Để làm được loại rượu thơm ngon và đảm bảo chất lượng cần phải phân lập và tuyển chọn một số vi sinh vật thuần khiết những sinh vật có khả năng phân giải tinh bột thành đường, và những v
TOÅNG QUAN 2.1 Sơ lược về bánh men rượu và quá trình lên men rượu
Sơ lược thành phần của bánh men rượu
Bánh men rượu là một hổn hợp nhiều vi sinh vật Chúng có sự tác dụng tương hổ nhau trong quá trình phân giải tinh bột và quá trình lên men
SVTH: NGUYỄN.T.PHƯỢNG LINH Trang 6
2.2.1 Sơ lược quy trình sản xuất bánh men rượu:
2.2.2 Thành phần thuốc bắc, thuốc nam
Năm 1993, Theo tác giả Nguyễn Văn Hiệu về bánh men rượu có 10 loại thuoác baéc
Tuỳ từng địa phương, tuỳ từng mùa trong năm mà người ta thêm hoặc bớt 10 vị thuốc bắc sau: Nhục đậu khâu, Quế chi, Bạch trượt, Thảo quả, Cam thảo, Đại hồi, Tiểu hồi, Tế tân, Liên kiều, Sa nhân Nhưng trong
SVTH: NGUYỄN.T.PHƯỢNG LINH Trang 7 đó có năm vị quan trọng : Nhục đậu khâu, Quế chi, Bạch trượt , Thảo quả, Đại hồi
Ngoài 10 vị thuốc bắc, một số địa phương sử dụng 10 vị thuốc nam : Cam thảo, Riềng, rừng, ngãi cứu ớt, lá ổi, cúc tần, lá bưởi, nhân tần, hàng quế
2.2.3 Thành phần tinh bột gạo
Năm 1996, theo tác giả Nguyễn Đức Lượng, thành phần gạo tẻ gồm các thành phần sau:
Bảng 2.1.Thành phần gạo tẻ
Thành phần hóa học của gạo tẻ là amilose (83%) và amylopectine (17%), còn ở nếp gần 100% là amylopectine
Protein của gạo chủ yếu là orezinin (enzem nhóm glutelin) ngoài ra còn có glubulin, anbumine (locozi) và prolamin
Bảng 2.2 Thành phần hoá học của gạo tẻ
SVTH: NGUYỄN.T.PHƯỢNG LINH Trang 8
Tinh bột (C6H10O5)n là những polysacarid tiêu biểu, là polysacarid dự trữ có nhiều trong ngũ cốc chiếm 60-80% Hợp chất cao phân tử này cấu tạo bởi nhiều gốc glucoza (α-gluco pinanoza) mỗi liên kết giữa các gốc được gọi đây là nối α- glucozit Tinh bột gặp iod sẽû có màu từ đỏ nâu đến màu xanh Tinh bột được cấu tạo bởi hai thành phần có tính chất hoá học khác nhau : amylo và amylopectin
• Amylose :Là loại polysacarit có cấu tạo mạch thẳng Phân tử amylo có từ vài trăm đến vài nghìn gốc glucoza liên kết với nhau chủ yếu bằng dây nối α 1-4 glucozit amyloza có cấu tạo xoắn, mỗi vòng xoắn có 6 gốc glucoza Trọng lượng phân tử của amyloza vào khoảng 10.000 đến 100.000
Khi tác dụng với Iod, tinh bột sẽ có màu tím xanh đặt trưng cho quá trình định tính tinh bột
Cấu tạo của amylose được thể hiện như sau:
Công thức cấu tạo của amylose
• Amylopectin: Có cấu tạo mạch nhánh bên cạnh các dây nối 1-4 glucozit trong phân tử, còn dây nối 1-6glucozit thì ở đầu các nhánh
SVTH: NGUYỄN.T.PHƯỢNG LINH Trang 9
Thuỷ phân tinh bột nhẹ bằng enzym amylase hay acid loãng thời ngắn sẽ tạo ra dextrin, một ít maltose glucose, hỗn hợp tạo ra được gọi là tinh bột tan Thuỷ phân sâu xa hơn bằng acid mạnh, hay enzym thời gian lâu có nhiệt độ tạo nhiều maltose, glucose hơn
Trọng lượng phân tử của amylopectin vào khoãng 50.000-1000.000 Khi tác dụng với Iod cho màu đỏ tím
Công thức cấu tạo của amylopectin
(dextrin là sản phẩûm trung gian khi thuỷ phân tinh bột, có một số đơn vị monoza không lớn, vẫn còn ít cấu tạo nhánh, liên kết trong dextrin là liên kết 1,6-0-glucozit và liên kết 1,4-0-glucozit)
2.3 PHẢN ỨNG THUỶ PHÂN Để cung cấp nguồn cacbon chủ yếu là glucoza thì nguyên liệu chứa tinh bột có thể nói làtốt nhất,hàm lượng N hữu cơ, khoáng, vitamin với lượng nhỏ
Phản ứng thuỷ phân là phản ứng phân giải các chất có sự tham gia của nước Nó là một phản ứng phổ biến, quan trọng trong công nghiệp thực Tinh bột Dextrin khối lượng lớn
SVTH: NGUYỄN.T.PHƯỢNG LINH Trang 10 phẩm Nhóm enzym thuỷ phân gọi chung là hydrolaza, có thể tách được từ động vật và vi sinh vật
