BỘ CÔNG THƯƠNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌCCẤP TRƯỜNG Tên đề tài NGHIÊN CỨU THIẾT KẾ MÔ HÌNH KIỂM SOÁT NHIỆT.
BỘ CÔNG THƯƠNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌCCẤP TRƯỜNG Tên đề tài: NGHIÊN CỨU THIẾT KẾ MƠ HÌNH KIỂM SỐT NHIỆT ĐỘ VÀ pH TRONG NI CẤY VI SINH VẬT Ở ĐIỀU KIỆN PHỊNG THÍ NGHIỆM TẠI VIỆN KHCN&QL MÔI TRƯỜNG Mã số đề tài: 171.4011 Chủ nhiệm đề tài: ThS Nguyễn Hoàng Mỹ Đơn vị thực hiện: Viện KHCN&QL Mơi trường Tp Hồ Chí Minh, tháng năm 2022 LỜI CÁM ƠN Trong công tác giảng dạy môn Vi sinh vật học Vi sinh môi trường Viện Khoa học công nghệ Quản lý Môi trường, nhóm giảng viên phụ trách nhận thấy cần có mơ hình ni cấy vi sinh vật để giảng dạy, nâng cao khả thực hành cho sinh viên Mặt khác, từ nhu cầu nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật xử lý môi trường sinh viên ngành Kỹ thuật môi trường, Quản lý tài nguyên môi trường thực đồ án tốt nghiệp, đề tài khoa học cấp trường “Nghiên cứu thiết kế mơ hình kiểm sốt nhiệt độ pH ni cấy vi sinh vật điều kiện phịng thí nghiệm Viện KHCN&QL Mơi trường” hình thành nhằm phục vụ cho mục tiêu Đề tài hoàn thành mơ hình ni cấy vi sinh vật dung tích 10Lit kiểm sốt nhiệt độ, pH điều kiển qua phần mềm ứng dụng điện thoại thông minh Nhóm nghiên cứu chân thành cảm ơn hỗ trợ hợp tác từ phòng ban Nhà trường thời gian thực hiện: hỗ trợ kinh phí từ phía Nhà trường, hướng dẫn thủ tục Phòng Quản lý khoa học hợp tác quốc tế, giúp đỡ Ban lãnh đạo Viện khoa học công nghệ hợp tác tốt đẹp với Trung tâm nghiên cứu đào tạo thuộc khu Công nghệ cao TpHCM Mơ hình sử dụng giảng dạy nghiên cứu cho sinh viên Viện KHCN&QL Môi trường trường ĐH Cơng nghiệp TpHCM Nhóm nghiên cứu PHẦN I THƠNG TIN CHUNG I Thơng tin tổng qt 1.1 Tên đề tài: Nghiên cứu thiết kế mơ hình kiểm sốt nhiệt độ pH ni cấy vi sinh vật điều kiện phịng thí nghiệm Viện KHCN&QL Môi trường 1.2 Mã số: 171.4011 1.3 Danh sách chủ trì, thành viên tham gia thực đề tài TT Họ tên Đơn vị cơng tác Vai trị thực đề tài ThS Nguyễn Hoàng Mỹ Viện KHCN&QL Môi Trường Chủ nhiệm đề tài ThS Đỗ Tân Khoa Hồ Đức Linh Viện KHCN&QL Môi Trường Thành viên Phan Thị Xuân Linh Viện KHCN&QL Môi Trường Thành viên Nguyễn Chí Thành Viện KHCN&QL Mơi Trường Thành viên Trung tâm đào tạo thuộc Khu công nghệ cao Tp.HCM Thành viên 1.4 Đơn vị chủ trì: 1.5 Thời gian thực hiện: 1.5.1 Theo hợp đồng: từ tháng 04 năm 2017 đến tháng 03 năm 2018 1.5.2 Gia hạn (nếu có): đến tháng 09 năm 2018 1.5.3 Thực thực tế: từ tháng 04 năm 2017 đến tháng 09 năm 2018 1.6 Những thay đổi so với thuyết minh ban đầu (nếu có): - Tên báo đăng ký theo thuyết minh: Tối ưu hóa quy trình ni cấy thu nhận sinh khối Bacillus hệ thống bioreactor dung tích lít - Tên báo cơng bố: Thiết kế mơ hình kiểm sốt nhiệt độ pH nuôi cấy vi sinh vật điều kiện phịng thí nghiệm Viện KHCN&QL Mơi Trường , ĐH Công nghiệp TpHCM - Lý do: thay đổi tên báo để thể nội dung nghiên cứu 1.7 Tổng kinh phí phê duyệt đề tài: 55 triệu đồng II Kết nghiên cứu Đặt vấn đề Bioreactor hay gọi hệ thống lên men nồi phản ứng sinh học sử dụng thùng chứa để nuôi giữ tế bào nhằm khai thác q trình sinh hóa, thu nhận sinh khối sản phẩm chuyển hóa thứ cấp Hệ thống cung cấp môi trường dinh dưỡng điều kiện ni cấy có kiểm sốt để tế bào phát triển theo mục đích khai thác Bioreactor sử dụng để nuôi cấy tế bào vi sinh vật, động vật, thực vật … liên tục theo mẻ, điều kiện hiếu khí kỵ khí Vật liệu thiết kế inox, thép khơng gỉ, hợp kim kháng khuẩn, thủy tinh chịu lực …Kích thước hệ thống quy mơ phịng thí nghiệm từ đến 50 lít, quy mơ pilot từ 0,3 đến 10m quy mô công nghiệp từ đến 500m3 thường có tỷ lệ chiều cao đường kính thùng lên men 2/1 3/1 Hình Cấu tạo hệ thống lên men Các điều kiện q trình ni cấy kiểm sốt tự động bán tự động thông qua điều khiển Trong điều kiện ni cấy lỏng, cần kiểm sốt việc