Đề tài được thực hiện qua 2 giai đoạn:- Giai đoạn 1: tiến hành nuôi cấy cây Bạch hoa xà in vitro tạo nguồn cây nguyên liệuban đầu và tạo mô sẹo, tạo rễ dưới tác dụng của các chất điều ho
Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Địa điểm và thời gian nghiên cứu
Các thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm nuôi cấy mô, công ty Cổ Phần Hương Nhiên và tại phòng thí nghiệm nuôi cấy vi sinh vật của Bộ môn vi sinh – Trường Đại Học Mở TP Hồ Chí Minh
Thời gian nghiên cứu từ tháng 8/2008 đến tháng 3/2009 qua hai giai đoạn : Giai đoạn 1: tiến hành cấy chuyền cây Bạch hoa xà in vitro sẵn có tạo nguồn nguyên liệu ban đầu, nuôi cấy tạo mô sẹo, tạo rễ dưới tác dụng của các chất điều hoà sinh trưởng ở những nồng độ khác nhau
Giai đoạn 2: tiến hành thử khả năng kháng khuẩn của các loại dịch chiết từ cây Bạch hoa xà ngoài tự nhiên và cây in vitro.
Trang thiết bị và dụng cụ trong nghiên cứu
Thiết bị : tủ cấy vô trùng, nồi hấp (autoclave), máy đo pH, cân điện tử, máy lạnh, máy khuấy, tủ ẩm, nhiệt kế, ẩm kế, bếp điện,…
Dụng cụ : pince, dao cấy, kéo, đĩa cấy, giấy cấy, ống nghiệm, chai nước biển, đèn cồn, pipette (loại 1 ml, 5 ml, 10 ml, ), đĩa petri, que cấy trang, que cấy vòng, giấy lọc, đĩa kháng sinh, micropipette ,…
Vật liệu
3.3.1 Vật liệu nuôi cấy cây Bạch hoa xà Đối tượng là cây dược liệu Bạch hoa xà (Plumbago zeylanica L.) được lấy từ vườn ươm của Viện Sinh Học Đà Lạt
Mẫu cấy sử dụng trong đề tài là lá và chồi của cây Bạch hoa xà in vitro sẵn có trong phòng thí nghiệm nuôi cấy mô Công ty cổ phần Hương Nhiên
Chồi nách được cấy chuyền tạo thành chồi mới
Lá được dùng trong các thí nghiệm nghiên cứu sự tạo mô sẹo
3.2.2.Vật liệu thử hoạt tính kháng khuẩn
Các loại vi khuẩn: Echerichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus được lấy tại phòng nghiên cứu vi sinh của Trường Đại Học Mở TP Hồ Chí
Minh, nấm Candida albicans được lấy từ Viện Pasteur TP Hồ Chí Minh
Dịch chiết cây Bạch hoa xà ngoài tự nhiên (3 th áng tu ổi ), mô sẹo và cây in vitro (sau 30 ng ày nu ôi c ấy ) được chiết tách bằng dung môi ethanol.
Môi trường sử dụng trong nghiên cứu
3.4.1 Môi trường nuôi cấy mô
Môi trường cấy là môi trường MS của Murashige và Skoog (1962)
Bảng 3.1 Thành phần môi trường MS của Murashige và Skoog
Thành phần Dạng sử dụng Nồng độ (mg/l)
Glycine 2,00 pH môi trường trước khi hấp: 5,7 – 5,8
Chất kích thích sinh trưởng: 2,4-D (2,4- Dichlorophenoxy – acetic acid), NAA ( 1 – naphthalene acetic acid ), IAA ( indolacetic acid )
3.4.2 Môi trường thử nghiệm vi sinh
- Môi trường nuôi cấy vi khuẩn
Môi trường cao thịt – peptone
- Dung dịch nước muối sinh lý 0,9%
Ngoài ra còn có các loại hóa chất khác như: cồn 70 0 , cồn 96 0 , ethanol…
Phương pháp nghiên cứu
3.5.1.Thí nghiệm 1 Khảo sát ảnh hưởng của 2,4 – D lên sự hình thành mô sẹo của cây Bạch hoa xà
Xác định nồng độ kích thích tố 2,4 – D thích hợp sự hình thành mô sẹo tối ưu của cây Bạch hoa xà in vitro
Tạo nguồn nguyên liệu cho thí nghiệm khảo sát hoạt tính kháng khuẩn
Thí nghiệm được thiết lập theo mô hình hoàn toàn ngẫu nhiên, bao gồm 6 nghiệm thức với 3 lần lặp lại Mỗi nghiệm thức bao gồm 3 bình thủy tinh dung tích 500 ml, mỗi bình chứa 60 ml môi trường nuôi cấy.