Phương trình tổng quát của phản ứng thuỷ phân tinh bột là: nH2O Để thực hiện quá trình trên người ta dùng nhiều phương pháp khác nhau, có ưu và nhược điểm riêng, đáng chú ý là 2 phương pháp sau :
2.3.1 Phương pháp thuỷ phân bằng acid
Dịch thuỷ phân thu được qua trung hoà bằng Na2CO3 hoặc NaOH, nếu dùng H2SO4 làm tác nhân thuỷ phân thì có thể dùng CaCO3 hoặc dùng nước vôi để trung hoà, sau đó đem lọc qua lọc ép khung bản với than hoạt tính để khử màu Dịch thuỷ phân này chủ yếu chứa glucoza, một lượng nhỏ các aicd amin, và có mặt của các chất khoáng
2.3.2 Phương pháp thuỷ phân bằng enzym
Các chế phẩm ở đây chủ yếu là từ nấm mốc, được nuôi cấy bề mặt hay bề sâu, dùng dưới tư cách là một phức hệ enzym amylaza gồm có α amylaza, β amylaza và glucoamylaza Sản phẩm thu được là hỗn hợp maltoza và glucoza Cũng có trường hợp dùng phối hợp giữa enzym từ nấm mốc và enzym từ vi khuẩn nuôi bề sâu, hiệu quả của quá trình sẽ cao hôn
Phương pháp này thuỷ phân các loại bột (sắn , gạo, ngô mì ) bằng cách thuỷ phân chế phẩm enzym loại này được đưa vào trong sản xuất rượu coàn
Trong công nghiệp bia, bột malt (nảy mầm từ đại mạch chứa chế phẩm α amylaza, β amylaza) thuỷ phân tinh bột của thóc malt và một số bột không phải malt( gạo, ngô) thu được dịch đường maltoza và dùng làm môi trường lên men bia
SVTH: NGUYỄN.T.PHƯỢNG LINH Trang 11
Enzym là một loại protêin được sinh vật tổng hợp nên và tham gia vào các phản ứng sinh học
Theo Nguyễn Đức Lượng NXBĐHQG, amylaza là một loại enzym có ý nghĩa về mặt sinh lý, thương mại và lịch sư û( còn gọi là diastase) Ezym này có nhiều ở động vật và thực vật
Amylaza là enzym thuộc nhóm thuỷ phân (hydrolaza) xúc tác sự phân giải liên kết glucoside nội phân tử trong polysaccharide với sự tham gia của nước
Hệ enzym amylase có 6 loại enzym chính như sau:
⮚ α-amylaza thuỷ phân liên kết α-1,4glucan của tinh bột và các polysaccharit
⮚ β-amylaza thuỷ phân α-1,4 glucan của tinh bột và các polysaccharit
⮚ γ amylaza thuỷ phân liên kết α-1,4glucan và 1,6 glucan của tinh bột
Ba enzym cuối thuỷ phân liên kết α-1,6 glucoside trong polysaccharit và các dextrin cuối
Enzym này thuỷ phân liên kết α- 1,4 glucoside trong polysaccharide của tinh bột, glucogen và các polysaccharide đồng loại một cách ngẫu nhiên không theo một trật tự nào cả α-amylase không chỉ thuỷ phân hồ tinh bột mà còn thuỷ phân cả hạt tinh bột nguyên lành, song với tốc độ rất chậm
SVTH: NGUYỄN.T.PHƯỢNG LINH Trang 12
Enzym vi sinh vật
Enzym là một loại protêin được sinh vật tổng hợp nên và tham gia vào các phản ứng sinh học
Theo Nguyễn Đức Lượng NXBĐHQG, amylaza là một loại enzym có ý nghĩa về mặt sinh lý, thương mại và lịch sư û( còn gọi là diastase) Ezym này có nhiều ở động vật và thực vật
Amylaza là enzym thuộc nhóm thuỷ phân (hydrolaza) xúc tác sự phân giải liên kết glucoside nội phân tử trong polysaccharide với sự tham gia của nước
Hệ enzym amylase có 6 loại enzym chính như sau:
⮚ α-amylaza thuỷ phân liên kết α-1,4glucan của tinh bột và các polysaccharit
⮚ β-amylaza thuỷ phân α-1,4 glucan của tinh bột và các polysaccharit
⮚ γ amylaza thuỷ phân liên kết α-1,4glucan và 1,6 glucan của tinh bột
Ba enzym cuối thuỷ phân liên kết α-1,6 glucoside trong polysaccharit và các dextrin cuối
Enzym này thuỷ phân liên kết α- 1,4 glucoside trong polysaccharide của tinh bột, glucogen và các polysaccharide đồng loại một cách ngẫu nhiên không theo một trật tự nào cả α-amylase không chỉ thuỷ phân hồ tinh bột mà còn thuỷ phân cả hạt tinh bột nguyên lành, song với tốc độ rất chậm
SVTH: NGUYỄN.T.PHƯỢNG LINH Trang 12