pha trộn thành phần dung dich tế bào, nhằm đảm bảo chuyển khối chất dinh dưỡng đến bề mặt tế bào cách tốt Cường độ pha trộn tùy thuộc loại cánh khuấy tốc độ khuấy Tuy nhiên, sử dụng cánh khuấy tác động đến cấu trúc làm phá vỡ tế bào Ở trường hợp hệ lên men hiếu khí, phun lỗ đơn phun vòng thường sử dụng để sục khí cho hệ lên men Với thể tích nhỏ, việc sục khí thay cho cánh khuấy để phối trộn tế bào môi trường dinh dưỡng Độ pH hệ lên men trì cách dùng dung dịch đệm điều chỉnh pH Đầu dị pH gắn hệ thống rời bên Nhiệt độ điều chỉnh hệ thống gia nhiệt đặt đáy gia nhiệt qua thành Phương pháp gia nhiệt qua thành kết hợp với dòng dung dịch bên giúp q trình kiểm sốt nhiệt độ nhanh xác hơn, đồng thời ảnh hưởng đến tế bào tiếp xúc gần với vị trí gia nhiệt Trong điều kiện nuôi cấy theo mẻ, tế bào vi sinh vật phát triển theo giai đoạn tiền phát, logarit, cân suy vong Trong điều kiện nuôi cấy liên tục, tế bào vi sinh vật cung cấp dinh dưỡng tiếp tục trì pha cân Pha logarit giai đoạn tế bào phân chia làm gia tăng sinh khối nhanh nhất, đồng thời pha tiêu tốn nhiều dinh dưỡng môi trường nuôi cấy Pha cân thường gia tăng sản phẩm phụ thứ cấp, chất trao đổi tế bào môi trường làm ảnh hưởng nhiều đến thành phần môi trường Cuối pha logarit, đầu pha cân thường giai đoạn tốt cho việc thu nhận sinh khối tế bào Pha cân giai đoạn tốt cho việc thu nhận sản phẩm chuyển hóa thứ cấp Tùy vào mục đích ni cấy để lựa chọn hình thức thời điểm thích hợp để hiệu suất ni cấy tối đa Trong cơng trình xử lý nước thải, việc sử dụng sinh khối vi sinh vật cho giai đoạn khởi động bổ sung sau tái tuần hoàn bùn vấn đề bắt buộc Sinh khối dạng đơng khơ dạng nước, thu nhận sau q trình ni cấy bioreactor công nghiệp Các chủng vi sinh vật phải nghiên cứu khả thích nghi với nguồn dinh dưỡng điều kiện lý hóa đặc trưng loại nước thải, từ đánh giá khả làm giảm chất hữu nitơ, carbon, phospho … Sau đó, chủng vi sinh vật tuyển chọn phải qua giai đoạn thử nghiệm pilot phịng thí nghiệm mơ hình xử lý nước thải mô hệ thống thực tế Tại Viện Khoa học công nghệ quản lý môi trường, mơ hình thiết kế có khả xử lý từ 50 – 100 lít nước thải, tùy theo cơng nghệ phương pháp sử dụng Tương ứng với thể tích nước thải trên, vi sinh vật có mật độ 106 – 109 tế bào/ml cần sử dụng từ đến 10 lít sản phẩm dung dịch sau ni cấy Thể tích cụ thể phải tính tốn dựa hàm lượng chất rắn lơ lửng hỗn hợp dễ bay (MLVSS - đại diện cho mật độ vi sinh vật có bùn hoạt tính), tỷ số F/M (thức ăn/vi sinh vật) mức độ ô nhiễm nước thải Thông thường, chủng vi sinh vật tiềm ni cấy bình tam giác máy lắc Lắc nhẹ bình tam giác hiệu để tạo dịch huyền phù tế bào, tăng cường oxy hóa thơng qua bề mặt chất lỏng trợ giúp chuyển khối chất dinh dưỡng mà không gây nguy hiểm cho cấu trúc tế bào Tuy nhiên phương pháp có hiệu khơng cao khó kiểm sốt điều kiện ni cấy Mặc khác, dung tích bình tam giác khơng đủ cho việc thu nhận thể tích sản phẩm cho mơ hình thực nghiệm xử lý nước thải Vì vậy, cần thiết phải có hệ thống mơ bioreactor cơng nghiệp, với thể tích phù hợp, vận hành đơn giản để phục vụ giảng dạy nghiên cứu ứng dụng sinh viên giảng viên Mục tiêu - Thiết kế mô hình ni cấy thu nhận sinh khối vi sinh vật điều kiện vơ trùng, kiểm sốt nhiệt độ pH - Viết phần mềm giám sát nhiệt độ, pH cho q trình ni cấy Phương pháp nghiên cứu 3.1 Phương pháp nghiên cứu thiết kế - Sử dụng phần mềm Autocad 2D solidwork để thiết kế vẽ mơ hình với u cầu: (1) thể tích từ đến 10 lít, (2) gia nhiệt khoảng 30 đến 80OC, (3) điều chỉnh pH khoảng đến14, (4) có khả sục khí, tiệt trùng, (5) bổ sung dung dịch dinh dưỡng thu nhận sản phẩm theo mẻ, (6) dễ vận hành kiểm sốt q trình giảng dạy, thực nghiên cứu - Từ vẽ, tiến hành gia công vật liệu inox 304 Đây chất liệu inox chống ăn mòn cao, chịu nhiệt tốt, dễ tạo hình, gia cơng tất phương pháp hản, khơng