NỘI DUNG NGHIÊN CỨU - Xác định nồng độ và thời gian xử lý mẫu tương ứng để vô trùng mẫu nuôi cấy - Nuôi cấy chồi đỉnh cây pemu in vitro - Nghiên cứu ảnh hưởng của BA, K và Cw đến khả năn
TOÅNG QUAN
LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN CỦA NUÔI CẤY MÔ
Năm 1938 nhà sinh vật học Đức Schleiden và Schwann đã đề xướng thuyết tế bào và nêu rõ: Mọi cơ thể sinh vật phức tạp đều gồm những đơn vị nhỏ các tế bào hợp thành Các tế bào đã phân hóa đều mang các thông tin di truyền có trong các tế bào đầu tiên, đó là trứng sau thụ tinh, là những đơn vị độc lập, từ đó có thể xây dựng lại toàn bộ cơ thể
Năm 1902, Haberlant, là người đầu tiên đưa các giả thuyết của Schleiden và Schwann vào thực nghiệm để chứng minh tính toàn thểá của tế bào, nhưng ông đã thất bại trong nuôi cấy các tế bào đã phân hóa tách từ lá một số cây một lá mầm Ngày nay, chúng ta đã biết được nguyên nhân thất bại là vì cây một lá mầm là đối tượng rất khó nuôi cấy, hơn nữa, ông lại dùng các tế bào đã mất hết khả năng tái sinh
Năm 1922, Kotte nuôi cấy đỉnh sinh trưởng tách từ đầu rễ của một cây hòa thảo, sự sinh trưởng chỉ tồn tại được một thời gian, mặc dù đã chuyển sang môi trường mới
Năm 1934, bắt đầu giai đoạn thứ 2 trong lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật, khi White (người Mỹ), nuôi cấy thành công trong một thời gian dài đầu rễ cà chua (Lycopersicum esculentum) Từ đó, việc nuôi cấy đầu rễ trong thời gian vô hạn đã được tiến hành nuôi cấy mô tượng tầng một số cây gỗ và xác nhận tác dụng kích thích sinh trưởng mô sẹo của acid-β-indolactic (IAA) và nhóm 3 vitamin B do White đề nghị: thiamin (B1), pyridoxin (B6), nicotinic acid
Việc phát hiện vai trò của IAA, NAA, 2,4-D và kinetin cùng với phát hiện vai trò của vitamin và nước dừa là những bước tiến rất quan trọng trong giai đoạn thứ hai của lịch sử nuôi cấy mô thực vật Đó là tiền đề kích thích cho việc xây dựng các môi trường xác định về mặt hóa học và cho việc làm các thí nghiệm ổn định dẫn đến các giai đoạn tiếp theo của ngành khoa học này
Năm 1957, Skoog và Miller đã công bố kết quả nghiên cứu về ảnh hưởng của tỷ lệ kinetin/auxin Nếu tỷ lệ kinetin/auxin thấp ảnh hưởng đến rễ và ngược lại Nếu tỷ lệ kinetin/auxin cao sẽ kích thích tạo chồi ở mô sẹo Thành công của Skoog và Miller dẫn đến những phát hiện quan trọng khác, mở đầu cho giai đoạn thứ ba của lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật
Bắt đầu từ năm 1954, một số kỹ thuật nuôi cấy đã phát triển Đầu tiên là kỹ thuật tách và nuôi cấy tế bào đơn, sau đó đến kỹ thuật nuôi cấy túi phấn, nuôi caỏy protoplast, chuyeồn gen…
Chúng ta đang từng bước vào giai đoạn thứ tư của nuôi cấy mô thực vật Đó là giai đoạn nuôi cấy mô thực vật được ứng dụng mạnh mẽ vào thực tiễn chọn giống, nhân giống, sản xuất các chất thứ cấp có hoạt tính sinh học và vào nghiên cứu lý luận di truyền thực vật bậc cao Các hiểu biết cơ bản về đời sống của mô và tế bào đơn trong môi trường nhân tạo, nhu cầu chất khoáng, vitamin, chất sinh trưởng, nguồn carbon của chương trình là những tiền đề được chuẩn bị trong các giai đoạn trước
Nuôi cấy mô thực vật hiện nay được đưa vào trong các chương trình chọn giống, nhân giống hiện đại Mặc dù còn rất nhiều vấn đề phải đi sâu nghiên cứu để giải quyết trong những năm tới, nuôi cấy mô thực vật ở Việt Nam đã thoát khỏi giai đoạn phôi thai của nó và đang chuẩn bị những đóng góp tích cực vào lý luận sinh học cây trồng và vào thực tiễn nông nghiệp.
