báo cáo thí nghiệm công nghệ tế bào

1.2 Giới thiệu về kĩ thuật nuôi cấy mô thực vật Nuôi cấy mô tế bào thực vật nói về việc nuôi cấy tất cả các phần của thực vật tế bào đơn, mô, cơ quan trong điều kiện vô trùng.. 5 Mô sẹo

VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP

Vật liệu

Mẫu cấy Dạ Yến Thảo: phòng Thí nghiệm Công nghệ Sinh học trường Đại học Bách Khoa Hồ Chí Minh

Hạt đậu xanh: chợ Lữ Gia

Hóa chất Javel: công ty Cổ phần hóa mỹ phẩm Mỹ Hảo

Hình 2.1: Hóa chất Javel dùng để khử trùng hạt đậu xanh.

Phương pháp

2.2.1 Giới thiệu môi trường MS và phương pháp pha môi trường

Môi trường MS là tên viết tắt của Murashige and Skoog medium, phát minh bởi nhà khoa học thực vật Toshio Murashige và Skoog Folke K vào năm 1962, là môi trường tổng hợp được pha sẵn rất giàu dinh dưỡng dành cho các giai đoạn nuôi cấy mô thực vật, chứa đầy đủ khoáng đa lượng, vi lượng, vitamins

Bảng 2.1: Thành phần môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962)

Phương pháp pha dung dịch mẹ:

Dung dịch mẹ (stock): là dạng pha sẵn của dung dịch môi trường chứa các thành phần trên với nồng độ cao hơn (x100, x1000) Sử dụng dung dịch mẹ trong nuôi cấy giúp tiết kiệm thời gian pha và tránh sai lệch quá lớn về nồng độ trong thành phần môi trường

Chuẩn bị 1 cốc lớn và 5 cốc nhỏ sạch, vô trùng Đảm bảo các thành phần pha dung dịch mẹ đã được chuẩn bị trước với nồng độ tương ứng (ví dụ: x100, x1000) và được bảo quản đúng cách (Lưu ý lượng cần dùng dựa trên nồng độ mong muốn và thể tích cuối cùng của dung dịch) Đo lường 500ml nước cất vào cốc lớn Đặt mỗi thành phần cần pha vào từng cốc nhỏ riêng biệt Dùng dụng cụ khuấy nhẹ từng cốc nhỏ để hòa tan hoàn toàn các chất vào nước cất, đảm bảo không có tủa xuất hiện Đổ từng dung dịch đã pha từ cốc nhỏ vào cốc lớn chứa nước cất, khuấy nhẹ để đảm bảo sự pha trộn đồng đều của các thành phần Kiểm tra lại nồng độ của các thành phần trong dung dịch môi trường, điều chỉnh bằng cách thêm thêm dung dịch mẹ hoặc nước cất nếu cần Định mức dung dịch môi trường theo yêu cầu Bảo quản dung dịch môi trường ở điều kiện phù hợp và đảm bảo vệ sinh

Phương pháp pha môi trường từ dung dịch mẹ:

Lấy ẵ nước cất vào pecer Lần lượt cho dung dịch mẹ cỏc chất vào Thờm agar, lắc đều rồi cho vào các ống nghiệm Hấp 121 độ C trong 15 phút

Bảng 2.2: Các loại môi trường nuôi cấy được sử dụng cho các thí nghiệm và các nhóm

9 2.2.2 Các bước chuẩn bị tủ cấy và cấy

Người cấy: xắn tay áo quá khuỷu tay, nên tháo đồng hồ và nhẫn có chi tiết phức tạp, rửa tay bằng xà phòng thật sạch rồi lau tay lại bằng bông tẩm cồn 70-76 độ

Tủ cấy và dụng cụ:

Lau bề mặt tủ bằng bông tẩm cồn 70-76 độ Bật đèn UV trong khoảng 15-20 phút, sau đó tắt đèn, bật quát hút trong 5 phút rồi bắt đầu các thao tác cấy Lau dụng cụ bằng cồn 70-76 độ trước khi đưa vào tủ cấy, đặt cách nhau trên bàn thao tác

Cách sắp xếp dụng cụ trong tủ cấy: Đèn cồn để giữa, đồ dùng của tay phải để bên tay phải và tương tự với tay trái Đĩa petri để trước mặt

