vị trí gắn kết khảo sát Kết q trình mơ khả gắn kết a4 trình bày hình 3.6 phụ lục 8.1-8.2, cho thấy cấu dạng chọn a4 tất trường hợp EGFR tập trung vào vị trí vị trí gắn kết cạnh tranh ATP (Hình 3.6A) Trong q trình docking tập trung thuận nghịch, cấu dạng đại diện chọn a4 có kiểu gắn kết giống khoang gắn kết cạnh tranh ATP dạng EGFR (Hình 3.6B) Điều dễ dàng giải thích cân nhắc đến bảo tồn cao cấu trúc bậc hai vị trí gắn kết Nhìn chung, hợp chất a4 cho thấy khả gắn kết tốt với dạng EGFR với lượng gắn kết (DG) dao động khoảng –9,43 đến –9,74 kcal.mol–1 (Phụ lục 8.1) Trong trường hợp EGFR nào, a4 có khả tạo liên kết hydro chủ yếu nhóm carbonyl với M793, vốn aminoacid đặc biệt quan trọng gắn kết TKIs Erl, Gef hay Osi Vòng phenyl C a4 chiếm lấy túi kỵ nước sâu bên vùng gắn kết cạnh tranh ATP, tương tự với cấu trúc kỵ nước khác 3-ethynylphenyl Erl, 3-cloro-4-fluorophenyl Gef Nmethylindol-3-yl Osi, vòng phenyl B a4 chiếm lấy vùng không gian tương tự phần cấu trúc dây nhánh O-alkyloxy hay N-alkylamino TKIs (Hình 3.6C, Phụ lục 8.1) Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 98 Hình 3.5 Vị trí gắn kết kiểu gắn kết ligand ĐKT từ re-docking cross-docking tập trung dạng EGFR (A) Erl, (B) Osi, (C) Gef, (D) JBJ Màu TKIs tương ứng với cấu trúc EGFR thích hình Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 99 Hình 3.6 Vị trí gắn kết kiểu gắn kết thuận nghịch không thuận nghịch hợp chất a4 dạng EGFR Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 100 (A) Kết khảo sát vị trí gắn kết a4 docking mù (B) Kết docking tập trung, vị trí gắn kết kiểu gắn kết thuận nghịch a4 (C) Các tương tác hình thành a4 với đơn vị aminoacid vị trí gắn kết cạnh tranh ATP (D) So sánh lượng gắn kết thuận nghịch không thuận nghịch a4 với giá trị ligand ĐKT (E) Thay đổi vị trí tương đối dạng gắn kết thuận nghịch (Osi a4) không thuận nghịch (Osi-S-C797 (5S)-a4-S-C797) Màu TKIs a4 tương ứng với cấu trúc EGFR thích hình Đối với q trình docking tập trung khơng thuận nghịch, có tổng cộng bốn sản phẩm khác a4 có khả tạo thành có phản ứng với C797 (Phụ lục 8.2) Kết docking không thuận nghịch bốn trường hợp sản phẩm với dạng EGFR cho thấy đồng phân (5S)-a4-S-C797 có khả hình thành cao với lực gắn kết (–9,10 đến –9,97 kcal.mol–1) ln mạnh ba đồng phân cịn lại (Phụ lục 8.2) Tuy nhiên, giả thiết hợp chất a4 hình thành liên kết cộng hố trị với C797 loại trừ so sánh với Osi (xem thêm mục 4.6.2) Như vây, nghiên cứu mô gắn kết phân tử trạng thái gắn kết phù hợp a4 với dạng EGFR trạng thái gắn kết thuận nghịch Do đó, cấu dạng đại diện chọn từ trình docking tập trung thuận nghịch lưu lại để sử dụng q trình MDs 3.6.3 Mơ động lực học phân tử Trong nghiên cứu MDs, phức hợp dạng EGFR với cấu dạng đại diện tương ứng hợp chất a4 từ trình docking tập trung thuận nghịch tiếp tục sử dụng, song song thực với phức hợp Erl dạng EGFR không gắn kết (apo-EGFR) tương ứng để so sánh 3.6.3.1 Động lực học phân tử protein ligand Động lực học tính ổn định động học phân tử EGFR, a4 Erl dạng apo-EGFR, EGFR-a4 EGFR-Erl khoảng thời gian 30-100 ns trình bày hình 3.7-3.8 phụ lục 8.3-8.7 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 101 Hình 3.7 Động lực học dạng apo-EGFRWT/L858R phức hợp tương ứng khoảng 30-100 ns mô Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 102 (A, D) Giá trị RMSD (nm) Rg (nm) EGFRWT (A) EGFRL858R (D) giá trị RMSD (nm) a4 Erl trường hợp (B, E) Giá trị RMSF (nm) tính đơn vị aminoacid cấu trúc bậc hai khoang gắn kết cạnh tranh ATP EGFRWT (B) EGFRL858R (E) (C, F) Số liên kết hydro hình thành a4 Erl với thành phần vị trí gắn kết cạnh tranh ATP EGFRWT (C) EGFRL858R (F) Đối với EGFRWT, giá trị RMSDP dao động khoảng 0,28-0,40 nm, 0,300,42 nm 0,19-0,24 nm tương ứng với trường hợp apo-EGFRWT, EGFRWTErl EGFRWT-a4, cho thấy cấu trúc EGFRWT tương đối ổn định dạng gắn kết không gắn kết, với giá trị RMSDP thay đổi chênh lệch 0,20 nm theo thời gian Sự ổn định cấu trúc EGFRWT thể giá trị Rg dao động khoảng 1,94-2,02 nm, 1,96-2,02 nm 1,95-1,99 nm, tương ứng với thay đổi Rg không 5% theo thời gian Trong đó, cấu trúc EGFRWT phức hợp EGFRWT-a4 có ổn định hai dạng cịn lại, với khoảng chênh lệnh giá trị RMSDP Rg theo thời gian nhỏ nhất, khoảng 0,040,05 nm (Hình 3.7A) Tuy nhiên, giá trị RMSFP việc gắn kết với Erl a4 khiến cho số cấu trúc bậc hai vị trí gắn kết cạnh tranh ATP Ploop loop hoạt động trở nên ổn định so với trạng thái khơng gắn kết EGFRWT (Hình 3.7B, Phụ lục 8.3A) Đối với phân tử ligand, giá trị RMSDL Erl a4 dao động khoảng 0,05-0,20 nm 0,06-0,12 nm, giá trị RMSFL giữ mức không vượt 0,2 nm, cho thấy phân tử ổn định vị trí gắn kết suốt thời gian mơ (Hình 3.7A, Phụ lục 8.3E,F) Tính ổn định đến từ khả trì hình thành tương tác khơng cộng hố trị, điển hình 1-3 liên kết hydro Erl 1-2 liên kết hydro a4 với EGFRWT, suốt trình mơ (Hình 3.7C) Đối với EGFRL858R, giá trị RMSDP của EGFRL858R trường hợp apoEGFRL858R, EGFRL858R-Erl EGFRL858R-a4 dao động khoảng 0,210,45 nm, 0,22-0,30 nm 0,22-0,36 nm Mức độ thay đổi giá trị RMSDP theo Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 103 thời gian trường hợp apo-EGFRL858R vượt 0,20 nm cho thấy cấu trúc apo-EGFRL858R có phần ổn định so với hai dạng gắn kết với Erl a4 tương ứng Mặc dù vậy, giá trị Rg dạng EGFRL858R dao động khoảng 1,93-1,98 nm, 1,94-1,99 nm 1,96-2,00 nm tương ứng với thay đổi không 5% Rg theo thời gian cho thấy cấu trúc tổng thể dạng EGFRL858R không bị thay đổi đáng kể (Hình 3.7D) Các giá trị RMSFP cho thấy khơng có thay đổi đáng kể cấu dạng cấu trúc bậc hai vị trí gắn kết cạnh tranh ATP trạng thái gắn kết với Erl a4 so với trạng thái không gắn kết, ngoại trừ trường hợp loop hoạt động Sự gắn kết với Erl a4 làm ổn định phần cấu trúc đầu tận N loop hoạt động (A859-K867), nhiên a4 đồng thời làm ổn định phần cấu trúc đầu tận C lại loop hoạt động (E868-E872) (Hình 3.7E, Phụ lục 8.3B) Trong đó, phân tử ligand Erl a4 cho thấy khả gắn kết ổn định suốt mô thông qua giá trị RMSDL dao động khoảng 0,08-0,17 nm 0,06-0,13 nm, qua giá trị RMSFL không vượt 0,2 nm (Hình 3.7D, Phụ lục 8.3E,F) Trong phức hợp EGFRL858R-Erl, Erl trì hình thành 1-3 liên kết hydro hầu hết thời gian, chí lên đến liên kết hydro khoảng nửa trình mơ phịng, EGFRL858Ra4, số liên kết hydro mà a4 trì hầu hết thời gian 1-3, qua giải thích tính ổn định động học hai phân tử (Hình 3.7F) Đối với EGFRG719S, cấu trúc EGFRG719S cho thấy ổn định động học ba trường hợp apo-EGFRG719S, EGFRG719S-Erl EGFRG719S-a4 với giá trị RMSDP thay đổi không 0,20 nm theo thời gian, dao động khoảng 0,23-0,32 nm, 0,23-0,32 nm 0,23-0,34 nm, với giá trị Rg dao động khoảng 1,95-1,99 nm, 1,97-2,01 nm 1,93-1,97 nm, tương ứng với thay đổi Rg khoảng 2% theo thời gian (Hình 3.8A) Với việc gắn kết với Erl a4, cấu trúc P-loop khoang gắn kết cạnh tranh ATP EGFRG719S ổn định so với trường hợp không gắn kết, qua giá trị RMSFP Đối với loop hoạt động, cấu trúc ổn định phức hợp EGFRG719S-a4 lại ổn định đoạn E868-A871 phức hợp Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 104 EGFRG719S-Erl, so với dạng không gắn kết apo-EGFRG719S (Hỉnh 3.8B, Phụ lục 8.3C) Xét đến tính ổn định động học phân tử ligand, giá trị RMSDL Erl a4 dao động khoảng 0,07-0,18 nm 0,08-0,14 nm, giá trị RMSFL chúng giữ mức khơng vượt q 0,2 nm (Hình 3.8A, Phụ lục 8.3E,F), phân tử có trạng thái gắn kết ổn định suốt thời gian mơ tương tác khơng cộng hố trị, điển hình liên kết hydro Đối với phức hợp EGFRG719S-Erl, Erl có khả trì hình thành 1-4 liên kết hydro hầu hết thời gian giai đoạn 30-60 ns, sau giảm xuống 1-3 liên kết hydro hầu hết quãng thời gian cịn lại Trong đó, hợp chất a4 phức hợp EGFRG719S-a4 hình thành 1-2 liên kết hydro gần toàn thời gian, cịn hình thành thêm liên kết hydro thứ với tần suất đáng kể trình mơ (Hình 3.8C) Đối với EGFRG724S, giá trị RMSDP trường hợp apo-EGFRG724S, EGFRG724S-Erl EGFRG724S-a4 thay đổi với độ chênh lệch không 0,20 nm theo thời gian, dao động khoảng 0,22-0,31 nm, 0,24-0,38 nm 0,19-0,26 nm Ngoài ra, giá trị Rg tương ứng dao động khoảng 1,97-2,01 nm, 1,99-2,05 nm 1,94-2,00 nm, cho thấy thay đổi Rg khoảng 3% theo thời gian Những kiện cấu trúc EGFRG724S trì ổn định trường hợp có gắn kết khơng gắn kết (Hình 3.8D) Việc gắn kết với Erl khiến cho cấu trúc bậc hai vị trí gắn kết cạnh tranh ATP EGFRG724S P-loop loop hoạt động trở nên ổn định hơn, việc gắn kết với a4 lại làm ổn định loop hoạt động so với EGFRG724S trạng thái không gắn kết (Hỉnh 3.8E, Phụ lục 8.3D) Đối với phân tử ligand, giá trị RMSDL Erl a4 dao động khoảng 0,07-0,16 nm 0,14-0,32 nm Như vậy, Erl có khả trì trạng thái gắn kết ổn định với EGFRG724S, hợp chất a4 có xu hướng thay đổi vị trí khoang gắn kết ATP so với trạng thái gắn kết ban đầu (Hình 3.8D) Điều tiếp tục thể quan sát giá trị RMSFL Erl a4 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 105 Hình 3.8 Động lực học dạng apo-EGFRG719S/G724S phức hợp tương ứng khoảng 30-100 ns mô Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 106 (A, D) Giá trị RMSD (nm) Rg (nm) EGFRG719S (A) EGFRG724S (D) giá trị RMSD (nm) a4 Erl trường hợp (B, E) Giá trị RMSF (nm) tính đơn vị aminoacid cấu trúc bậc hai khoang gắn kết cạnh tranh ATP EGFRG719S (B) EGFRG724S (E) (C, F) Số liên kết hydro hình thành a4 Erl với thành phần vị trí gắn kết cạnh tranh ATP EGFRG719S (C) EGFRG724S (F) Có thể thấy giá trị RMSDL Erl tương tự tất dạng EGFR giữ mức không vượt 0,2 nm, giá trị RMSDL a4 trường hợp EGFRG724S lại cao trường hợp lại, đặc biệt với nguyên tử C27, C28, O2 O4 thuộc hai nhóm methoxy vịng phenyl B (Phụ lục 8.3E,F) Tính ổn định Erl cịn thể chỗ ligand có khả trì trạng thái gắn kết với 1-3 liên kết hydro suốt giai đoạn 30-100 ns, a4 trì 0-1 liên kết hydro khoảng 30-60 ns, sau hình thành 0-2 liên kết hydro khoảng thời gian lại, sau vịng phenyl B di chuyển đến vị trí gắn kết khác (Hình 3.8F, Phụ lục 8.7) 3.6.2.2 Các tương tác lượng gắn kết tự Kết phân tích tương tác mà điển hình liên kết hydro, lượng gắn kết tự đóng góp vào lượng gắn kết tự cấu trúc bậc hai trạng thái gắn kết hợp chất a4 với dạng EGFR, so sánh với trường hợp tương ứng Erl, trình bày hình 3.9 phụ lục 8.4-3.6 Khi xét đến liên kết hydro với tần suất hình thành 10%, thấy aminoacid M793 thuộc vùng lề (hinge region) đơn vị tham gia vào liên kết hydro chủ yếu hầu hết trường hợp Erl a4 (62,6-108,2%), ngoại trừ phức hợp EGFRG724S-a4 (12,4%) Ngoài M793, hợp chất a4 phức hợp với EGFRWT, EGFRL858R EGFRG719S có khả hình thành thêm liên kết hydro với K745 thuộc strand S740-747, đơn vị có tương tác cầu muối (salt brigde) với D855 thuộc đoạn trình tự kiểu DFG (DFG motif), qua hình thành tương tác chéo với D855 có ảnh hưởng đến hoạt động protein kinase EGFR Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 107 Trái với trạng thái gắn kết với ba dạng EGFR kể trên, a4 phức hợp EGFRG724S-a4 lại hình thành liên kết hydro với M793 với tần suất thấp (12,4%) khơng hình thành liên kết hydro đủ ổn định với K745 (dưới 10%), thay vào hình thành liên kết hydro với H805, đơn vị nằm xa khỏi khoang gắn kết cạnh tranh ATP (Hình 3.9A, Phụ lục 8.4) Đối với lượng gắn kết tự do, tổng giá trị lượng học phân tử lượng tự q trình solvat hóa (EMM + Gsolvation) trường hợp EGFR gắn kết với a4 nhìn chung có trị số cao (–21,92 đến –30,36 kcal.mol–1) so với trường hợp Erl (–9,68 đến –11,88 kcal.mol–1), qua cho thấy khả tương tác mạnh hợp chất a4 khoang gắn kết cạnh tranh ATP EGFR, chủ yếu đến từ tương tác vdW, khả tương tác mạnh thuộc trường hợp phức hợp EGFRG719S-a4 EGFRG724S-a4 Xu hướng thay đổi lượng tương tác Erl a4 quan sát tương tự với xu hướng thay đổi lượng gắn kết từ kết nghiên cứu gắn kết phân tử (Hình 3.6D, Phụ lục 8.1) Tuy nhiên, kể đến đại lượng biến thiên entropy (DS) đại lượng liên quan đến thay đổi cấu trúc dạng EGFR cấu dạng Erl a4 q trình MDs, thấy biến thiên entropy (DS) có đóng góp lớn vào lượng gắn kết tự phức hợp chứa Erl (–101,03 đến –137,30 kcal.mol–1) so với trường hợp a4 (5,62 đến –12,81 kcal.mol–1), dẫn đến việc lượng gắn kết tự Erl với dạng EGFR có trị số lớn so với trường hợp a4 tương ứng (Hình 3.9B, Phụ lục 8.5) Ngồi ra, phân tích đóng góp vào lượng gắn kết tự cấu trúc bậc hai giúp khuynh hướng tương tác Erl a4 với dạng EGFR Kết phân tích cho thấy Erl a4 tương tác chủ yếu với strand S711720 , vùng lề strand S843-847 dạng EGFR, với vùng lề hiệu với Erl a4, thấy qua tần suất hình thành liên kết hydro với M793 Trong Erl cịn có thêm tương tác chủ yếu với strand S724-731, tương tác a4 với cấu trúc bậc hai hiệu (Hình 3.9C, Phụ lục 8.6) Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Erl a4 Năng lượng (kcal.mol–1) 80 60 40 EGFRWT C EGFRL858R EMM+Gsolvat –T×ΔS EMM+Gsolvat –T×ΔS -50 -100 -150 EGFRG719S EGFRG724S a4 Erl 6.0 4.0 2.0 108 Năng lượng đóng góp (kcal.mol–1) H805 M793 K745 w1104 M793 T790 L788 Q791 G719 20 a4 Erl B 100 L718 Tần suất (%) A 0.0 -2.0 Loop hoạt động Strand S850-853 Strand S843-847 Loop xúc tác Helix H798-805 Vùng lề Strand S786-791 Strand S740-747 Strand S724-731 P-loop Strand S711-720 Loop hoạt động Strand S850-853 Strand S843-847 Loop xúc tác Helix H798-805 Vùng lề Strand S786-791 Strand S740-747 Strand S724-731 P-loop Strand S711-720 -4.0 Hình 3.9 Phân tích tương tác a4 Erl với dạng EGFR mô động lực học phân tử (A) Các liên kết hydro có tần suất 10% hình thành a4 Erl với thành phần khoang gắn kết cạnh tranh ATP dạng EGFR (B) Năng lượng gắn kết tự a4 Erl với dạng EGFR (C) Đóng góp vào lượng gắn kết cấu trúc bậc hai vị trí gắn kết cạnh tranh ATP hệ mô Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 109 3.7 HỒ SƠ DƯỢC ĐỘNG HỌC VÀ ĐỘC TÍNH CỦA HỢP CHẤT a4 Dược động học độc tính hợp chất a4 dự đoán SwissADME (http://www.swissadme.ch/) ADMETlab2.0 (https://admetmesh.scbdd.com/) Kết dự đốn trình bày hình 3.10 phụ lục 9.1-9.2 A B MW LogP(o/w) XLOGP3 LogPo/w #Liên kết khơng tự xoay Điện tích hình thức LogS #Liên kết tự xoay MW LogD7.4 Độ bão hoà TPSA LogS (ESOL) #Dị tố #Nguyên tử vòng lớn #Acc #Don #Vịng TPSA #Liên kết tự xoay Hình 3.10 Biểu đồ radar biểu diễn đặc tính lý hóa hợp chất a4 Theo SwissADME (A) ADMETlab2.0 (B) (15/10/2022) Kết tính tốn thơng số lý hố cho thấy a4 thể tính chất lý hố phù hợp, đáp ứng 5/6 tiêu chí theo SwissADME 10/13 tiêu chí ADMETlab2.0, độ bão hào hay tỷ lệ số nguyên tử Csp3 phân tử (0,07), tính chất tan (Log S) tính chất phân bố pH 7,4 (LogD7.4) tính chất chưa phù hợp a4 Hợp chất a4 thoả mãn quy tắc Lipinski, quy tắc Veber, quy tắc Egan theo SwissADME thoã mãn quy tắc GoldenTriangle theo ADMETlab2.0, qua có tính chất ADMET thuận lợi để sử dụng đường uống Ngoài ra, cấu trúc a4 không chứa thành phần cấu trúc cảnh báo PAINS153 Tuy nhiên, cấu trúc a4 số hạn chế chưa đáp ứng 1/4 tiêu chí quy tắc Ghose (MR > 130), 1/9 tiêu chí quy tắc Muegge (XLOGP3 > 5), không thoả mãn quy tắc Pfizer (TPSA > 75 Å2) quy tắc GSK (MW > 400, logP > 4) Do cấu trúc hợp chất cần tiếp tục cải tiến phát triển để tìm chất khởi nguồn tối ưu Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 110 Chương BÀN LUẬN 4.1 TỔNG HỢP CÁC MACS CHỨA CẤU TRÚC NỐI CYCLOHEXANON 4.1.1 Tổng hợp dẫn chất 1,3-diphenyl-1H-pyrazol-4-carbaldehyd (j-n) Các dẫn chất 1,3-diphenyl-1H-pyrazol-4-carbaldehyd (n-j) tổng hợp qua hai bước, dễ dàng tinh chế phương pháp kết tinh lại EtOH với hiệu suất tổng cộng mức trung bình đến cao (33,7-87,9%) Các kiện phổ thu được, gồm IR, MS, 1H-NMR 13C-NMR (DMSO-d6), cho thấy phù hợp với cấu trúc dự kiến ban đầu, phản ánh rõ ràng số điểm đặc trưng cấu trúc dẫn chất Cụ thể, nhóm chức aldehyd dẫn chất xác nhận thơng qua phổ IR với tín hiệu với cường độ mạnh khoảng 1672-1664 cm-1 (nC=O), phổ 1H-NMR 13C-NMR (DMSO-d6) tín hiệu singlet nhọn khoảng 9,99-9,95 ppm (H6) tín hiệu khoảng 184,6-184,4 ppm (C6) Ngồi ra, có mặt ngun tử hydro dị vịng 1H-pyrazol đặc trưng tín hiệu khoảng 3127-3117 cm-1 (nC5-H) phổ IR tín hiệu singlet nhọn khoảng 9,34-9,18 ppm phổ 1H-NMR (DMSO-d6) Bên cạnh đó, dẫn chất k n, có mặt ngun tử fluor xác nhận thơng qua tín hiệu cường độ mạnh khoảng 1225-1219 cm-1 (nC4b-F), tương tác tách đỉnh doublet-doublet khoảng 8,03-8,00 ppm với J = 5,0-5,5 Hz J’ = 8,5-9,0 Hz (H2b, H6b) đỉnh triplet khoảng 7,34 ppm với J = 9,0 Hz (H3b, H5b) phổ 1H-NMR (DMSO-d6), tín hiệu doublet khoảng 162,8-162,6 ppm (1JFC = 237,5-250 Hz) đặc trưng cho nguyên tử C4b gắn trực tiếp với fluor phổ 13 C-NMR (DMSO-d6) Đối với dẫn chất l, m n, có mặt nhóm methoxy xác nhận rõ ràng qua tín hiệu singlet khoảng 3,83-3,82 ppm (H7a, H7b), tín hiệu khoảng 160,0-158,6 ppm (C4a, C4b) khoảng 55,5-55,2 ppm (C7a, C7b), phổ 1H-NMR 13C-NMR (DMSO-d6) 4.1.2 Tổng hợp dẫn chất (E)-2-(phenylmethylen)cyclohexan-1-on (1-4) Các dẫn chất (E)-2-(phenylmethylen)cyclohexan-1-on tổng hợp thông qua hai bước liên tiếp, gồm giai đoạn hình thành enamin trung gian trước ngưng tụ Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 111 với dẫn chất benzaldehyd, tinh chế phương pháp CC với hiệu suất tổng cộng mức trung bình (29,7-61,2%) Trong nghiên cứu này, phương pháp tổng hợp vi sóng áp dụng cho hai giai đoạn phản ứng, nhìn chung giúp rút ngắn thời gian phản ứng tổng hợp enamin, từ 3-8 phản ứng đun hồi lưu cổ điển, xuống khoảng giờ154-156, hiệu suất thu sản phẩm ngưng tụ 1-4 với so với phương pháp khác không khác nhiều (1: 37-40%, 2: 36-61%, 3: 6276%, 4: 37%), theo thống kê ghi nhận SciFindern (15/10/2022) H5 H4 H6 H3 H8b H 5b H6b H2b H7b H5 H4 H6 7,32 7,06 2,41 H3 H8b 1,72-1,68 2,80 3,79 6,97 6,83 9,52 1,84-1,80 (E)-2-[(4-Hydroxy-3-methoxyphenyl) methylene]cyclohexan-1-on (1) H5b H6b H2b H7b Hình 4.1 Xác nhận cấu hình (E) dẫn chất 1-4 dựa phổ ROESY Ví dụ dẫn chất (E)-2-[(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)methylen]cyclohexan-1-on (1) Các kiện phổ thu được, gồm IR, MS, 1H- 13C-NMR, cho thấy phù hợp với cấu trúc dự kiến ban đầu, phản ánh rõ ràng số điểm đặc trưng cấu trúc dẫn chất Cụ thể, có mặt nhóm ceton α,β-khơng no chứng minh tín hiệu cường độ mạnh khoảng 1670-1655 cm-1 (nC1=O) tín hiệu khoảng 200,6-199,7 ppm (C1) phổ IR 13C-NMR Bên cạnh đó, liên kết đơi (C7b=C2), hình thành từ ngưng tụ nhóm aldehyd dẫn chất benzaldehyd với nhóm methylen cyclohexanon, với proton vinyl (H7b) Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 112 cho tín hiệu triplet khoảng 7,32-7,24 ppm phổ 1H-NMR Cấu hình (E) liên kết đơi xác nhận thông qua phổ ROESY không quan sát thấy tương tác không gian proton vinyl (H7b) với proton methylen (H3) có tín hiệu khoảng 2,84-2,77 ppm (Hình 4.1) Ngồi ra, nhóm methylen linh động cịn lại (H6) dẫn chất 1-4 đặc trưng tín hiệu triplet khoảng 2,44-2,41 ppm tín hiệu khoảng 40 ppm phổ 1H- 13 C-NMR Nhóm methoxy dẫn chất phổ 1H- 13C-NMR qua tín hiệu singlet nhọn khoảng 3,80-3,70 ppm tín hiệu khoảng 60,6-55,6 ppm Ngoại trừ dẫn chất 3, nhóm hydroxy dẫn chất 1, đặc trưng tín hiệu cường độ mạnh khoảng 3379-3238 cm-1 (nO-H) phổ IR tín hiệu singlet khoảng 9,52-8,87 ppm phổ 1H-NMR 4.1.3 Tổng hợp MACs chứa cấu trúc nối cyclohexanon (j1-n3) Trong nghiên cứu này, tác giả tổng hợp xác định cấu trúc 18 MACs chứa cấu trúc nối cyclohexanon Hiệu suất tổng hợp MACs này, tính riêng với phản ứng ngưng tụ Claisen-Schmidt dẫn chất 1,3-diphenyl-1H-pyrazol4-carbaldehyd (j-n) với dẫn chất (E)-2-(phenyl methylen)cyclohexan-1-on (1-4), nhìn chung mức trung bình đến cao (20,1-88,1%) Trong đó, phản ứng ngưng tụ có tham gia dẫn chất xảy chậm hiệu suất thấp (34,8-48,4% 20,1-26,3% tương ứng) so với dẫn chất (40,1-88,1% 34,5-57,0% tương ứng) Có thể thấy rõ hiệu ứng liên hợp nhóm phenolic (C4b-OH) (+C) gây ảnh hưởng lên toàn hệ liên hợp cấu trúc theo làm giảm khả phản ứng nhóm carbonyl (C1=O) tính linh động nhóm methylen (C6-H) Đặc biệt, mơi trường base sử dụng (KOH/EtOH-THF), nhóm phenolat tương ứng (C4b-O(-)) tạo thành gây hiệu ứng liên hợp mạnh nhiều (+C, +I), giải thích thời gian phản ứng dẫn chất xảy chậm so với dẫn chất Đặc biệt, theo tra cứu SciFindern (15/10/2022), hợp chất tổng hợp nghiên cứu hợp chất chưa báo cáo cơng trình nghiên cứu khác Tn thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 113 Hình 4.2 Xác nhận cấu hình (2E,6E) MACs j1-n3 dựa phổ ROESY Ví dụ dẫn chất (2E,6E)-2-[[3-(4-fluoro phenyl)-1-(4-methoxyphenyl)-1H-pyrazol-4yl]methylen]-6-[(3,4,5-trimethoxy phenyl)methylen]cyclohexan-1-on (n3) Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 114 Các kiện phổ thu được, gồm IR, MS, 1H- 13C-NMR, cho thấy phù hợp với cấu trúc dự kiến ban đầu, phản ánh rõ ràng số điểm đặc trưng cấu trúc MACs Cụ thể, phổ 1H- 13C-NMR MACs tín hiệu đặc trưng nhóm aldehyd cấu trúc dẫn chất j-n, bao gồm tín hiệu proton khoảng 9,99-9,95 ppm (C6-H) tín hiệu carbon khoảng 184,6-184,4 ppm (C6); tín hiệu nhóm methylen linh động cấu trúc dẫn chất 1-4, bao gồm tín hiệu proton khoảng 2,44-2,41 ppm (H6) tín hiệu carbon khoảng 40 ppm (C6); thay vào xuất thêm tín hiệu đặc trưng nhóm vinyl, bao gồm tín hiệu proton khoảng 7,59-7,53 ppm (H6a) hai tín hiệu carbon khoảng 120-140 ppm (C6a C6), xác nhận cho hình thành sản phẩm ngưng tụ ClaisenSchmidt tương ứng157 Bên cạnh đó, qua phản ứng ngưng tụ, tín hiệu đặc trưng nhóm ceton proton vinyl dẫn chất vinyl ceton 1-4 thay đổi rõ rệt so với tín hiệu dẫn chất divinyl ceton j1-n3, cụ thể chuyển dịch tín hiệu carbon khoảng 200,6-199,7 ppm (C1) tín hiệu proton vinyl khoảng 7,32-7,24 (H7b) dẫn chất 1-4 thành tín hiệu tương ứng khoảng 188,1-187,9 ppm (C1) 7,59-7,50 ppm (H7b) MACs j1-n3157 Cấu hình (E) liên kết đôi cấu trúc MACs xác nhận thông qua phổ ROESY không quan sát thấy tương tác không gian proton vinyl (H7b) proton vinyl (H6a) tương ứng với proton methylen (H3) (2,97-2,88 ppm) với proton methylen (H5) (2,97-2,90 ppm) (Hình 4.2) Ngồi ra, nhóm khác hydroxy, methoxy, fluoro, nhóm khơng bị thay đổi phản ứng ngưng tụ, tín hiệu đặc trưng nhóm phổ IR, H- 13C-NMR khơng thay đổi so với tín hiệu nhóm tương ứng cấu trúc nguyên liệu ban đầu dẫn chất j-n 1-4 4.2 KHẢ NĂNG GÂY ĐỘC TÍNH TRÊN TẾ BÀO UNG THƯ IN VITRO CỦA CÁC MACs THỬ NGHIỆM Một số nhận xét liên quan cấu trúc MACs với tác dụng gây độc tính TBUT rút dựa kết thu (Hình 4.3) Tn thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 115 § Đối với việc thay cấu trúc dây nối, với nhóm vòng A, B C, việc thay đổi dây nối kiểu aceton (a1-c4 g1-i4) sang kiểu cyclohexanon (j1n3), chẳng hạn trường hợp hợp chất a1-a4 so với j1-j4, hay c1-c4 so với k1-k4 tương ứng, làm giảm khả gây độc tính TBUT Xu hướng dễ dàng quan sát thấy với việc tất MACs chứa cấu trúc cyclohexanon thử nghiệm nằm nhóm gây độc tính trung bình đến yếu, chí khơng gây độc tính đáng kể ba dịng TBUT § Đối với thay nhóm vịng B, với nhóm vòng A, C cấu trúc nối, khả gây độc tính MACs nhìn chung phân hố tỷ lệ nghịch với số lượng nhóm methoxy Cụ thể, ngoại trừ hợp chất a4, độc tính TBUT mạnh hầu hết gây MACs với nhóm methoxy (4-OH-3-OMe 3-OH-4-OMe) hợp chất a2, b2, c1, c2, g1, g2, h2 i2, theo sau MACs với hai nhóm methoxy (4-OH3,5-diOMe) hợp chất b4 c4 Cuối cùng, ngoại trừ hợp chất c3, tất MACs cịn lại với ba nhóm methoxy (3,4,5-triOMe) thử nghiệm nằm nhóm gây độc tính trung bình đến yếu, chí khơng gây độc tính đáng kể ba dịng TBUT § Đối với thay nhóm khác vịng A, với nhóm vịng B, C cấu trúc nối, ảnh hưởng rõ ràng nhận thấy việc MACs chứa nhóm nitro vịng A (d1-f4) khơng có khả ức chế đáng kể tăng trưởng TBUT so với trường hợp khơng chứa nhóm (a1-c4) Trong đó, thay nhóm methoxy vịng A mặt làm gia tăng độc tính TBUT vịng B có nhóm methoxy (g1, g2, h1, h2, i1 i2), mặt khác lại làm giảm độc tính vịng B có từ hai nhóm methoxy trở lên (g3, g4, h3, h4, i3 i4), so với MACs thay vịng A tương ứng (a1-c4) § Đối với thay nhóm khác vịng C, với nhóm vịng A, B cấu trúc nối, nhìn chung thay nhóm methoxy Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 116 fluoro vịng C làm tăng khả ức chế TBUT, đặc biệt quan sát thấy b1, b2, c1 c2 h1, h2, i1 i2 so với a1 a2 g1 g2 tương ứng Sự giảm gần hoạt tính MACs d1-f4 j1-n3 giải thích thêm vào cấu trúc thân dầu nitro cyclohexan tương ứng, qua làm cân thân dầu - thân nước thích hợp Ngồi ra, khối lượng phân tử lớn MACs chứa cấu trúc nối cyclohexanon hay chứa nhóm 3,4,5-trimethoxy vịng B, ảnh hưởng đến khả gây độc tế bào MACs Hai yếu tố kể ảnh hưởng đến khả hấp thu vào TBUT MACs Ngoài ra, thay dây nối aceton cyclohexanon làm cấu trúc MACs tương ứng trở nên cứng nhắc số lượng cấu dạng hạn chế hơn, làm cho khả gắn kết với đích tác động cụ thể MACs trở nên tương thích hiệu quả, dẫn đến gây độc tính thấp TBUT –F ~ –OMe > –H R2 C –H, –H > –[CH2]3– O R3 N N A B –OH > –OMe >> –H –OMe > –(OMe)2 > –(OMe)3 R4 R5 R1 –OMe > –H >> –NO2 Hình 4.3 Tóm tắt nhận xét SAR độc tính TBUT MACs 4.3 KHẢ NĂNG ỨC CHẾ EGFR VÀ CÁC PROTEIN TYROSIN KINASE KHÁC IN VITRO CỦA CÁC MACs THỬ NGHIỆM Từ kết đánh giá tỷ lệ ức chế EGFRWT EGFRL858R, số nhận xét liên quan cấu trúc MACs với khả ức chế ghi nhận § Với nhóm vịng A, thêm vào nhóm methoxy (–OMe) khơng làm thay đổi đáng kể khả ức chế EGFRWT EGFRL858R Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 117 trường hợp cặp a2 - g2, b2 - h2 c2 - i2 (p > 0,05), giảm nhẹ trường hợp b1 - h1 (p < 0,05) § Khi xét đến thay vịng C, thêm vào nhóm fluoro (–F) không làm thay đổi khả ức chế EGFRWT (p > 0,05) làm giảm khả ức chế EGFRL858R (p < 0,05) trường hợp cặp a2 - b2 g2 h2 Trong đó, thêm vào nhóm methoxy (–OMe) lại làm giảm thấy rõ khả ức chế hai dạng EGFR, cặp a2 - c2 g2 - i2 (p < 0,05) § Đối với thay vòng B, xuất nhiều nhóm methoxy (–OMe) hợp chất a4 (4-OH-3,5-diOMe) làm tăng khả ức chế so với MACs lại (3-OH-4-OMe 4-OH-3-OMe) EGFRWT EGFRL858R 4.4 KHẢ NĂNG KÍCH HOẠT APOPTOSIS IN VITRO TRÊN DÒNG TẾ BÀO UNG THƯ ĐẠI TRÀNG SW480 CỦA HỢP CHẤT a4 Các thử nghiệm đánh giá khả kích hoạt apoptosis cho thấy hợp chất a4 có khả kích hoạt q trình apoptosis TBUT SW480 phụ thuộc nồng độ (dose-dependent) thời gian (time-dependent), đáng kể nồng độ 10 µM µM Trong đó, hoạt tính gia tăng cảm ứng caspase-3 số tác động trình kích hoạt apoptosis hợp chất a4 Kết cho thấy phù hợp với khả ức chế a4 hoạt động EGFR TK Thông thường, EGFR kích hoạt hai đường tín hiệu đường PI3K/Akt/mTOR tham gia vào q trình điều hồ chu kỳ tế bào ngăn chặn q trình apoptosis, việc ngăn chặn q trình apoptosis có liên quan đến protein thuộc họ Bcl-2 (B-cell lympho-2) có vai trị quan trọng q trình điều hồ apoptosis nội sinh (intrinsic) Sự kích hoạt PI3K/Akt/mTOR làm kích hoạt protein ức chế apoptosis Bcl-2 Bcl-xL, chặn đứng hoạt động protein hỗ trợ kích hoạt apoptosis Bid Bad, qua ức chế hoạt động protein kích hoạt apoptosis Bad Bak bề mặt ty thể, dẫn đến ngăn chặn trình phóng thích cytochrom c Cytochrom c yếu tố giúp phân cắt pro- Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 118 caspase-9 thành caspase-9, caspase khơi mào cho phân cắt procaspase-3 thành caspase-3 hành Do q trình ngăn chặn cytochrom c phóng thích ngăn cản tạo thành caspase-3 chặn đứng trình apoptosis Như trường hợp hợp chất a4 có khả ức chế hoạt động EGFR, đường tín hiệu PI3K/Akt/mTOR bị chặn đứng, dẫn tới q trình kích hoạt apoptosis nội sinh cách tăng cường cảm ứng hoạt động caspase-3158,159 Tuy