Quá trình thuỷ phân tinh bột bằng α-amylase là một quá trình đa giai đoạn: giai đoạn dịch hoá tạo thành một lượng lớn dextrin phân tử thấp(α-dextrin), sang giai đoạn đường hoá, các dextrin phân tử thấp này bị thuỷ phân tiếp tục tạo ra các tetramaltose, trimaltose không cho màu với
Iod, các chất này bị thuỷ phân rất chậm bỡi α-amylase cho tới dissacchrie và monodissacchrie
Thông thường α-amylase thuỷ phân tinh bột thành dextrin phân tử thấp không cho màu với Iod và một ít maltose, glucose
Tinh bột α amylase α-dextrin + Maltose + glucose
Tâm hoạt động của α-amylase có chứa nhóm –COOH và –NH2, α-amylase dễ tan trong nước, trong các dung dịch muối và rượu loãng
Protein của các α-amylase có tính acid yếu và có tính chất globulin Điểm đẳng điện nằm trong vùng pH: 4,2-5,7 (Bernfeld 1951) Trọng lượng phân tử của α-amylase từ các nguồn khác nhau rất gần nhau, α-amylase của naám moác: 45000-50000 ,cuûa malt: 59000 (Kmin:1956, Fischer1960) α-amylase là một metaloenzyme Các α-amylase đều chứa từ 1-30 nguyên tử gam Ca/mol, khi tách hoàn toàn Ca khỏi phân tử enzym thì α- amylase không còn khả năng phân giải cơ chất α-amylase bền với nhiệt hơn các amylaza khác
Từ các nguồn khác nhau, điều kiện hoạt động cũng khác nhau
SVTH: NGUYỄN.T.PHƯỢNG LINH Trang 13 β amylaza
Bảng 2.3 Nguồn gốc, độ pH ,nhiệt độ amylaza
Amylaza Độ PH Nhiệt độ thích hợp
2.4.2 β-amylase (1-4 glucan-maltohydrolase): β-amylase xúc tác sự thuỷ phân liên kết α-1,4 glucosid trong tinh bột, glycogen và polysaccharide đồng thể, phân cắt từng tự maltose một từ đầu không khử của mạch maltose tạo thành có cấu hình β, vì thế enzym này được gọi làβ amylase β-amylaza hầu như không thuỷ phân hạt tinh bột nguyên lành, mà lại thuỷ phân hồ tinh bột mạnh mẽ β-amylaza là một albumin, tâm của nó có chứa nhóm –SH và – COOH cùng với vòng imidazon của các gốc histindin Khác với α- amylase, β-amylaza rất bền khi không có Ca 2+ β-amylaza chỉ phổ biến ở hạt nảy mầm, không có trong vi khuẩn và “sự tồn tại của β-amylaza trong nấm mốc cho đến nay vẫn chưa chưa được chứng minh hoàn toàn”.(Nguyễn Lân Dũng-1982)
SVTH: NGUYỄN.T.PHƯỢNG LINH Trang 14
Glucoamylase(γ -Amylase) phân cắt liên kết α-1,4 –glucosede và liên kếtα-1,6 –glucosede trong tinh bột và polysaccharided đồng loại từ đầu không khử cho đến sản phẩm cuối cùng là glucose Enzym này được tìm thấy nhiều ở nấm mốc
Tinh bột glucoamylaza Glucose +Oligosaccharide mạch ngắn
Ezym này có khả năng thuỷ phân liên kết α-1,6-glucosid trong các polyose và digosaccharit kiểu tinh bột và glycogen
Thuỷ phân maltose thành glucose, nhưng không thuỷ phân tinh bột Ezym này cóù khả năng thuỷ phân liên kết α-1,4-glucosid trong các glucopiranoside, có khả năng chuyển các glucoside sang đường và rượu
Thuỷ phân các liên kết α-1,6glucoside trong inzomaltose panose và các dextrin tới hạn có thể chuyển hoá các cơ chất nàyđến các đường lên men được
2.4.7 Hoạt độ của các loại enzym Amylaza
Khi sử dụng bất kỳ một sản phẩm nào chúng ta cũng cần biết rõ hoạt độ xúc tác của nó Tuy nhiên, hoạt độ của enzym amylaza không phải là đại lượng tuyệt đối, mà chỉ quy ước theo hoạt độ xúc tác thu được trong điều kiện thực tế mà thôi
Hệ enzym amylaza có các hoạt độ đặt trưng sau: o Hoạt độ A (HĐA): Khả năng phân giải tinh bột đến sản phẩm không đổi màu với Iod, còn gọi là hoạt độ amylaza cuỷa cheỏ phaồm
SVTH: NGUYỄN.T.PHƯỢNG LINH Trang 15 o Hoạt độ Glucoamylase(HĐG1):Khả năng thuỷ phân tinh bột tới glucose của chế phẩm enzym o Hoạt độ đường hóa (Hđ Đh): Khả năng đường hoá tinh bột đến đường khử của enzym o Hoạt độ Maltose (HĐM):Khả năng thuỷ phân maltose đến glucose cuỷa cheỏ phaồm enzym.