2.2.3 Khử trùng hạt đậu xanh

Lắc trong xà phòng (nước rửa chén) loãng, cao khoảng 2cm trong 2 phút, đổ nước khéo để hạt còn trong chai bi Rửa hết xà phòng bằng nước máy

Rửa với nước cất vô trùng 3 lần, mỗi lần 30 giây Lắc trong cồn 70 độ (1 phút), rửa lại với nước cất vô trùng 3 lần Lắc với dung dịch Javel Mỹ Hảo (Sodium Hypochloride 5%) 10% bổ sung 2 giọt Tween 20 trong vòng 10 phút Rửa lại bằng nước cất vô trùng đến khi hạt hết nổi bọt, mỗi lần lắc 30 giây Cấy hạt vào môi trường

Hơ đĩa petri ngoài vành và nắp đĩa petri Hơ kẹp thật kỹ (3 lần)

10 Hạt đậu xanh được cấy trên môi trường A, pH 5,8

2.2.4 Tạo sẹo từ trụ hạ diệp cây mầm đậu xanh

Nguyên liệu: Cây mầm đậu xanh được cắt thành 2 đoạn hạ diệp và 2 đoạn thượng diệp dài 1cm

Môi trường nuôi cấy: Môi trường B, nồng độ BA 0,1mg/L, pH 5.8 ± 0,02

Buồng cấy và dụng cụ vô trùng đã được chuẩn bị kỹ lưỡng Đèn cồn, kéo, kẹp, đĩa petri, ống nghiệm và các dụng cụ khác được sắp xếp một cách cẩn thận để dễ dàng tiếp cận và sử dụng Mẫu mầm đậu xanh được lấy ra khỏi ống nghiệm bằng kẹp kéo và sau đó được cắt thành 4 mẫu, gồm 2 mẫu trụ thượng diệp và 2 mẫu trụ hạ diệp, mỗi mẫu có độ dài khoảng 1cm, được đặt vào đĩa petri Nắp chai bi được mở ra cẩn thận để tránh nhiễm khuẩn Miệng chai bi được hơ trước khi mẫu được cấy vào môi trường Tiếp theo, 2 đoạn hạ diệp và

2 đoạn thượng diệp được lần lượt cấy vào 2 chai bi Mẫu được đặt nằm ngang trên môi trường và nhẹ nhàng ấn để đảm bảo tiếp xúc đầy đủ Miệng chai bi được hơ lại và đậy nắp lại để đảm bảo vệ sinh Mẫu được nuôi cấy trong khoảng 2 tuần, sau đó kết quả sẽ được thu nhận sau khi quá trình nuôi cấy hoàn thành

Lưu ý: Luôn đảm bảo vệ sinh và cẩn thận khi thực hiện các bước để tránh nhiễm và đảm bảo chất lượng của mẫu và kết quả cấy

2.2.5 Nuôi cấy nốt đơn thân Dạ Yến Thảo

Nguyên liệu: Cây Dạ Yến Thảo in vitro được cắt thành các đoạn bên mang chồi bên, bỏ chồi ngọn

Môi trường nuôi cấy: Môi trường C, nồng độ BA 1mg/L, pH 5.8 ± 0,02

Buồng cấy và dụng cụ vô trùng đã được chuẩn bị sẵn Đèn cồn, kéo, kẹp, đĩa petri, ống nghiệm và các dụng cụ khác đã được sắp xếp một cách gọn gàng và dễ tiếp cận Miệng

11 chai/bình chứa mẫu đã được hơ để đảm bảo vệ sinh Mẫu được gắp từ chai thủy tinh bằng kẹp và đặt vào đĩa petri Cây Dạ Yến Thảo được chọn và mẫu được cắt tại các đốt thân ngay dưới đốt lá, loại bỏ phần ngọn Nắp chai bi đã được mở cẩn thận để tránh nhiễm khuẩn, miệng chai bi đã được hơ trước khi đặt mẫu vào môi trường Mẫu đốt thân của cây Dạ Yến Thảo đã được đặt nằm đứng trên môi trường Miệng chai bi đã được hơ lại và đậy nắp lại Kết quả sẽ được thu nhận sau khi quá trình nuôi cấy hoàn thành