nhiên, q trình apoptosis ngoại sinh (extrinsic) kích hoạt phối tử TNF-α, FasL TRAIL liên kết với thụ thể chết TNFR1, FGFR DR4/5 tương ứng, qua kéo theo kích hoạt caspase-8 caspase-10 khơi mào cho trình apoptosis ngoại sinh cách phân cắt procaspase-3, thành caspase hành tương ứng, kích hoạt trình apoptosis nội sinh cách phân cắt Bid160 Sự gia tăng cảm ứng caspase-3 đến từ đường ngoại sinh nội sinh, cần có thêm thử nghiệm khẳng định để củng cố mối liên quan khả ức chế EGFR với khả kích hoạt apoptosis hợp chất a4 4.5 KHẢ NĂNG GÂY ẢNH HƯỞNG CHU KỲ TẾ BÀO UNG THƯ ĐẠI TRÀNG SW480 IN VITRO CỦA HỢP CHẤT a4 Hợp chất a4, mục 3.4.3, chứng minh có khả kích hoạt q trình apoptosis dù theo đường nội sinh hay ngoại sinh thông qua q trình cảm ứng caspase-3, qua ức chế sửa chữa bắt đầu thối hóa ADN158,159 Các tế bào với ADN bị hư hại vượt qua điểm kiểm tra (checkpoint) G2/M để vào trình nguyên phân (M), mà phải dừng lại cuối pha S đầu pha G2 để chờ ADN sửa chửa161 Tuy nhiên với caspase-3 bị cảm ứng, tế bào tiếp tục có ADN bị hư hại khơng sửa chữa, qua liên tục bị bắt giữ G2/M dẫn đến việc việc ức chế tăng sinh162,163 Ngoài ra, nhiều nghiên cứu hoạt chất, tương tự a4, có khả năng kích hoạt apoptosis bắt giữ tế bào pha G2/M qua việc điều hồ đường tín hiệu RAS/RAF/MEK/MAPK PI3K/ Akt/mTOR có liên quan đến hoạt động EGFR164,165 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 119 4.6 KHẢ NĂNG GẮN KẾT VỚI EGFR IN SILICO CỦA HỢP CHẤT a4 4.6.1 Mô lại khả gắn kết ligand ĐKT Kết re-docking thuận nghịch Erl vị trí gắn kết cạnh tranh ATP cho thấy phù hợp khả tái tạo liệu thực nghiệm trình gắn kết khơng cộng hố trị (non-covalent docking), với giá trị RMSD (1) RMSD (2) tương ứng dao động khoảng 1,18-1,50 Å 0,42-0,58 Å trường hợp EGFR141 Ngoài ra, Erl cho thấy khả gắn kết tốt với dạng EGFR với lượng gắn kết (DG) dao động khoảng –8,32 đến –8,48 kcal.mol–1 với liên kết hydro hình thành, điển hình với M793 (1,83-1,92 Å) w1104 (1,86-1,96 Å) so với Erl ĐKT (1,96 Å 2,02 Å) (4HJO) (Hình 3.5A, Phụ lục 8.1) Đối với kết cross-docking thuận nghịch Gef Osi vị trí gắn kết cạnh tranh ATP, giá trị RMSD (1) Gef Osi dao động khoảng 3,673,89 Å 2,99-3,33 Å có khác biệt cấu dạng thu từ docking so với Gef ĐKT (4WKQ, 2ITZ 2ITO) Osi ĐKT (6JXT 6JWL) tương ứng, chủ yếu phần cấu trúc dây nhánh O-alkyloxy N-alkylamino linh động tiếp xúc với dung mơi Tuy nhiên, phần cấu trúc cịn lại phân tử không kể đến phần dây nhánh có chồng khít với đáng kể, thể qua giá trị RMSD (2) tương ứng dao động khoảng 1,41-1,77 Å 1,15-1,40 Å trường hợp EGFR (Hình 3.5B,C) Sự khác biệt nhỏ kết docking Gef Osi với cấu dạng ban đầu ligand ĐKT không tránh khỏi thực cross-docking ligand (Gef hay Osi) khác với ligand ban đầu (Erl) cấu trúc ĐKT sử dụng (4HJO) trình gắn kết sử dụng trình bán linh động (semi flexible) với protein cứng nhắc141 Bên cạnh đó, Gef Osi cho thấy khả gắn kết tốt với dạng EGFR với lượng gắn kết (DG) tương ứng dao động khoảng –8,39 đến –8,68 kcal.mol–1 –9,07 đến –9,66 kcal.mol–1 Đối với Gef, ligand có khả hình thành liên kết hydro với M793 (1,78-1,93 Å) w1104 (1,88-2,22 Å), so với liên kết hydro Gef ĐKT với M793 (2,62 Å) (Hình 3.5C, Phụ lục 8.1) Trong đó, Osi có khả hình thành liên kết Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 120 hydro với M793 (1,78-1,95 Å) tương tự với trường hợp Osi ĐKT (2,57 Å), đặc biệt, định hướng cấu trúc acrylamido đến vị trí C797, sẵn sàng cho hình thành liên kết cộng hố trị với aminoacid (Hình 3.6B, Phụ lục 8.1) Kết crossdocking không thuận nghịch Osi vị trí gắn kết cạnh tranh ATP cho thấy phù hợp khả tái tạo liệu thực nghiệm q trình gắn kết cộng hố trị (covalent docking), với giá trị RMSD (1) RMSD (2) tương ứng khoảng 3,013,10 Å 1,03-1,48 Å trường hợp EGFR Năng lượng gắn kết dạng Osi cộng hoá trị (Osi-S-C797) cao (–9,48 đến –10,68 kcal.mol–1) so với dạng Osi khơng cộng hố trị (–9,07 đến –9,66 kcal.mol–1), cho thấy ảnh hưởng hình thành liên kết cộng hố trị đến lượng gắn kết (Phụ lục 8.2) Ngoài liên kết cộng hoá trị với C797, dạng Osi cộng hoá trị (Osi-S-C797) hình thành liên kết hydro chủ yếu với M793 (1,74-1,89 Å) (Hình 3.6E) Đối với kết cross-docking JBJ vị trí allosteric, giá trị RMSD (1) trường hợp EGFR dao động khoảng 2,01-2,32 Å, cho thấy phù hợp tương cấu dạng JBJ ĐKT (7JXQ 7K1I) Bởi trình docking cross-docking, giá trị RMSD (1) » Å từ kết cross-docking JBJ chấp nhận được141 Các cấu dạng JBJ thu có lượng gắn kết (DG) dao động khoảng –11,38 đến –11,68 kcal.mol–1 có khả tạo liên kết hydro chủ yếu với D855 (2,00-2,07 Å) so với liên kết hydro JBJ ĐKT với F856 (2,75 Å) (Hình 3.5D, Phụ lục 8.1) 4.6.2 Mơ khả gắn kết hợp chất a4 Giả thiết a4 tạo liên kết cộng hoá trị với C797 loại trừ số lý sau: § Thứ nhất, gắn kết không thuận nghịch Osi làm gia tăng lực gắn kết, từ –9,07 đến –9,66 kcal.mol–1 trở thành –9,48 đến –10,68 kcal.mol–1, trình gắn kết không thuận nghịch a4 lại làm giảm lực gắn kết, từ –9,43 đến –9,74 kcal.mol–1 trở thành –8,67 đến –9,31 kcal.mol–1 cho dù trường hợp đồng phân Chỉ dạng (5S)-a4-S-C797 trường hợp EGFRG719S có lực mạnh (–9,97 kcal.mol–1) so với dạng a4 khơng cộng hố trị tương ứng (–9,74 kcal.mol–1) (Phụ lục 8.2) Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 121 § Trong Osi khơng có thay đổi đáng kể cấu dạng trước sau liên kết cộng hố trị hình thành (RMSD 0,66-2,08 Å), hợp chất a4 lại có thay đổi cấu dạng lớn để liên kết cộng hố trị hình thành (RMSD 6,13-10,49 Å) (Phụ lục 8.2) Điều không phù hợp với nghiên cứu trước việc trạng thái khơng cộng hố trị ban đầu phân tử ligand nên đáp ứng cấu dạng phù hợp để liên kết cộng hố trị hình thành thuận lợi166,167 Những thay đổi lớn cấu dạng a4 liên kết cộng hoá trị hình thành làm thay đổi tương tác khơng cộng hố trị qua nhìn chung làm giảm lực gắn kết, làm ổn định trạng thái gắn kết dẫn tới điều kiện khiến liên kết cộng hoá trị dễ bị phân cắt168 § Thứ ba, xét đến đồng phân (5S)-a4-S-C797 có khả hình thành cao a4, khoảng cách từ vị trí nguyên tử S C797 đến nguyên tử C5 a4 trạng thái gắn kết thuận nghịch 8,49-8,66 Å, dài so với khoảng cách đến nguyên tử Cβ nhóm acrylamido Osi 3,90-4,41 Å (Hình 3.6E) Điều lần cho thấy cấu dạng trạng thái gắn kết không thuận nghịch tạo điều kiện thuận lợi cho Osi hình thành liên kết cộng hố trị với C797, điều mà dự đốn khơng xảy với trường hợp a4 4.6.3 Liên hệ với khả ức chế dạng EGFR hợp chất a4 Xét đến lượng gắn kết tự phức hợp EGFR-Erl, giá trị lượng tương tác giảm dần theo thứ tự EGFRL858R-Erl > EGFRWT-Erl = EGFRG719SErl > EGFRG724S-Erl (p < 0,05), giá trị biến thiên entropy giảm dần theo thứ tự EGFRWT-Erl >> EGFRG724S-Erl >> EGFRG719S-Erl > EGFRL858R-Erl Do lượng gắn kết tự phức hợp EGFR-Erl giảm dần theo thứ tự EGFRWT-Erl > EGFRG724S-Erl > EGFRG719S-Erl > EGFRL858R-Erl Thứ tự phù hợp với khả ức chế Erl hoạt động dạng EGFR qua mơ hình thử nghiệm khác công bố nghiên cứu trước đây169,170 Đối với phức hợp EGFR-a4, giá trị lượng tương tác giảm dần theo thứ tự EGFRG724S-a4 > EGFRWT-a4 = EGFRL858R-a4 > EGFRG719S-a4 (p < 0,05) giá trị biến thiên entropy giảm dần theo thứ tự EGFRWT-a4 > EGFRG724S-a4 > Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 122 EGFRL858R-a4 > EGFRG719S-a4 Do lượng gắn kết tự phức hợp EGFR-a4 dự đốn giảm dần theo thứ tự EGFRWT-a4 > EGFRG724S-a4 > EGFRL858R-a4 > EGFRG719S-a4 Kết dự đoán phù hợp với kết thực nghiệm khả ức chế hoạt động EGFR in vitro mục 3.3, cho thấy a4 có khả ức chế EGFRL858R mạnh EGFRWT Dựa thứ tự giảm dần lượng gắn kết tự do, kết hợp với kiện động lực học tương tác hình thành với aminoacid quan trọng, hợp chất a4 dự đoán có khả ức chế hoạt động EGFRG719S mạnh EGFRL858R Ngoài ra, liên hệ kết mô với thực nghiệm với thay đổi hoạt tính ức chế EGFR trình bày mục 4.3, trường hợp nhóm vịng A, B C thay đổi giải thích qua trạng thái gắn kết a4: § Đối với thay vịng A, thêm vào nhóm 4-OMe không làm thay đổi đáng kể khả ức chế EGFRWT EGFRL858R, chẳng hạn cặp a2 - g2, b2 - h2 c2 - i2 (p > 0,05), giảm nhẹ trường hợp b1 - h1 (p < 0,05) Như thay vị trí số vịng A làm thay đổi khả ức chế a4 với EGFRWT EGFRL858R, điều phù hợp với trạng thái gắn kết a4 vịng A hướng khỏi khoang gắn kết khơng hình thành tương tác chủ yếu (Hình 3.6B,C) § Đối với thay vịng C, thêm vào nhóm 4-F khơng làm thay đổi khả ức chế EGFRWT làm giảm khả ức chế EGFRL858R chẳng hạn cặp a2 - b2 g2 - h2 (p < 0,05) Trong đó, thêm vào nhóm 4-OMe lại làm giảm thấy rõ khả ức chế hai dạng EGFR, cặp a2 - c2 g2 - i2 (p < 0,05) Điều giải thích vịng C trại thái gắn kết a4 định hướng sâu khoang gắn kết, phía strand S786-789 Sự gắn thêm nhóm 4-F 4-OMe khiến nhóm tiến sát đến vị trí strand S786789 gây cản trở không gian làm giảm khả gắn kết Sỡ dĩ MACs chứa nhóm vịng C có khả ức chế EGFRL858R EGFRWT túi gắn kết nơi vịng C chiếm giữ, R858 hay L858 tiếp cận túi gắn kết Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 123 Phần dây nhánh cồng kềnh R858 gây bất lợi cho việc gắn kết vịng C nhóm lớn, đặc biệt nhóm 4-OMe (Hình 3.6B,C) § Đối với thay vịng B, xuất nhiều nhóm 4-OMe hợp chất a4 (4-OH-3,5-diOMe) làm tăng khả ức chế so với MACs lại (3-OH-4-OMe/4-OH-3-OMe) EGFRWT EGFRL858R Điều giải thích nhóm vịng B a4 cung cấp nhiều nhóm nhận liên kết hydro hơn, tăng khả tạo nhiều liên kết hydro với aminoacid K716 thuộc strand S711-720 K728 thuộc strand S724-731 4.7 HỒ SƠ DƯỢC ĐỘNG HỌC VÀ ĐỘC TÍNH CỦA HỢP CHẤT a4 Đối với q trình dược động học, theo ADMETlab2.0, a4 dự đốn có tính thấm thụ động tốt qua mơ hình tế bào MDCK cell line (v > ´ 10–6 cm.giây–1) Caco-2 (logv > –5,15), có khả hấp thu cao qua dày-ruột, qua có sinh khả dụng đường uống cao Trong trình phân bố, theo ADMETlab2.0, a4 dự đốn tích phân bố phù hợp (0,04-20 L.kg–1), nhiên có tỷ lệ gắn kết với protein huyết tương cao (> 90%) Đối với trình chuyển hoá, theo ADMETlab2.0, enzym CYP1A2, CYP2C9 đặc biệt CYP3A4 dự đốn có liên quan đến q trình chuyển hóa đáng kể hợp chất a4 Cả SwissADME ADMETlab2.0 có chung dự đốn khả ức chế a4 hoạt động CYP2C19 CYP2C9 Trong giai đoạn thải trừ, theo ADMETlab2.0, a4 dự đốn có độ thải trung bình (5-15 mL.min–1.kg–1) có thời gian bán thải thấp, gợi ý cần phải tăng liều sử dụng và/hoặc tăng tần suất sử dụng a4 để trì nồng độ có tác dụng Cuối cùng, hồ sơ độc tính (T) mà a4 gây dự đoán ADMETlab2.0 Kết dự đoán nhìn chung cho thấy a4 có nguy thấp gây kích ứng-ăn mịn mắt, gây bất thường tim khoảng QT dài hay loạn nhịp, gây độc tế bào gan người gây đột biến Ngồi ra, a4 cịn dự đốn có độc tính cấp đường uống chuột thấp, với LD50 500 mg.kg–1 Tuy nhiên, a4 dự đốn có nguy cao gây tổn thương gan, gây kích ứng da gây độc tính hệ hơ hấp Tn thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 124 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Trong nghiên cứu trình bày luận văn này, tác giả tiến hành phương pháp thực nghiệm để giải nội dung nghiên cứu đặt ghi nhận kết nghiên cứu sau: Nội dung Tổng hợp MACs chứa cấu trúc 1,3-diphenyl-1H-pyrazol cấu trúc nối cyclohexanon Nghiên cứu thu 18 MACs (j1-n3) với hiệu suất 20,1-88,1%, có độ tinh khiết cao có cấu trúc phân tử phù hợp với dự kiến Các MACs chất mới, chưa cơng bố cơng trình nghiên cứu khác (SciFindern, 15/10/2022) Nội dung Đánh giá khả kháng ung thư MACs qua thử nghiệm độc tính tế bào dịng TBUT người Nhìn chung ba dịng TBUT, có 12 MACs thể độc tính mạnh (IC50 3,22-10,28 µM) Các MACs gây độc tính mạnh đồng ba dịng TBUT hợp chất a2, a4, b2, c1, c2, g1, g2, h2 i2 Các nhận xét liên quan cấu trúc - độc tính TBUT tác giả rút Các MACs gồm a2, a4, b1, b2, c1, c2, g2, h1, h2 i2 lựa chọn cho thử nghiệm Nội dung Đánh giá khả ức chế hoạt động dạng EGFR protein tyrosin kinase khác MACs Các MACs a2, a4, b1, b2, c1, c2, g2, h1, h2 i2 có khả ức chế EGFR, HER2 VEGFR2 ngưỡng µM Trong đó, a4 thể khả ức chế mạnh EGFRWT (IC50 15,19 ± 0,84 µM) EGFRL858R (IC50 7,21 ± 1,28 µM) Các nhận xét liên quan cấu trúc - hoạt tính ức chế EGFR tác giả rút Nội dung Đánh giá khả kích hoạt q trình apoptosis MACs tiềm dịng TBUT đại tràng người SW480 Hợp chất a4 kích hoạt trình apoptosis TBUT SW480 sau 24 48 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 125 qua thay đổi hình thái học tế bào, gia tăng tỷ lệ tế bào giai đoạn apoptosis gia tăng hoạt động enzym caspase-3 Nội dung Đánh giá ảnh hưởng MACs tiềm lên chu kỳ TBUT đại tràng người SW480 Hợp chất a4 bắt giữ TBUT SW480 pha G2/M chu kỳ tế bào Nội dung Đánh giá khả gắn kết MACs tiềm với dạng EGFR phương pháp gắn kết phân tử mô động lực học phân tử Hợp chất a4 trì ổn định trạng thái gắn kết thuận nghịch vào vị trí gắn kết cạnh tranh ATP dạng EGFRWT, EGFRL858R EGFRG719S 100 ns Các cấu trúc bậc hai đóng góp hiệu vào gắn kết a4 gồm strand S711-720, vùng lề strand S843-847, đặc biệt liên kết hydro với M793 thuộc vùng lề Năng lượng gắn kết a4 với dạng EGFR gợi ý khả ức chế a4 EGFRG719S mạnh so với EGFRL858R EGFRWT Nội dung Dự đốn hồ sơ dược động học - độc tính MACs tiềm Mặc dù tồn hạn chế cần khắc phục, a4 sở hữu tính chất lý hố tính chất ADMET tiềm KIẾN NGHỊ Mặc dù thu số kết tiềm năng, điều kiện kinh phí để thực nghiên cứu có hạn khơng tránh khỏi việc nghiên cứu cịn số tồn thiếu sót Sau tác giả có số đề nghị việc tiếp tục làm sáng tỏ khả kháng CRC theo hướng ức chế hoạt động EGFR, đề xuất mở rộng với hướng nghiên cứu tương lai Với khả phát triển MACs § Tiếp tục mở rộng cấu trúc MACs chứa dị vịng 1H-pyrazol qua việc đa dạng hố nhóm thế, vị trí nhóm dị tố vịng A, B C § Gắn thêm cấu trúc giúp cải thiện độ tan nước và/hoặc dược động học Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 