Nuôi cấy mô thực vật cây lan kim tuyến (anoectochilus setaceus blume)

HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA NƠNG HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT CÂY LAN KIM TUYẾN (ANOECTOCHILUS SETACEUS BLUME) Giáo viên hướng dẫn : TS PHẠM PHÚ LONG Bộ môn : THỰC VẬT Sinh viên thực : NGUYỄN KHÁNH Mã sinh viên : 632124 Lớp : K63RHQMC HÀ NỘI, 2022 LỜI CAM ĐOAN Tơi Nguyễn Khánh, sinh viên khố 63 Học viện Nông nghiệp Việt Nam, chuyên ngành Quản lý sản xuất nhà có mái che, xin cam đoan: Đây khoá luận tốt nghiệp thân trực tiếp thực hướng dẫn TS Phạm Phú Long; Cơng trình khơng trùng lặp với nghiên cứu khác công bố Việt Nam; Các số liệu thơng tin khố luận có nguồn gốc rõ ràng, cơng bố theo quy định Nếu có gian lận nào, tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm Hà Nội, ngày 10 tháng 08 năm 2022 Sinh viên Nguyễn Khánh i LỜI CẢM ƠN Nhân dịp hoàn thành khố luận tốt nghiệp, với lịng kính trọng biết ơn sâu sắc, xin bày tỏ lời cảm ơn tới: Quý thầy, cô giáo Khoa Nông học, Học viện Nơng nghiệp Việt Nam tận tình truyền đạt kiến thức hữu ích cho tơi suốt q trình học tập trường Đặc biệt, tơi xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới: TS Phạm Phú Long, Giám đốc Viện Nghiên cứu Phát triển Cây dược liệu, Học viện Nông nghiệp Việt Nam, trực tiếp hướng dẫn, bảo tận tình cho tơi suốt q trình học tập cho tơi nhiều ý kiến q báu tồn q trình thực hồn thiện khố luận tốt nghiệp Tôi xin chân trân trọng cảm ơn tập thể phòng Nghiên cứu Chọn tạo giống Cây dược liệu tạo điều kiện, giúp đỡ suốt q trình nghiên cứu, hồn thiện khố luận tốt nghiệp Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới người thân, gia đình bạn bè đồng hành, chia sẻ, động viên vượt qua khó khăn, trở ngại để tơi n tâm học tập hồn thành khố luận tốt nghiệp Xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, ngày 10 tháng 08 năm 2022 Sinh viên Nguyễn Khánh ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT iv DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH vi TÓM TẮT vii PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Tính cấp thiết đề tài 1.2 Mục đích yêu cầu đề tài 1.2.1 Mục đích 1.2.2 Yêu cầu PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan lan kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) 2.2 Phân loại 2.3 Đặc điểm hình thái 2.3.1 Thân 2.3.2 Rễ 2.3.3 Lá 2.3.4 Hoa 2.4 Điều kiện sinh thái phân bổ iii 2.5 Giá trị lan kim tuyến 2.6 Các phương pháp nhân giống lan kim tuyến 2.6.1 Nhân giống hữu tính hạt 2.6.2 Nhân giống phương pháp giâm 2.6.3 Nhân giống in vitro 2.7 Một số nghiên cứu nhân giống bảo tồn lan kim tuyến nước 2.7.1 Nghiên cứu nhân giống bảo tồn lan kim tuyến giới 2.7.2 Nghiên cứu nhân giống bảo tồn lan kim tuyến Việt Nam 2.8 Nhân giống nuôi cấy mô in vitro 10 2.8.1 Môi trường nuôi cấy 11 2.8.2 Môi trường vật lý 16 2.8.3 Điều kiện vô trùng 16 PHẦN NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 3.1 Địa điểm 18 3.2 Thời gian 18 3.3 Vật liệu 18 3.4 Nội dung nghiên cứu 18 3.5 Phương pháp nghiên cứu 19 3.6 Bố trí thí nghiệm 19 3.6.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng chất điều tiết sinh trưởng đến trình hình thành PLBs từ vật liệu ban đầu 19 iv 3.6.