có từ tính, có khả đàn hồi cao, giá thành hợp lý cho việc gia công thiết kế Mặc khác, sử dụng hệ thống vật liệu inox trình giảng dạy, nghiên cứu đảm bảo mặt an toàn cho sinh viên so với chất liệu thủy tinh - Nâng cao khả giám sát hệ thống phần mềm kết nối với điện thoại thông minh qua Bluetooth: dễ dàng cài đặt sử dụng điện thoại Android, hiển thị số liệu điều khiển trực tiếp từ điện thoại 3.2 Phương pháp đánh giá vận hành hệ thống 3.2.1 Thí nghiệm vận hành đánh giá khả ổn định nhiệt độ, pH thời gian nuôi cấy theo mẻ - Sau tiệt trùng hệ thống đèn UV 30 phút, tiến hành thí nghiệm: - Thí nghiệm 1: Sử dụng giống vi khuẩn Bacillus cho vào hệ thống môi trường cao thịt peptone tiệt trùng điều chỉnh pH7 Gia nhiệt khoảng nhiệt độ 30 OC, 40OC, 50OC Mỗi khoảng nhiệt độ cài đặt 24 Đánh giá hiệu nuôi cấy thông qua mật độ vi khuẩn - Thí nghiệm 2: Sử dụng giống vi khuẩn Bacillus cho vào hệ thống môi trường cao thịt peptone tiệt trùng Cài đặt nhiệt độ 30OC Điều chỉnh pH với giá trị pH 5, 6, 7, Mỗi khoảng pH ổn định 24h Đánh giá hiệu nuôi cấy thông qua mật độ vi khuẩn - Thí nghiệm 3: Sử dụng giống vi khuẩn Bacillus cho vào hệ thống môi trường cao thịt peptone tiệt trùng Cài đặt nhiệt độ 30OC, pH 7, đánh giá hiệu nuôi cấy thông qua mật độ vi khuẩn vào thời điểm từ đến 48 Trong đó, Thí nghiệm đánh giá khả ổn định nhiệt độ gia nhiệt Thí nghiệm đánh giá khả ổn định pH đầu dị Thí nghiệm đánh giá ổn định hệ thống sau khoảng thời gian dài nuôi cấy Mỗi thí nghiệm lặp lại lần tiến hành hai mức thể tích lít lít nhằm đánh giá khả ổn định hệ thống tất vị trí bên lịng ngăn chứa dịch nuôi cấy Đồng thời kiểm tra khả pha trộn dung dịch hệ thống sục khí mức thể tích thấp cao 3.2.2 Thí nghiệm vận hành đánh giá khả ổn định hệ thống nuôi cấy liên tục Sau tiệt trùng hệ thống đèn UV 30 phút, sử dụng giống vi khuẩn Bacillus cho vào hệ thống lít mơi trường cao thịt peptone tiệt trùng Cài đặt nhiệt độ 30OC, pH Sau giờ, mở van xả thu nhận lít sản phẩm sau nuôi cấy đồng thời mở van nạp để bổ sung vào lít mơi trường Tiến hành lần Đánh giá hiệu thông qua mật độ vi khuẩn thu nhận sản phẩm Tổng kết kết nghiên cứu 4.1 Kết thiết kế hệ thống bioreactor Theo tính tốn phần mềm thiết kế, để đạt thể tích mong muốn từ đến 10 lít tỷ lệ chiều cao đường kính thùng lên men hợp lý, hệ thống bioreactor lựa chọn thông số chiều dài 530cm, chiều rộng 280cm, chiều cao 700cm bao gồm ngăn nối liền với Ngăn tủ điện, nơi lưu thông khí để tản nhiệt vào xung quanh thành ngăn Phía hệ thống điều khiển có hình thể ngày giờ, nhiệt độ, pH, cơng tắc đèn UV, van điều chỉnh lưu lượng khí Bộ phận gia nhiệt đặt bên quạt làm mát Ngăn nơi chứa dịch ni cấy, có ống dẫn khí, van xả bên dưới; van bổ sung dinh dưỡng bên hơng (hình 2) Hình Bản vẽ hệ thống bioreactor Đối tượng sử dụng hệ thống bioreactor chủng vi khuẩn hiếu khí Để đảm bảo q trình ni cấy thu nhận chủng vi khuẩn mục tiêu, hệ thống đèn UV bố trí nắp đậy ngăn 2, cơng tắc điều khiển ngăn Lựa chọn phương pháp gia nhiệt qua thành để giảm thiểu ảnh hưởng đến tế bào, nên phận gia nhiệt đặt bên ngăn 1, với hệ thống quạt làm mát, lưu thơng khơng khí để tản nhiệt vào ngăn Cảm biến nhiệt PT100 (dòng sản phẩm TF101U2) sử dụng hệ thống đầu dò chuyển đổi nhiệt độ khu vực đo thành tín hiệu điện đầu Đầu dị nhiệt độ có điện trở làm bạch kim (platinum) có độ xác cao, chịu áp lực, chống rung, thích hợp sử dụng dung dịch lỏng có khuấy trộn Bao bọc bên ngồi vỏ thép khơng rỉ V4A lớp bảo vệ IP66 Đối với pH, hệ thống dùng đầu dò hãng Atlas Scientific biên độ đo 0-14 đặt đáy ngăn Đầu dò bọc lớp màng mỏng thủy tinh cho phép ghi nhận khác biệt nồng độ ion H+ bên ngồi màng Từ khác biệt đó, đầu dị xác định giá trị pH tương quan (Hình 3) Hình Cảm biến nhiệt độ đầu dị pH sử dụng hệ thống Với thể tích nhỏ nên hệ thống không sử dụng cánh khuấy mà tận dụng