ĐẶT ĐIỂM LÂM SINH HỌC CỦA CÂY PEMU
Cây gỗ lớn, có tán hình tháp, thường xanh, cao 25-30 m hay hơn, đường kính thân tới hơn 1 m Thân thẳng có bạnh to, vỏ màu xám xanh, bong thành mảng, vỏ gỗ có mùi thơm dịu Cành nhỏ dẹt và thõng rũ xuống Lá hình vảy, cây non hay cành không mang nón có lá to, hai bên xòe rộng, còn ở cành già hay cành mang nón lá nhỏ hơn, mặt dưới màu trắng xanh (Trần Hợp, 2002)
Nón đực mọc ở nách lá dài 1 cm Nón cái mọc ở đầu cành có đế mập và nhỏ
Quả nón hình cầu đường kính 2 cm, màu nâu đỏ, có 5-8 đôi vảy hình khiên, hạt hình trứng dài 0,5 cm có 2 cành không đều nhau Phôi có 2 lá mầm hình giải, lúc cây mạ thì lá mọc gần đối, 4 lá tiếp sau bắt đầu mọc vòng (Nguyễn Thượng Hiền, 1995)
2.2.3 Đặc điểm sinh thái học
Cây pemu lúc còn non chịu bóng, lớn ưa sáng thích hợp với khí hậu nhiệt đới núi cao, có độ ẩm cao, ưa đất, sâu, chua, thoát nước Pemu thường mọc trên các sườn núi, bãi bằng thuộc vùng núi cao của dãy Hoàng Liên Sơn
Pemu mọc ở độ cao 900 – 2500 m, tập trung nhiều ở 950 – 1500 m, trong rừng rậm nhiệt đới thường xanh mưa mùa ẩm, trên sườn núi thường hỗn giao với một số loài cây lá rộng, lá kim khác như sồi cau (Lithocarpu fenestrata), đỗ quyên (Rhododendron simsii), kim giao (Nageic fleuryi), thông nàng (Podocarpus imbricatus),… trên đất mùn màu vàng xám, phong hóa từ đá granít có tầng dày thay đổi, thành phần cơ giới nhẹ Trên các dông núi thường gặp các giải rừng hẹp thuần loại pemu.
Cây pemu tái sinh ít bằng hạt trong bóng râm có lớp đất mặt sâu, ẩm, không có khả năng tái sinh bằng chồi, trong sách đỏ Việt Nam (Bộ khoa học – công nghệ – môi trường, 1996)
Pemu là cây gỗ lớn thường có đường kính từ 1,5 –2 m, cao 25 –30 m Tập trung ở các vùng Văn Bàn, Sa Pa, Than Uyên mọc trên các loại đất feralít có màu vàng, vàng đỏ, đất dày, chịu được đất chua. Ở Việt Nam: Cây mọc tự nhiên ở Hà Giang, Tuyên Quang, Lào Cai, Yên Bái, Sơn La, Lai Châu, Hà Tây, Hòa Bình, Nghệ An, Hà Tỉnh, Quảng Bình, Quảng Trị, Thừa Thiên Huế, Gia Lai, Kom Tum, Đắk Lắk, Lâm Đồng
Trên thế giới: Trung Quốc, Lào
Gỗ pemu có màu vàng nâu, có thớ mịn, vân đỏ có mùi thơm và không bị mối mọt, để hàng trăm năm không mục Thân thẳng dễ cưa xẻ, được dùng làm đồ mỹ nghệ, điêu khắc, dùng làm cầu, dùng trong xây dựng, cất tinh dầu làm hương liệu rất quý và làm dược liệu
Gỗ pemu dùng chế biến để xuất khẩu Còn phần cành, gốc và rễ ta tận dụng chúng để thu lấy tinh dầu, dùng trong kỹ nghệ dược, mỹ phẩm cao cấp hoặc xuất khẩu
Pemu cùng họ với bách xanh, trắc bách diệp, có tán đẹp, nên có thể cũng được dùng làm cây cảnh (Lê Đình Khả, 1996)
Tinh dầu pemu được sử dụng làm hương liệu nước hoa, ngoài ra dầu pemu còn dùng làm thuốc sát trùng chữa sưng tấy
⮚ Thành phần hóa học tinh dầu pemu:
Tinh dầu pemu là một chất lỏng trong suốt, màu vàng nhạt, nhẹ hơn nước, mùi thơm dịu, vị cay và đắng
Gỗ pemu và nhất là rễ chứa tinh dầu, từ 2-3% Tinh dầu pemu đặc sắc do có tỷ lệ cao của rượu sesquiterpenic đơn vòng gọi là fokienol, nó có mùi thơm rất dễ chịu Chúng vừa được làm nguyên liệu hương, vừa là chất định hương, giữ hương thơm bền lâu nên rất được ưa chuộng
Biết không chính xác (K) Do gỗ quý và rễ có tinh dầu giá trị cao nên cây bị khai thác mạnh Hiện nay chỉ còn gặp rải rác ở nơi xa dân hoặc trên đỉnh và đường núi hiểm trở Tái sinh kém, sinh trưởng chậm nên số lượng giảm nhanh chóng Vì thế cây pemu đã được đưa vào sách đỏ Việt Nam (1996) cần có kế hoạch bảo vệ và nghiên cứu phát triển lâu dài
Cây con khi đạt 12-18 tháng tuổi, cao 25 cm đem trồng Đất trồng pemu phải còn mang tính chất đất rừng Không được trồng pemu trên đất cằn khô kiệt
Trong các rừng đang được phục hồi thì trồng theo băng, cuốc hố 40×40×40 cm Cự ly cây cách cây 4 m, hàng cách hàng 5 m Mật độ 450-625 cây/ha Nếu trồng thuần loại:1100 cây/ha và cây × cây là 3 m Chọn ngày mưa ẩm đem cây con đi trồng, đặt cây ngay ngắn ở giữa hố sau đó lấp đất xung quanh, nén chặt đất, vun gốc cao hơn để cây khỏi bị úng
Chăm sóc và bảo vệ:
⮚ Năm thứ nhất: Phát dọn dây leo, bụi rậm vào tháng 3, 8
⮚ Năm thứ hai: Làm cỏ, vun gốc vào tháng 3, 7, 9
⮚ Năm thứ ba: Phát quang mở rộng tán, vun gốc cây, làm cỏ sạch quanh gốc, đường kính 1 m
Pemu là loại cây có nhiều chất dầu, dễ cháy Vì vậy việc bảo vệ rừng cây pemu là rất cần thiết bằng cách tạo đường băng xanh, cản lửa
2.2.7 Kỹ thuật nhân giống đã sử dụng
Nhân giống cây rừng bằng giâm hom đang được phát triển rất nhanh và được áp dụng rộng rãi vào trồng rừng cao sản cũng như phục vụ công tác bảo tồn tài nguyên di truyền cây rừng
Pemu quý hiếm vừa có phân bố rải rác và có số lượng cá thể ít, lại khó thu hái hạt nên thành công nhân giống bằng hom là rất đáng khích lệ, nó giúp đưa nhanh loài cây vào các chương trình trồng rừng
Vật liệu và phương pháp giâm hom: a Vật liệu giâm hom
Hom cành được xử lý thuốc kích thích ra rễ và giâm tại nhà kính của trung tâm nghiên cứu thực nghiệm lâm sinh Lâm Đồng b Các loại thuốc kích thích ra rễ, các loại thuốc giâm hom là
NHÂN GIỐNG VÔ TÍNH BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ
2.3.1 Khái niệm và ứng dụng
Nuôi cấy mô tế bào thực vật là một ngành còn non trẻ nằm trong hệ thống nhân giống vô tính và nuôi cấy mô bắt đầu với một mảnh nhỏ cây trồng không nhiễm vi sinh vật, đặt trong môi trường dinh dưỡng Chồi mới hay callus (mô không tổ chức) hình thành do sự tăng sinh khối được cấy chuyền để nhân giống
Hệ thống nhân giống vô tính và nuôi cấy mô được phân loại tổng quát theo Hartman và Kester (1983) như sau:
⮚ Tái sinh cây con từ cấu trúc hay mô sinh dưỡng:
1 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng
4 Nuoõi caỏy choài baỏt ủũnh
5 Nuôi cấy mô và tế bào
- Nuôi cấy tế bào huyền phù
⮚ Tái sinh cây con bởi cấu trúc sinh sản:
Schwabe (1984) cho rằng nhân giống vô tính in vitro có thể do sự tăng sinh của mô có tổ chức hoặc do sự phân hóa của mô không có tổ chức (callus) để tạo thành cây con mới