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng chất điều tiết sinh trưởng đến trình nhân nhanh PLBs 20 3.6.3 Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng chất điều tiết sinh trưởng đến trình tái sinh chồi từ PLBs 21 3.6.4 Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng chất điều tiết sinh trưởng đến sinh trưởng phát triển chồi 21 3.6.5 Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng chất điều tiết sinh trưởng đến trình tạo rễ 22 3.7 Các tiêu theo dõi 23 3.8 Phương pháp xử lý số liệu 23 PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24 4.1 Đánh giá ảnh hưởng chất điều tiết sinh trưởng đến trình hình thành PLBs từ vật liệu ban đầu 24 4.2 Đánh giá ảnh hưởng chất điều tiết sinh trưởng đến trình nhân nhanh PLBs 27 4.3 Đánh giá ảnh hưởng chất điều tiết sinh trưởng đến trình tái sinh chồi từ PLBs 30 4.4 Đánh giá ảnh hưởng chất điều tiết sinh trưởng sinh trưởng phát triển chồi 35 4.5 Đánh giá ảnh hưởng chất điều tiết sinh trưởng khả tạo rễ 39 4.6 Trồng lan kim tuyến giá thể 45 PHẦN KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 48 5.1 Kết luận 48 v 5.2 Đề nghị 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 KẾT QUẢ XỬ LÝ THỐNG KÊ 53 vi DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT CT Công thức ĐC Đối chứng MS Murashige & Skood medium, 1962 6-BA 6-Benzulaminopurine -NAA -Naphthaleneacetic acid MT Môi trường PLBs Protocorm-like bodies iv DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Môi trường cảm ứng tạo PLBs 20 Bảng 3.2 Môi trường nhân nhanh PLBs 20 Bảng 3.3 Môi trường tái sinh chồi từ PLBs 21 Bảng 3.4 Môi trường sinh trưởng phát triển chồi 22 Bảng 3.5 Môi trường tạo rễ 22 Bảng 4.1 Ảnh hưởng môi trường đến trình hình thành PLBs vật liệu ban đầu sau 30 ngày nuôi cấy 25 Bảng 4.2 Ảnh hưởng mơi trường đến q trình nhân nhanh PLBs sau 30 ngày nuôi cấy mô 28 Bảng 4.3 Ảnh hưởng mơi trường q trình tái sinh chồi sau 30 ngày nuôi cấy mô 31 Bảng 4.4 Ảnh hưởng môi trường đến sinh trưởng phát triển chồi sau 30 ngày nuôi cấy mô 36 Bảng 4.5 Ảnh hưởng mơi trường đến hình thành phát triển rễ sau 30 ngày nuôi cấy mô 42 Bảng 4.6 Sinh trưởng phát triển vườn ươm lan kim tuyến 45 v DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Cây lan kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) Hình 4.1 Mẫu tạo PLBs từ thân lan kim tuyến sau 30 ngày ni cấy mơ 27 Hình 4.2 Mẫu PLBs sau tháng sau 30 ngày nuôi cấy mô 30 Hình 4.3 Mẫu tái sinh chồi sau 30 ngày nuôi cấy mô 34 Hình 4.4 Mẫu sinh trưởng phát triển chồi sau 30 ngày nuôi cấy mô 39 Hình 4.5 Mẫu tạo rễ sau tháng 44 Hình 4.6 Cây lan kim tuyến sau 30 ngày trồng vườn ươm 46 vi 18 Nguyen Trung Thanh, Pham Luong Hang, Nguyen Van Ket, Truong Thi Lan Anh, Phung Van Phe, Nguyen Thi Hong Gam, Phi Thi Cam Mien, 2012 The role of different medium and plant hormones on multiple shoots of Jewel orchids (Anoectochilus setaceus Blume) VNU Journal of Science, Natural Sciences and Technology, 28: 47-53 52 KẾT QUẢ XỬ LÝ THỐNG KÊ Thí nghiệm 1: Descriptives Tỷ lệ tạo PLBs 95% Confidence Interval for Mean N Mean Std Deviation Std Error Lower Bound Upper Bound Minimum Maximum 1.0 51.428571428571420 21.665358411575856 9.689042833036096 24.527475880736578 78.329666976406270 14.285714285714285 71.428571428571430 2.0 62.857142857142854 12.777531299998804 5.714285714285717 46.991742256012586 78.722543458273120 42.857142857142854 71.428571428571430 3.0 71.428571428571420 14.285714285714285 6.388765649999399 53.690514311374780 89.166628545768050 57.142857142857140 85.714285714285710 4.0 