q trình sục khí để tạo dịng pha trộn dung dịch với tế bào ni cấy Ống sục khí đặt đáy ngăn có van điều chỉnh tốc độ sục khí Ngồi ra, cịn có van nạp để bổ sung nguyên liệu, dung dịch dinh dưỡng từ phía hơng van xả để lấy bớt sản phẩm sau ni cấy đặt phía ngăn Cả hai van thông trực tiếp vào dung dịch nuôi cấy bên ngăn 2, phục vụ cho trình nuôi cấy theo mẻ mà không cần mở nắp ngăn Sau so sánh loại vật liệu thủy tinh, inox 304 inox 316, nghiên cứu lựa chọn inox 304 cho thiết kế Inox 304 hay gọi thép khơng gỉ có thành phần chủ yếu Crom (Cr), Niken (Ni), có độ cứng, độ bền cao, bề mặt sáng bóng, khơng gỉ sét, có khả chống ăn mịn chiu nhiệt tốt Ngồi ra, giá thành phù hợp dễ thiết kế hệ thống van, ống dẫn dọc theo thành ống Quá trình thực Trung tâm đào tạo công nghệ cao Thành phố Hồ Chí Minh Sau đó, hệ thống bioreactor vận chuyển phịng thí nghiệm sinh học môi trường, Viện KHCN&QL Môi trường cho thử nghiệm đánh giá (Hình 4) Hình Hệ thống bioreactor thiết kế với vật liệu inxo 304 Để tăng thêm hiệu thuận tiện trình sử dụng, phần mềm Bioreactor HC-06 dùng điều khiển hệ thống thông qua kết nối bluetooth với điện thoại thông minh Phần mềm có cài đặt chế độ tự động (AUTO) cho hệ thống chế độ điều khiển tay (MANUAL) Chế độ tự động cho phép cài đặt nhiệt độ thời gian Chế độ điều khiển tay cho phép cài đặt điều chỉnh thêm chức sục khí, quạt đèn UV (Hình 5) Hình Màn hình ứng dụng Bioreactor HC-06 Ưu điểm phần mềm Bioreactor HC-06 dễ dàng cài đặt tất điện thoại thông minh android, thao tác dễ sử dụng Nhược điểm kết nối với hệ thống bioreactor thông qua Bluetooth Điều làm giới hạn khoảng cách kiểm soát cho người dùng Các bước vận hành sau: Bước 1: Bật đèn UV 30 phút để khử trùng hệ thống Bước 2: Cho môi trường dinh dưỡng giống vi sinh vật Bước 3: Bật Bluetooth điện thoại Chọn thiết bị kết nối “choose a devide” chọn CONNECT (HC- 06) Bước 4: Chọn chế độ AUTO MANUAL Bước 5: Cài nhiệt độ muốn nuôi cấy – set temperature Bước 6: Cài thời gian nuôi cấy – Alam Time (phút) Bước 7: Chạy mơ hình – RUN Hình Màn hình điều khiển hệ thống cài đặt Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết thiết kế hệ thống bioreactor Theo tính tốn phần mềm thiết kế, để đạt thể tích mong muốn từ đến 10 lít tỷ lệ chiều cao đường kính thùng lên men hợp lý, hệ thống bioreactor lựa chọn thông số chiều dài 530cm, chiều rộng 280cm, chiều cao 700cm bao gồm ngăn nối liền với Ngăn tủ điện, nơi lưu thơng khí để tản nhiệt vào xung quanh thành ngăn Phía hệ thống điều khiển có hình thể ngày giờ, nhiệt độ, pH, công tắc đèn UV, van điều chỉnh lưu lượng khí Bộ phận gia nhiệt đặt bên quạt làm mát Ngăn nơi chứa dịch ni cấy, có ống dẫn khí, van xả bên dưới; van bổ sung dinh dưỡng bên hơng (hình 4.1) Hình 4.1 Bản vẽ hệ thống bioreactor Đối tượng sử dụng hệ thống bioreactor chủng vi khuẩn hiếu khí Để đảm bảo q trình ni cấy thu nhận chủng vi khuẩn mục tiêu, hệ thống đèn UV bố trí nắp đậy ngăn 2, công tắc điều khiển ngăn Lựa chọn phương pháp gia nhiệt qua thành để giảm thiểu ảnh hưởng đến tế bào, nên phận gia nhiệt đặt bên ngăn 1, với hệ thống quạt làm mát, lưu thông không khí để tản nhiệt vào ngăn Cảm biến nhiệt PT100 (dòng sản phẩm TF101U2) sử dụng hệ thống đầu dò chuyển đổi nhiệt độ khu vực đo thành tín hiệu điện đầu Đầu dị nhiệt độ có điện trở làm bạch kim (platinum) có độ xác cao, chịu áp lực, chống rung, thích hợp sử dụng dung dịch lỏng có khuấy trộn Bao bọc bên ngồi vỏ thép không rỉ V4A lớp bảo vệ IP66 Đối với pH, hệ thống dùng đầu dò hãng Atlas Scientific biên độ đo 0-14 đặt đáy ngăn Đầu dò bọc 39 lớp màng mỏng thủy tinh cho phép ghi nhận khác biệt nồng độ ion H+ bên màng Từ khác biệt đó, đầu dị xác định giá trị pH tương quan (Hình 4.2) Hình 4.2 Cảm biến nhiệt độ đầu dò pH sử dụng hệ thống Với thể tích nhỏ nên hệ thống khơng sử dụng cánh khuấy mà tận dụng