126 § Áp dụng dạng bào chế đại hệ phân tán nanolipid (SLNs, NLCs), hệ vi tự nhũ (SMEDDs) siêu vi tự nhũ (SNEDDs) Với khả kháng CRC mở rộng với loại ung thư khác § Đánh giá độc tính số dịng TBUT đại trực tràng khác SW620 - dịng TBUT trích từ khối u đại tràng di - SW48 - dòng TBUT đại tràng biểu EGFRG719S § Đánh giá độc tính dòng tế bào thường chẳng hạn HEK293 (thận) để xác định MACs an toàn loại trừ MACs gây độc với tế bào thường § Đánh giá khả kháng khối u MACs tiềm qua thử nghiệm in vivo động vật thử nghiệm, ví dụ mơ hình chuột gây ung thư đại tràng § Đánh giá loại ung thư khác mà EGFR đóng vai trị quan trọng, ví dụ ung thư phổi không tế bào nhỏ Với khả ức chế EGFR mở rộng với protein tyrosin kinase khác § Đánh giá khả ức chế in vitro với dạng EGFR khác EGFRG719S, EGFRT790M hay EGFRC797S protein tyrosin kinase § Khẳng định lại vị trí gắn kết hợp chất a4 vùng TK EGFR, chẳng hạn (1) thử nghiệm đánh giá tác động hiệp đồng với TKIs (2) thử nghiệm xác định cấu trúc EGFR trạng thái đồng kết tinh với a4 § Đánh giá độc tính tế bào dịng tế bào điều chỉnh để làm tăng biểu dạng EGFR, ví dụ Ba/F3 NIH-3T3, (2) đánh giá mức độ biểu EGFR hoạt động phosphoryl hố EGFR Với khả kích hoạt q trình apoptosis § Xác định chế kích hoạt apoptosis theo đường nội sinh hay ngoại sinh Với đặc tính dược động học độc tính § Đánh giá độc tính mơ hình động vật, thử nghiệm độc tính cấp đường uống thử nghiệm độc tính bán trường diễn chuột Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh DANH MỤC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ CĨ LIÊN QUAN QHD Nam, TLN Phuong, TKN Ngan, TP Long, NT Tuyen Synthesis of 1HPyrazole-4-carbaldehyde and 4-Phenylbut-3-en-2-one Derivatives as Intermediates in Synthesis of Monocarbonyl Analogues of Curcumin Vietnamese Journal of Pharmacy 2019;59(12):55-58, 65 TT Thi, HN Viet, BN Ngoc et al Synthesis of Monocarbonyl Analogues of Curcumin Containing 1H-Pyrazole Heterocyclic from Phenylhydrazine and Its Derivatives Ho Chi Minh City Journal of Medicine 2021;25(2):72-79 QHD Nam, BD Vu, HN Viet, NT Tuyen Synthesis of Monocarbonyl Analogues of Curcumin Containing 1H-Pyrazole Heterocyclic Journal of Medicine and Pharmacy (Vietnam) 2021;38:48-52 TKN Ngan, QHD Nam, BN Ngoc et al Synthesis of Monocarbonyl Analogues of Curcumin Containing 1-(4-Nitrophenyl)-1H-pyrazole Heterocyclics Journal of Medicine and Pharmacy (Vietnam) 2022;46:59-64 QHD Nam, BN Ngoc, TKN Ngan et al Synthesis of Monocarbonyl Analogues of Curcumin Containing 1,3-Diphenyl-1H-pyrazole Heterocyclics Journal of Medicine and Pharmacy (Vietnam) 2022;48:34-39 TT Thi, DT Son, DTTN Tuyen, QHD Nam, NT Tuyen Synthesis of Monocarbonyl Analogues of Curcumin Containing 1H-Pyrazole Heterocyclic from Phenylhydrazine and Its Derivatives Journal of Medicine and Pharmacy (Vietnam) 2022;52:47-51 QHD Nam, TKN Ngan, BD Vu et al Synthesis, Biological Evaluation, and Molecular Modeling Studies of 1-Aryl-1H-pyrazole Fused Curcumin Analogues as Anticancer Agents ACS Omega 2022;7(38):33963-33984 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh TÀI LIỆU THAM KHẢO RL Siegel, KD Miller, HE Fuchs, A Jemal Cancer Statistics, 2021 CA: Cancer J Clin 2021;71(1):7-33 H Sung, J Ferlay, RL Siegel et al Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN Estimates of Incidence and Mortality Worldwide for 36 Cancers in 185 Countries CA: Cancer J Clin 2021;71(3):209-249 C Fitzmaurice, C Allen, RM Barber et al Global, Regional, and National Cancer Incidence, Mortality, Years of Life Lost, Years Lived with Disability, and DisabilityAdjusted Life-Years for 32 Cancer Groups, 1990 to 2015: A Systematic Analysis for the Global Burden of Disease Study JAMA Oncol 2017;3(4):524-548 CA Doubeni, AO Laiyemo, JM Major et al Socioeconomic Status and the Risk of Colorectal Cancer: An Analysis of More Than a Half Million Adults in the National Institutes of Health-Aarp Diet and Health Study Cancer 2012;118(14):3636-3644 EM Montminy, M Zhou, L Maniscalco et al Contributions of Adenocarcinoma and Carcinoid Tumors to Early-Onset Colorectal Cancer Incidence Rates in the United States Ann Intern Med 2021;174(2):157-166 DE O'Sullivan, RL Sutherland, S Town et al Risk Factors for Early-Onset Colorectal Cancer: A Systematic Review and Meta-Analysis Clin Gastroenterol Hepatol 2022;20(6):1229-1240e5 A Qaseem, CJ Crandall, RA Mustafa, LA Hicks, TJ Wilt Screening for Colorectal Cancer in Asymptomatic Average-Risk Adults: A Guidance Statement from the American College of Physicians Ann Intern Med 2019;171(9):643-654 M Thörn, R Bergström, U Kressner et al Trends in Colorectal Cancer Incidence in Sweden 1959-93 by Gender, Localization, Time Period, and Birth Cohort Cancer Causes Control 1998;9(2):145-152 RL Siegel, KD Miller, A Goding Sauer et al Colorectal Cancer Statistics, 2020 CA Cancer J Clin 2020;70(3):145-164 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 10 A Ayati, S Emami, S Moghimi, A Foroumadi Thiazole in the Targeted Anticancer Drug Discovery Future Med Chem 2019;11(15):1929-1952 11 Y Shan, Michael P Eastwood, X Zhang et al Oncogenic Mutations Counteract Intrinsic Disorder in the EGFR Kinase and Promote Receptor Dimerization Cell 2012;149(4):860-870 12 L Hong, Y Han, H Zhang et al High Expression of Epidermal Growth Factor Receptor Might Predict Poor Survival in Patients with Colon Cancer: A MetaAnalysis Genet Test Mol Biomark 2013;17(4):348-351 13 P Gazzaniga, I Nofroni, O Gandini et al Tenascin C and Epidermal Growth Factor Receptor as Markers of Circulating Tumoral Cells in Bladder and Colon Cancer Oncol Rep 2005;14(5):1199-1202 14 MB Resnick, J Routhier, T Konkin, E Sabo, VE Pricolo Epidermal Growth Factor Receptor, c-Met, β-Catenin, and p53 Expression as Prognostic Indicators in Stage II Colon Cancer: A Tissue Microarray Study Clin Cancer Res 2004;10(9):3069-3075 15 G Galizia, E Lieto, F Ferraraccio et al Prognostic Significance of Epidermal Growth Factor Receptor Expression in Colon Cancer Patients Undergoing Curative Surgery Ann Surg Oncol 2006;13(6):823-835 16 H Ogiso, R Ishitani, O Nureki et al Crystal Structure of the Complex of Human Epidermal Growth Factor and Receptor Extracellular Domains Cell 2002;110(6):775-787 17 PA Schwartz, BW Murray Protein Kinase Biochemistry and Drug Discovery Bioorg Chem 2011;39(5):192-210 18 R Rosell, T Moran, C Queralt et al Screening for Epidermal Growth Factor Receptor Mutations in Lung Cancer N Engl J Med 2009;361(10):958-967 19 F Ciardiello, G Tortora A Novel Approach in the Treatment of Cancer: Targeting the Epidermal Growth Factor Receptor Clin Cancer Res 2001;7(10):2958-2970 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 20 M Maemondo, A Inoue, K Kobayashi et al Gefitinib or Chemotherapy for NonSmall-Cell Lung Cancer with Mutated EGFR N Engl J Med 2010;362(25):23802388 21 International Human Genome Sequencing Consortium Finishing the Euchromatic Sequence of the Human Genome Nature 2004;431(7011):931-945 22 H Makinoshima, M Takita, K Saruwatari et al Signaling through the Phosphatidylinositol 3-Kinase (PI3K)/Mammalian Target of Rapamycin (mTOR) Axis Is Responsible for Aerobic Glycolysis Mediated by Glucose Transporter in Epidermal Growth Factor Receptor-Mutated Lung Adenocarcinoma J Biol Chem 2015;290(28):17495-17504 23 NS Garton, MD Barker, RP Davis et al Optimisation of a Novel Series of Potent and Orally Bioavailable Azanaphthyridine SYK Inhibitors Bioorg Med Chem Lett 2016;26(19):4606-4612 24 B Nagar c-Abl Tyrosine Kinase and Inhibition by the Cancer Drug Imatinib (Gleevec/STI-571) J Nutr 2007;137(6) (Suppl 1):1518S-1523S, 1548S 25 SR Hubbard Crystal Structure of the Activated Insulin Receptor Tyrosine Kinase in Complex with Peptide Substrate and ATP Analog EMBO J 1997;16(18):55725581 26 N Tebbutt, MW Pedersen, TG Johns Targeting the ErbB Family in Cancer: Couples Therapy Nat Rev Cancer 2013;13(9):663-673 27 RA Mitchell, Rodney B Luwor, AW Burgess Epidermal Growth Factor Receptor: Structure-Function Informing the Design of Anticancer Therapeutics Exp Cell Res 2018;371(1):1-19 28 N Kim, D Cho, H Kim et al Colorectal Adenocarcinoma-Derived EGFR Mutants Are Oncogenic and Sensitive to EGFR-Targeted Monoclonal Antibodies, Cetuximab and Panitumumab Int J Cancer 2020;146(8):2194-2200 29 M Iradyan, N Iradyan, P Hulin et al Targeting Degradation of EGFR through the Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Allosteric Site Leads to Cancer Cell Detachment-Promoted Death Cancers 2019;11(8):1094 30 C To, J Jang, T Chen et al Single and Dual Targeting of Mutant EGFR with an Allosteric Inhibitor Cancer Discov 2019;9(7):926 31 C-H Yun, TJ Boggon, Y Li et al Structures of Lung Cancer-Derived EGFR Mutants and Inhibitor Complexes: Mechanism of Activation and Insights into Differential Inhibitor Sensitivity Cancer Cell 2007;11(3):217-227 32 C-J Tsai, R Nussinov Emerging Allosteric Mechanism of EGFR Activation in Physiological and Pathological Contexts Biophys J 2019;117(1):5-13 33 E Martinelli, R De Palma, M Orditura, F De Vita, F Ciardiello Anti-Epidermal Growth Factor Receptor Monoclonal Antibodies in Cancer Therapy Clin Exp Immunol 2009;158(1):1-9 34 M Toolabi, S Moghimi, TO Bakhshaiesh et al 6-Cinnamoyl-4- arylaminothienopyrimidines as Highly Potent Cytotoxic Agents: Design, Synthesis and Structure-Activity Relationship Studies Eur J Med Chem 2020;185:111786 35 X Lu, L Yu, Z Zhang et al Targeting EGFRL858R/T790M and EGFRL858R/T790M/C797S Resistance Mutations in NSCLC: Current Developments in Medicinal Chemistry Med Res Rev 2018;38(5):1550-1581 36 K Ohashi, LV Sequist, ME Arcila et al Characteristics of Lung Cancers Harboring NRAS Mutations Clin Cancer Res 2013;19(9):2584 37 Z Du, CM Lovly Mechanisms of Receptor Tyrosine Kinase Activation in Cancer Mol Cancer 2018;17(1):58 38 Y Jia, C-H Yun, E Park et al Overcoming EGFR(T790M) and EGFR(C797S) Resistance with Mutant-Selective Allosteric Inhibitors Nature 2016;534(7605):129132 39 BB Aggarwal, C Sundaram, N Malani, H Ichikawa Curcumin: The Indian Solid Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Gold BB Aggarwal, Y-J Surh, S Shishodia(s), eds The Molecular Targets and Therapeutic Uses of Curcumin in Health and Disease ed Springer US; 2007:1-75 40 M-H Teiten, S Eifes, M Dicato, M Diederich Curcumin - the Paradigm of a MultiTarget Natural Compound with Applications in Cancer Prevention and Treatment Toxins 2010;2(1):128-162 41 SC Gupta, S Prasad, JH Kim et al Multitargeting by Curcumin as Revealed by Molecular Interaction Studies Nat Prod Rep 2011;28(12):1937-1955 42 R Wilken, MS Veena, MB Wang, ES Srivatsan Curcumin: A Review of AntiCancer Properties and Therapeutic Activity in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma Mol Cancer 2011;10(1):12-30 43 T Ak, Gỹlỗin Antioxidant and Radical Scavenging Properties of Curcumin Chem Biol Interact 2008;174(1):27-37 44 G Kuttan, KB Hari Kumar, C Guruvayoorappan, R Kuttan Antitumor, AntiInvasion and Antimetastatic Effects of Curcumin BB Aggarwal, Y-J Surh, S Shishodia(s), eds The Molecular Targets and Therapeutic Uses of Curcumin in Health and Disease ed Springer US; 2007:173-184 45 JL Arbiser, N Klauber, R Rohan et al Curcumin Is an In Vivo Inhibitor of Angiogenesis Mol Med 1998;4(6):376-383 46 N Chainani-Wu Safety and Anti-Inflammatory Activity of Curcumin: A Component of Tumeric (Curcuma longa) J Altern Complement Med 2003;9(1):161-168 47 P Anand, AB Kunnumakkara, RA Newman, BB Aggarwal Bioavailability of Curcumin: Problems and Promises Mol Pharm 2007;4(6):807-818 48 Y-J Wang, M-H Pan, A-L Cheng et al Stability of Curcumin in Buffer Solutions and Characterization of Its Degradation Products J Pharm Biomed Anal 1997;15(12):1867-1876 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 49 FC Rodrigues, NV Anil Kumar, G Thakur Developments in the Anticancer Activity of Structurally Modified Curcumin: An up-to-Date Review Eur J Med Chem 2019;177:76-104 50 MJC Rosemond, L St John-Williams, T Yamaguchi, T Fujishita, JS Walsh Enzymology of a Carbonyl Reduction Clearance Pathway for the HIV Integrase Inhibitor, S-1360: Role of Human Liver Cytosolic Aldo-Keto Reductases Chem Biol Interact 2004;147(2):129-139 51 JL Revalde, Y Li, BC Hawkins, RJ Rosengren, JW Paxton Heterocyclic Cyclohexanone Monocarbonyl Analogs of Curcumin Can Inhibit the Activity of ATP-Binding Cassette Transporters in Cancer Multidrug Resistance Biochem Pharmacol 2015;93(3):305-317 52 H Luo, S Yang, Y Cai, Z Peng, T Liu Synthesis and Biological Evaluation of Novel 6-Chloroquinazolin Derivatives as Potential Antitumor Agents Eur J Med Chem 2014;84:746-752 53 R Wang, C Chen, X Zhang et al Structure-Activity Relationship and Pharmacokinetic Studies of 1,5-Diheteroarylpenta-1,4-dien-3-ones: A Class of Promising Curcumin-Based Anticancer Agents J Med Chem 2015;58(11):47134726 54 N Samaan, Q Zhong, J Fernandez et al Design, Synthesis, and Evaluation of Novel Heteroaromatic Analogs Of curcumin as Anti-Cancer Agents Eur J Med Chem 2014;75:123-131 55 PV Sri Ramya, S Angapelly, L Guntuku et al Synthesis and Biological Evaluation of Curcumin Inspired Indole Analogues as Tubulin Polymerization Inhibitors Eur J Med Chem 2017;127:100-114 56 PS Ramya, L Guntuku, S Angapelly et al Synthesis and Biological Evaluation of Curcumin Inspired Imidazo[1,2-a]pyridine Analogues as Tubulin Polymerization Inhibitors