Một số nghiên cứu - ứng dụng của nấm mốc
Việc nghiên cứu và ứng dụng chế phẩm enzym amylase từ nấm mốc vào cuộc sống từ lâu đã được nhiều nước trên thế giới thực hiện trong nhiều lĩnh vực khác nhau: y học, thực phẩm, chăn nuôi… Ở Liên Xô, Tiệp Khắc, Đông Đức các chủng Apergillus, Endomysespecies, đã sản xuất glucoamylase ở quy mô công nghiệp bằng phương pháp nuôi cấy chìm Ở Nhật, Mỹ, Hungary… nuôi cấy Apergillus,tạo α-amylaza và
Rhizopus neveus tạo glucoamylaza bằng phương pháp bề mặt
Từ năm 1960, ở Nhật 100% glucose được sản xuất bằng phương pháp thuỷ phân bởi enzym
Từ lâu, nhân dân ta đã biết sử dụng nấm mốc, mấm men để ủ rượu Năm 1960, nhà máy rượu Hà Nội đã nghiên cứu sản xuất enzyme amylaza thô từ nấm mốc
Năm1989, Vũ thị Thị Thu Thuỷ(ĐHNL) đã xây dụng thành công quy trình nuôi cấy và thu hoạch enzym từ nấm mốc, thu kết quả tốt trên môi trường cám gạo, bắp xay có bổ sung 1% NaNO3 , 0,05% MgSO4 , 0,05% CaCO3, 0,1% KH2PO4 Kết quả cho thấy hoạt độ amylaza của nấm mốc cao
SVTH: NGUYỄN.T.PHƯỢNG LINH Trang 16 hơn mầm bắp Thời gian sản xuất ngắn hơn, giá thành thấp hơn so với maàm baép
2.5.3.1 Ứng dụng trong công nghệ sản xuất bia
Chế phẩm amylaza từ nấm mốc (Asp oryzae, Asp.awamori,
Rhizopus, Endomycopsis bispora), được thay thế cho malt (đại mạch nảy mầm) làm tác nhân đường hoá tinh bột trong sản xuất rượu, bia, từ nguyên liệu có bột Việc sử dụng chế phẩm amylaza vi sinh vật thay thế malt đã tiết kiệm được hàng tấn đại mạch thuộc loại tốt, giảm giá thành, rút ngắn qui trình sản xuất
Khi so sánh thuỷ phân tinh bột bằng malt và bằng chế phẩm enzym của nấm mốc thì người ta thấy rằng: Nếu coi tổng lượng đường glucose, maltose, saccharose là 100% thì đường hoá bằng malt có 71% maltose, 24- 28% glucose, đường hoá bằng enzym nấm mốc 14-21% , 80-85% glucose, mà glucose là loại đường dễ lên men
2.5.3.2 Ứng dụng trong công nghệ sản xuất bánh mì
Nguyên liệu chính để sản xuất bánh mì là bột từ lúa mì Trong sản xuất bánh mì enzym được xem như một chất phụ gia cho vào quá trình làm bánh để làm tăng chất lượng bánh mì: làm tăng nhanh thể tích bánh, làm màu sắc của bánh đẹp hơn, làm tăng mùi thơm của bánh
Trong sản xuất bánh mì enzymα,β amylaza đóng vai trò thuỷ phân tinh bột thành đựờng, còn nấm men Saccharomyces cereviseae sẽ chuyển hoá thành cồn, CO2 làm tăng thể tích và tạo màu sắc, mùi thơm của bánh
Chế phẩm amylase thường dùng trong sản xuất bánh mì thường là enzym của nấm mốc Trong nấm mốc không những có amylase mà còn có protease
SVTH: NGUYỄN.T.PHƯỢNG LINH Trang 17 Ứng dụng chế phẩm enzym amylaza với lượng 0,002-0,05% so với bột nhão sẽ tăng quá trình lên men bột Rút ngắn thời gian lên men xuống còn 20 -30% Tăng độ xốp lên đến 5-8%, tăng thể tích lên 15-20%, màu sắc bánh sẽ đẹp hơn Nếu làm bánh ngọt thêm chế phẩm amylase và bột sẽ xảy ra quá trình đường hóa, do đó sẽ giảm được lượng đường tiêu tốn (có thể giảm đến 50%)
2.5.3.3 Ứng dụng trong sản xuất mật, tinh bột, malt, glucose Ứng dụng rộng rãi chế phẩm amylase của vi sinh vật trong sản xuất mật, tinh bột, maltose, glucose từ nguyên liệu tinh bột
Từ năm 1960 ở Nhật, 100% glucose được sản xuất bằng phương pháp thủy phân bởi enzym Trong sản xuất mật, tinh bột, maltose, glucose sử dụng 2 loại enzym chủ yếu là amylase và glucoamylase từ nấm mốc và từ vi khuẩn
2.5.3.4 Ứng dụng trong sản xuất bánh, kẹo
Kết hợp giữa amylase và protease của bột làm tăng hàm lượng amino và acid tự do và tăng lượng đường khử Đường khử và các amino có trong khối bột sẽ tham gia vào các phản ứng oxy hóa khử và kết quả là tạo bánh quy có mùi vị hấp dẫn
Ngoài những ứng dụng trên, amylase còn ứng dụng trong một số ngành khác như: công nghệ dệt giấy, trong chăn nuôi, trong y học…
2.5.3.5.Một số ứng dụng của nấm men
Ngoài việc ứng dụng vào trong quá trình sản xuất rượu bia.Nấm men còn ứng dụng trong một số ngành :
Trong y học, năm 1923 HerryBoulard nhà vi sinh học người Pháp đã phân lập chủng nấm men thuộc giống Saccharomyces từ vỏ trái cây, loại này có tác dụng rất tốt trong việc phòng bệnh tiêu chảy cho người và ngày nay được nghiên cứu thuốc điều trị bệnh ở gia súc non
SVTH: NGUYỄN.T.PHƯỢNG LINH Trang 18 Viện sinh học tổng hợp các hợp chất protein ở Liên Xô, 1967 đã phân lập hơn 500 chủng nấm men từ các mẫu đất bùn ở những nơi có dầu mỏ hoặc quanh nhà máy hóa dầu, có khả năng đồng hóa được hydratcacbon Chế phẩm sinh học có sự kết hợp giữa vi khuẩn, nấm men, saccharomyces và các enzym Khi sử dụng chế phẩm này vào môi trường nuôi trồng thủy sản, chúng có tác dụng phân hủy nhanh các chất thải hữu cơ, giúp phòng chống các bệnh do vi sinh vật khác gây ra Đồng thời, tăng cường độ oxy hóa, oxy hòa tan, giảm nhu cầu sinh học (BOD), nhu cầu oxy hóa (COD), hoặc làm giảm rong tảo trên mặt ao hồ Ngoài ra, bổ sung các chế phẩm này vào trong thức ăn thủy sản cũng góp phần làm tăng thêm hàm lượng đạm, acid amin, vitamin cần thiết cho vật nuôi
Nấm men còn được sử dụng là vật chủ trong công nghệ cấy chuyển gen để tạo ra những sản phẩm quý giá từ kỹ thuật chuyển gen và tái tổ hợp, có thể kể tên một vài loại sau:
Năm 1995 hãng Suntory (Mỹ) đã tạo được một giống nấm men mới bằng công nghệ gen và giết chết các vi khuẩn trong bia
Năm 1980, Kimura A (Nhật) đã tạo được các chủng nấm men có khả năng sinh sản insulin, interferon
Năm 1986, Mỹ đã sản xuất vaccin phòng bệnh viêm gan B thông qua tế bào ghép gan và nấm men Saccharomyces cereviseae.