q trình sục khí để tạo dòng pha trộn dung dịch với tế bào ni cấy Ống sục khí đặt đáy ngăn có van điều chỉnh tốc độ sục khí Ngồi ra, cịn có van nạp để bổ sung ngun liệu, dung dịch dinh dưỡng từ phía hơng van xả để lấy bớt sản phẩm sau nuôi cấy đặt phía ngăn Cả hai van thơng trực tiếp vào dung dịch nuôi cấy bên ngăn 2, phục vụ cho q trình ni cấy theo mẻ mà không cần mở nắp ngăn Về nguyên vật liệu lựa chọn, có hai loại thiết kế bioreactor thủy tinh inox Bioractor thủy tinh suốt có ưu điểm đẹp, chịu nhiệt tốt, quan sát dung dịch bên trong, dễ vệ sinh Tuy nhiên giá thành cao, dễ vỡ trình vận chuyển khó gia cơng van, ống dẫn Nếu sử dụng ống dẫn, đầu dị thiết kế nắp inox Bioractor inox hay gọi thép khơng gỉ có ưu điểm giá thành thấp, độ bền cao, thiết kế van ống dẫn dọc theo thành hệ thống Mặc khác, có khả chịu nhiệt tốt dễ dàng trình vận chuyển, sử dụng (hình 4.3) Inox 304 hay cịn gọi thép khơng gỉ có thành phần chủ yếu Crom (Cr), Niken (Ni), có độ cứng, độ bền cao, bề mặt sáng bóng, khơng gỉ sét Đặc biệt, Inox 304 có khả chống ăn mịn chiu nhiệt tốt, đảm bảo an tồn vệ sinh thực phẩm nên ứng dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực Inox 316 Crom (Cr), Niken (Ni) cịn có thêm Molybdenum có khả chống ăn mòn cao inox 304, chịu nhiệt lên đến 500 độ C nên sử dụng điều kiện môi trường khắc nghiệt vùng ven biển, muối làm tan băng, giải pháp ngâm nước muối, hoá chất Tuy nhiên, giá thành inox 316 lại cao hơn, độ chịu lực thấp hơn, nhiệt độ nóng chảy cao phí tạo hình sản phẩm lớn 40 Hình 4.3 Bioreactor thủy tinh inox Hình 4.4 Hệ thống bioreactor thiết kế với vật liệu inox 304 41 Sau so sánh loại vật liệu, nghiên cứu lựa chọn inox 304 cho thiết kế Quá trình thực Trung tâm đào tạo cơng nghệ cao Thành phố Hồ Chí Minh Sau đó, hệ thống bioreactor vận chuyển phịng thí nghiệm sinh học môi trường, Viện KHCN&QL Môi trường cho thử nghiệm đánh giá (Hình 4.4) Hình 4.5 Màn hình ứng dụng Bioreactor HC-06 Các bước vận hành sau: Bước 1: Bật đèn UV 30 phút để khử trùng hệ thống Bước 2: Cho môi trường dinh dưỡng giống vi sinh vật Bước 3: Bật Bluetooth điện thoại Chọn thiết bị kết nối “choose a devide” chọn CONNECT (HC- 06) Bước 4: Chọn chế độ AUTO MANUAL Bước 5: Cài nhiệt độ muốn nuôi cấy – set temperature Bước 6: Cài thời gian nuôi cấy – Alam Time (phút) Bước 7: Chạy mơ hình – RUN Hình 4.6 Màn hình điều khiển hệ thống cài đặt 42 Ngoài ra, để tăng thêm hiệu thuận tiện trình sử dụng, phần mềm Bioreactor HC-06 dùng điều khiển hệ thống thông qua kết nối bluetooth với điện thoại thơng minh Phần mềm nhóm thiết kế thuộc Trung tâm nghiên cứu công nghệ caoTpHCM thiết kế bàn giao cho nhóm nghiên cứu Phần mềm cài đặt điện thoại có hệ điều hành Adroid Phần mềm có cài đặt chế độ tự động (AUTO) cho hệ thống chế độ điều khiển tay (MANUAL) Chế độ tự động cho phép cài đặt nhiệt độ thời gian Chế độ điều khiển tay cho phép cài đặt điều chỉnh thêm chức sục khí, quạt đèn UV (Hình 4.5) Ưu điểm phần mềm Bioreactor HC-06 dễ dàng cài đặt tất điện thoại thông minh android, thao tác dễ sử dụng Tuy nhiên nhược điểm kết nối với hệ thống bioreactor thơng qua Bluetooth Điều làm giới hạn khoảng cách kiểm soát cho người dùng 4.2 Kết đánh giá vận hành hệ thống 4.2.1 Kết chuẩn bị giống Theo quy trình ni cấy vi sinh vật thiết bị bioreactor, chủng vi sinh vật sử dụng phải dạng phải nhân sinh khối với hàm lượng đủ lớn (trên 10 tế bào/ml) trước bổ sung vào hệ thống Giống Bacillus nhận từ Viện Sinh học thực phẩm, ĐH Công nghiệp TpHCM sau kiểm tra độ kiến hiển vi, cấy truyền môi trường cao thịt peptone rắn cho kết tốt (Hình 4.7) Tế bào vi khuẩn hình que, khuẩn lạc mơi trường rắn màu trắng đục, lồi, mép nhăn (a) Khuẩn lạc môi trường thạch (b) Vi khuẩn Bacillus kính hiển vi (c) Giống F2 mơi trường lỏng Hình 4.7 Giống Bacillus môi trường cao thịt peptone 43 