Mantell, và ctv (1985), cho biết nhân giống vô tính in vitro có thể thực hiện bằng một trong bốn phương pháp sau:
- Nhân giống bằng sự tăng sinh chồi nách
- Nhaõn gioỏng qua nuoõi caỏy choài ủổnh
- Nhân giống bằng chồi bất định hay phôi vô tính trực tiếp trên mẫu cấy
- Nhân giống qua nuôi cấy callus để phát sinh chồi bất định hay phôi vô tính Ứng dụng
Nhân giống vô tính in vitro đảm bảo tính đồng nhất Cây mới nhận được sau khi nuôi cấy in vitro hoàn toàn sạch bệnh với tất cả các tính trạng về sức sống, năng suất và phẩm chất từ tổ tiên xa xưa
Một số lớn cây trồng sản xuất qua nuôi cấy mô đã được tiêu thụ trên thị trường thương mại với giá hàng triệu dollars Kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật bậc cao để cải thiện cây trồng bao gồm những ứng dụng sau (Bajij, 1986):
- Nhân giống vô tính với tốc độ nhanh
- Tạo cây trồng sạch bệnh và kháng bệnh
- Cảm ứng và tuyển lựa dòng đột biến
- Sản xuất cây đơn bội qua nuôi cấy túi phấn
- Lai xa qua nuôi cấy phôi và noãn
- Tạo dòng lai soma và lai protoplast
- Gây biến tính thực vật qua hấp thụ DNA ngoại lai
- Cải thiện hiệu quả quang hợp
- Bảo quản lạnh các nguồn gen
Bên cạnh các ứng dụng trong chọn - nhân giống, người ta còn thu nhận các chất có hoạt tính sinh học (alkaloid, steroid,…) qua nuôi cấy mô một số tế bào cây thuốc trên quy mô lớn
2.3.2 Kỹ thuật nhân giống vô tính in vitro
Nhân giống vô tính in vitro thường trải qua các bước sau:
- Vô trùng và nuôi cấy mẫu
- Tạo thể nhân giống in vitro
- Tái sinh thành cây hoàn chỉnh in vitro
- Tạo điều kiện thích hợp chuyển cây ra vườn ươm để thuần hóa
⮚ Vô trùng và nuôi cấy mẫu
Chọn lựa và xử lý mẫu, thiết lập sự nuôi cấy vô trùng, thường là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng
Mẫu được đưa vào nuôi cấy thường còn đang ở giai đoạn non, quá trình phân chia và phân hoá mạnh Đỉnh sinh trưởng và chồi bên được sử dụng ở hầu hết các loại cây trồng, ngoài ra chóp đỉnh và chồi non nẩy mầm từ hạt cũng được sử dụng Đỉnh sinh trưởng nhỏ được tách bằng kính lúp
Mẫu được khử trùng bằng Na-hypochlorite, Ca-hypochlorite hay HgCl2 trước khi cấy vào môi trường Đối với cây trồng đã có kết quả nghiên cứu của các tác giả trên thế giới, môi trường nuôi cấy sẵn có thường được áp dụng Tuy nhiên, với đối tượng mới, môi trường nuôi cấy thích hợp cần được nghiên cứu sâu sắc
Môi trường được sử dụng rộng rãi trong môi trường nuôi cấy mô hiện nay là môi trường MS (Murashighe-Skoog, 1962) Đối với mẫu dễ bị hóa nâu, môi trường thường được bổ sung than hoạt tính (Activated charcoal) hay ngâm mẫu trước khi cấy với hỗn hợp ascorbic acid và citric acid (25-150mg/l cho mỗi loại) Đối với cây thân gỗ, thường sử dụng môi trường WPM (Lloy & McCow, 1980)
⮚ Tạo thể nhân giống in vitro
Mẫu nuôi cấy được cấy trên môi trường chọn lọc đặc biệt nhằm mục đích tạo thể nhân giống in vitro
Có hai thể nhân giống in vitro: thể chồi (multiple shoot), thể cắt đốt