94.285714285714290 7.824607964359518 3.499271061118827 84.570180276310620 104.001248295117960 85.714285714285710 100.000000000000000 5.0 88.571428571428580 6.388765649999406 2.857142857142860 80.638728270863450 96.504128871993710 85.714285714285710 100.000000000000000 6.0 85.714285714285710 10.101525445522107 4.517539514526256 73.171585241641670 98.256986186929750 71.428571428571430 100.000000000000000 30 75.714285714285720 19.548024552334258 3.568964667326100 68.414933384946820 83.013638043624620 14.285714285714285 100.000000000000000 Total 53 Tỷ lệ tạo PLBs Côn Subset for alpha = 0.05 g thức N Duncan 1.0 a 2.0 3.0 62.85714285714285 62.85714285714285 4 71.42857142857142 71.42857142857142 0 5.0 4.0 51.42857142857142 6.0 85.71428571428571 85.71428571428571 0 88.57142857142858 88.57142857142858 0 94.28571428571429 Sig .183 314 062 341 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 5.000 Thí nghiệm 2: Descriptives Hệ số nhân nhanh 95% Confidence Interval for Mean N Mean 6.60 548 245 5.92 7.40 894 400 9.20 837 9.80 5 Total Std Deviation Std Error Lower Bound Minimum Maximum 7.28 6.29 8.51 374 8.16 10.24 10 837 374 8.76 10.84 11 11.20 837 374 10.16 12.24 10 12 10.00 707 316 9.12 10.88 11 30 9.03 1.752 320 8.38 9.69 12 54 Upper Bound Hệ số nhân nhanh Subset for alpha = 0.05 Công thức Duncana N 6.60 7.40 9.20 9.80 10.00 5 11.20 Sig .120 140 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 5.000 Thí nghiệm 3: Descriptives 95% Confidence Interval for N Mean Mean Std Std Deviation Error Lower Bound Upper Bound Minimum Maximum Số lượng 13.80 837 374 12.76 14.84 13 15 chồi 14.00 707 316 13.12 14.88 13 15 14.80 837 374 13.76 15.84 14 16 18.60 3.507 1.568 14.25 22.95 14 23 5 16.40 894 400 15.29 17.51 15 17 15.00 1.000 447 13.76 16.24 14 16 Total 30 15.43 2.239 409 14.60 16.27 13 23 760 0894 0400 649 871 860 1140 0510 718 1.002 1.0 1.280 0447 0200 1.224 1.336 1.2 1.3 1.760 0894 0400 1.649 1.871 1.7 1.9 5 1.520 1304 0583 1.358 1.682 1.4 1.7 1.460 4159 1860 944 1.976 1.0 1.9 Total 30 1.273 4034 0736 1.123 1.424 1.9 Độ dài chồi Số lượng chồi Công thức N Subset for alpha = 0.05 55 Duncana 13.80 14.00 14.80 14.80 15.00 15.00 5 16.40 18.60 Sig .299 155 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 5.000 Độ dài chồi Subset for alpha = 0.05 Công thức Duncana N 760 860 1.280 1.460 5 1.520 1.520 1.760 Sig .418 072 060 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 5.000 Thí nghiệm 4: Descriptives 95% Confidence Interval for Mean N Dài thân Mean Std Std Lower Upper Deviation Error Bound Bound Minimum Maximum 1.0 2.920 1095 0490 2.784 3.056 2.8 3.1 2.0 3.060 1673 0748 2.852 3.268 2.8 3.2 3.0 3.260 1140 0510 3.118 3.402 3.1 3.4 4.0 4.040 2074 0927 3.783 4.297 3.8 4.3 56 5.0 3.840 1140 0510 3.698 3.982 3.7 4.0 6.0 3.720 1304 0583 3.558 3.882 3.6 3.9 30 3.473 4433 0809 3.308 3.639 2.8 4.3 Total Đường kính 1.0 1820 02168 00970 1551 2089 15 20 thân 2.0 1880 02168 00970 1611 2149 15 20 3.0 1880 02168 00970 1611 2149 15 20 4.0 2060 01342 00600 1893 2227 20 23 5.0 2000 00707 00316 1912 2088 19 21 6.0 1960 00548 00245 1892 2028 19 20 30 1933 01729 00316 1869 1998 15 23 1.0 2.200 4472 2000 1.645 2.755 2.0 3.0 2.0 2.600 5477 2449 1.920 3.280 2.0 3.0 3.0 3.200 4472 2000 2.645 3.755 3.0 4.0 4.0 3.800 4472 2000 3.245 4.355 3.0 4.0 5.0 2.800 4472 2000 2.245 3.355 2.0 3.0 6.0 2.600 5477 2449 1.920 3.280 2.0 3.0 