4.2.2 Kết thí nghiệm vận hành đánh giá khả ổn định nhiệt độ, pH thời gian nuôi cấy theo mẻ * Khả ổn định nhiệt độ Mỗi tế bào vi sinh vật có khoảng nhiệt độ pH tối thích cho phát triển, vậy, hai thơng số cần ổn định xác suốt thời gian nuôi cấy [7] Đối với nuôi cấy vi khuẩn, thông thường nhiệt độ tối ưu từ 25 – 35OC Một số nhóm ưa nhiệt cần nhiệt độ cao từ 50 – 80OC [5] Hệ thống thiết kế theo phương pháp gia nhiệt qua thành nên thời gian để nhiệt độ phân tán cho tồn dung dịch mơi trường tương đối chậm Tuy nhiên, điều làm giảm tác động đột ngột nhiệt độ đến tế bào giúp cho phân tác nhiệt dung dịch đặn ổn định [6] Kết theo dõi nuôi cấy chủng vi khuẩn nhiệt độ khác cho thấy sinh khối thu nhận nhiệt độ 40OC cao nhất, trung bình 3,11x108 tế bào/ml thể tích ni cấy lít 3,45x108 tế bào/ml thể tích ni cấy lít Ở nhiệt độ 30OC 50OC, sinh khối giảm đáng kể, 1,19 đến 1,22x108 tế bào/ml mức thể tích (Bảng 4.1 hình 4.8) Nghiên cứu Bacillus tác giả … cho thấy nhiệt độ tối ưu chủng vi khuẩn 37OC So sánh mức thể tích, mật độ tế bào thu nhận khoảng nhiệt độ khơng có chênh lệch đáng kể Điều cho thấy sinh trưởng phát triển theo nhiệt độ chủng vi khuẩn diễn khắp vị trí dung dịch Tuy nhiên, trình vận hành, nhận thấy thể tích từ lít tăng lên lít (gấp 2,35 lần) thời gian trung bình hệ thống gia nhiệt đến nhiệt độ cài đặt từ 15,1 phút tăng lên 36,1 phút (dài gấp 2,39 lần) Việc gia nhiệt qua thành thể tích nhỏ lít thể tích lớn lít có khác biệt mặt thời gian, không làm ảnh hưởng đến việc phân bố nhiệt độ khắp toàn dung dịch 44 Bảng 4.1 Kết vận hành đánh giá khả ổn định nhiệt độ Nhiệt độ 30OC 40OC 50OC Lần Lần Lần TB Lần Lần Lần TB Lần Lần Lần TB lít lít Mật độ tế bào Thời gian gia Mật độ tế bào Thời gian gia (*108 tb/ml) nhiệt (phút) (*108 tb/ml) nhiệt (phút) 2,03 13 1,87 32 2,05 15 1,99 33 1,79 15 2,38 32 1,96 14,3 2,08 32,3 2,93 15 3,37 36 3,29 14 2,99 36 3,11 14 3,39 37 3,11 14,3 3,25 36,3 1,08 16 1,21 39 1,21 17 1,48 40 1,29 17 0,98 40 1,19 16,7 1,22 39,7 Hình 4.8 Kết vận hành đánh giá khả ổn định nhiệt độ * Khả ổn định pH Trong q trình ni cấy, giá trị pH theo dõi liên tục để giữ môi trường phạm vi tối ưu cho vi sinh vật phát triển Thông thường, pH tối ưu cho vi khuẩn hiếu khí 6-7, nhiên, giá trị pH thường giảm trình vi sinh vật phát triển Khi đó, dung dịch NaOH sử dụng để cân lại pH thiết lập ban đầu [7] Ở thí nghiệm 2, sinh khối cao thu nhận pH 8,43 8,47x109 tế bào/ml mức thể tích tương ứng lít lít pH có lượng sinh khối thấp nhất, 1x109 tế bào/ml Ở hai thí nghiệm, kết thu khơng có khác biệt đáng kể hai mức thể tích lít lít 45 Bảng 4.2 Kết vận hành đánh giá khả ổn định pH Mật độ tế bào (*108 tb/ml) L1 L2 pH L3 TB L1 L2 pH L3 TB lít lít 0,69 0,53 0,58 0,60 3,89 3,71 3,73 3,78 0,51 0,59 0,56 0,55 3,88 3,94 3,78 3,87 Mật độ tế bào (*108 tb/ml) L1 L2 pH L3 TB L1 L2 pH L3 TB lít lít 8,44 8,51 8,35 8,43 6,03 6,01 5,93 5,99 8,52 8,51 8,39 8,47 6,33 6,49 6,35 6,39 Hình 4.9 Kết vận hành đánh giá khả ổn định pH Các mẫu dịch sau nuối cấy nhiệt 50OC pH 5, quan sát kính hiển vi quang học có xuất tế bào mang bào tử Bacillus Nhiều nghiên cứu sinh trưởng phát triển Bacillus cho thấy điều kiện nuôi cấy lỏng, vi khuẩn Bacillus tăng trưởng tối ưu nhiệt độ 37OC, pH 7, tốc độ phân chia tối đa Bacillus sau 40-50 phút Ở nhiệt độ cao, giá trị pH bất lợi, điều kiện dinh dưỡng thấp, Bacillus có khả tạo bào tử nên tồn dịch nuôi cấy gia tăng sinh khối [1,4,15] * Khả ổn định thời gian ni cấy theo mẻ Ở thí nghiệm 3, kết hình 4.9 cho thấy hai mức thể tích lít lít, đồ thị biểu diễn hàm lượng sinh khối Bacillus thu theo thứ tự giai đoạn nuôi cấy theo mẻ Với mật độ giống ban đầu 1,05x10 tế bào/ml, sau 24 giờ, mật độ tế bào đạt 3,59 46 đến 4,04x108 tế bào/ml, sau giảm dần qua 48 giờ, 72 96 Có thể xác định thời điểm 24h tế bào giai đoạn logarit có tốc độ phân chia nhanh Bảng 4.3 Kết vận hành đánh giá khả ổn định thời gian nuôi cấy theo mẻ Mật độ tế bào (*109 tb/ml) L1 L2 L3 TB L1 L2 12 L3 TB L1 L2 18 L3 TB L1 L2 24 L3 TB lít lít 1,23 1,01 0,95 1,06 2,44 2,11 2,35 2,30 2,89 3,52 3,55 3,32 4,22 4,01 3,92 4,05 1,48 1,94 1,18 1,53 2,52 3,05 2,39 2,65 2,33 3,57 3,85 3,25 5,12 5,67 4,95 5,25 Mật độ tế bào (*109 tb/ml) L1 L2 30 L3 TB L1 L2 36 L3 TB L1 L2 42 L3 TB L1 L2 48 L3 TB lít lít 6,03 6,01 5,93 5,99 5,03 5,98 6,22 5,74 6,03 5,81 5,12 5,65 4,33 5,24 4,72 4,76 6,33 6,49 6,35 6,39 6,02 6,55 6,89 6,49 6,26 6,01 5,82 6,03 5,86 5,12 5,77 5,58 Hình 4.10 Kết vận hành đánh giá khả ổn định thời gian nuôi cấy theo mẻ 47 Trong thời gian 96 cài đặt nhiệt độ 30OC, pH 7, gia nhiệt hoạt động ổn định, biên độ dao động khoảng 1OC Riêng giá trị pH có nhiều biến động, thời điểm 24 giờ, pH tăng đến 7,4, sau thời điểm 48 giờ, pH giảm cịn 6,5 Điều thay đổi sản phẩm chuyển hóa mà tế bào trao đổi với mơi trường ni cấy 4.2.3 Kết vận hành đánh giá khả ổn định hệ thống nuôi cấy liên tục Đối với tất trình lên men, yêu cầu quan trọng phải đảm bảo cho tế bào tham gia đặt điều kiện lý hóa giống Các thơng số nhiệt độ, pH, hàm lượng O2, CO2 hòa tan… thường kiểm sốt cách trực tiếp thơng qua sensor đặt nồi lên men Các thông số hàm lượng enzyme, sinh khối, protein … kiểm soát giám tiếp cách lấy mẫu đem phân tích [8,9,13] Hình 4.11 Sinh khối thu sau lần bổ sung mơi trường dinh dưỡng Trong q trình ni cấy liên tục, tế bào khơng có pha suy vong mà trì pha cân Để trình thu nhận sản phầm sinh khối không làm thay đổi đột ngột trạng thái tế bào cần đảm bảo trình nạp mơi trường dinh dưỡng vào q trình rút dịch sản phẩm phải tương đương thể tích [11,14] Trong thiết kế hệ thống bioreactor, van nạp đặt bên hơng, phía cịn van xả đặt bên ngăn Quá trình bổ sung tiến hành sau trình rút chiết Trong q trình thực hiện, nhận thấy có dao động nhiệt độ pH bổ sung môi trường dinh dưỡng Nhiệt độ giảm 2-5 OCvà pH tăng 0,3-0,5 Bảng điều khiển hiển thị giá trị có thay đổi phần mềm bioreactor_HC06 48 điện thoại báo rung Hệ thống khoảng 3-5 phút cho việc điều chỉnh nhiệt độ pH quay lại giá trị cài đặt ban đầu Kết mật độ sinh khối lần bồ sung dinh dưỡng thứ vào thời điểm 10 cao (3,21x108 tế bào/ml), thấp vào thời điểm (2,11x108 tế bào/ml) Quan sát kính hiển vi, sản phẩm thu nhận sau thời điểm khơng có xuất bào tử vi khuẩn Bacillus Điều chứng tỏ tế bào giai đoạn tốt cho trình trao đổi chất [2,15] Như vậy, bước đầu vận hành điều kiện nuôi cấy theo mẻ nuôi cấy liên tục hệ thống thu nhận sinh khối vi sinh vật trạng thái tốt Chu trình sinh trưởng vi sinh vật tương ứng với điều kiện tối ưu giống ban đầu cung cấp Điều cho thấy phát triển vi sinh vật hệ thống nuôi cấy ổn định Hệ thống cho thấy hoạt động ổn định mức thể tích thấp lít lít Đây mức thể tích phù hợp cho q trình nghiên cứu sinh viên, giảng viên viện KHCN&QL Môi trường Ở mức thể tích này, nguyên vật liệu đầu vào ít, trình kiểm sốt dễ dàng từ giúp giảm chi phí nghiên cứu cho sinh viên giảng viên Mơ hình hoạt động ổ định hỗ trợ cho giảng viên giảng thực hành vi sinh mơi trường, vi sinh vật học Q trình vận hành hệ thống giúp sinh viên có nhìn nhận bước đầu vận hành cho hệ thống quy mô công nghiệp sau Chương KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận - Đề tài thiết kế mơ hình ni cấy vi sinh vật có kiểm sốt nhiệt độ pH dung tích 10L vật liệu inox 304 - Đề tài thiết kế phần mềm Bioreactor HC06 cài đặt điện thoại adroid, kết nối qua Bluetooth đến hệ thống nuôi cấy - Hệ thống nuôi cấy vi sinh vật hoạt động ổn định giới hạn nhiệt độ từ 30-50OC, giới hạn pH từ đến 8, khoảng thời gian 0-96 nuôi cấy liên tục Mật độ tế bào thu nhận đạt 108 tế bào/ml - Hệ thống đảm bảo giới hạn sinh trưởng ổn định chủng vi khuẩn Bacillus thử nghiệm sau lần bổ sung dinh dưỡng 49 5.2 