Nghiệm thức đối chứng (NT0) DO: (môi trường MS)
NT1: D1(môi trường MS + 2,4-D 0.5 mg/l)
NT2: D2 (môi trường MS + 2,4-D 1 mg/l)
NT3: D 3 (môi trường MS + 2,4-D 1.5 mg/l)
NT4: D4 (môi trường MS + 2,4-D 2 mg/l)
NT5: D5 (môi trường MS + 2,4-D 3 mg/l)
Tổng số bình nuôi cấy: 54 bình
Số mẫu cấy/1 bình: 5 mẫu
Lá cây Bạch hoa xà được cắt thành đoạn nhỏ với kích thước 0,5 x 0,5 cm và cấy vào môi trường MS bổ sung chất kích thích sinh trưởng 2,4-D trong bình chứa.
* Các chỉ tiêu theo dõi
- Tỉ lệ mẫu cấy tạo mô sẹo (%) = (số mẫu cấy tạo mô sẹo x 100) / tống số mẫu cấy
- Thời gian bắt đầu xuất hiện mô sẹo
3.5.2 Thí ngiệm 2 Khảo sát ảnh hưởng của NAA lên sự hình thành rễ của mô lá cây Bạch hoa xà
Xác định nồng độ kích thích tố NAA thích hợp sự hình thành rễ tối ưu của mô lá cây Bạch hoa xà in vitro
Tạo nguồn nguyên liệu cho thí nghiệm khảo sát hoạt tính kháng khuẩn
Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, gồm 5 nghiệm thức, 3 lần lặp lại, mỗi nghiệm thức là 5 bình thủy tinh 250 ml có chứa 40 ml môi trường
Nghiệm thức đối chứng (NT0) NO: (môi trường MS)
NT1: N1(môi trường MS + NAA 1 mg/l)
NT2: N2 (môi trường MS + NAA 1,5 mg/l)
NT3: N 3 (môi trường MS + NAA 2 mg/l)
NT4: N 4 (môi trường MS + NAA 3 mg/l)
Tổng số bình nuôi cấy: 75 bình
Số mẫu cấy/1 bình: 3 mẫu
Lá cây Bạch hoa xà in vitro được cắt thành từng đoạn có kích thước 0,5 x 0,5 cm, cấy vào các bình chứa môi trường MS bổ sung chất kích thích sinh trưởng: NAA
Bảng 3.2 Các nồng độ NAA được sử dụng trong thí nghiệm
Nghiệm thức Nồng độ (mg/l )
• Tỉ lệ mẫu cấy hình thành mô sẹo
• Tỉ lệ mẫu cấy hình thành rễ
• Số rễ trung bình/mẫu
3.5.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của IAA lên sự hinh thành rễ cây Bạch hoa xà in vitro
Xác định nồng độ kích thích tố IAA thích hợp sự hình thành rễ tối ưu của cây Bạch hoa xà in vitro
Tạo nguồn nguyên liệu cho thí nghiệm khảo sát hoạt tính kháng khuẩn
Thí nghiệm được thiết kế với bố cục hoàn toàn ngẫu nhiên, bao gồm 5 nghiệm thức lặp lại 3 lần Mỗi nghiệm thức sử dụng 5 bình thủy tinh thể tích 500 ml, mỗi bình chứa 60 ml môi trường.