Eur J Med Chem 2018;143:216-231 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 57 P Qiu, L Xu, L Gao et al Exploring Pyrimidine-Substituted Curcumin Analogues: Design, Synthesis and Effects on EGFR Signaling Bioorg Med Chem 2013;21(17):5012-5020 58 SA Sufi, LN Adigopula, SB Syed et al In Silico and In Vitro Anti-Cancer Potential of a Curcumin Analogue (1E,6E)-1,7-Di(1H-indol-3-yl)hepta-1,6-diene3,5-dione Biomed Pharmacother 2017;85:389-398 59 G Banuppriya, R Sribalan, V Padmini Synthesis and Characterization of Curcumin-Sulfonamide Hybrids: Biological Evaluation and Molecular Docking Studies J Mol Struct 2018;1155:90-100 60 Y-Y Xu, Y Cao, H Ma, H-Q Li, G-Z Ao Design, Synthesis and Molecular Docking of α,β-Unsaturated Cyclohexanone Analogous of Curcumin as Potent Egfr Inhibitors with Antiproliferative Activity Bioorg Med Chem 2013;21(2):388-394 61 H-L Qin, J Leng, BGM Youssif et al Synthesis and Mechanistic Studies of Curcumin Analog-Based Oximes as Potential Anticancer Agents Chem Biol Drug Des 2017;90(3):443-449 62 L Sutto, FL Gervasio Effects of Oncogenic Mutations on the Conformational Free-Energy Landscape of EGFR Kinase PNAS 2013;110(26):10616 63 M Zaborowska-Szmit, DM Kowalski, A Piórek, M Krzakowski, S Szmit A Decrease in D-Dimer Concentration and an Occurrence of Skin Rash as Iatrogenic Events and Complementary Predictors of Survival in Lung Cancer Patients Treated with EGFR Tyrosine Kinase Inhibitors Pharmacol Rep 2016;68(6):1140-1148 64 R Roskoski Classification of Small Molecule Protein Kinase Inhibitors Based Upon the Structures of Their Drug-Enzyme Complexes Pharmacol Res 2016;103:26-48 65 Y Zhang, C Wang, Z Liu et al P-gp Is Involved in the Intestinal Absorption and Biliary Excretion of Afatinib In Vitro and in Rats Pharmacol Rep 2018;70(2):243250 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 66 J Fassunke, F Müller, M Keul et al Overcoming EGFRG724S-Mediated Osimertinib Resistance through Unique Binding Characteristics of SecondGeneration EGFR Inhibitors Nat Commun 2018;9(1):4655 67 DJH De Clercq, DE Heppner, C To et al Discovery and Optimization of Dibenzodiazepinones as Allosteric Mutant-Selective EGFR Inhibitors ACS Med Chem Lett 2019;10(11):1549-1553 68 MW Karaman, S Herrgard, DK Treiber et al A Quantitative Analysis of Kinase Inhibitor Selectivity Nat Biotechnol 2008;26(1):127-132 69 HJ Chae, JS Kang, JO Byun et al Molecular Mechanism of StaurosporineInduced Apoptosis in Osteoblasts Pharmacol Res 2000;42(4):373-381 70 S Bruno, B Ardelt, JS Skierski, F Traganos, Z Darzynkiewicz Different Effects of Staurosporine, an Inhibitor of Protein Kinases, on the Cell Cycle and Chromatin Structure of Normal and Leukemic Lymphocytes Cancer Res 1992;52(2):470-473 71 XH Lv, ZL Ren, BG Zhou et al Discovery of N-(Benzyloxy)-1,3-diphenyl-1Hpyrazole-4-carboxamide Derivatives as Potential Antiproliferative Agents by Inhibiting Mek Bioorg Med Chem 2016;24(19):4652-4659 72 J Wen, Q Niu, J Liu et al Novel Thiol-Based Histone Deacetylase Inhibitors Bearing 3-Phenyl-1H-pyrazole-5-carboxamide Scaffold as Surface Recognition Motif: Design, Synthesis and SAR Study Bioorg Med Chem Lett 2016;26(2):375379 73 SF Wang, Y Yin, YL Zhang et al Synthesis, Biological Evaluation and 3D-QSAR Studies of Novel 5-Phenyl-1H-pyrazole Cinnamamide Derivatives as Novel Antitubulin Agents Eur J Med Chem 2015;93:291-299 74 A Kamal, AB Shaik, N Jain et al Design and Synthesis of Pyrazole-Oxindole Conjugates Targeting Tubulin Polymerization as New Anticancer Agents Eur J Med Chem 2015;92:501-513 75 M Mansha, UU Kumari, Z Cournia, N Ullah Pyrazole-Based Potent Inhibitors of Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh GGT1: Synthesis, Biological Evaluation, and Molecular Docking Studies Eur J Med Chem 2016;124:666-676 76 YJ Esvan, F Giraud, E Pereira et al Synthesis and Biological Activity of Pyrazole Analogues of the Staurosporine Aglycon K252C Bioorg Med Chem 2016;24(14):3116-3124 77 HS Ibrahim, SM Abou-Seri, M Tanc et al Isatin-Pyrazole Benzenesulfonamide Hybrids Potently Inhibit Tumor-Associated Carbonic Anhydrase Isoforms IX and XII Eur J Med Chem 2015;103:583-593 78 H Zhang, P Zhu, J Liu et al Synthesis, In Vitro and In Vivo Antitumor Activity of Pyrazole-fused 23-Hydroxybetulinic Acid Derivatives Bioorg Med Chem Lett 2015;25(3):728-732 79 XX Tao, YT Duan, LW Chen et al Design, Synthesis and Biological Evaluation of Pyrazolyl-Nitroimidazole Derivatives as Potential EGFR/HER-2 Kinase Inhibitors Bioorg Med Chem Lett 2016;26(2):677-683 80 K-M Qiu, H-H Wang, L-M Wang et al Design, Synthesis and Biological Evaluation of Pyrazolyl-Thiazolinone Derivatives as Potential EGFR and HER-2 Kinase Inhibitors Bioorg Med Chem 2012;20(6):2010-2018 81 MJ Akhtar, AA Khan, Z Ali et al Synthesis of Stable Benzimidazole Derivatives Bearing Pyrazole as Anticancer and EGFR Receptor Inhibitors Bioorg Chem 2018;78:158-169 82 R Ducray, P Ballard, BC Barlaam et al Novel 3-Alkoxy-1H-pyrazolo[3,4d]pyrimidines as EGFR and ErbB2 Receptor Tyrosine Kinase Inhibitors Bioorg Med Chem Lett 2008;18(3):959-962 83 WL Jorgensen The Many Roles of Computation in Drug Discovery Science 2004;303(5665):1813-1818 84 N Moitessier, P Englebienne, D Lee, J Lawandi, CR Corbeil Towards the Development of Universal, Fast and Highly Accurate Docking/Scoring Methods: A Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Long Way to Go Br J Pharmacol 2008;153 Suppl 1(Suppl 1):S7-S26 85 ID Kuntz, JM Blaney, SJ Oatley, R Langridge, TE Ferrin A Geometric Approach to Macromolecule-Ligand Interactions J Mol Biol 1982;161(2):269-288 86 BJ McConkey, V Sobolev, M Edelman The Performance of Current Methods in Ligand-Protein Docking Curr Sci 2002:845-856 87 XY Meng, HX Zhang, M Mezei, M Cui Molecular Docking: A Powerful Approach for Structure-Based Drug Discovery Curr Comput Aided Drug Des 2011;7(2):146-157 88 E Fischer Einfluss Der Configuration Auf Die Wirkung Der Enzyme Berichte der deutschen chemischen Gesellschaft 1894;27(3):2985-2993 89 DE Koshland, Jr Correlation of Structure and Function in Enzyme Action Science 1963;142(3599):1533-1541 90 W Sherman, T Day, MP Jacobson, RA Friesner, R Farid Novel Procedure for Modeling Ligand/Receptor Induced Fit Effects J Med Chem 2006;49(2):534-553 91 D Fischer, R Norel, H Wolfson, R Nussinov Surface Motifs by a Computer Vision Technique: Searches, Detection, and Implications for Protein-Ligand Recognition Proteins 1993;16(3):278-292 92 M Rarey, B Kramer, T Lengauer, G Klebe A Fast Flexible Docking Method Using an Incremental Construction Algorithm J Mol Biol 1996;261(3):470-489 93 A Miranker, M Karplus Functionality Maps of Binding Sites: A Multiple Copy Simultaneous Search Method Proteins 1991;11(1):29-34 94 DS Goodsell, H Lauble, CD Stout, AJ Olson Automated Docking in Crystallography: Analysis of the Substrates of Aconitase Proteins 1993;17(1):1-10 95 CM Oshiro, ID Kuntz, JS Dixon Flexible Ligand Docking Using a Genetic Algorithm J Comput Aided Mol Des 1995;9(2):113-130 96 J Aqvist, VB Luzhkov, BO Brandsdal Ligand Binding Affinities from MD Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Simulations Acc Chem Res 2002;35(6):358-365 97 HJ Böhm Prediction of Binding Constants of Protein Ligands: A Fast Method for the Prioritization of Hits Obtained from De Novo Design or 3D Database Search Programs J Comput Aided Mol Des 1998;12(4):309-323 98 I Muegge, YC Martin A General and Fast Scoring Function for Protein-Ligand Interactions: A Simplified Potential Approach J Med Chem 1999;42(5):791-804 99 J Srinivasan, TE Cheatham, P Cieplak, PA Kollman, DA Case Continuum Solvent Studies of the Stability of DNA, RNA, and Phosphoramidate-DNA Helices J Am Chem.l Soc 1998;120(37):9401-9409 100 SF Sousa, PA Fernandes, MJ Ramos Protein-Ligand Docking: Current Status and Future Challenges Proteins 2006;65(1):15-26 101 GM Morris, DS Goodsell, RS Halliday et al Automated Docking Using a Lamarckian Genetic Algorithm and an Empirical Binding Free Energy Function J Comput Chem 1998;19(14):1639-1662 102 M Karplus, JA McCammon Molecular Dynamics Simulations of Biomolecules Nat Struct Biol 2002;9(9):646-652 103 JD Durrant, JA McCammon Molecular Dynamics Simulations and Drug Discovery BMC Biol 2011;9(1):71 104 RO Dror, DH Arlow, P Maragakis et al Activation Mechanism of the β2Adrenergic Receptor Proc Natl Acad Sci USA 2011;108(46):18684-18689 105 JD McCorvy, KV Butler, B Kelly et al Structure-Inspired Design of β-ArrestinBiased Ligands for Aminergic GPCRS Nat Chem Biol 2018;14(2):126-134 106 JF Cordero-Morales, V Jogini, A Lewis et al Molecular Driving Forces Determining Potassium Channel Slow Inactivation Nat Struct Mol Biol 2007;14(11):1062-1069 107 D Van Der Spoel, E Lindahl, B Hess et al GROMACS: Fast, Flexible, and Free Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh J Comput Chem 2005;26(16):1701-1718 108 E Lindahl, B Hess, D Van Der Spoel GROMACS 3.0: A Package for Molecular Simulation and Trajectory Analysis J Mol Model 2001;7(8):306-317 109 OJ Wouters, M McKee, J Luyten Estimated Research and Development Investment Needed to Bring a New Medicine to Market, 2009-2018 JAMA 2020;323(9):844-853 110 I Khanna Drug Discovery in Pharmaceutical Industry: Productivity Challenges and Trends Drug Discov Today 2012;17(19-20):1088-1102 111 S Basavaraj, GV Betageri Can Formulation and Drug Delivery Reduce Attrition During Drug Discovery and Development - Review of Feasibility, Benefits and Challenges Acta Pharm Sin B 2014;4(1):3-17 112 GK Kiriiri, PM Njogu, AN Mwangi Exploring Different Approaches to Improve the Success of Drug Discovery and Development Projects: A Review Future J Pharm Sci 2020;6(1):27 113 S Kar, J Leszczynski Open Access In Silico Tools to Predict the Admet Profiling of Drug Candidates Expert Opin Drug Discov 2020;15(12):1473-1487 114 JC Madden, SJ Enoch, A Paini, MTD Cronin A Review of In Silico Tools as Alternatives to Animal Testing: Principles, Resources and Applications Altern Lab Anim 2020;48(4):146-172 115 G Xiong, Z Wu, J Yi et al ADMETlab 2.0: An Integrated Online Platform for Accurate and Comprehensive Predictions of ADMET Properties Nucleic Acids Res 2021;49(1):5-14 116 A Daina, O Michielin, V Zoete SwissADME: A Free Web Tool to Evaluate Pharmacokinetics, Drug-Likeness and Medicinal Chemistry Friendliness of Small Molecules Sci Rep 2017;7(1):42717 117 QHD Nam, TKN Ngan, BD Vu et al Synthesis, Biological Evaluation, and Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Molecular Modeling Studies of 1-Aryl-1H-pyrazole-fused Curcumin Analogues as Anticancer Agents ACS Omega 2022;7(38):33963-33984 118 QHD Nam, BD Vu, HN Viet, NT Tuyen Synthesis of Monocarbonyl Analogues of Curcumin Containing 1H-Pyrazole Heterocyclic Journal of Medicine and Pharmacy (Vietnam) 2021;38:48-52 119 TT Thi, HN Viet, BN Ngoc et al Synthesis of Monocarbonyl Analogues of Curcumin Containing 1H-Pyrazole Heterocyclic from Phenylhydrazine and Its Derivatives Ho Chi Minh City Journal of Medicine 2021;25(2):72-79 120 TKN Ngan, QHD Nam, BN Ngoc et al Synthesis of Monocarbonyl Analogues of Curcumin Containing 1-(4-Nitrophenyl)-1H-pyrazole Heterocyclics Journal of Medicine and Pharmacy (Vietnam) 2022;46:59-64 121 QHD Nam, BN Ngoc, TKN Ngan et al Synthesis of Monocarbonyl Analogues of Curcumin Containing 1,3-Diphenyl-1H-pyrazole Heterocyclics Journal of Medicine and Pharmacy (Vietnam) 2022;48:34-39 122 TT Thi, DT Son, DTTN Tuyen, QHD Nam, NT Tuyen Synthesis of Monocarbonyl Analogues of Curcumin Containing 1H-Pyrazole Heterocyclic from Phenylhydrazine and Its Derivatives Journal of Medicine and Pharmacy (Vietnam) 2022;52:47-51 123 QHD Nam, TLN Phuong, TKN Ngan, TP Long, NT Tuyen Synthesis of 1HPyrazole-4-carbaldehyde and 4-Phenylbut-3-en-2-one Derivatives as Intermediates in Synthesis of Monocarbonyl Analogues of Curcumin Vietnamese Journal of Pharmacy 2019;59(12):55-58, 65 124 J Van Meerloo, GJL Kaspers, J Cloos Cell Sensitivity Assays: The MTT Assay IA Cree(s), eds Cancer Cell Culture: Methods and Protocols ed Humana Press; 2011:237-245 125 E Varkondi, E Schäfer, G Bökönyi et al Comparison of ELISA-Based Tyrosine Kinase Assays for Screening EGFR Inhibitors J Recept Signal Transduct Res Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 2005;25(1):45-56 126 SA Elmetwally, KF Saied, IH Eissa, EB Elkaeed Design, Synthesis and Anticancer Evaluation of Thieno[2,3-d]Pyrimidine Derivatives as Dual EGFR/HER2 Inhibitors and Apoptosis Inducers Bioorg Chem 2019;88:102944 127 A Ghith, KM Youssef, NSM Ismail, KAM Abouzid Design, Synthesis and Molecular Modeling Study of Certain VEGFR-2 Inhibitors Based on Thienopyrimidne Scaffold as Cancer Targeting Agents Bioorg Chem 2019;83:111128 128 J Portugal, MJ Waring Assignment of DNA Binding Sites for 4′,6-Diamidine2-Phenylindole and Bisbenzimide (Hoechst 33258) A Comparative Footprinting Study Biochim Biophys Acta Gene Regul Mech 1988;949(2):158-168 129 I Vermes, C Haanen, H Steffens-Nakken, C Reutelingsperger A Novel Assay for Apoptosis Flow Cytometric Detection of Phosphatidylserine Expression on Early Apoptotic Cells Using Fluorescein Labelled Annexin V J Immunol Methods 1995;184(1):39-51 130 AM Rieger, KL Nelson, JD Konowalchuk, DR Barreda Modified Annexin V/Propidium Iodide Apoptosis Assay for Accurate Assessment of Cell Death J Vis Exp 2011(50):2597 131 RU Jänicke, ML