Kiến nghị - Thử nghiệm nuôi cấy số chủng vi khuẩn nấm men khác với khoảng nhiệt độ, pH thời gian thay đổi khác - Cải tiến trình điều chỉnh bổ sung pH nuôi cấy thời gian liên tục 48 - Cải tiến bổ sung đầu dị xác định thơng số khí hịa tan kiểm sốt lưu lượng khí nạp vào cách xác hơn, giúp cho q trình ni cấy đạt hiệu suất cao 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] A.D Warth, Relationship between the heat resistance of spores and the optimum and maximum growth temperatures of Bacillus Species Journal of Bacteriology, 134(3):699705, 1978 [2] A.J Nair, Introduction to Biotechnology and Genetic Engineering, Chapter 18: Microbial culture and applications Infinity Science Press LLC, India, 657 – 668, 2008 [3] Anup Ashok, Kruthi Doriya, Devulapally Ram Mohan Rao, Devarai Santhosh Kumar, Design of solid state bioreactor for industrial applications: An overview to conventional bioreactors Biocatalysis Agricultural Biotechnology 9:11-18, 2017 [4] Caroline Choma Philippe Schmitt, Effect of temperature on growth characteristics of Bacillus International Journal Food Micriobiology 55:73-77, 2000 [5] D.H Bergey, Themophilic bacteria Journal of Bacteriology 4(4): 301-306, 1919 [6] Frederick K., Lingchong Y Carl L H., Long-term monitoring of bacteria undergoing programmed population control in a microchemoastat Science 309:137-140, 2005 [7] George Cătălin Marinescu Roua Gabriela Popescu, Open-Source bioreactor controller for bacterial protein expression PeerJ Preprints, 4: 1-27, 2018 [8] Hitesh Jagani, Karteek Hebbar, Sagar S Gang, P Vasanth Raj, Raghu Chandrashekhar H J.Venkata Rao, An Overview of Fermenter and the Design Considerations to Enhance Its Productivity Pharmacologyonline 1: 261-301, 2010 [9] Jagriti Singh, Nirmata Kaushik Soumitra Biswas, Bioreactors – Technology & Design Analysis The Scitech Journal, 1(6): 27 – 36, 2014 [10] Lương Đức Phẩm, Giáo trình Cơng nghệ lên men NXB Giáo dục VN, 2010 [11] Meyer H.P, Kappeli O Feichter A., Growth control in microbial cultures Annual Review of Microbiology, 39: 299-319, 1985 51 [12] Michel Musoni, Jacqueline Destain, Philippe Thonart, Jean-Baptiste Bahama Frank Delvigne, Bioreactor design and implementation strategies for the cultivation of filamentous fungi and the production of fungal metabolites: from traditional methods to engineered systems Biotechnol Agron Soc Environ, 19(4): 430-442, 2015 [13] Nguyễn Hồng Lộc Giáo trình Cơng nghệ tế bào, Chương Thiết kế hệ thống lên men NXB ĐH Huế, trang 33-57, 2006 [14] Raina M Maier, Environmental Microbiology, Part I, chapter 3: Bacteria Growth Academic Press, Elsevier, 38-54, 2009 [15] S Quintavalla G Parolari, Effectf of temperature, aw and pH on the growth of Bacillus cell and spores: a response serface methodology stydy International Journal of food microbiology, 19:207-216, 1993 52 PHẦN III PHỤ LỤC ĐÍNH KÈM Hợp đồng thực đề tài nghiên cứu khoa học Thuyết minh đề tài phê duyệt Quyết định nghiệm thu Hồ sơ nghiệm thu (biên họp, phiếu đánh giá, bảng tổng hợp điểm, giải trình, phiếu phản biện) Sản phẩm nghiên cứu (Bài báo, Biên bản giao mơ hình, Hướng dẫn sử dụng) 53 ... kiểm sốt nhiệt độ pH đặt ph? ??ng thí nghiệm X9.11, Vi? ??n KHCN&QL Mơi Trường, ĐH Công nghiệp TpHCM Bài báo: Thiết kế mô hình kiểm sốt nhiệt độ pH ni cấy vi sinh vật điều kiện ph? ??ng thí nghiệm Vi? ??n KHCN&QL... nhận sinh khối vi sinh vật điều kiện vơ trùng, kiểm sốt nhiệt độ pH - Vi? ??t ph? ??n mềm giám sát nhiệt độ, pH cho q trình ni cấy Ph? ?ơng ph? ?p nghiên cứu 3.1 Ph? ?ơng ph? ?p nghiên cứu thiết kế - Sử dụng ph? ??n... trường ? ?Nghiên cứu thiết kế mơ hình kiểm sốt nhiệt độ pH nuôi cấy vi sinh vật điều kiện ph? ??ng thí nghiệm Vi? ??n KHCN&QL Mơi trường? ?? hình thành nhằm ph? ??c vụ cho mục tiêu Đề tài hồn thành mơ hình ni cấy