Nghiệm thức đối chứng (NT0) IO: (môi trường MS)
NT1: I1(môi trường MS + IAA 1 mg/l)
NT2: I2 (môi trường MS + IAA 1,5 mg/l)
NT3: N3 (môi trường MS + IAA 2 mg/l)
NT4: N4 (môi trường MS + IAA 3 mg/l)
Tổng số bình nuôi cấy: 75 bình
Số mẫu cấy/1 bình: 3 mẫu
Chồi cây Bạch hoa xà nuôi cấy trên môi trường MS ( cao 2,5 cm ) được cấy chuyền sang môi trường MS có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng: IAA
Bảng 3.3 Các nồng độ IAA được sử dụng trong thí nghiệm
Nghiệm thức Nồng độ IAA (mg/l )
• Tỉ lệ chồi ra rễ
• Số rễ trung bình/ mẫu
• Chiều cao trung bình của chồi
3.5.4 Thí nghiệm 4 Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết thô từ cây Bạch hoa xà in vitro và ngoài tự nhiên
Xác định hoạt tính kháng khuẩn của cây Bạch hoa xà ngoài tự nhiên và in vitro
Môi trường cấy khuẩn: môi trường cao thịt pep-ton
Môi trường cấy nấm: môi trường Sabouraud
Dung môi sử dụng chiết xuất là ethanol
Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, gồm 6 nghiệm thức
Nghiệm thức đối chứng ( NTO ): Ethanol NT1: dịch chiết cây Bạch hoa xà ngoài tự nhiên NT2: dịch chiết rễ cây Bạch hoa xà ngoài tự nhiên NT3: dịch chiết cây Bạch hoa xà in vitro
NT4: dịch chiết rễ cây in vitro NT5: dịch chiết mô sẹo in vitro
Số lần lặp lại: 3 lần (mỗi chủng vi khuẩn, nấm làm 3 đĩa Petri)
Tổng số đĩa Petri cho mỗi loại dịch chiết: 18 đĩa
Tổng số đĩa Petri cho thí nghiệm: 18 x 4 (chủng vi khuẩn, nấm) = 72 đĩa
Môi trường cao thịt – peptone hoặc môi trường Sabouraud được hấp khử trùng, tiến hành đỗ vào đĩa Petri, cho thạch có chiều dày đồng nhất, khoảng 4 mm để nguội ở nhiệt độ phòng thí nghiệm, nếu chưa sử dụng nên bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ từ 4 – 8 0 C
- Dịch chiết cây Bạch hoa xà
Thân, lá, rễ của cây Bạch hoa xà được thu hái ngoài tự nhiên đem rửa sạch Cân 5 g và đem giã nát, sau đó nhỏ vào 6 ml ethanol Để yên trong 30 phút, lọc qua giấy lọc, bỏ xác, lấy phần dịch lỏng
Dịch chiết từ cây Bạch hoa xà in vitro, rễ và mô sẹo cây Bạch hoa xà in vitro được chuẩn bị tương tự
Vi khuẩn được nhân sinh khối trong 4 -5 ml môi trường lỏng cao thịt – pepton, ở nhiệt độ phòng từ 6 – 8 giờ Sau đó dùng nước muối sinh lý 0,9 % pha loãng vi khuẩn sao cho đạt nồng độ 1 10 8 CFU / ml
Tiến hành tương tự đối với nấm Candida albicans (nhân sinh khối trên môi trường Sabouraud)
- Trải vi khuẩn lên mặt thạch
Dùng micropipette hút 200 μl dịch khuẩn nồng độ 1.10 8 CFU / ml, bơm vào đĩa môi trường dùng que cấy trang, trang đều trên mặt thạch sao cho vi khuẩn được khuyết tán đều trên mặt thạch
Dùng pince gắp giấy lọc hình tròn đường kính 0,5 cm, đặt lên mặt đĩa Petri đã trãi vi khuẩn, mỗi đĩa petri đặt 3 giấy lọc thành hình tam giác, mỗi đĩa giấy cách nhau 3 – 4 cm, cách thành đĩa petri 2- 3 cm
Tiến hành nhỏ dịch chiết cây Bạch hoa xà lên đĩa giấy lọc, mỗi đĩa giấy lọc nhỏ 100 μl dịch chiết Bạch hoa xà, ở nghiệm thức đối chứng nhỏ 100 μl ethanol
Các đĩa petri được ủ trong tủ ấm ở 37 0 C, sau 24 giờ lấy ra theo dõi và đọc kết quả
* Chỉ tiêu theo dõi Đo đường kính vòng kháng khuẩn sau 24 giờ ủ trong tủ ấm.