(cutting), ngoài ra còn có thể giò (protocorm)
Tạo thể nhân giống in vitro dựa vào đặc điểm nhân giống ngoài tự nhiên của cây trồng Tuy nhiên, có những loại cây trồng không có khả năng nhân giống, người ta thường nhân giống bằng cách tạo cụm chồi từ mô sẹo Để tạo thể nhân giống, trong môi trường nuôi cấy thường được bổ sung cytokinin, auxin, gibberenlin và các chất hữu cơ khác…
⮚ Nhaân gioáng in vitro Đây là giai đoạn quan trọng trong việc nhân giống cây trồng bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật, nhằm mục đích tăng sinh khối cây trồng Vật liệu nuôi cấy là những thể chồi
Môi trường nuôi cấy thông thường giống với môi trường tạo thể chồi, đôi khi nồng độ chất sinh trưởng giảm thấp cho phù hợp với nhân giống kéo dài Điều kiện nuôi cấy thích hợp cho quá trình tăng sinh được nhanh, cây nhân giống in vitro có trạng thái sinh lý trẻ và được duy trì trong thời gian vô hạn
⮚ Tái sinh cây hoàn chỉnh in vitro Đây là giai đoạn tạo cây con hoàn chỉnh có đầy đủ thân lá và rễ chuẩn bị chuyển ra vườn ươm cây
Cây con phải khoẻ mạnh nhằm nâng cao sức sống khi đưa ra môi trường bình thường
Các chất có tác dụng kích thích tạo chồi được loại bỏ, thay vào đó là những chất kích thích quá trình ra rễ (IAA, NAA, IBA…thuộc nhóm auxin) Điều kiện nuôi cấy tương tự với điều kiện tự nhiên bên ngoài, một bước thuần hóa trước khi được đưa ra khỏi điều kiện in vitro
⮚ Chuyển cây in vitro ra vườn ươm (thuần hoá) Đây là giai đoạn khó khăn nhất trong quá trình nhân giống in vitro Cây in vitro được nuôi cấy trong điều kiện ổn định về dinh dưỡng, ánh sáng, nhiệt độ, ẩm độ… Khi chuyển ra đất với điều kiện tự nhiên khắc nghiệt hơn: Dinh dưỡng thấp, ánh sáng có cường độ mạnh, nhiệt độ cao, ẩm độ thấp…Cây con dễ dàng bị stress, mất nước và mau bị héo, bệnh hại xâm nhập dễ gây chết cây (nhất là do nấm gây hại) Để tránh tình trạng này, vườn ươm cây cấy mô phải mát, cường độ chiếu sáng thấp, nhiệt độ không khí mát, ẩm độ cao,…
Cây con thường được cấy trong luống ươm có cơ cấu dễ thoát nước, tơi xốp, giữ được ẩm Trong những ngày đầu cần phải được phủ nylon để giảm quá trình thoát hơi nước ở lá (thường 7-10 ngày sau cấy)
VAI TRÒ CHẤT KÍCH THÍCH SINH TRƯỞNG
Chất điều hoà sinh trưởng là những chất với liều lượng thấp hiệu ứng sinh học cao, được tổng hợp tại một cơ quan và gây ảnh hưởng điều tiết đến các quá trình sinh lý, trao đổi chất nào đó trong những cơ quan khác Chất điều hoà sinh trưởng là sản phẩm trao đổi chất bình thường của cơ thể thực vật Nó đóng vai trò chủ đạo trong quá trình sinh trưởng, phát triển và những quá trình sinh lý, hoá sinh khác cũng như trong phản ứng thích nghi của thực vật đối với điều kiện của môi trường (Bùi Trang Việt, 2000)
Auxin hoạt hoá sự phân bào, sinh trưởng kéo dài, cần cho sự tạo mạch dẫn và ra rễ, tăng trưởng của quả, tạo quả không hạt, kích thích sinh trưởng của oỏng phaỏn (Buứi Trang Vieọt, 2000)