Đặc điểm chung của vi sinh vật trong bánh men rượu
2.6.1 Đặc điểm của nấm mốc
Nấm mốc là tên chung để chỉ các nhóm nấm, không phải là nấm men cũng không phải là nấm lớn có quả thể Đây là nhóm vi sinh vật có cấu tạo dạng sợi có lông tơ, sợi bông tạo khuẩn ty ở dạng bột màu sắc của
SVTH: NGUYỄN.T.PHƯỢNG LINH Trang 19 nấm mốc được xác định bởi các bào tử do nó sinh ra như màu xanh, vàng trắng, đen nâu Trong thực phẩm nấm mốc xuất hiện trên bề mặt nước chấm, bánh mì để lâu ngày, trên rau quả và thức ăn khác, gây mùi vị khó chịu Một số loài tiết ra chất độc gây ngộ độc thức ăn Mặt khác, nấm mốc lại có có thể tham gia vào nhiều quá trình có lợi khác như : Nó quan trọng cho quá trình sản xuất nước chấm, tương, chao đường acid hữu cơ Nấm mốc hô hấp hiếu khí bắt buộc, có thể phát triển ở một số môi trường mà nấm men và vi khuẩn không thể phát triển được, như môi trường áp suất thẩm thấu, đụù ẩm và độ acid lớn
2.6.1.2 Các điều kiện cho nấm mốc sinh trưởng và phát triển a) Nhiệt độ
Hầu hết phát triển ở nhiệt độ 15-30 o C, sinh trưởng tốt nhất 25-30 o C, tuy nhiên vẫn có một số loài nấm mốc phát triển ngoài nhiệt độ trên (Cladocporiumherbarum) mọc chậm và rõû -6 o C trên thịt ướp lạnh Asp flavus ở 35 o C Nhiệt còn ảnh hưởng đến việc sinh bào tử nấm mốc và ảnh hưởng đến hình thái cơ quan bào tử b) Độ ẩm Độ ẩm ảnh hưởng lớn trên nấm mốc và thể hiện không ở sự sinh trưởng của hệ sợi nấm và sự sinh bào tử mà còn ở sự nảy mầm của bào tử Vai trò của độ ẩm trong sự phát triển của nấm mốc đặc biệt rõû rệt ở những naõm phaự hoỏi nguừ coẫc toăn kho ẹieơn hỡnh nhử Aspergillus flavus caăn coự ủoụ ẩm tương đối cho sự nảy mầm là 80%, sự sinh trưởng là 80%, sinh bào tử là 85% Trong khi đó Asp niger cần độ ẩm tương đối cho sự sinh trưởng là 88- 89%, cho sự sinh bào tử là 92-95% Đối với nấm Rhizopus nigricans thì độ ẩm tương đối cho sự nảy mầm là 90-92%, cho sự sinh trưởng là 92-94%, cho sự sinh bào tử là 96% c) Yếu tố dinh dưỡng khác
SVTH: NGUYỄN.T.PHƯỢNG LINH Trang 20 Có rất nhiều yếu tố khác ảnh hưởng đến khả năng phát triển của nấm mốc Những sự biến đổi trong việc sản xuất các sản phẩm trao đổi chất của chúng gồm một số chất sau đây :
+Cơ chất yêu cầu dinh dưỡng của từng loài nấm mốc khác nhau, do đó trên một cơ chất nhất định chỉ gặp những loài phát triển phù hợp với cơ chất đó
+pH đa số loài nấm mốc phát triển ở pH 4 -8 tuy nhiên vẫn có một số loài phát triển được ở pH acid hoặc pH kiềm hơn
+Oxy lượng oxy cần cho nấm mốc là rất quan trọng cho sự phát triển, phần lớn nấm mốc điều ưa khí, có loài ưa khí ít, có loài ưa khí nhiều Chẳng hạn như Mucor lan rất nhanh trên môi trường ưa khí, do đó chúng mọc nổi trên hộâp petri
2.6.1.3 Một số nấm mốc trong bánh men rượu
Giống Mucor: Hệ sợi hình ống, dạng nhung, dạng len, màu trắng sáng hoăùc màu đen, khụng cú thõn bũ (stolon ) khụng cú vỏch ngăn Bào tử nang hình thành trên tất cả các sợi nấm khí sinh Cuống bọc bào tử dựng đứng, đơn độc hoặc phân nhánh, luôn luôn tận cùng bằng bọc bào tử lõi cuống hình trụ tròn hoặc trái lê Bọc bào tử hình cầu màu trắng hoặc nhạt màu, không có mấu, màng bào tử nhẵn Hình dạng các bọc bào tử thay đổi trơn nhẵn hoặc có hạt Bào tử vách dày, đôi khi hiện diện Sinh sản tiếp hợp tạo cuống teo và nguyên phối nang Giống Mucor thường làm hư hỏng thực phẩm tạo khóm trắng to lan nhanh trên bề mặt thực phẩm, sau chuyển thành nhóm đen với nhiều bào tử kính trong nang Trong công nghiệp chế biến rượu dùng loài Mucor rouxii để đường hoá tinh bột trong quá trình
Giống Rhizopus: Là loại nấm hệ sợi không có vách ngăn Tạo rể giả và thân bò có màu đen khi già, cuống bào tử có lõi dạng cầu mọc từ rể giả
SVTH: NGUYỄN.T.PHƯỢNG LINH Trang 21 Bào tử màu đen, dạng cầu và tạo bào tử kính, khuẩn ty thể phát triển rộng có dạng bông
Giống Aspergillus: Giống này có hệ khuẩn ty không màu hoặc màu vàng nhạt, khuẩn ty phân nhánh có nhiều vách ngăn tế bào Tế bào có hạch nhân, cuống đính bào tử không phân nhánh dài và thẳng, đầu phình, trên đầu cuống sinh bào tử được phình to ra được gọi là túi đỉnh Túi đỉnh có thể là hình cầu, hình bầu dục, hoặc hình chuỳ Đầu túi đỉnh được mọc ra những tế bào hình ống gọi là thể bình Thể bình có thể có một lớp có thể có hai lớp Đầu thể bình hình thành nên đỉnh bào tử nối dài với nhau tạo thành hình chuỗi dài và càng tận cùng càng lớn dần Những chuỗi đính bào tử xếp đối xứng toả tròn trên chóp nang Đính bào tử điển hình thường có hình cầu, đơn bào bề mặt xù xì Do cuống sinh bào tử và đính bào tử có màu sắc, nên màu của chúng trở thành màu của khuẩn lạc mốc: màu vàng, màu lục, đen, tro, nâu Khi chín bào tử đính tách khỏi đầu thể bình và phát tán (Lương Đức Phẩm,1996)
2.6.2 Đặc điểm chung của nấm men
Nấm men phân bố rộng trong tự nhiên, đất, nước, không khí, lương thực thực phẩm Nấm men thường có cấu tạo đơn bào, không di động Sinh sản vô tính theo hình thức nảy chồi va là nhóm vi sinh vật có nhân thật Tế bào nấm men thường lớn hơn tế bào vi khuẩn rất nhiều (gấp 10 lần ) Tuỳ theo từng loại và môi trường sinh sống mà có hình dạng và kích thước khác nhau: hình trứng, hình tròn (Saccharomyces cerevisiae), hình elip (Saccharomyces ellipoideus), hình quả chanh (Saccharomyces apiculatus), đôi khi có hình chai ( Saccharomyces ludwigii) , hình ống dài( Pichia) Có loài có khuẩân ty và khuẩân ty giả Có loài tạo váng khi nuôi cấy trong môi trường dịch thể
SVTH: NGUYỄN.T.PHƯỢNG LINH Trang 22
Nấm men cú kớch thước từ 4-20 àm thậm chớ 25àm Trong đú,chiều rộng tế bào là 3-5àm và chiều dài tế bào là 5-10àm hoặc hơn nữa Kích thước này cũng thay đổi tuỳ thuộc giống,loài và điều kiện của môi trường sống.Trong môi trường lỏng, nấm men có khả năng sinh ra một lớp màng bao bọc như tấm voan Còn trong môi trường đặt nấm men có nhiều dạng khác nhau, nấm men có màu trắng đục, vàng hoặc hồng , mặt tế bào thường khô và căng Tế bào nấm men trong tự nhiên có thể đúng riêng lẽû, chùm.Sau khi nảy chồi dính nhau tạo thành chuỗi
Nhiều loài nấm men có khả năng lên men các loại đường để tạo thành rượu trong điều kiện yếm khí Còn trong điều kiện hiếu khí thì chúng có khả năng tạo thành sinh khối tế bào.Nấm men sinh sản nhanh chóng, sinh khối giàu protein, lipid và vitamin, sử dụng nhiều trong công nghệp thực phẩm để sản suất rượu, bia, nước giải khác lên men, sản xuất men bánh mì, sản suất protein sinh khối, gây hương nước chấm, sản suất chất béo, dược phẩûm Tuy nhiên vẫn có một số loài nấm men gây bệnh cho người và gia súc, làm hư hỏng lương thực và thực phẩm
Nấm men sinh sản với nhiều hình thức khác nhau: sinh sản vô tính và hữu tính
• Sinh sản vô tính gồm: sinh sản nảy chồi và phân chia
+Sinh sản bằng cách nảy chồi
Bình thường đến một giai đoạn nào đó, tế bào phân chia và tạo thành những tế bào con, lúc đầu tế bào này nhỏ hơn tế bào mẹ sau đó lớn dần lên, hoặc tách khỏi tế bào mẹ hoặc không tách khỏi, mà tạo thành những chồi nhỏ liên kết với nhau, ngay cả khi trưởng thành tạo thành chuổi tế bào gọi là khuẩn ty giả Đây là phương pháp sinh sản vô tính chủ yếu nhất của naám men