Kết quả và ssthảo luận
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Thí nghiệm1 Ảnh hưởng của 2,4-D lên sự hình thành mô sẹo từ lá cây Bạch hoa xà in vitro
Tiến hành khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng lên sự hình thành mô sẹo từ lá cây Bạch hoa xà in vitro, kết quả thể hiện ở bảng 4.1 và 4.2
Bảng 4.1 Tỉ lệ mẫu cấy tạo mô sẹo, kích thước mô sẹo từ lá cây Bạch hoa xà in vitro dưới tác dụng của 2,4-D sau 30 ngày nuôi cấy
Ti lệ mẫu cấy tạo sẹo (%)
Kích thước trung bình của mô sẹo (cm)
• Ghi chú: Trong cùng một cột các giá trị trung bình di theo sau có cùng 1 ký tự thì không khác biệt có ý nghĩa ở mức độ 0,01
Bảng 4.2 Thời gian xuất hiện mô sẹo từ lá cây Bạch hoa xà in vitro
Thời gian xuất hiện mô sẹo (ngày sau cấy)
N5 20 Vàng,cósắc tố đỏ, có mô xốp
Hình 4.1 Mô sẹo từ lá cây Bạch hoa xà trên môi trường MS, bổ sung 2,4 – D sau 30 ngày nuôi cấy
Môi trường MS với 2,4 – D nồng độ từ 0,5 – 3 mg/l đều thích hợp tạo mô sẹo từ lá cây Bạch hoa xà
Nghiên cứu cho thấy môi trường MS bổ sung 2,4-D 1 mg/l (nghiệm thức N2) kích thích mô sẹo phát triển kích thước lớn nhất (1,67 cm) Trong khi đó, cũng ở môi trường MS với 2,4-D 1 mg/l (nghiệm thức N3) lại thúc đẩy tỷ lệ hình thành mô sẹo đạt cao nhất (100%) Đáng chú ý, tỷ lệ sống của mô sẹo này cũng vượt trội so với các nghiệm thức còn lại Ngược lại, nếu không bổ sung 2,4-D (nghiệm thức N0), mô lá cây Bạch hoa xà sẽ không hình thành sẹo Do đó, việc bổ sung chất điều hòa sinh trưởng đóng vai trò quan trọng trong quá trình hình thành mô sẹo.