Lưu ý: Luôn đảm bảo vệ sinh và cẩn thận khi thực hiện các bước để tránh nhiễm và đảm bảo chất lượng của mẫu và kết quả cấy

2.2.6 Điều kiện nuôi cấy Điều kiện nhiệt độ 25 ± 2 o C Điều kiện ánh sáng: 4000lux

Thời gian chiếu sáng: 24 giờ/ngày

KẾT QUẢ - BÀN LUẬN

Kết quả khử trùng hạt đậu xanh

Hình 3.1.1: Kết quả khử trùng hạt đậu xanh sau khi lắc 7 phút với Javel 10% và cấy trên môi trường A sau 1 tuần

Mẫu Tỉ lệ mẫu vô trùng

(%) Tỉ lệ nhiễm (%) Chiều cao cây (cm)

Bảng 3.1.1: Kết quả khử trùng hạt đậu xanh sau khi lắc 7 phút với Javel 10%

Bảng 3.1.2: Kết quả khử trùng hạt đậu xanh sau khi lắc với Javel 10%

Tỉ lệ mẫu mầm cây đậu xanh vô trùng thu được khi lắc với Javel 10% trong 2 khoảng thời gian là 7 phút và 10 phút đều thu được tỉ lệ mẫu vô trùng là 100% và tỉ lệ nhiễm là 0%

Mẫu mầm cây đậu xanh thu được khi lắc Javel 10% trong 2 khoảng thời gian là 7 phút và 10 phút có chiều cao tương đương nhau (10,47cm khi lắc 7 phút và 11,07cm khi lắc

Rửa với nước cất vô trùng giúp giảm thiểu các tạp chất có thể gây nhiễm trùng, ảnh hưởng đến nồng độ chất tăng trưởng thực vật

Nhóm Thời gian lắc với

Javel 10% (phút) Tỉ lệ mẫu vô trùng

(%) Chiều cao cây trung bình (cm)

14 Lắc trong cồn 70 độ giúp giảm thiểu lượng vi sinh vật trên bề mặt chai bi và đĩa petri

Sử dụng dung dịch Javel Mỹ Hảo (Sodium Hypochloride 5%) 10% bổ sung 2 giọt Tween 20 trong vòng 10 phút giúp giảm thiểu vi sinh vật trên bề mặt chai bi và đĩa petri

Rửa lại mẫu hạt bằng nước cất vô trùng giúp giảm thiểu hóa chất còn sót lại và xác vi sinh vật

Thời gian ngâm hạt trong các loại dung dịch trên không làm ảnh hưởng đáng kể đến chiều cao của mầm cây

Việc hơ đĩa petri ngoài vành và nắp đĩa petri giúp giảm thiểu vi sinh vật trên bề mặt

Hơ kẹp thật kỹ để đảm bảo rằng không có vi sinh vật nào từ kẹp được truyền sang mẫu cấy

Kết quả tạo sẹo từ trụ hạ diệp cây mầm đậu xanh

Mẫu Loại mẫu Tỉ lệ mẫu tạo sẹo sau 1 tuần nuôi cấy (%)

1 Trụ thượng diệp 100 Có sự tăng kích thước mô sẹo ở vết thương

2 Trụ thượng diệp 100 Có sự tăng kích thước mô sẹo ở vết thương

3 Trụ hạ diệp 100 Có sự tăng kích thước mô sẹo ở vết thương

100 Có sự tăng kích thước mô sẹo ở vết thương

Bảng 3.2.1: Kết quả mẫu tạo sẹo và hình thái sẹo từ trụ thượng diệp và trụ hạ hiệp cây mầm đậu xanh trên môi trường B bổ sung NAA 2,5mg/L và BA 1mg/L sau 1 tuần nuôi cấy

Mẫu Loại mẫu Tỉ lệ mẫu tạo sẹo sau 2 tuần nuôi cấy (%) Hình thái sẹo

1 Trụ thượng diệp 100 1 đầu ít tạo sẹo, 1 đầu tạo sẹo nhiều

2 Trụ thượng diệp 100 Mô sẹo phát triển nhiều trên 2 đầu và lan khắp thân

3 Trụ hạ diệp 100 Mô sẹo có phát triển, không nhiều

4 Trụ hạ diệp 100 Mô sẹo ít

Bảng 3.2.2: Kết quả mẫu tạo sẹo và hình thái sẹo từ trụ thượng diệp và trụ hạ hiệp cây mầm đậu xanh trên môi trường B bổ sung NAA 2,5mg/L và BA 1mg/L sau 2 tuần nuôi cấy