SVTH: NGUYỄN.T.PHƯỢNG LINH Trang 23
+Sinh sản bằng phân cách nảy chồi:
Một số loài phân đôi tế bào thành hai tế bào con bằng nhau giống nhau Lúc đầu nhân chia thành hai phần, sau đó ở phần giữa tế bào xuất hiện thành tế bào, thành này lớn dần lên và màng nguyên sinh chất lọt vào bên trong Lúc này thành tế bào mới phát triển toàn diện và chia tế bào mẹ làm hai tế bào con Mỗi tế bào con chứa ẵ chất nhõn, dần dần hai tế bào tỏch khỏi nhau và trở thành hai tế bào độc lập Thường gặp ở nấm men sợi
• Sinh sản hữu tính bằng bào tử túi
Bào tử túi nấm men là những bào tử được sinh ra trong những túi nhỏ gọi là túi nang Mỗi túi chứa từ 4-8 bào tử túi Bào tử túi có kích thước và hình dạng tuỳ từng loài nấm men
NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Nội dung
Địa điểm và thời gian
Thời gian: Từ 2/7/2005 đến 30/11/2005 Địa điểm: Phòng thí nghiệm Khoa CNSH Q9
Dụng cụ và phương pháp nghiên cứu
3.3.1 Duùng cuù Đĩa petri, ống nghiệm, đèn cồn, ống đong, bình tam giác, que cấy kớnh hieồn vi
Máy cất nước, tủ sấy, tủ ấm, tủ lạnh, máy lắc, autoclave, phòng cấy voõ truứng
Tiến hành lấy 15 mẫu đại diện như sau: Trường Sơn (tròn, màu trắng ngà, có mùi thơm, có tẩm trấu), Năm Hóa (loại bột mịn, và màu ngà, có lẫn xát trấu xay), Xuân Thạnh (viên tròn, màu trắng ngà, hơi xốp, ủ bằng rơm), Hà Nội bột (bột mịn, màu trắng đục có lẫn ít trấu xay), Vạn Phát, Trương Xá, Bắc Thái, Tứ Quý, Vạn Lợi, Gò Đen (men vi sinh), Tố Loan, Tư Tỷ, Hà Nội (dạng cám xay), Đồng tiền( màu trắng hơi ngà,viên nhỏ)
SVTH: NGUYỄN.T.PHƯỢNG LINH Trang 27
3.3.1.4 Môi trường khảo sát (phụ lục)
3.3.1.5 Môi trường sinh hóa (phụ lục)
3.3.2.1 Cách pha loãng mẫu đi phân lập
Cân 10 g mẫu nghiền nhuyễn cho vào bình tam giác chứa 90 ml nước muối sinh lí 9 0 /00, để trên máy lắc, lắc 30 phút Dùng micropipet vô trùng hút 1 ml mẫu cho vào ống nghiệm chứa 9 ml nước muối sinh lí 9 0 /00, ta được mẫu pha loãng là 10 -1 Tương tự, như vậy ta được các mẫu pha loãng là 10 -
SVTH: NGUYỄN.T.PHƯỢNG LINH Trang 28
Thạch đĩa Thạch đĩa Thạch đĩa
SVTH: NGUYỄN.T.PHƯỢNG LINH Trang 29
Sau khi pha loãng mẫu, hút 1ml dung dịch mẫu từ 3 nồng độ pha loãng liên tiếp khác nhau cho vào các đĩa petri có chứa sẵn môi trường Sabouraud Mỗi nồng độ cho vào 2 đĩa, rồi dùng que cấy trang, trang cho đều cho đến khi mặt thạch khô (thao tác phải ở điều kiện vô trùng) Sau đó dùng giấy báo sạch gói đĩa lại cho vào tủ ấm ủ ở nhiệt độ 37 0 C Sau 24 đến 48 giờ, lấy ra quan sát
❖ Đối với nấm men, quan sát hình dạng đặc điểm sau:
★ Đặc tính khuẩn lạc nhô cao, lõm hay bằng phẳng
★ Đặc tính quang học (trong, bán trong, hay không trong, cấu trúc khuẩn lạc bằng mắt thường)
★ Sau khi quan sát bằng mắt thường ta làm tiêu bản nhuộm đơn và quan sát dưới kính hiển vi có độ phóng đại x10, x40, x100
★ Ghi nhận các đặc điểm: Hình thái bắt màu, có chồi hay không có chồi Sau đó cấy truyền tất cả các nấm men vào môi trường Sabouraud thạch nghiêng để giữ giống
❖ Đối với nấm mốc: Chọn những khóm đặc trưng cấy truyền vào môi trường Sabouraud thạch nghiêng để giữ giống
3.3.2.3 Khả năng phân giải tinh bột
Những loại nấm mốc đã được giữ trong môi trường giữ giống ta tiến hành thử khả năng phân giải tinh bột Môi trường tinh bột là Sabouraud lỏng bổ sung 1% tinh bột Cấy nấm mốc vào môi trường, nuôi lắc ở nhiệt độ phòng 4 ngày Sau 4 ngày ta thử khả năng phân giải tinh bột của chúng