30 2.867 6814 1244 2.612 3.121 2.0 4.0 1.0 900 1225 0548 748 1.052 1.1 2.0 1.100 1000 0447 976 1.224 1.0 1.2 3.0 1.160 1140 0510 1.018 1.302 1.0 1.3 4.0 1.380 0837 0374 1.276 1.484 1.3 1.5 5.0 1.300 1000 0447 1.176 1.424 1.2 1.4 6.0 1.220 0837 0374 1.116 1.324 1.1 1.3 30 1.177 1813 0331 1.109 1.244 1.5 1.0 620 0447 0200 564 676 2.0 780 0447 0200 724 836 3.0 800 0707 0316 712 888 4.0 1.020 0837 0374 916 1.124 1.1 5.0 940 1140 0510 798 1.082 1.1 6.0 900 1000 0447 776 1.024 1.0 30 843 1501 0274 787 899 1.1 1.0 0600 01000 00447 0476 0724 05 07 2.0 0660 00894 00400 0549 0771 05 07 3.0 0680 00447 00200 0624 0736 06 07 4.0 0840 00548 00245 0772 0908 08 09 5.0 0820 00447 00200 0764 0876 08 09 6.0 0760 00894 00400 0649 0871 06 08 30 0727 01112 00203 0685 0768 05 09 Total Số Total Dài Total Rộng Total Trọng lượng Total 57 DAI THAN Subset for alpha = 0.05 CT Duncana N 1.0 2.920 2.0 3.060 3.0 6.0 3.720 5.0 3.840 4.0 3.260 4.040 Sig .140 1.000 203 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 5.000 DK THAN Subset for alpha = 0.05 CT Duncana N 1.0 1820 2.0 1880 3.0 1880 6.0 1960 5.0 2000 4.0 2060 Sig .054 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 5.000 Số Subset for alpha = 0.05 Công thức Duncana N 1.0 2.200 2.0 2.600 2.600 6.0 2.600 2.600 58 1.000 5.0 3.0 4.0 2.800 2.800 3.200 3.200 3.800 Sig .083 083 061 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 5.000 DAI LA Subset for alpha = 0.05 CT Duncana N 1.0 2.0 1.100 3.0 1.160 6.0 1.220 5.0 4.0 900 1.220 1.300 1.300 1.380 Sig 1.000 089 225 225 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 5.000 Rộng Subset for alpha = 0.05 Công thức Duncana N 1.0 2.0 780 3.0 800 6.0 5.0 4.0 800 900 698 062 a Uses Harmonic Mean Sample Size = 5.000 Trọng lượng Subset for alpha = 0.05 1.0 940 1.020 1.000 N 900 940 Means for groups in homogeneous subsets are displayed Công thức 620 Sig Duncana 0600 59 440 130 2.0 0660 0660 3.0 0680 0680 6.0 5.0 0820 4.0 0840 0760 Sig .119 0760 054 119 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 5.000 Thí nghiệm 5: Descriptives 95% Confidence Interval for Mean N Số rễ Lower Upper Deviation Error Bound Bound Minimum Maximum 1.400 5477 2449 720 2.080 1.0 2.0 1.800 4472 2000 1.245 2.355 1.0 2.0 2.400 5477 2449 1.720 3.080 2.0 3.0 2.600 5477 2449 1.920 3.280 2.0 3.0 5 3.800 4472 2000 3.245 4.355 3.0 4.0 3.400 5477 2449 2.720 4.080 3.0 4.0 30 2.567 9714 1774 2.204 2.929 1.0 4.0 940 1517 0678 752 1.128 1.2 1.440 3209 1435 1.042 1.838 1.2 2.0 1.540 1140 0510 1.398 1.682 1.4 1.7 1.800 1581 0707 1.604 1.996 1.6 2.0 5 2.140 1517 0678 1.952 2.328 1.9 2.3 1.880 1304 0583 1.718 2.042 1.7 2.0 30 1.623 4224 0771 1.466 1.781 2.3 2.800 1000 0447 2.676 2.924 2.7 2.9 3.540 1140 0510 3.398 3.682 3.4 3.7 3.800 1732 0775 3.585 4.015 3.7 4.1 3.900 1225 0548 3.748 4.052 3.8 4.1 5 4.560 0894 0400 4.449 4.671 4.5 4.7 4.180 0837 0374 4.076 4.284 4.1 4.3 30 3.797 5672 1036 3.585 4.008 2.7 4.7 Total Dài thân Std Total Dài rễ Mean Std Total 60 Đk thân 1940 00894 00400 1829 2051 18 20 2300 02739 01225 1960 2640 20 25 2400 04183 01871 1881 2919 20 30 2700 06708 03000 1867 3533 20 35 5 3800 04472 02000 3245 4355 30 40 3300 04472 02000 2745 3855 30 40 30 2740 07514 01372 2459 3021 18 40 2.40 548 245 1.72 3.08 2.80 837 374 1.76 3.84 3.20 447 200 2.64 3.76 4 3.40 548 245 2.72 4.08 5 4.80 447 200 4.24 5.36 4.20 447 200 3.64 4.76 30 