Hình 3.2.1: Mô sẹo hình thành từ trụ thượng diệp và trụ hạ diệp cây mầm đậu xanh trên môi trường B bổ sung NAA 2,5mg/L và BA 1mg/L sau 2 tuần nuôi cấy

Tỉ lệ mẫu tạo sẹo từ trụ thượng diệp (%)

Hình thái sẹo trụ thượng diệp Tỉ lệ mẫu tạo sẹo từ trụ hạ diệp (%)

Hình thái sẹo trụ hạ diệp

Có mẫu mọc rễ với kích thước lớn, đều tạo mô sẹo, màu sẫm

100 Các mẫu đều ít tạo mô sẹo, màu sẫm

2 1 100 Các mẫu đều tạo mô sẹo, màu sẫm 100 Các mẫu đều tạo mô sẹo, màu sẫm

3 2 100 Các mẫu đều ít tạo mô sẹo, màu sẫm 100

Một số mẫu tạo mô sẹo với kích thước lớn, màu sẫm

4 3 100 Các mẫu đều ít tạo mô sẹo, màu sẫm 100

Một số mẫu tạo mô sẹo với kích thước lớn, màu sáng

Bảng 3.2.3: Kết quả mẫu tạo sẹo và hình thái sẹo từ trụ thượng diệp và trụ hạ hiệp cây mầm đậu xanh trên môi trường B bổ sung NAA 2,5mg/L và các nồng độ BA lần lượt là

0, 1, 2, 3mg/L sau 2 tuần nuôi cấy

Hình 3.2.2: Mô sẹo hình thành từ trụ thượng diệp và trụ hạ diệp cây mầm đậu xanh trên môi trường B bổ sung NAA 2,5mg/L và nồng độ BA lần lượt là 0, 1, 2, 3mg/L sau 2 tuần nuôi cấy

Tỉ lệ mẫu trụ hạ diệp và trụ thượng diệp tạo mô sẹo sau 1 tuần và 2 tuần nuôi cấy trên môi trường B bổ sung NAA 2,5mg/L và BA 1mg/L đều là 100%

Mẫu cấy mầm đậu xanh ở trụ thượng diệp và trụ hạ diệp ở nồng độ NAA 2,5mg/L,

BA 3mg/L phát triển kém, ở nồng độ NAA 2,5mg/L phát triển kém hơn

Mẫu cấy mầm đậu xanh ở trụ thượng diệp và trụ hạ diệp ở nồng độ NAA 2,5mg/L,

BA 1mg/L tạo sẹo tốt, nồng độ NAA 2,5mg/L, BA 2mg/L tạo sẹo tốt hơn

19 Nhìn chung, khi tăng tỉ lệ chất điều hòa thì tỉ lệ tạo sẹo giảm dần

Trụ hạ diệp có tỉ lệ tạo mô sẹo to nhiều hơn trụ thượng diệp, một số mẫu to ở trụ thượng diệp có thể do nồng độ chất điều hòa sinh trưởng nội sinh lớn tại vị trí cắt gây nên Đặc biệt, ở mẫu cấy trụ hạ diệp của nhóm 3 có các mẫu tạo mô sẹo với độ lớn vượt trội, màu sẫm tối, chứng tỏ nồng độ BA 2mg/L ảnh hưởng tới kết quả kích thước tạo mô sẹo

Nhìn chung, mô sẹo ở mẫu cấy trụ hạ diệp to và nhiều hơn so với mẫu cấy trụ hạ diệp, các trường hợp bất thường khác có thể do nồng độ chất điều hòa sinh trưởng nội sinh lớn tại vị trí cắt gây nên

Riêng tại mẫu cấy trụ thượng diệp của nhóm 1, có một mẫu tạo bộ rễ lớn cạnh mô sẹo, có thể do nồng độ chất điều hòa sinh trưởng nội sinh lớn tại vị trí cắt gây nên