4.2 Thí nghiệm2 Ảnh hưởng của NAA lên sự hình thành mô sẹo và tạo rễ từ lá của cây Bạch hoa xà in vitro
Sau 30 ngày nuôi cấy khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng NAA lên sự hình thành mô sẹo và rễ của cây Bạch hoa xà in vitro, kết quả thể hiện trong bảng 4.3
Bảng 4.3 Tỉ lệ mẫu cấy tạo mô sẹo và rễ từ lá cây Bạch hoa xà dưới tác dụng của chất điều hòa sinh trưởng NAA, sau 30 ngày nuôi cấy
Số lượng rễ trung bình (rễ/mẫu) Nghiệm thức
Tỉ lệ hình thành mô sẹo (%)
Tỉ lệ hình thành rễ (%)
• Ghi chú: Trong cùng một cột các giá trị trung bình di theo sau có cùng 1 ký tự thì không khác biệt có ý nghĩa ở mức độ 0,01
Nồng độ NAA = 0 mg/l Nồng độ NAA = 1 mg/l
Nồng độ NAA = 1,5 mg/l Nồng độ NAA = 2 mg/l
Hình 4.2 Mô sẹo và rễ từ lá của cây Bạch hoa xà dưới tác dụng của chất điều hòa sinh trưởng NAA, sau 30 ngày nuôi cấy
Về số lượng rễ, có sự khác biệt giữa các nghiệm thức xử lý NAA so với đối chứng
Giữa các nghiệm thức có xử lý NAA, N2 ( NAA 1,5 mg/l ) cho số lượng rễ trung bình trên mẫu cao nhất ( 14,30 rễ ) và khác biệt có ý nghĩa so với các nghiệm thức còn lại
Qua bảng 4.3 Sau 30 ngày nuôi cấy ta thấy các nghiệm thức đều hình thành mô sẹo và rễ đạt tỉ lệ 100% Nghiệm thức N2 (1,5 mg/l) có số lượng rễ trung bình cao nhất so với các nghiệm thức có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng khác trong thí nghiệm Ở mẫu đối chứng môi trường MS không có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng không có hiện tượng xuất hiện mô sẹo và rễ
4.3 Thí nghiệm3 Ảnh hưởng của IAA lên sự tạo rễ và chiều cao chồi của cây Bạch hoa xà
Kết quả sau 30 ngày nuôi cấy khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng IAA lên quá trình tạo rễ và chồi của cây Bạch hoa xà nuôi cấy in vitro được trình bày trong Bảng 4.5.
Bảng 4.5 Tỉ lệ mẫu cấy tạo rễ và chiều cao của cây Bạch hoa xà dưới tác dụng của chất điều hòa sinh trưởng IAA, sau 30 ngày nuôi cấy
Số lượng rễ trung bình (rễ/chồi)
Chiều cao trung bình của chồi (cm/chồi) Nghiệm thức
Tỉ lệ hình thành rễ (%)
Dài, khỏe ( có sự hình thành rễ ở những lá nằm sát môi trường
• Ghi chú: Trong cùng một cột các giá trị trung bình di theo sau có cùng 1 ký tự thì không khác biệt có ý nghĩa ở mức độ 0,01
Nồng độ IAA = 0 mg/l Nồng độ IAA = 1mg/l
Nồng độ IAA = 0 mg/l Nồng độ IAA = 1 mg/l
Nồng độ IAA = 1,5 mg/l Nồng độ IAA = 2 mg/l
Nồng độ IAA = 1,5 mg/l Nồng độ IAA = 2 mg/l
Nồng độ IAA = 3 mg/l Nồng độ IAA = 3mg/l
Hình 4.3 Rễ và chồi của cây Bạch hoa xà dưới tác dụng của chất điều hòa sinh trưởng IAA, sau 30 ngày nuôi cấy
Về số lượng rễ, có sự khác biệt giữa các nghiệm thức xử lý IAA so với nghiệm thức đối chứng
Giữa các nghiệm thức có xử lý IAA, N2 ( IAA 1,5 mg/l ) cho số lượng rễ trung bình trên mẫu cao nhất ( 8,13 rễ ) và khác biệt có ý nghĩa so với các nghiệm thức còn lại Qua bảng 4.3 Sau 30 ngày nuôi cấy thì nghiệm thức N2 ( 1,5 mg/l ) của thí nghiệm cho kết quả số lượng trung bình trên mẫu cao nhất so với môi trường có bổ sung nồng độ IAA khác Ở môi trường đối chứng nghiệm thức N0 ta thấy cho kết quả số lượng rễ trung bình trên mẫu thấp nhất