Sự vận chuyển auxin có vai trò quan trọng trong sự tăng trưởng và phân hóa, auxin giúp kéo dài và phân chia tế bào, các hiện tượng hướng động, ưu thế ngọn, lão suy, rụng, đậu, tăng trưởng và chín của quả…(Nguyễn Văn Kế, 2000)
Auxin kích thích mạnh sự kéo dài tế bào diệp tiêu Sự kéo dài của tế bào rễ cần những nồng độ auxin thấp hơn nhiều so với thân và chồi Hiệu ứng auxin giảm khi nồng độ auxin nhỏ hơn nồng độ tối ưu và trở nên độc ở các nồng độ quá cao
Tất cả cây trồng đều tổng hợp được chất auxin (dạng tổng hợp) tùy theo giai đoạn phát triển của chúng Ngay từ khi chất auxin được nhận dạng, có nhiều chất có cấu trúc gần nhau và giống nhau về mặt hoá học đã được thí nghiệm Một vài chất này đã thể hiện các đặc tính tương tự như các đặc tính của chất auxin, nhưng thường với liều lượng thấp hơn, hơn nữa chúng ít bị kiểm soát bởi các enzym và có thể có một tác động kéo dài trong đó có NAA Trong lĩnh vực nuôi cấy in vitro, những chất này đã chiếm một vị trí quan trọng, hai tính chất được nghiên cứu nhiều là kích thích sự phân chia tế bào và sự hình thành rễ (Traàn Vaên Minh, 2005)
Auxin chẳng những kích thích sự tăng trưởng của chồi non mà còn khởi phát sinh cho sự tạo mới.Ở nồng độ thấp thường dùng kết hợp với cytokinin thì auxin khởi phát mô phân sinh ngọn, vượt quá nồng độ giới hạn thì auxin ngăn cản sự phát triển của lá mới hay của mô phân sinh bên (Bùi Trang Việt, 2000)
Các cytokinin kích thích mạnh sự phân chia tế bào với điều kiện có sự hiện diện của auxin Cytokinin cũng giúp sự gia tăng kích thước tế bào và sinh tổng hợp protein Cytokinin ngăn cản sự lão hóa mô, thúc đẩy sự hình thành của chồi non, nhưng lại ức chế sự tạo rễ (Dương Công Kiên, 2002)
Sự sinh tổng hợp cytokinin ở trong cây xảy ra ở những vùng rất khác nhau, đặc biệt là ở những nơi có sự phân chia tế bào mạnh (ở ngọn thân hay rễ) Nó hiện diện hầu hết trong các mô, đặc biệt trong hạt, trái và trong rễ, tuy nhiên rễ là nơi tổng hợp nhiều nhất, vì vậy khi rễ bị tổn thương thì thấy nụ phát triển yếu do không tạo đủ cytokinin Nó hoạt hoá sự phân bào, song tác động này chỉ thể hiện trong sự phối hợp với auxin (Trần Văn Minh, 2005) Trong nuôi cấy mô, cytokinin thể hiện các tính chất cho phép chúng ta giải quyết những khó khăn trong việc duy trì sự sống của mô, kích thích sự phân chia tế bào và định hướng tế bào trong con đường phân hoá (Trần Văn Minh, 2005)
Hiệu ứng chính của gibberellin là kéo dài thân, kích thích sự kéo dài lóng Gibberellin kích thích mạnh sự phân chia tế bào mô vỏ và biểu bì
Kích thích sự kéo dài lóng, vừa do sự kéo dài vừa do sự phân chia tế bào thân, là đặc tính nổi bật của gibberellin Gibberellin kích thích mạnh sự phân chia tế bào nhu mô vỏ và biểu bì Xử lý gibberellin làm tăng năng suất mía cây và đường (do kích thích sự kéo dài lóng) Gibberellin liều cao (hay phối hợp với cytokinin) kích thích mạnh sự tăng trưởng lá Trên lá yến mạch hay diệp tiêu lúa, gibberellin chỉ có vai trò làm tăng hiệu ứng auxin (Bùi Trang Việt, 2000).