Kết quả nuôi cấy nốt đơn thân Dạ Yến Thảo

Mẫu Tỉ lệ tạo chồi sau 2 tuần nuôi cấy (%) Hình thái chồi mới

1 100 Chồi mọc thành cụm nhỏ ở đốt thân và đầu lá nơi tiếp xúc với môi trường

2 100 Chồi mọc thành cụm ở đốt thân

3 100 Chồi mọc thành cụm nhỏ ở đốt thân và đầu lá nơi tiếp xúc với môi trường

4 100 Chồi mọc thành cụm ở đốt thân

Bảng 3.3.1: Kết quả mẫu tạo chồi từ đốt thân Dạ Yến Thảo trên môi trường C bổ sung BA 1mg/L sau 2 tuần nuôi cấy

Hình 3.3.1: Chồi hình thành từ đốt thân Dạ Yến Thảo trên môi trường C bổ sung BA

1mg/L sau 2 tuần nuôi cấy

Mẫu Tỉ lệ tạo chồi sau 3 tuần nuôi cấy (%)

Số chồi mới/mẫu cấy

Chiều cao mới trung bình sau 3 tuần (cm)

Chồi mọc tạo cụm lớn, nhiều chồi có độ cao dưới 1mm, phần lá chạm vào môi trường có sinh chồi

2 100 13 0,42 Chồi mọc tạo cụm lớn, nhiều chồi có độ cao dưới 1mm

Chồi mọc tạo cụm lớn, chi chít, nhiều chồi có độ cao dưới 1mm, phần lá chạm vào môi trường có sinh chồi chi chít

4 100 23 0.15 Chồi mọc tạo cụm lớn, chi chít, nhiều chồi có độ cao dưới

Bảng 3.3.2: Kết quả mẫu tạo chồi từ đốt thân Dạ Yến Thảo trên môi trường C bổ sung BA 1mg/L sau 3 tuần nuôi cấy

Hình 3.3.2: Chồi hình thành từ đốt thân Dạ Yến Thảo trên môi trường C bổ sung BA

1mg/L sau 3 tuần nuôi cấy

Tỉ lệ tạo chồi sau 3 tuần nuôi cấy (%)

Số chồi mới/mẫu cấy

Chiều cao mới trung bình sau 3 tuần (cm)

1 0 100 6,6 1,75 Chồi mọc tạo rễ, cây con cao vượt trội

Chồi mọc tạo cụm lớn, chi chít, nhiều chồi có độ cao dưới 1mm, phần lá chạm vào môi trường có sinh chồi chi chít

Chồi mọc tạo cụm lớn, chi chít, nhiều chồi có độ cao dưới 1mm, phần lá chạm vào môi trường có sinh chồi chi chít

4 3 75 3,3 0,2 Chồi phát triển kém, chết mẫu

Bảng 3.3.2: Kết quả mẫu tạo chồi từ đốt thân Dạ Yến Thảo trên môi trường C bổ sung nồng độ BA lần lượt là 0, 1, 2, 3mg/L sau 3 tuần nuôi cấy

Hình 3.3.3: Chồi hình thành từ đốt thân Dạ Yến Thảo trên môi trường C bổ sung nồng độ BA lần lượt là 0, 1, 2, 3mg/L sau 3 tuần nuôi cấy

Kết quả: Ở nhóm 1, mẫu cấy phát triển tạo rễ, thân cây cao vượt trội

Mẫu cấy nhóm 2 và nhóm 3 tạo cụm chồi lớn, tròn, chi chít

Mẫu cấy nhóm 4 phát triển kém, mẫu gần chết

Một số mẫu không đạt do môi trường nuôi cấy bị lỏng, mẫu cấy quá nhỏ không thể phát triển

Mẫu cấy không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng không tạo nhiều chồi mới, do không bị ảnh hưởng bởi BA để tạo chồi

Mẫu cấy nhóm 2 và 3 bổ sung BA nồng độ 1mg/L và 2mg/L phát triển cụm chồi tốt, khỏe Ở nồng độ BA 2mg/L, số chồi tạo thành cũng là cao nhất [6]

Mẫu cấy nhóm 4 không phát triển cụm chồi nhiều như nhóm 2 và 3, thậm chí mẫu sắp chết