Về chi ều cao ch ồi, có sự khác biệt giữa các nghiệm thức xử lý IAA so với nghiệm thức đối chứng
Giữa các nghiệm thức có xử lý IAA, N2 ( IAA 1,5 mg/l ) cho chi ều cao trung b ình c ủa ch ồi cao nhất ( 4,50 cm ) và khác biệt có ý nghĩa so với các nghiệm thức còn lại
Qua bảng 4.3 Sau 30 ngày nuôi cấy thì nghiệm thức N2 ( 1,5 mg/l ) của thí nghiệm cho kết quả chiều cao trung bình của chồi cao nhất so với môi trường có bổ sung nồng độ IAA khác Ở môi trường đối chứng nghiệm thức N0 ta thấy cho kết quả chiều cao trung bình của chồi thấp nhất
4.4 Thí nghiệm 4 Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết thô từ cây Bạch hoa xà ngoài tự nhiên và in vitro
Ly trích ịch chiết thô từ cây Bạch hoa xà ngoài tự nhiên ( toàn cây và rễ ) và cây Bạch hoa x à in v itro ( toàn cây, rễ và mô sẹo ) để khảo sát hoạt tính kháng khuẩn và nấm, kết quả thể hiện trong bảng 4.4
Bảng 4.4 Đường kính vòng kháng khuẩn của dịch chiết thô từ cây Bạch hoa xà ngoài tự nhiên và in vitro Đường kính vòng kháng khuẩn
Vi khuẩn Gram (-) Vi khuẩn Gam (+) Nấm men Nghiệm thức
Bạch hoa xà ngoài tự nhiên
Bạch hoa xà ngoài tự nhiên
Dịch chiết mô sẹo cây Bạch hoa xà in vitro
Bạch hoa xà in vitro
Bạch hoa xà in vitro
• Ghi chú: _: không có vòng kháng khuẩn
- Đối với E.coli: đường kính vòng kháng khuẩn ở mẫu dịch chiết từ cây Bạch hoa xà ngoài tự nhiên nhỏ nhất ( 0,92 cm ), vòng kính đường kháng khuẩn tăng lên ở dịch chiết rễ cây Bạch hoa xà ngoài tự nhiên ( 1,10 cm ), và cao nhất ở dịch chiết r ễ cây in vitro ( 1,25 cm ) Cả 5 loại dịch chiết này đều có đường kính vòng kháng khuẩn cao hơn so với mẫu ethanol ( 0,75 cm ), chứng tỏ dịch chiết từ cây Bạch hoa xà có khả năng kháng E.coli, khả năng kháng tương đối cao
- Đối với Pseudomonas aeruginosa: đường kính vòng kháng khuẩn trên mẫu dịch chiết cây Bạch hoa xà ngoài tự nhiên thấp nhất ( 0,89 cm ), kế đến là dịch chiết từ cây in vitro ( 0,95 cm ) và cao nhất ở rễ cây in vitro có đường kính vòng kháng khuẩn (1.20 cm), Cả 5 loại dịch chiết này đều có đường kính vòng kháng khuẩn cao hơn so với mẫu ethanol ( 0,7 cm ), chứng tỏ dịch chiết từ cây Bạch hoa xà có khả năng kháng
Pseudomonas aeruginosa, khả năng kháng tương đối cao
- Đối với Staphylococcus aureus: đường kính vòng kháng khuẩn ở dịch chiết cây Bạch hoa xà ngoài tự nhiên nhỏ nhất ( 0,95 cm ), đường kính vòng kháng khuẩn tăng lên ở mẫu dịch chiết rễ cây Bạch hoa xà ngoài tự nhiên ( 0,98 cm )và đường kính vòng kháng khuẩn cao nhất ở mẫu dịch chiết rễ cây in vitro ( 1,25 cm ), chứng tỏ dịch chiết từ rễ cây in vitro kháng Staphylococcus aureus cao nhất Các mẫu dịch chiết từ cây Bạch hoa xà có đường kính vòng kháng khuẩn lớn hơn đối với mẫu ethanol, chứng tỏ trong dịch chiết từ cây Bạch hoa xà có khả năng kháng Staphylococcus aureus
- Đối với nấm Candida albicans: 5 loại dịch chiết từ cây Bạch hoa xà ngoài tự nhiên, rễ cây ngoài tự nhiên , cây in vitro, mô sẹo và rễ cây in vitro không có khả năng kháng Candida albicans Mẫu ethanol có khả năng kháng Candida albicans nhưng khả năng kháng yếu