3.47 973 178 3.10 3.83 5 1.240 1140 0510 1.098 1.382 1.1 1.4 1.580 0837 0374 1.476 1.684 1.5 1.7 1.620 1304 0583 1.458 1.782 1.5 1.8 1.720 0837 0374 1.616 1.824 1.6 1.8 5 2.280 1789 0800 2.058 2.502 2.1 2.5 1.900 1000 0447 1.776 2.024 1.8 2.0 30 1.723 3411 0623 1.596 1.851 1.1 2.5 640 0548 0245 572 708 900 1225 0548 748 1.052 1.1 1.140 1140 0510 998 1.282 1.0 1.3 1.240 0548 0245 1.172 1.308 1.2 1.3 5 1.760 0548 0245 1.692 1.828 1.7 1.8 1.420 0837 0374 1.316 1.524 1.3 1.5 30 1.183 3724 0680 1.044 1.322 1.8 Total Số Total Dài Total Rộng Total Trọng 0980 01483 00663 0796 1164 08 12 lượng 3100 01414 00632 2924 3276 30 33 3400 05477 02449 2720 4080 30 40 4460 04393 01965 3915 5005 40 51 5 6400 05477 02449 5720 7080 60 70 4660 06148 02750 3897 5423 40 53 30 3833 17371 03171 3185 4482 08 70 Total Số rễ Công thức N Subset for alpha = 0.05 61 Duncana 1.400 1.800 5 3.400 5 3.800 1.800 2.400 2.400 2.600 Sig .233 079 546 233 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 5.000 Dài rễ Subset for alpha = 0.05 Công thức Duncana N 5 1.440 1.540 1.800 1.880 5 Sig .940 2.140 1.000 400 499 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 5.000 Dài thân Subset for alpha = 0.05 Công thức Duncana N 5 3.800 3.900 5 Sig 2.800 3.540 4.180 4.560 1.000 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 5.000 62 191 1.000 1.000 Đk thân Subset for alpha = 0.05 Công thức Duncana N 1940 2300 2300 2400 2400 3300 5 3800 2700 Sig .122 176 078 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 5.000 Số Subset for alpha = 0.05 Công thức Duncana N 2.40 2.80 3.20 3.40 4.20 5 4.80 Sig 2.80 272 123 105 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 5.000 Dài Subset for alpha = 0.05 Công thức Duncana N 5 1.580 1.620 1.720 1.240 1.900 63 5 Sig 2.280 1.000 092 1.000 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 5.000 Rộng Subset for alpha = 0.05 Công thức Duncana N 5 1.140 1.240 5 Sig .640 900 1.420 1.760 1.000 1.000 074 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 5.000 Trọng lượng Subset for alpha = 0.05 Công thức Duncana N 5 3100 3400 4460 4660 5 Sig 0980 6400 1.000 302 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 5.000 64 489 1.000 1.000 Trồng vườm ươm: Descriptives 95% Confidence Interval for Mean N Sống 1 Chiề Tota l 1 u cao Tota l Số 1 Dài Mean Std Deviation Std Error Lower Bound Upper Bound Minimum Maximum 92 289 083 73 1.10 75 452 131 46 1.04 83 381 078 67 99 3.717 1267 0366 3.636 3.797 3.5 3.9 4.375 3251 0938 4.168 4.582 3.9 5.0 4.046 4139 0845 3.871 4.221 3.5 5.0 3.58 900 260 3.01 4.16 6.33 1.231 355 5.55 7.12 4.96 1.756 359 4.22 5.70 Tota l 1 1.59166666666666 33698754585385 09727992515613 1.37755499502318 1.80577833831015 1.100000000000000 2.200000000000000 8 0 2.53333333333333 29644356609443 08557588634207 2.34498207743273 2.72168458923393 2.000000000000000 3.000000000000000 65 0 Tota 2.06250000000000 57241859113612 11684445563052 1.82078882762465 2.30421117237534 1.100000000000000 3.000000000000000 l 0 Rộng 1 1.38333333333333 29490625115398 08513210174472 1.19595884074577 1.57070782592089 4 8000000000000000 1.800000000000000 2.00000000000000 38847019307675 11214168527250 1.75317781488754 2.24682218511245 1.300000000000000 2.800000000000000 Tota 1.69166666666666 46148782702553 09420080822653 1.49679744782124 1.88653588551209 l 66 0 8000000000000000 2.800000000000000