Sprengart, MR Wati, AG Porter Caspase-3 Is Required for DNA Fragmentation and Morphological Changes Associated with Apoptosis J Biol Chem 1998;273(16):9357-9360 132 C Jayat, M-H Ratinaud Cell Cycle Analysis by Flow Cytometry: Principles and Applications Biol Cell 1993;78(1):15-25 133 GM Morris, R Huey, W Lindstrom et al AutoDock and AutoDock Tools 4: Automated Docking with Selective Receptor Flexibility J Comput Chem 2009;30(16):2785-2791 134 PA Ravindranath, S Forli, DS Goodsell, AJ Olson, MF Sanner AutoDockFR: Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Advances in Protein-Ligand Docking with Explicitly Specified Binding Site Flexibility PLOS Comput Biol 2015;11(12):e1004586 135 Jin H Park, Y Liu, Mark A Lemmon, R Radhakrishnan Erlotinib Binds Both Inactive and Active Conformations of the EGFR Tyrosine Kinase Domain Biochem J 2012;448(3):417-423 136 Y Yosaatmadja, C Squire, C McKeage, M Flanagan 1.85 Angstrom Structure of EGFR Kinase Domain with Gefitinib (to be published) RCSB Protein Databank 2014 10.2210/pdb4WKQ/pdb 137 X-E Yan, P Ayaz, S-J Zhu et al Structural Basis of AZD9291 Selectivity for EGFRT790M J Med Chem 2020;63(15):8502-8511 138 TS Beyett, C To, DE Heppner et al Molecular Basis for Cooperative Binding and Synergy of ATP-Site and Allosteric EGFR Inhibitors Nat Commun 2022;13(1):2530 139 Molecular Operating Environment (MOE) Version 2015.10 Chemical Computing Group Inc.; 2015 140 MD Hanwell, DE Curtis, DC Lonie et al Avogadro: An Advanced Semantic Chemical Editor, Visualization, and Analysis Platform 2012;4(1):1-17 141 D Ramírez, J Caballero Is It Reliable to Take the Molecular Docking Top Scoring Position as the Best Solution without Considering Available Structural Data? Molecules 2018;23(5):1038 142 The PyMOL Molecular Graphics System Version 2.3.4 Schrodinger, LLC; 2021 143 J Huang, S Rauscher, G Nawrocki et al CHARMM36m: An Improved Force Field for Folded and Intrinsically Disordered Proteins Nat Methods 2017;14(1):7173 144 K Vanommeslaeghe, E Hatcher, C Acharya et al CHARMM General Force Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Field (CGenFF): A Force Field for Drug‐Like Molecules Compatible with the CHARMM All‐Atom Additive Biological Force Fields J Comput Chem 2010;31(4):671-690 145 W Humphrey, A Dalke, K Schulten VMD: Visual Molecular Dynamics J Mol Graph 1996;14(1):33-38 146 R Kumari, R Kumar, A Lynn g_mmpbsa - a Gromacs Tool for HighThroughput MM-PBSA Calculations J Chem Inf Model 2014;54(7):1951-1962 147 M Karplus, JN Kushick Method for Estimating the Configurational Entropy of Macromolecules Macromolecules 1981;14(2):325-332 148 NT Dan, HD Quang, V Van Truong et al Design, Synthesis, Structure, In Vitro Cytotoxic Activity Evaluation and Docking Studies on Target Enzyme GSK-3β of New Indirubin-3ʹ-oxime Derivatives Sci Rep 2020;10(1):11429 149 DA Cross, SE Ashton, S Ghiorghiu et al AZD9291, an Irreversible EGFR TKI, Overcomes T790M-Mediated Resistance to EGFR Inhibitors in Lung Cancer Cancer Discov 2014;4(9):1046-1061 150 JD Moyer, EG Barbacci, KK Iwata et al Induction of Apoptosis and Cell Cycle Arrest by CP-358,774, an Inhibitor of Epidermal Growth Factor Receptor Tyrosine Kinase Cancer Res 1997;57(21):4838-4848 151 BW Lee, GL Johnson, SA Hed et al DEVDase Detection in Intact Apoptotic Cells Using the Cell Permeant Fluorogenic Substrate, (Z-DEVD)-2-Cresyl Violet BioTechniques 2003;35(5):1080-1085 152 R Huey, GM Morris Using AutoDock with AutoDock Tools: A Tutorial The Scripps Research Institute, USA 2008;8:54-56 153 JB Baell, GA Holloway New Substructure Filters for Removal of Pan Assay Interference Compounds (PAINS) from Screening Libraries and for Their Exclusion in Bioassays J Med Chem 2010;53(7):2719-40 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 154 M Nakhjiri, M Safavi, E Alipour et al Asymmetrical 2,6- Bis(benzylidene)cyclohexanones: Synthesis, Cytotoxic Activity and QSAR Study Eur J Med Chem 2012;50:113-123 155 G-Z Ao, M-Z Zhou, Y-Y Li et al Discovery of Novel Curcumin Derivatives Targeting Xanthine Oxidase and Urate Transporter as Anti-Hyperuricemic Agents Bioorg Med Chem 2017;25(1):166-174 156 S Ying, X Du, W Fu et al Synthesis, Biological Evaluation, QSAR and Molecular Dynamics Simulation Studies of Potential Fibroblast Growth Factor Receptor Inhibitors for the Treatment of Gastric Cancer Eur J Med Chem 2017;127:885-899 157 Q Weng, L Fu, G Chen et al Design, Synthesis, and Anticancer Evaluation of Long-Chain Alkoxylated Mono-Carbonyl Analogues of Curcumin Eur J Med Chem 2015;103:44-55 158 F Chang, JT Lee, PM Navolanic et al Involvement of PI3K/Akt Pathway in Cell Cycle Progression, Apoptosis, and Neoplastic Transformation: A Target for Cancer Chemotherapy Leukemia 2003;17(3):590-603 159 C Loreto, G La Rocca, R Anzalone et al The Role of Intrinsic Pathway in Apoptosis Activation and Progression in Peyronie's Disease Biomed Res Int 2014;2014:616149 160 S Elmore Apoptosis: A Review of Programmed Cell Death Toxicol Pathol 2007;35(4):495-516 161 Y Wang, P Ji, J Liu et al Centrosome-Associated Regulators of the G2/M Checkpoint as Targets for Cancer Therapy Mol Cancer 2009;8:8 162 L Pu, AA Amoscato, ME Bier, JS Lazo Dual G1 and G2 Phase Inhibition by a Novel, Selective CDC25 Inhibitor 6-Chloro-7-(2-morpholin-4-ylethylamino)quinoline-5,8-dione J Biol Chem 2002;277(49):46877-85 163 JI Chao, PC Kuo, TS Hsu Down-Regulation of Survivin in Nitric Oxide- Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Induced Cell Growth Inhibition and Apoptosis of the Human Lung Carcinoma Cells J Biol Chem 2004;279(19):20267-76 164 X Xu, Y Zhang, D Qu, T Jiang, S Li Osthole Induces G2/M Arrest and Apoptosis in Lung Cancer A549 Cells by Modulating PI3K/Akt Pathway J Exp Clin Cancer Res 2011;30(1):33 165 C Lv, W Sun, H Sun et al Asperolide A, a Marine-Derived Tetranorditerpenoid, Induces G2/M Arrest in Human NCI-H460 Lung Carcinoma Cells, Is Mediated by p53-p21 Stabilization and Modulated by Ras/Raf/MEK/ERK Signaling Pathway Mar Drugs 2013;11(2):316-331 166 J Singh, RC Petter, TA Baillie, A Whitty The Resurgence of Covalent Drugs Nat Rev Drug Discov 2011;10(4):307-317 167 R Mah, JR Thomas, CM Shafer Drug Discovery Considerations in the Development of Covalent Inhibitors Bioorg Med Chem Lett 2014;24(1):33-39 168 Y Ai, L Yu, X Tan, X Chai, S Liu Discovery of Covalent Ligands Via Noncovalent Docking by Dissecting Covalent Docking Based on a “Steric-Clashes Alleviating Receptor (SCAR)” Strategy J Chem Inf Model 2016;56(8):1563-1575 169 RK Kancha, N von Bubnoff, C Peschel, J Duyster Functional Analysis of Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) Mutations and Potential Implications for EGFR Targeted Therapy Clin Cancer Res 2009;15(2):460-467 170 T Hirano, H Yasuda, T Tani et al In Vitro Modeling to Determine Mutation Specificity of EGFR Tyrosine Kinase Inhibitors against Clinically Relevant EGFR Mutants in Non-Small-Cell Lung Cancer Oncotarget 2015;6(36):38789-38803 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PHỤ LỤC Phụ lục DỮ LIỆU PHỔ CỦA CÁC DẪN CHẤT 1,3-DIPHENYL-1HPYRAZOL-4-CARBALDEHYD (j-n) Phụ lục 1.1 Dữ liệu phổ 1,3-diphenyl-1H-pyrazol-4-carbaldehyd (j) 1,3-Diphenyl-1H-pyrazol-4-carbaldehyd (j) CTPT: C16H12ON2 - MW: 248,29 Phụ lục 1.1.1 Phổ IR hợp chất j Phụ lục 1.1.2 Phổ MS hợp chất j Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục 1.1.3 Phổ 1H-NMR hợp chất j Phụ lục 1.1.4 Phổ 13C-NMR hợp chất j Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục 1.2 Dữ liệu phổ 3-(4-fluorophenyl)-1-phenyl-1H-pyrazol-4carbaldehyd (k) 3-(4-Fluorophenyl)-1-phenyl-1H-pyrazol-4-carbaldehyd (k) CTPT: C16H11FON2 - MW: 266,28 Phụ lục 1.2.1 Phổ IR hợp chất k Phụ lục 1.2.2 Phổ MS hợp chất k Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục 1.2.3 Phổ 1H-NMR hợp chất k Phụ lục 1.2.4 Phổ 13C-NMR hợp chất k Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục 1.3 Dữ liệu phổ 3-(4-methoxyphenyl)-1-phenyl-1H-pyrazol-4carbaldehyd (l) 3-(4-Methoxyphenyl)-1-phenyl-1H-pyrazol-4-carbaldehyd (l) CTPT: C17H14O2N2 - MW: 278,31 Phụ lục 1.3.1 Phổ IR hợp chất l Phụ lục 1.3.2 Phổ MS hợp chất l Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục 1.3.3 Phổ 1H-NMR hợp chất l Phụ lục 1.3.4 Phổ 13C-NMR hợp chất l Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục 1.4 Dữ liệu phổ 1-(4-methoxyphenyl)-3-phenyl-1H-pyrazol-4carbaldehyd (m) 1-(4-Methoxyphenyl)-3-phenyl-1H-pyrazol-4-carbaldehyd (m) CTPT: C17H14O2N2 - MW: 278,31 Phụ lục 1.4.1 Phổ IR hợp chất m Phụ lục 1.4.2 Phổ MS hợp chất m Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục 1.4.3 Phổ 1H-NMR hợp chất m Phụ lục 1.4.4 Phổ 13C-NMR hợp chất m Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục 1.5 Dữ liệu phổ 3-(4-fluorophenyl)-1-(4-methoxyphenyl)-1Hpyrazol-4-carbaldehyd (n) 3-(4-Fluorophenyl)-1-(4-methoxyphenyl)-1H-pyrazol-4-carbaldehyd (n) CTPT: C17H13FO2N2 - MW: 296,30 Phụ lục 1.5.1 Phổ IR hợp chất n Phụ lục 1.5.2 Phổ MS hợp chất n Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục 1.5.3 Phổ 1H-NMR hợp chất n Phụ lục 1.5.4 Phổ 13C-NMR hợp chất n Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục DỮ LIỆU PHỔ CỦA CÁC DẪN CHẤT (E)-2-(PHENYL METHYLEN)CYCLOHEXAN-1-ON (1-4) Phụ lục 2.1 Dữ liệu phổ (E)-2-[(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)methylen] cyclohexan-1-on (1) (E)-2-[(4-Hydroxy-3-methoxyphenyl)methylen]cyclohexan-1-on (1) CTPT: C14H16O3 - MW: 232,28 Phụ lục 2.1.1 Phổ IR hợp chất Phụ lục 2.1.2 Phổ MS hợp chất Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục 2.1.3 Phổ 1H-NMR hợp chất Phụ lục 2.1.4 Phổ 13C-NMR hợp chất Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục 2.2 Dữ liệu phổ (E)-2-[(3-hydroxy-4-methoxyphenyl)methylen] cyclohexan-1-on (2) (E)-2-[(3-Hydroxy-4-methoxyphenyl)methylen]cyclohexan-1-on (2) CTPT: C14H16O3 - MW: 232,28 Phụ lục 2.2.1 Phổ IR hợp chất Phụ lục 2.2.2 Phổ MS hợp chất Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục 2.2.3 Phổ 1H-NMR hợp chất Phụ lục 2.2.4 Phổ 13C-NMR hợp chất Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục 2.3 Dữ liệu phổ (E)-2-[(3,4,5-trimethoxyphenyl)methylen] cyclohexan-1-on (3) (E)-2-[(3,4,5-Trimethoxyphenyl)methylen]cyclohexan-1-on (3) CTPT: C16H20O4 - MW: 276,33 Phụ lục 2.3.1 Phổ IR hợp chất Phụ lục 2.3.2 Phổ MS hợp chất Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục 2.3.3 Phổ 1H-NMR hợp chất Phụ lục 2.3.4 Phổ 13C-NMR hợp chất Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục 2.4 Dữ liệu phổ (E)-2-[(4-hydroxy-3,5-dimethoxyphenyl)methylen] cyclohexan-1-on (4) (E)-2-[(4-Hydroxy-3,5-dimethoxyphenyl)methylen]cyclohexan-1-on (4) CTPT: C15H18O4 - MW: 262,31 Phụ lục 2.4.1 Phổ IR hợp chất Phụ lục 2.4.2 Phổ MS hợp chất Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục 2.4.3 Phổ 1H-NMR hợp chất Phụ lục 2.4.4 Phổ 13C-NMR hợp chất Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục DỮ LIỆU PHỔ CỦA CÁC MACS CHỨA CẤU TRÚC NỐI CYCLOHEXANON (j1-n3) Phụ lục 3.1 Dữ liệu phổ j1 (2E,6E)-2-[(4-Hydroxy-3-methoxyphenyl)methylen]-6-[(1,3-diphenyl-1H-pyrazol4-yl)methylen]cyclohexan-1-on (j1) CTPT: C30H26N2O3 - MW: 462,55 Phụ lục 3.1.1 Phổ IR hợp chất j1 Phụ lục 3.1.2 Phổ MS hợp chất j1 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục 3.1.3 Phổ 1H-NMR hợp chất j1 Phụ lục 3.1.4 Phổ 13C-NMR hợp chất j1 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục 3.2 Dữ liệu phổ j2 (2E,6E)-2-[(3-Hydroxy-4-methoxyphenyl)methylen]-6-[(1,3-diphenyl-1H-pyrazol4-yl)methylen]cyclohexan-1-on (j2) CTPT: C30H26N2O3 - MW: 462,55 Phụ lục 3.2.1 Phổ IR hợp chất j2 Phụ lục 3.2.2 Phổ MS hợp chất j2 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục 3.2.3 Phổ 1H-NMR hợp chất j2 Phụ lục 3.2.4 Phổ 13C-NMR hợp chất j2 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục 3.3 Dữ liệu phổ j3 (2E,6E)-2-[(3,4,5-Trimethoxyphenyl)methylen]-6-[(1,3-diphenyl-1H-pyrazol-4yl)methylen]cyclohexan-1-on (j3) CTPT: C32H30N2O4 - MW: 506,60 Phụ lục 3.3.1 Phổ IR hợp chất j3 Phụ lục 3.3.2 Phổ MS hợp chất j3 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục 3.3.3 Phổ 1H-NMR hợp chất j3 Phụ lục 3.3.4 Phổ 13C-NMR hợp chất j3 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục 3.4 Dữ liệu phổ j4 (2E,6E)-2-[(4-Hydroxy-3,5-dimethoxyphenyl)methylen]-6-[(1,3-diphenyl-1Hpyrazol-4-yl)methylen]cyclohexan-1-on (j4) CTPT: C31H28N2O4 - MW: 492,58 Phụ lục 3.4.1 Phổ IR hợp chất j4 Phụ lục 3.4.2 Phổ MS hợp chất j4 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục 3.4.3 Phổ 1H-NMR hợp chất j4 Phụ lục 3.4.4 Phổ 13C-NMR hợp chất j4 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục 3.5 Dữ liệu phổ k1 (2E,6E)-2-[[3-(4-Fluorophenyl)-1-phenyl-1H-pyrazol-4-yl]methylen]-6-[(4hydroxy-3-methoxyphenyl)methylen]cyclohexan-1-on (k1) CTPT: C30H25FN2O3 - MW: 480,54 Phụ lục 3.5.1 Phổ IR hợp chất k1 Phụ lục 3.5.2 Phổ MS hợp chất k1 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục 3.5.3 Phổ 1H-NMR hợp chất k1 Phụ lục 3.5.4 Phổ 13C-NMR hợp chất k1 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục 3.6 Dữ liệu phổ k2 (2E,6E)-2-[[3-(4-Fluorophenyl)-1-phenyl-1H-pyrazol-4-yl]methylen]-6-[(3hydroxy-4-methoxyphenyl)methylen]cyclohexan-1-on (k2) CTPT: C30H25FN2O3 - MW: 480,54 Phụ lục 3.6.1 Phổ IR hợp chất k2 Phụ lục 3.6.2 Phổ MS hợp chất k2 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục 3.6.3 Phổ 1H-NMR hợp chất k2 Phụ lục 3.6.4 Phổ 13C-NMR hợp chất k2 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục 3.7 Dữ liệu phổ k3 (2E,6E)-2-[[3-(4-Fluorophenyl)-1-phenyl-1H-pyrazol-4-yl]methylen]-6-[(3,4,5trimethoxyphenyl)methylen]cyclohexan-1-on (k3) CTPT: C32H29FN2O4 - MW: 524,59 Phụ lục 3.7.1 Phổ IR hợp chất k3 Phụ lục 3.7.2 Phổ MS hợp chất k3 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục 3.7.3 Phổ 1H-NMR hợp chất k3 Phụ lục 3.7.4 Phổ 13C-NMR hợp chất k3 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục 3.8 Dữ liệu phổ k4 (2E,6E)-2-[[3-(4-Fluorophenyl)-1-phenyl-1H-pyrazol-4-yl]methylen]-6-[(4hydroxy-3,5-dimethoxyphenyl)methylen]cyclohexan-1-on (k4) CTPT: C31H27FN2O4 - MW: 510,57 Phụ lục 3.8.1 Phổ IR hợp chất k4 Phụ lục 3.8.2 Phổ MS hợp chất k4 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục 3.8.3 Phổ 1H-NMR hợp chất k4 Phụ lục 3.8.4 Phổ 13C-NMR hợp chất k4 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục 3.9 Dữ liệu phổ l1 (2E,6E)-2-[(4-Hydroxy-3-methoxyphenyl)methylen]-6-[[3-(4-methoxyphenyl)-1phenyl-1H-pyrazol-4-yl]methylen]cyclohexan-1-on (l1) CTPT: C31H28N2O4 - MW: 492,58 Phụ lục 3.9.1 Phổ IR hợp chất l1 Phụ lục 3.9.2 Phổ MS hợp chất l1 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục 3.9.3 Phổ 1H-NMR hợp chất l1 Phụ lục 3.9.4 Phổ 13C-NMR hợp chất l1 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục 3.10 Dữ liệu phổ l2 (2E,6E)-2-[(3-Hydroxy-4-methoxyphenyl)methylen]-6-[[3-(4-methoxyphenyl)-1phenyl-1H-pyrazol-4-yl]methylen]cyclohexan-1-on (l2) CTPT: C31H28N2O4 - MW: 492,58 Phụ lục 3.1.1 Phổ IR hợp chất l2 Phụ lục 3.10.2 Phổ MS hợp chất l2 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục 3.10.3 Phổ 1H-NMR hợp chất l2 Phụ lục 3.10.4 Phổ 13C-NMR hợp chất l2 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục 3.11 Dữ liệu phổ l3 (2E,6E)-2-[(3,4,5-Trimethoxyphenyl)methylen]-6-[[3-(4-methoxyphenyl)-1-phenyl1H-pyrazol-4-yl]methylen]cyclohexan-1-on (l3) CTPT: C33H32N2O5 - MW: 536,63 Phụ lục 3.11.1 Phổ IR hợp chất l3 Phụ lục 3.11.2 Phổ MS hợp chất l3 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục 3.11.3 Phổ 1H-NMR hợp chất l3 Phụ lục 3.11.4 Phổ 13C-NMR hợp chất l3 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục 3.12 Dữ liệu phổ l4 (2E,6E)-2-[(4-Hydroxy-3,5-dimethoxyphenyl)methylen]-6-[[3-(4-methoxyphenyl)1-phenyl-1H-pyrazol-4-yl]methylen]cyclohexan-1-on (l4) CTPT: C32H30N2O5 - MW: 522,60 Phụ lục 3.12.1 Phổ IR hợp chất l4 Phụ lục 3.12.2 Phổ MS hợp chất l4 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục 3.12.3 Phổ 1H-NMR hợp chất l4 Phụ lục 3.12.4 Phổ 13C-NMR hợp chất l4 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục 3.13 Dữ liệu phổ m1 (2E,6E)-2-[(4-Hydroxy-3-methoxyphenyl)methylen]-6-[[1-(4-methoxyphenyl)-3phenyl-1H-pyrazol-4-yl]methylen]cyclohexan-1-on (m1) CTPT: C31H28N2O4 - MW: 492,58 Phụ lục 3.13.1 Phổ IR hợp chất m1 Phụ lục 3.13.2 Phổ MS hợp chất m1 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục 3.13.3 Phổ 1H-NMR hợp chất m1 Phụ lục 3.13.4 Phổ 13C-NMR hợp chất m1 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục 3.14 Dữ liệu phổ m2 (2E,6E)-2-[(3-Hydroxy-4-methoxyphenyl)methylen]-6-[[1-(4-methoxyphenyl)-3phenyl-1H-pyrazol-4-yl]methylen]cyclohexan-1-on (m2) CTPT: C31H28N2O4 - MW: 492,58 Phụ lục 3.14.1 Phổ IR hợp chất m2 Phụ lục 3.14.2 Phổ MS hợp chất m2 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục 3.14.3 Phổ 1H-NMR hợp chất m2 Phụ lục 3.14.4 Phổ 13C-NMR hợp chất m2 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục 3.15 Dữ liệu phổ m3 (2E,6E)-2-[(3,4,5-Trimethoxyphenyl)methylen]-6-[[1-(4-methoxyphenyl)-3-phenyl1H-pyrazol-4-yl]methylen]cyclohexan-1-on (m3) CTPT: C33H32N2O5 - MW: 536,63 Phụ lục 3.15.1 Phổ IR hợp chất m3 Phụ lục 3.15.2 Phổ MS hợp chất m3 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục 3.15.3 Phổ 1H-NMR hợp chất m3 Phụ lục 3.15.4 Phổ 13C-NMR hợp chất m3 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục 3.16 Dữ liệu phổ m4 (2E,6E)-2-[(4-Hydroxy-3,5-dimethoxyphenyl)methylen]-6-[[1-(4-methoxyphenyl)3-phenyl-1H-pyrazol-4-yl]methylen]cyclohexan-1-on (m4) CTPT: C32H30N2O5 - MW: 522,60 Phụ lục 3.16.1 Phổ IR hợp chất m4 Phụ lục 3.16.2 Phổ MS hợp chất m4 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục 3.16.3 Phổ 1H-NMR hợp chất m4 Phụ lục 3.16.4 Phổ 13C-NMR hợp chất m4 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục 3.17 Dữ liệu phổ n2 (2E,6E)-2-[[3-(4-Fluorophenyl)-1-(4-methoxyphenyl)-1H-pyrazol-4-yl] methylen]6-[(3-hydroxy-4-methoxyphenyl)methylen]cyclohexan-1-on (n2) CTPT: C31H27FN2O4 - MW: 510,57 Phụ lục 3.17.1 Phổ IR hợp chất n2 Phụ lục 3.17.2 Phổ MS hợp chất n2 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục 3.17.3 Phổ 1H-NMR hợp chất n2 Phụ lục 3.17.4 Phổ 13C-NMR hợp chất n2 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục 3.18 Dữ liệu phổ n3 (2E,6E)-2-[[3-(4-Fluorophenyl)-1-(4-methoxyphenyl)-1H-pyrazol-4-yl] methylen]6-[(3,4,5-trimethoxyphenyl)methylen]cyclohexan-1-on (n3) CTPT: C33H31FN2O5 - MW: 554,62 Phụ lục 3.18.1 Phổ IR hợp chất n3 Phụ lục 3.18.2 Phổ MS hợp chất n3 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục 3.18.3 Phổ 1H-NMR hợp chất n3 Phụ lục 3.18.4 Phổ 13C-NMR hợp chất n3 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục DỮ LIỆU THỬ NGHIỆM ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG GÂY ĐỘC TÍNH TẾ BÀO UNG THƯ IN VITRO IC50 (µM) MACs SW480 MDA-MB-231 A549 a1 8,17 ± 0,73 9,39 ± 0,61 12,37 ± 1,72 a2 8,11 ± 0,19 6,68 ± 0,18 7,30 ± 0,48 a3 58,62 ± 6,95 60,97 ± 4,55 94,93 ± 14,86 a4 4,86 ± 0,33 4,89 ± 0,20 4,44 ± 0,32 b1 7,50 ± 0,94 4,35 ± 0,35 9,79 ± 0,44 b2 7,27 ± 0,70 6,55 ± 0,89 7,40 ± 0,49 b3 41,20 ± 6,26 56,55 ± 5,56 69,35 ± 4,43 b4 10,41 ± 0,95 25,01 ± 5,82 21,36 ± 2,83 c1 5,72 ± 0,39 6,33 ± 0,46 6,94 ± 0,38 c2 5,75 ± 0,49 5,45 ± 0,31 6,29 ± 0,28 c3 17,32 ± 1,68 13,58 ± 1,02 22,06 ± 1,27 c4 7,39 ± 0,39 8,32 ± 0,45 12,36 ± 1,44 d1 > 100 > 100 > 100 d2 > 100 > 100 > 100 d3 > 100 > 100 > 100 d4 > 100 > 100 > 100 e1 > 100 > 100 > 100 e2 > 100 > 100 > 100 e3 > 100 > 100 > 100 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh IC50 (µM) MACs SW480 MDA-MB-231 A549 e4 > 100 > 100 > 100 f1 > 100 > 100 > 100 f2 > 100 > 100 > 100 f3 > 100 > 100 > 100 f4 > 100 > 100 > 100 g1 7,71 ± 0,21 8,37 ± 1,32 7,99 ± 0,45 g2 6,29 ± 0,33 4,92 ± 0,19 4,64 ± 0,15 g3 64,36 ± 6,36 71,09 ± 7,11 94,52 ± 7,53 g4 > 100 > 100 > 100 h1 3,82 ± 0,34 7,72 ± 0,72 4,89 ± 0,24 h2 3,22 ± 0,22 5,34 ± 0,24 4,69 ± 0,35 h3 > 100 > 100 > 100 h4 40,95 ± 3,12 60,21 ± 6,85 48,42 ± 5,78 i1 5,70 ± 0,39 9,48 ± 1,18 10,28 ± 1,15 i2 4,70 ± 0,37 7,89 ± 0,52 6,59 ± 0,61 i3 > 100 > 100 > 100 i4 > 100 > 100 > 100 j1 55,65 ± 7,22 67,82 ± 6,44 70,13 ± 4,28 j2 43,09 ± 3,80 49,78 ± 6,07 64,24 ± 6,04 j3 > 100 > 100 > 100 j4 73,79 ± 8,06 75,78 ± 6,66 92,94 ± 7,67 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh IC50 (µM) MACs SW480 MDA-MB-231 A549 k1 34,27 ± 4,53 35,14 ± 3,80 58,63 ± 3,45 k2 25,46 ± 2,01 32,16 ± 1,84 37,13 ± 4,48 k3 > 100 > 100 > 100 k4 50,12 ± 8,89 57,32 ± 2,51 65,75 ± 5,40 l1 > 100 > 100 > 100 l2 > 100 > 100 > 100 l3 > 100 > 100 > 100 l4 > 100 > 100 > 100 m1 41,10 ± 4,63 45,40 ± 2,05 33,54 ± 2,27 m2 > 100 > 100 > 100 m3 > 100 > 100 > 100 m4 >100 >100 >100 n2 > 100 > 100 > 100 n3 > 100 > 100 > 100 Ell 1,38 ± 0,12* 1,71 ± 0,20* 1,58 ± 0,16* *p < 0,05 so với giá trị IC50 hợp chất thử nghiệm (a1-n3) Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục DỮ LIỆU THỬ NGHIỆM ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ HOẠT ĐỘNG TYROSIN KINASE CỦA EGFR IN VITRO Phụ lục 5.1 Dữ liệu thử nghiệm đánh giá khả ức chế EGFR in vitro Tỷ lệ ức chế (%) IC50 (µM) Hợp chất EGFRWT EGFRL858R EGFRWT EGFRL858R a2, µM 14,77 ± 1,33 31,77 ± 1,63 - - a4, µM 30,56 ± 2,34* 41,08 ± 1,54* 15,19 ± 0,84† 7,21 ± 1,28† b1, µM 18,59 ± 0,34 32,43 ± 2,87 - - b2, µM 15,70 ± 0,91 22,54 ± 1,77 - - c1, µM 14,24 ± 2,74 23,57 ± 1,14 - - c2, µM 6,48 ± 0,64 17,29 ± 0,72 - - g2, µM 13,42 ± 2,72 30,48 ± 0,92 - - h1, µM 14,47 ± 2,96 25,77 ± 0,91 - - h2, µM 14,74 ± 0,97 21,58 ± 1,33 - - i2, µM 6,56 ± 1,33 13,22 ± 0,79 - - Erl, 0,3 nM 21,77 ± 1,55 - Erl, nM 75,35 ± 0,82 - 1,22 ± 0,17 nM - Erl, 30 nM 102,43 ± 0,11 - Osi, nM - 11,89 ± 0,84 Osi, 10 nM - 61,66 ± 0,25 - 9,47 ± 0,40 nM Osi, 100 nM - 93,41 ± 0,55 *p < 0,05 so với giá trị MACs khác †p < 0,05 so với giá trị IC50 đối chứng dương tương ứng Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục 5.2 Dữ liệu thử nghiệm đánh giá khả ức chế protein tyrosin kinase khác in vitro Tỷ lệ ức chế (%) Hợp chất HER2 VEGFR2 a2, µM 10,75 ± 1,09 10,98 ± 1,80 a4, µM 17,27 ± 0,41* 20,51 ± 4,59* b1, µM 8,64 ± 0,53 9,22 ± 1,77 b2, µM 4,32 ± 0,83 3,69 ± 2,41 c1, µM 18,40 ± 0,31* 16,77 ± 0,25* c2, µM 6,73 ± 0,60 4,07 ± 1,34 g2, µM 6,60 ± 0,30 5,60 ± 2,05 h1, µM 2,34 ± 0,53 5,94 ± 0,32 h2, µM 2,22 ± 2,02 2,98 ± 0,39 i2, µM 7,85 ± 2,93 4,96 ± 2,32 Sta, nM 22,13 ± 1,25 27,43 ± 0,69 Sta, 30 nM 66,81 ± 1,52 74,38 ± 0,44 Sta, 300 nM 101,48 ± 2,06 108,81 ± 0,25 *p < 0,05 so với giá trị MACs khác Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục DỮ LIỆU THỬ NGHIỆM ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KÍCH HOẠT APOPTOSIS IN VITRO A a4 - 10 μM a4 - μM Cam - 0,5 μM B a4 - 10 μM a4 - 2,5 μM Đối chứng âm a4 - μM Cam - 0,5 μM a4 - 2,5 μM Đối chứng âm Phân bố quần thể tế bào SW480 giai đoạn apoptosis sau xử lý với hợp chất a4 nồng độ 10 - - 2,5 µM Cam nồng độ 0,5 µM khoảng thời gian (A) 24 (B) 48 giờ, so sánh với mẫu đối chứng âm DMSO 0,5% Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục DỮ LIỆU THỬ NGHIỆM ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ẢNH HƯỞNG LÊN CHU KỲ TẾ BÀO IN VITRO A Đối chứng âm a4 - 10 μM a4 - μM a4 - 2,5 μM B Đối chứng âm a4 - 10 μM a4 - μM a4 - 2,5 μM Phân bố quần thể tế bào giai đoạn khác chu kỳ TBUT SW480 sau xử lý với hợp chất a4 nồng độ 10 - - 2,5 µM khoảng thời gian (A) 24 (B) 48 giờ, so sánh với mẫu đối chứng âm DMSO 0,5% Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục DỮ LIỆU THỬ NGHIỆM ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG GẮN KẾT VỚI EGFR IN SILICO Phụ lục 8.1 Kết docking tập trung thuận nghịch ligand ĐKT hợp chất a4 Docking mù Vị trí gắn kết Erl Cạnh tranh ATP Gef Cạnh tranh ATP Docking tập trung D Ga RMSD (Å) (kcal.mol–1) (1)b –8,45 –8,68 (2)c Tương tác Van der waals Liên kết hydro EGFRWT JBJ Allosteric –9,20 –11,38 Kém phân cựce 1,27 0,56 K728 M793 C797 L788 Q791 L792 L718 V726 A743 K745 w1104 M793 P794 F795 L788 L844 Q791 M793 F795 L718 V726 A743 K745 D800 L788 L844 Q791 P794 F795 L718 V726 A743 K745 C797 M793 L844 A743 L788 D855 K745 L747 I759 M766 3,83 1,77 M793 D800 w1104 Osi Cạnh tranh ATP Phân cựcd 3,14 1,15 M793 D800 2,24 - T854 D855 F856 V786 L788 L858 L861 a4 Cạnh tranh ATP –9,44 - - K728 M793 L792 P794 F795 L718 V726 A743 K745 R841 L844 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Docking mù Vị trí gắn kết Docking tập trung D Ga RMSD (Å) (kcal.mol ) (1) –1 Erl Cạnh tranh ATP –8,32 b (2) c Tương tác Van der waals Liên kết hydro 1,50 0,42 K728 M793 C797 w1104 Gef Cạnh tranh ATP –8,39 3,67 1,59 M793 D800 EGFRL858R w1104 Osi Cạnh tranh ATP JBJ Allosteric –9,07 –11,68 2,99 1,23 M793 D800 2,01 - T854 D855 F856 Phân cựcd Kém phân cựce L788 Q791 L792 L718 V726 A743 K745 M793 D800 M793 L844 Q791 M793 F795 L718 V726 A743 K745 G796 C797 D800 L788 L792 M793 L844 Q791 P794 F795 L718 V726 A743 K745 C797 M793 L844 A743 L788 D855 K745 I759 M766 V786 L788 R858 K860 L861 a4 Cạnh tranh ATP –9,43 - - K728 M793 L792 P794 L718 V726 A743 K745 R841 L844 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Docking mù Vị trí gắn kết Docking tập trung D Ga RMSD (Å) (kcal.mol ) (1) –1 Erl Cạnh tranh ATP –8,48 b (2) c Tương tác Van der waals Liên kết hydro 1,18 0,42 K728 M793 C797 w1104 Gef Cạnh tranh ATP –8,55 3,89 1,59 M793 D800 EGFRG719S w1104 Osi Cạnh tranh ATP JBJ Allosteric –9,33 –11,39 3,30 1,30 M793 F795 2,17 - T854 D855 F856 Phân cựcd Kém phân cựce L788 Q791 L792 L718 V726 A743 K745 M793 L788 L844 Q791 M793 F795 L718 V726 A743 K745 C797 D800 L788 M793 L844 L718 Q791 M793 L718 V726 A743 K745 F795 C797 D800 M793 L844 A743 L788 D855 K745 L747 I759 M766 V786 L788 L858 L861 a4 Cạnh tranh ATP –9,74 - - K728 M793 K728 L792 P794 L718 V726 A743 K745 L792 R841 L844 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Docking mù Vị trí gắn kết Docking tập trung D Ga RMSD (Å) (kcal.mol ) (1) –1 Erl Cạnh tranh ATP Gef Cạnh tranh ATP –8,47 –8,65 b (2) c Tương tác Van der waals Liên kết hydro EGFRG724S JBJ Allosteric –9,66 –11,60 Kém phân cựce 1,18 0,42 K728 M793 C797 L718 L788 G796 L718 V726 A743 K745 w1104 Q791-P794 D800 L788 M793 L844 Q791 M793 F795 L718 V726 A743 K745 G796 C797 D800 L788 L792 M793 L844 L718 Q791 C797 L718 V726 A743 K745 M793-F795 D800 M793 L844 A743 L788 D855 K745 L747 I759 M766 3,68 1,41 M793 D800 w1104 Osi Cạnh tranh ATP Phân cựcd 3,33 1,40 M793 D800 2,32 - T854 D855 F856 V786 L788 L858 L861 a4 Cạnh tranh ATP –9,52 - - K728 M793 L792 P794 L718 V726 A743 K745 R841 L844 a Năng lượng gắn kết cao cấu dạng đại diện cho cluster lựa chọn bRMSD tính với tồn phân tử cRMSD tính với phần cấu trúc phân tử sau loại trừ phần dây nhánh tiếp xúc với dung môi dTương tác phân cực kể đến liên kết hydro khơng điển hình, tương tác cation-pi, proton-pi, pi-pi eTương tác không phân cực kể đến tương tác alkyl-alkyl, pi-alkyl (-) Không xác định Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục 8.2 Kết docking tập trung không thuận nghịch Osi hợp chất a4 H N N O C797 S N N N O N N NH C797 O O O * N N OH S N