SVTH: NGUYỄN.T.PHƯỢNG LINH Trang 30 bằng cách:Dùng pipet hút 1ml cho vào ống nghiệm sạch, rồi nhỏ 1-2 giọt Lugol vào, kèm theo ống đối chứng
Kết quả: Ống nghiệm chuyển sang màu vàng hay không màu thì ống đó có khả năng phân giải tinh bột Còn ống không có khả năng phân giải tunh bột thì không chuyển màu Những mẫu có khả năng phân giải tinh bột thì được giữ lại
Trên môi trường thạch đĩa Sabouraud có bổ sung 1% tinh bột, cấy 3 khóm nấm men lên thạch (thực hiện trong buồng cấy vô trùng) Để ở nhiệt độ phòng 5-7 ngày Sau đó, thử vòng phân giải tinh bột của nấm men bằng Iod 0,2N(nhỏ 1 giọt Iod 0.2N lên khóm nấm men, xung quanh khóm tạo vòng trong thì có khả năng phân giải tinh bột)
Những mẫu có khả năng phân giải tinh bột thì được giữ lại
3.3.3 ẹũnh danh naỏm men, naỏm moỏc
Môi trường định danh nấm men là Sabouraud, Hansen, môi trường cám gạo, môi trường thạch mạch nha, môi trường rỉ đường Từ những ống giống đã phân lập ban đầu Những nấm men có khả năng phân giải tinh bột và những nấm men có khả năng lên men đường
Quan sát hình thái, kích thước khuẩn lạc trên môi trường Sabouraud
3.3.3.1.2 Quan sát và đo kích thước tế bào nấm men
Tế bào nấm men thay đổi tùy từng giống từng loài, tùy từng loại môi trường chúng sống Để quan sát ta thường dùng môi trường dịch nha, nuôi 3 ngày ở 25 0 C Lưu ý là không đo tế bào nẩy chồi
SVTH: NGUYỄN.T.PHƯỢNG LINH Trang 31
Lau sạch lam bằng cồn, ký hiệu mẫu ở góc trái của lam
Nhỏ 1 giọt nước muối sinh lý hoặc nước cất vô trùng lên lam
Dùng que cấy tròn lấy 1 ít nấm men hòa đều lên nước cất vô trùng để làm veát boâi
Nhỏ một giọt fushine Để yên 1 phút, rồi rửa bằng nước cất Để khô trong không khí
Quan sát dưới kính hiển vi có độ phóng đại x10, x40, x100 (phải có dầu soi)
3.3.3.1.3 Quan sát sự nẩy chồi của nấm men
Muốn quan sát sự nẩy chồi của nấm men ta nuôi cấy trên môi trường rỉ đường, nuôi cấy nấm men ở 30 0 C/24-48 giờ Sau đó, lấy một ít dịch lỏng chấm thành một giọt trên lam và đặt lam úp ngược cho một giọt nấm men nhỏ xuống lõm kính rồi quan sát
Một số loài nấm men có tế bào dài, nối tiếp nhau tạo nên dạng sợi gọi là khuẩn ty, hoặc khuẩn ty giả ở các khuẩn ty giả các tế bào không nối liền nhau một cách chặt chẽ như ở khuẩn ty that Nấm men chỉ sinh khuẩn ty giả trong điều kiện thiếu oxi Ở một số loài nấm men chẳng những có khả năng lên men mà còn có khả năng phân giải tinh bột mạnh, thường những loài này có khuẩn ty thật Để quan sát và phân biệt khuẩn ty thật, khuẩn ty giả ta nuôi cấy nấm men trên môi trường thạch đĩa Hansen
Phương pháp làm: Trên môi trường thạch đĩa Hansen (thao tác ở trên đèn cồn và ở phòng cấy vô trùng) Dùng que cấy thẳng đốt đỏ trên ngọn đèn cồn đưa từ từ vào trong ống giống( để từ từ ở thành ống để cho nó
SVTH: NGUYỄN.T.PHƯỢNG LINH Trang 32 bớt nóng và sẽ không làm chết giống) Sau đó, lấy một ít nấm men cấy vào thạch đĩa Hansen 2 lằn cấy song song, dùng lammell đã thanh trùng đậy lên
2 lằn cấy ấy (tránh để bọt khí vào, để tạo nên môi trường kị khí) ủ ở nhiệt độ phòng 24-48 giờ Sau đó, đưa lên kính hiển vi x10, x40 để xem hình dạng và cấu tạo khuẩn ty
3.3.3.1 5.Quan sát nang bào tử
Nhiều loài nấm men có khả năng sinh nang bào tử, nang bào tử có kích thước và hình dạng khác nhau tùy từng loài.Thông thường, ta quan sát ở tế bào già và tế bào ở môi trường nghèo dinh dưỡng Môi trường thường sử dụng là môi trường Adamo nuôi ở nhiệt độ phòng/ 5-10 ngày Để thấy rõ ta nhuộm bằng phương pháp nhuộm bào tử