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
Mẫu ban đầu dùng để nuôi cấy là chồi đỉnh, được lấy từ cây 1-1,5 tuổi (có nguồn gốc từ trung tâm nghiên cứu lâm sinh Lâm Đồng) và được gây trồng tại Viện Sinh Học Nhiệt Đới, Thủ Đức, thành phố Hồ Chí Minh
Tuỷ caỏy voõ truứng, noài haỏp voõ truứng, oỏng nghieọm 25 ì100 mm, bỡnh tam giác dung dịch 300 ml, được đậy kín bằng nắp cao su, đĩa nhôm đường kính 20 cm, coỏc, oỏng ủong, pipet…
Các thí nghiệm được thực hiện trên hai môi trường nuôi cấy cơ bản: MS và WPM (có bổ sung thêm các chất kích thích, điều hòa sinh trưởng) Để thuận tiện, môi trường nuôi cấy được pha từ các dung dịch mẹ đã chuẩn bị: khoáng đa lượng (macro), khoáng vi lượng (micro), vitamin, Fe_EDTA a Macro
- Macro MS (Murashige và Skooge, 1962)
Na2MoO4.2H2O : 0,25 mg/l CuSO4.5H2O : 0,025 mg/l
Na2EDTA.2H2O : 37,3 g/5l e Các chất điều hòa sinh trưởng : BA, IBA, Ki f Các chất khác:
Pha môi trường làm việc
Pha một lít môi trường làm việc từ các dung dịch mẹ đã chuẩn bị:
⮚ 100 ml macro (MS và WPM)
3.1.4 Thể tích môi trường nuôi cấy
Ban đầu cấy trong ống nghiệm chứa 10 ml môi trường vô trùng, sau 7-10 ngày mẫu nuôi cấy được chuyển sang bình tam giác 300 ml có chứa 65 ml môi trường
3.1.5 Chuaồn bũ maóu nuoõi caỏy
Sử dụng cành non khoảng 15-20 ngày tuổi, lấy chồi đỉnh rửa sạch nhiều lần dưới vòi nước máy sau đó ngâm trong nước xà phòng 0,1% trong 15 phút và được rửa lại bằng nước máy bình thường
Môi trường và dụng cụ nuôi cấy được vô trùng bằng nồi hấp vô trùng ở nhiệt độ 121 o C và áp suất 1 atm trong 22 phút Tủ cấy vô trùng, nhiệt độ nuôi cấy 26±2 o C, cường độ chiếu sáng 3000 lux, thời gian chiếu sáng 8 giờ/ngày.
BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM NGHIÊN CỨU
Các thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, một yếu tố (completely randomized design, CRD) 3 lần lặp lại, mỗi nghiệm thức ở từng lần lặp lại cấy 3 bình tam giác, mỗi bình cấy 5 mẫu, đối với ống nghiệm mỗi lần lặp lại cấy 20 ống nghiệm
3.2.1 Voõ truứng maóu nuoõi caỏy
Mục tiêu của thí nghiệm này là vô trùng mẫu nuôi cấy, tạo nguồn vật liệu ban đầu vô trùng để sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo
- Thí nghiệm 1.1: Ảnh hưởng của Hypo-Na và thời gian đến khả năng vô truứng maóu caõy pemu nuoõi caỏy in vitro
Mục tiêu thí nghiệm xác định nồng độ Hypo-Na và thời gian để vô trùng maãu
Bảng 3.1: Ảnh hưởng nồng độ Hypo-Na và thời gian đến vô trùng mẫu
Nghiệm thức Công thức vô trùng
Nồng độ Hypo-Na (%) Thời gian (phút)
- Thí nghiệm 1.2: Ảnh hưởng của HgCl2 và thời gian đến khả năng vô truứng maóu caõy pemu
Mục tiêu thí nghiệm xác định nồng độ HgCl2 và thời gian để vô trùng mẫu
Bảng 3.2: Ảnh hưởng nồng độ HgCl2 và thời gian đến vô trùng mẫu
Công thức vô trùng mẫu
Thời gian theo dõi: 10 ngày sau khi cấy vào ống nghiệm
3.2.2 Ảnh hưởng của các môi trường khoáng cơ bản đến khả năng tái sinh choài caây pemu in vitro
Mục đích của thí nghiệm này là sử dụng chồi đỉnh sinh trưởng làm nguyên liệu nuôi cấy ban đầu Đỉnh sinh trưởng là vùng nhu mô phân sinh chứa những tế bào tiền phôi có khả năng phân chia, phân hóa và phát sinh cơ quan Đây là vùng khởi sinh, tế bào luôn ở dạng trẻ về sinh lý, khả năng phát sinh hình thái mạnh, nuôi cấy đỉnh sinh trưởng là tiền đề cho việc tạo nguyên liệu khởi đầu cho nuôi cấy in vitro và luôn giữ được đặc điểm của cây mẹ Cây pemu lần đầu tiên được nghiên cứu nuôi cấy mô ở Việt Nam nên việc xác định môi trường cơ bản thích hợp cho nuôi cấy là rất quan trọng tyỷ leọ maóu soỏng voõ truứng (%)
= toồng soỏ maóu caỏy ì 100 tyỷ leọ maóu soỏng voõ truứng (%) soá maãu soáng khoâng bò nhieãm
Tyỷ leọ maóu soỏng voõ truứng
Bảng 3.3: Ảnh hưởng của môi trường khoáng cơ bản đến khả năng tái sinh choài
Thành phần môi trường khoáng BA(mg/l) Cw(%)
WPM ẵ WPM ẵ MS WPM ẵ WPM ẵ MS WPM
- Các chỉ tiêu theo dõi được ghi nhận sau 45 ngày nuôi cấy
3.2.3 Ảnh hưởng của BA, Ki và Cw đến khả năng nhân giống
Sau khi thu được chồi qua nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, ta lấy chồi in vitro đó dùng làm nguyên liệu cho quá trình nhân giống vô tính BA, Ki là chất kích thích sinh trưởng cần thiết cho quá trình phân hóa cơ quan Nước dừa được bổ sung vào môi trường nuôi cấy kích thích cho sự nhân chồi trên nhiều đối tượng
Bảng 3.4: Ảnh hưởng nồng độ BA, Ki và Cw đến khả năng phát sinh chồi
Nghiệm thức Môi trường BA (mg/l) Ki (mg/l) Cw (%)
- Các chỉ tiêu theo dõi được ghi nhận sau 45 ngày nuôi cấy.
3.2.4 Ảnh hưởng của BA và IBA đến khả năng nhân giống cây pemu in vitro
Nhân giống cây pemu là giai đoạn chính nghiên cứu quá trình tăng sinh khối in vitro Trong vi nhân giống, cytokinin và auxin đóng vai trò quan trọng trong việc phát sinh, sinh trưởng và phát triển thực vật, tỷ lệ này rất cao kích thích phát sinh chồi và ngược lại Ở thí nghiệm này, ta tìm tỷ lệ BA/IBA thích hợp để nuôi cấy phát sinh chồi cây pemu in vitro
Bảng 3.5: Ảnh hưởng của nồng độ BA và IBA đến khả năng phát sinh chồi
Nghieọm thức Môi trường BA IBA
- 0,3 0,3 Chỉ tiêu theo dõi được ghi nhận sau 45 ngày nuôi cấy
3.2.5 Ảnh hưởng của các chất hữu cơ đến khả năng nhân giống pemu in vitro
Mục tiêu thí nghiệm này xác định nồng độ BA, yeast extract, glutamine và ngô thích hợp cho nuôi cấy phát sinh chồi cây pemu in vitro
Bảng 3.6: Ảnh hưởng của lượng BA, yeast extract, glutamine và ngô đến khả năng phát sinh chồi
- Chỉ tiêu theo dõi được ghi nhận sau 45 ngày nuôi cấy
3.2.6 Ảnh hưởng của BA, IBA, Yeast extract và than đến khả năng vươn thaân caây pemu in vitro
Mục tiêu thí nghiệm này xác định nồng độ thích hợp của BA, IBA, Yeast extract và than đến khả năng vươn thân cây pemu in vitro
Bảng 3.7: Ảnh hưởng của BA, IBA, yeast extract và than đến khả naờng vửụn thaõn
1 Chỉ tiêu theo dõi được ghi nhận sau 45 ngày nuôi cấy
3.2.7 Ảnh hưởng của IBA và Rib đến quá trình tạo rễ cây pemu in vitro
Auxin đóng vai trò quan trọng trong qúa trình kích thích phát sinh rễ Thí nghiệm này xác định nồng độ IBA và Rib đến quá trình ra rễ
Bảng 3.8: Ảnh hưởng của IBA và Rib đến quá trình tạo rễ
Nghiệm thức Môi trường IBA (mg/l) Rib (g/l)
WPM WPM WPM WPM WPM
- Chỉ tiêu theo dõi được ghi nhận sau 60 ngày.
CÁC CHỈ TIÊU NGHIÊN CỨU
⮚ Soỏ choài/cuùm nuoõi caỏy
⮚ Sự hình thành mô sẹo (+/-)
PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU
Kết quả thí nghiệm được tính toán và phân tích bằng phần mềm thống kê Mstatc, Excel.