S OH O C797 Osi-S-C797 O * O (1R/S)-a4-S-C797 (5R/S)-a4-S-C797 a4-S-C797 Osi-S-C797 DGa (kcal.mol–1) EGFRWT RMSDb (Å) Liên kết hydro (1R) (1S) (5R) (5S) –10,57 –9,07 –8,67 –8,94 –9,16 0,66 10,26 9,85 6,23 6,23 w1104 w1104 M793 D800 K745 R841 K875 K745 R841 K875 Phân cựcc Q791 P794 F795 G724 N842 Không phân cựcd L718 V726 A743 L718 S720 V726 K745 M793 L844 K745 L844 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn N842 D855 G719 L718 S720 V726 L718 V726 A743 L718 V726 A743 K745 R841 L844 K745 L844 K745 L788 L844 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh a4-S-C797 EGFRL858R Osi-S-C797 (1S) (5R) (5S) DGa (kcal.mol–1) –9,48 –8,97 –8,71 –8,98 –9,10 RMSDb (Å) 2,08 10,31 10,12 6,22 6,50 Liên kết hydro M793 D800 K745 R841 K875 K745 R841 K875 w1104 Phân cựcc Q791 L792 F795 G724 N842 D855 G724 N842 D855 D800 R841 Không phân cựcd L718 V726 K728 L718 S720 V726 L718 S720 V726 L718 V726 A743 L718 V726 A743 A743 M793 L844 K745 R841 L844 K745 R841 L844 K745 R841 L844 K745 L788 L844 DGa (kcal.mol–1) RMSDb (Å) EGFRG719S (1R) Liên kết hydro L718 –10,68 –9,31 –9,02 –9,19 –9,97 0,82 10,49 10,33 8,99 6,49 M793 D800 K745 R841 K875 K745 R841 K875 S719 w1104 S719 w1104 Phân cựcc Q791 P794 F795 G724 N842 D855 G724 N842 D855 D800 R841 L718 Không phân cựcd L718 V726 A743 L718 S720 V726 L718 S720 V726 L718 V726 A743 L718 V726 A743 K745 M793 L844 K745 R841 L844 K745 R841 L844 K745 R841 L844 K745 R841 L844 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh a4-S-C797 Osi-S-C797 DGa (kcal.mol–1) EGFRG724S RMSDb (Å) Liên kết hydro (1R) (1S) (5R) (5S) –10,19 –8,99 –8,87 –9,13 –9,17 0,94 10,10 9,64 6,13 6,43 M793 F795 K745 R841 K875 K745 R841 K875 w1104 G719 Phân cựcc Q791 P794 D800 S724 N842 D855 Không phân cựcd L718 V726 A743 L718 S720 V726 K745 M793 L844 K745 R841 L844 a N842 D855 L718 V726 K745 L718 V726 A743 L718 V726 A743 R841 L844 K745 L844 K745 L788 L844 Năng lượng gắn kết cao cấu dạng đại diện cho cluster lựa chọn bThay đổi vị trí tương đối dạng gắn kết thuận nghịch với dạng gắn kết không thuận nghịch tương ứng, tính với tồn phân tử cTương tác phân cực kể đến liên kết hydro khơng điển hình, tương tác cation-pi, proton-pi, pi-pi dTương tác không phân cực kể đến tương tác alkyl-alkyl, pi-alkyl (-) Không xác định Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục 8.3 Giá trị RMSF dạng apo-EGFR phức hợp với a4 Erl tương ứng B EGFRWT 0.8 0.6 EGFRWT-Apo WT 0.4 EGFR 0.2 EGFRWT-a4 0.0 703 733 763 793 823 853 883 913 943 -Erl RMSF (nm) RMSF (nm) A EGFRL858R 0.8 0.6 EGFRL858R-Apo 0.4 EGFRL858R-Erl 0.2 EGFRL858R-a4 0.0 703 973 733 763 793 Đơn vị aminoacid D EGFRG719S 0.8 0.6 EGFRG719S-Apo G719S 0.4 EGFR 0.2 EGFRG719S-a4 0.0 703 733 763 793 823 853 883 913 943 -Erl RMSF (nm) RMSF (nm) C RMSF (nm) 0.2 C15 O2 C17 O O1 C10 C11 Erl N N N3 C9 HN N1 F C16 C12 C4 C2 C1 WT EGFR C3 C8 C5 C6 913 943 973 0.6 EGFRG724S-Apo 0.4 EGFRG724S-Erl 0.2 EGFRG724S-a4 733 763 793 EGFRL858R C7 EGFRG719S G724S EGFR 0.1 C17 0.2 C6 C16 C1 C4 C3 N1 N 0.3 883 913 943 973 O1 C7 C11 853 C8 C10 0.4 823 Đơn vị aminoacid C9 N2 O3 C20 O C14 C13 O C21 O C18 C19 0.3 O4 883 EGFRG724S 0.0 703 973 RMSF (nm) C22 853 0.8 Đơn vị aminoacid E 0.4 823 Đơn vị aminoacid O C20 C26 C21 C18 C2 C19 C5 N2 N C22 C23 C12 O2 O C13 a4 O4 O C25 C24 C28 OH O3 C27 EGFRWT EGFRL858R EGFRG719S C15 C14 EGFRG724S 0.1 0.0 C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9 C10 C11 C12 C13 C14 C15 C16 C17 C18 C19 C20 C21 C22 N1 N2 N3 O1 O2 O3 O4 C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9 C10 C11 C12 C13 C14 C15 C16 C17 C18 C19 C20 C21 C22 C23 C24 C25 C26 C27 C28 N1 N2 O1 O2 O3 O4 0.0 Nguyên tử Nguyên tử Giá trị RMSF (nm) dạng apo-EGFR phức hợp với a4 Erl tương ứng (A-D) giá trị RMSF (nm) a4 (E) Erl (F) phức hợp Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục 8.4 Liên kết hydro có tần suất 10% ghi nhận khoảng thời gian 30-100 ns hệ mô Aminoacid Tần suất EGFRWT-Erl Aminoacid Tần suất EGFRWT-a4 Aminoacid Tần suất EGFRL858R-Erl Aminoacid Tần suất EGFRL858R-a4 M793 90,8% M793 91,7% M793 98,4% M793 99,0% L788 35,4% K745 28,8% L788 34,8% K745 75,0% G719 20,6% T790 19,4% Q791 17,6% w1104 14,8% EGFRG719S-Erl EGFRG719S-a4 EGFRG724S-Erl EGFRG724S-a4 M793 97,6% K745 79,7% M793 108,2% H805 24,0% L788 31,8% M793 62,7% L788 28,8% M793 12,4% w1104 30,7% Q791 16,9% Q791 22,1% Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục 8.5 Các lượng tương tác thành phần (kcal.mol–1) ước tính a4 Erl với dạng EGFR Gsolvat Eelec EvdW Gpolar Gnon polar EGFRWT Erl –13,40 ± 2,78 –40,12 ± 3,36 47,65 ± 5,98 –4,82 ± 0,33 –10,69 ± 3,86 –101,03 a4 –14,27 ± 5,16 –52,31 ± 4,86 43,26 ± 7,72 –5,75 ± 0,38 –29,08 ± 4,32 5,62 EGFRL858R –T ´ DS Erl –11,98 ± 3,57 –37,42 ± 2,74 44,32 ± 5,60 –4,59 ± 0,29 –9,68 ± 4,24 –137,30 a4 –16,87 ± 5,46 –54,83 ± 3,07 48,65 ± 7,87 –5,93 ± 0,25 –28,98 ± 4,39 –1,13 EGFRG719S EMM + Gsolvat Erl –10,73 ± 2,86 –36,95 ± 3,39 41,11 ± 5,08 –4,53 ± 0,36 –11,10 ± 3,72 –126,77 a4 –14,99 ± 4,57 –55,40 ± 2,77 45,92 ± 5,93 –5,89 ± 0,25 –30,36 ± 4,23 –12,81 EGFRG724S EMM Erl –9,41 ± 3,53 –33,56 ± 4,13 35,29 ± 8,37 –4,20 ± 0,49 –11,88 ± 4,13 –112,16 a4 –8,30 ± 3,17 –40,35 ± 5,47 31,42 ± 6,78 –4,69 ± 0,66 –21,92 ± 4,34 –4,98 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục 8.6 Đóng góp vào lượng gắn kết cấu trúc bậc hai khoang gắn kết cạnh tranh ATP ghi nhận khoảng thời gian 30-100 ns hệ mô EGFRWT EGFRL858R Aminoacid Erl a4 Erl a4 Strand S711-720 –1,51 ± 0,05 –2,06 ± 0,05 –1,83 ± 0,07 –2,09 ± 0,06 P-loop –0,25 ± 0,01 –0,51 ± 0,01 –0,09 ± 0,01 –0,59 ± 0,02 Strand S724-731 –1,92 ± 0,05 –1,14 ± 0,07 –2,15 ± 0,06 –0,84 ± 0,08 Strand S740-747 0,19 ± 0,08 –0,78 ± 0,09 –1,56 ± 0,08 1,95 ± 0,07 Strand S786-791 –1,23 ± 0,04 –0,90 ± 0,03 1,31 ± 0,04 –1,53 ± 0,03 Vùng lề –2,73 ± 0,05 –3,68 ± 0,07 –2,59 ± 0,05 –3,52 ± 0,06 Helix H798-805 0,44 ± 0,04 –0,26 ± 0,07 0,90 ± 0,06 1,42 ± 0,07 Loop xúc tác –0,20 ± 0,02 0,34 ± 0,02 –0,12 ± 0,01 0,62 ± 0,05 Strand S843-847 –1,90 ± 0,02 –2,00 ± 0,02 –1,46 ± 0,01 –2,17 ± 0,01 Strand S850-853 –0,74 ± 0,01 –0,70 ± 0,01 –0,74 ± 0,01 –0,78 ± 0,01 2,24 ± 0,14 4,74 ± 0,11 0,26 ± 0,08 2,51 ± 0,09 Loop hoạt động Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh EGFRG719S EGFRG724S Aminoacid Erl a4 Erl a4 Strand S711-720 –1,62 ± 0,05 –2,34 ± 0,04 –1,60 ± 0,04 –2,11 ± 0,07 P-loop –0,04 ± 0,00 –1,12 ± 0,01 –0,03 ± 0,00 –0,41 ± 0,01 Strand S724-731 –1,87 ± 0,04 –1,39 ± 0,07 –1,42 ± 0,04 –2,11 ± 0,05 Strand S740-747 –2,20 ± 0,05 2,45 ± 0,06 –0,56 ± 0,06 2,61 ± 0,08 Strand S786-791 –0,44 ± 0,06 –1,64 ± 0,03 –1,22 ± 0,04 0,31 ± 0,02 Vùng lề –2,52 ± 0,06 –2,90 ± 0,06 –2,66 ± 0,05 –2,41 ± 0,08 Helix H798-805 0,34 ± 0,06 0,41 ± 0,06 –0,33 ± 0,06 0,24 ± 0,12 Loop xúc tác –0,23 ± 0,01 0,76 ± 0,04 –0,35 ± 0,01 –0,10 ± 0,02 Strand S843-847 –1,53 ± 0,02 –2,00 ± 0,01 –1,06 ± 0,02 –1,21 ± 0,02 Strand S850-853 –0,48 ± 0,01 –0,93 ± 0,01 –0,39 ± 0,01 –0,14 ± 0,01 1,64 ± 0,06 3,99 ± 0,11 1,53 ± 0,10 –0,64 ± 0,07 Loop hoạt động Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục 8.7 Video mô động lực học 100 ns phức hợp gắn kết Erl a4 với dạng EGFR Các mã QR chứa đường dẫn đến video mô tương ứng EGFRWT - Erl EGFRWT - a4 EGFRL858R - Erl EGFRL858R - a4 EGFRG719S - Erl EGFRG719S - a4 EGFRG724S - Erl EGFRG724S - a4 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục DỮ LIỆU DỰ ĐỐN HỒ SƠ DƯỢC ĐỘNG HỌC VÀ ĐỘC TÍNH IN SILICO Phụ lục 9.1 Dữ liệu dự đoán hồ sơ dược động học - độc tính theo SwissADME (http://www.swissadme.ch/) Tính chất MW [150 - 500 g.mol–1] lý hoá #Nguyên tử nặng 34 #Nguyên tử nặng thuộc vòng thơm 23 Độ bão hoà (#Carbon sp3 / #Carbon) [0,25 - 1] 452,50 0,07 #Liên kết tự xoay [0 - 9] #Acc [0-10] #Don [0-5] Độ khúc xạ mol (MR) Diện tích bề mặt tiếp xúc (TPSA) [20 - 130 Å2] 133,52 73,58 Tính chất Log Po/w (iLOGP) 4,26 phân bố Log Po/w (XLOGP3) [–0,7 - 5,0] 5,33 dầu (o) - Log Po/w (WLOGP) 5,34 nước (w) Log Po/w (MLOGP) 3,03 Log Po/w (SILICOS-IT) 5,30 Log P tổng hợp từ mơ hình 4,65 Độ tan Log S (ESOL) [–6 - 0] nước Phân loại (ESOL) Log S (Ali) Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn –5,98 Ít tan –6,63 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phân loại (Ali) Log S (SILICOS-IT) Phân loại (SILICOS-IT) Tính chất Hấp thu qua dày - ruột dược động Thấm qua hàng rào máu não –7,64 Khó tan Cao Khơng Cơ chất p-glycoprotein Khơng Ức chế CYP1A2 Khơng Ức chế CYP2C19 Có Ức chế CYP2C9 Có Ức chế CYP2D6 Khơng Ức chế CYP3A4 Khơng Thấm qua da Log Kp (cm.s–1) Tính chất Khó tan #Vi phạm quy tắc Lipinski [MW ≤ 500, Log Po/w (MLOGP) –5,28 giống thuốc ≤ 4,15, #Acc ≤ 10, #Don ≤ 5] #Vi phạm quy tắc Ghose [160 ≤ MW ≤ 480, –0,4 ≤ Log Po/w (WLOGP) ≤ 5,6, 40 ≤ MR ≤ 130, 20 ≤ #Nguyên tử ≤ 70] #Vi phạm quy tắc Veber [#Liên kết tự xoay ≤ 10, TPSA ≤ 140] #Vi phạm quy tắc Egan [Log Po/w (WLOGP) ≤ 5,88, TPSA ≤ 131,6] #Vi phạm quy tắc Muegge [200 ≤ MW ≤ 600, –2 ≤ Log Po/w (XLOGP3) ≤ 5, TPSA ≤ 150, #Vòng ≤ 7, #Carbon > 4, #Dị tố > 1, #Liên kết tự xoay ≤ 15; #Acc ≤ 10; #Don ≤ 5] Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Xác suất sinh khả dụng chuột > 10% (Abbott) 0,55 Tính chất #Cảnh báo cấu trúc PAINS hoá dược #Cảnh báo cấu trúc Brenk #Vi phạm quy tắc tính chất giống chất khởi nguồn [250 ≤ MW ≤ 350, XLOGP ≤ 3,5, #Liên kết tự xoay ≤ 7] Khả tiếp cận tổng hợp [® 1: Rất dễ, ® 10: Rất khó] a 3,72 Dữ liệu ghi nhận từ SwissADME (http://www.swissadme.ch/) (15/10/2022) bDữ liệu dấu ngoặc vuông [ ] thể cho giá trị tối ưu tính chất hố lý dùng để biểu diễn biểu đồ radar, hoặc điều kiện tối ưu quy tắc tương ứng trình bày Phụ lục 9.2 Dữ liệu dự đốn hồ sơ dược động học - độc tính theo ADMETlab2.0 (https://admetmesh.scbdd.com/)a Tính chất MW [100 - 600 g.mol–1] 452,170 lý hố Thể tích (Å3) 478,862 #Acc [0 - 12] #Don [0 - 7] #Liên kết tự xoay [0 - 11] #Vòng [0 - 6] #Nguyên tử vòng lớn [0 - 18] #Dị tố [1 - 15] Điện tích hình thức [–4 - 4] #Liên kết không tự xoay [0 - 30] Độ linh động (#Liên kết tự xoay / không tự xoay) #Trung tâm bất đối [0 - 2] Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn 26 0,308 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh TPSA [0 - 140 Å2] 73,580 Tính tan nước (Log S) [–4 - 0,5 log[mol.L–1]] –5,705 Tính phân bố dầu - nước (LogD7.4) [1 - log[mol.L–1]] 4,131 Tính phân bố dầu - nước (Log Po/w) [0 - log[mol.L–1]] 4,748 Tính chất Định lượng tính chất giống thuốc [Thu hút: > 0,67] 0,355 hoá dược Khả tiếp cận tổng hợp [Dễ: £ 6] 2,445 Độ bão hoà (#Carbon sp3 / #Carbon) [Phù hợp: ³ 0,42] 0,071 Medicinal Chemistry Evolution 2018 [Mới, thu hút: ³ 45] Hợp chất tự nhiên [Hợp chất tự nhiên: > 5] 22,0 –0,547 Lipinski [MW ≤ 500, Log Po/w ≤ 5, #Acc ≤ 10, #Don ≤ 5] Chấp nhận Pfizer [Không độc: TPSA ³ 75 logP £ 3] Loại bỏ GSK [ADMET phù hợp: MW £ 400, logP £ 4] Loại bỏ GoldenTriangle [ADMET phù hợp: 200 £ MW £ 500, –2 Chấp nhận £ logD £ 5] #Cảnh báo cấu trúc PAINS #Cảnh báo cấu trúc ALARM NMR #Cảnh báo cấu trúc BMS #Cảnh báo cấu trúc tạo phức chelat Tính chất Tính thấm qua Caco-2 [logv > –5,15 log[cm.s–1]] hấp thu Tính thấm qua MDCK [v > ´ 10–6 cm.s–1] –5,056 1,24 ´ 10–5 Ức chế p-glycoprotein [® 0: Khơng, ® 1: Có] 1,000 Cơ chất p-glycoprotein [® 0: Khơng, ® 1: Có] 0,002 Tn thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Hấp thu qua ruột người [® 0: > 30%, ® 1: < 30%] 0,008 Sinh khả dụng đường uống [® 0: Cao, ® 1: Thấp] 0,009 Tính chất Tỷ lệ gắn protein (%) [£ 90%] phân bố Thể tích phân bố [0,04 - 20 L.kg–1] 0,251 Thấm qua hàng rào máu não [® 0: Khơng, ® 1: Có] 0,020 Tỷ lệ tự (%) [≥ 5%] 0,831 Ức chế CYP1A2 [® 0: Khơng, ® 1: Có] 0,701 Tính chất chuyển hố Chuyển hố CYP1A2 [® 0: Khơng, ® 1: Có] 101,989 0,586 Ức chế CYP2C19 [® 0: Khơng, ® 1: Có] 0,943 Chuyển hố CYP2C19 [® 0: Khơng, ® 1: Có] 0,171 Ức chế CYP2C9 [® 0: Khơng, ® 1: Có] 0,927 Chuyển hố CYP2C9 [® 0: Khơng, ® 1: Có] 0,891 Ức chế CYP2D6 [® 0: Khơng, ® 1: Có] 0,029 Chuyển hố CYP2D6 [® 0: Khơng, ® 1: Có] 0,876 Ức chế CYP3A4 [® 0: Khơng, ® 1: Có] 0,533 Chuyển hố CYP3A4 [® 0: Khơng, ® 1: Có] 0,864 Tính chất Độ thải [≥ mL.min–1.kg–1] 5,538 thải trừ T1/2 [® 0: Dài (³ giờ), ® 1: Ngắn (< giờ)] 0,598 Độc tính Ngăn chặn gen hERG [® 0: Khơng, ® 1: Có] 0,129 Độc tính tế bào gan người [® 0: Khơng, ® 1: Có] 0,130 Nguy tổn thương gan [® 0: Khơng, ® 1: Cao] 0,969 Tn thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Gây đột biến (Ames) [® 0: Khơng, ® 1: Có] 0,095 Độc tính cấp đường uống (chuột) [® 0: Thấp, ® 1: Cao] 0,024 Liều tối đa ngày theo FDA [® 0: > 0,011 mmol.kg– Độc tính ngày–1, ® 1: £ 0,011 mmol.kg–1.ngày–1] 0,534 Kích ứng da [® 0: Khơng, ® 1: Có] 0,929 Gây ung thư [® 0: Khơng, ® 1: Có] 0,571 Ăn mịn mắt [® 0: Khơng, ® 1: Có] 0,003 Kích ứng mắt [® 0: Khơng, ® 1: Có] 0,155 Độc tính hệ hơ hấp [® 0: Khơng, ® 1: Có] 0,867 Chỉ số nồng độ sinh học (BCF) (–log[L.kg–1]) 2,757 mơi trường IC50 (–log[µg.L–1.MW–1]) T pyriformis sau 48 5,122 LD50 (–log[µg.L–1.MW–1]) P promelas sau 96 6,084 LD50 (–log[µg.L–1.MW–1]) D magna sau 48 5,931 a Dữ liệu ghi nhận từ ADMETlab2.0 (https://admetmesh.scbdd.com/) (15/10/2022) bDữ liệu dấu ngoặc vuông [ ] thể cho giá trị tối ưu tính chất hoá lý dùng để biểu diễn biểu đồ radar, hoặc điều kiện tối ưu quy tắc tương ứng trình bày Trong số trường hợp, kết trình bày dạng xác suất từ đến chia thành ba nhóm kết luận dựa kinh nghiệm với màu khác gồm: (1) Tốt/Excellent (¢): 0-0,1 (– – –) 0,1-0,3 (– –), (2) Khá/Medium (¢): 0,3-0,5 (–) 0,5-0,7 (+), (3) Kém/Poor (¢): 0,7-0,9 (+ +) 0,9-1,0 (+ + +) Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn