khóa luận sàng lọc tác dụng ức chế enzyme tyrosinase của một số dược liệu việt nam

DANH MĀC CÁC HÌNH VẼ VÀ Đà THÞ Hình 1.2 Hai b°ớc đ¿u cąa quá trình táng hāp melanin xúc tác Hình 2.1 Quy trình chiÁt xuÃt thu cao chiÁt d°āc liệu 21 Hình 2.2 Quy trình thử nghiệm đánh gi

Đ¾I HâC QUàC GIA HÀ NàI

TR¯àNG Đ¾I HàC Y D¯þC

TR ÞNH THÞ HÀU

KHÓA LU ÀN TÞT NGHIÞP Đ¾I HàC NGÀNH D¯þC HàC

HÀ N ÞI - 2023

Đ¾I HâC QUàC GIA HÀ NàI

TR¯àNG Đ¾I HàC Y D¯þC

Ng°ßi thực hiện: TRÞNH THÞ HÀU

KHÓA LU ÀN TÞT NGHIÞP Đ¾I HàC NGÀNH D¯þC HàC

Khóa: QH.2018.Y

Ng°ái h°ßng d¿n 1: ThS ĐẶNG KIM THU

Ng°ái h°ßng d¿n 2: ThS NGUYỄN THÞ HUYÀN

HÀ N ÞI – 2023

L àI CÀM ¡N

Đ°āc làm và hoàn thành khóa luÁn tát nghiệp d°āc sĩ đ¿i hãc, tôi cÁm thÃy

vô cùng biÁt ¡n sự giúp đÿ quý báu cąa các th¿y cô giáo, b¿n bè và ng°ßi thân

Tr°ớc tiên, tôi xin bày tß lßi cÁm ¡n chân thành và lòng biÁt ¡n sâu sÃc tới

ThS Nguy ễn Thị Huyền, ThS Đặng Kim Thu – hai cô giáo đã luôn quan tâm,

giúp đÿ, tÁn tình h°ớng d¿n tôi trong suát quá trình thực hiện khóa luÁn

Tôi xin chân thành cÁm ¡n Tr°ßng Đ¿i hãc Y D°āc đã t¿o điều kiện tát nhÃt cho tôi đ°āc hãc tÁp trong suát thßi gian ngßi trên ghÁ nhà tr°ßng và cho phép tôi thực hiện khóa luÁn này Đßng thßi, tôi xin cÁm ¡n các th¿y cô giáo bá môn D°āc lý – D°āc lâm sàng, Hóa d°āc – Kiểm nghiệm, Bào chÁ, D°āc liệu – D°āc hãc cá truyền đã nhiệt tình giúp đÿ, t¿o điều kiện cho tôi trong suát thßi gian nghiên cću và thực hiện khóa luÁn

Lßi cuái cùng, tôi xin gửi lßi cÁm ¡n đÁn gia đình, b¿n bè đã luôn sát cánh, ąng há, đáng viên, góp ý để tôi hoàn thành khóa luÁn này

Hà Nái, ngày 24 tháng 05 năm 2023

Sinh viên

Tr ßnh Thß HÁu

DANH M ĀC CÁC KÝ HIÞU, CHĀ VI¾T TÂT

DCT Enzyme dopachrome tautomerase

FDA Căc quÁn lý Thực phÁm và D°āc phÁm Hoa Kỳ (Food and

Drug Admiministrati) OTC Thuác không kê đ¡n (Over The Counter)

B16F10 TÁ bào sÃc tá ng°ßi

EtOH Ethanol

MeOH Methanol

BuOH Butanol

EtOAc Ethyl acetat

DNA Deoxyribonucleic acid

LDL Lipoprotein tÿ trãng thÃp (Low density lipoprotein)

QSAR Quantitative Structure - Activity Relationship

DMSO Dimethyl sulfoxide

IC50 Half maximal inhibitory concentration

SD Đá lệch chuÁn (Standard Deviation)

%I % ćc chÁ

A Đá hÃp thă quang (Absorbance)

DANH M ĀC CÁC HÌNH VẼ VÀ Đà THÞ

Hình 1.2 Hai b°ớc đ¿u cąa quá trình táng hāp melanin xúc tác

Hình 2.1 Quy trình chiÁt xuÃt thu cao chiÁt d°āc liệu 21 Hình 2.2 Quy trình thử nghiệm đánh giá khÁ năng ćc chÁ

Hình 3.1 KhÁ năng ćc chÁ tyrosinase cąa acid kojic 27 Hình 3.2 KhÁ năng ćc chÁ tyrosinase cąa các cao EtOH 28 Hình 3.3 Giá trá IC50 cąa các cao EtOH hoa Hòe, Chùm ngây,

Cam thÁo và chćng d°¡ng acid kojic 29 Hình 3.4 Tác dăng ćc chÁ tyrosinase cąa các phân đo¿n dách

Hình 3.5 Giá trá IC50 ćc chÁ tyrosinase cąa các các phân đo¿n

dách chiÁt Cam thÁo và acid kojic 31

DANH M ĀC CÁC BÀNG

BÁng 2.1 Các thuác thử và hóa chÃt c¿n thiÁt 19

BÁng 2.2 Bá trí thử nghiệm đánh giá tác dăng ćc chÁ enzym

tyrosinase in vitro cąa các m¿u thử 23

BÁng 3.1 Khái l°āng và hiệu suÃt cao chiÁt EtOH các d°āc liệu 26

BÁng 3.2 Hiệu suÃt chiÁt cao phân đo¿n Cam thÁo 26

M ĀC LĀC

L àI CÀM ¡N

DANH M ĀC CÁC KÝ HIÞU, CHĀ VI¾T TÂT

DANH M ĀC CÁC HÌNH VẼ VÀ Đà THÞ

DANH M ĀC CÁC BÀNG

M ĀC LĀC

ĐẶT VÂN ĐÀ 1

CH¯¡NG 1 - TâNG QUAN 3

1.1 Táng quan về melanin 3

1.1.1 Các rái lo¿n tăng sÃc tá da 3

1.1.2 Vai trò cąa melanin 4

1.1.3 Quá trình sinh táng hāp melanin 5

1.2 Táng quan về enzyme tyrosinase 6

1.2.1 Khái niệm enzyme tyrosinase 6

1.2.2 Vai trò cąa tyrosinase trong quá trình táng hāp melanin 7

1.2.3 Các yÁu tá Ánh h°áng đÁn ho¿t đáng cąa enzyme tyrosinase 8

1.2.4 Mát sá chÃt ćc chÁ enzym tyrosinase có ngußn gác táng hāp đã đ°āc sử dăng 9

1.2.5 Các d°āc liệu có tác dăng ćc chÁ enzyme tyrosinase 10

1.3 Táng quan về ph°¡ng pháp đánh giá tác dăng ćc chÁ enzyme tyrosinase 16

CH¯¡NG 2 – ĐÞI T¯þNG VÀ PH¯¡NG PHÁP NGHIÊN CĄU 18

2.1 Đái t°āng nghiên cću 18

2.1.1 D°āc liệu nghiên cću 18

2.1.2 M¿u nghiên cću 18

2.2 Nguyên vÁt liệu thí nghiệm 18

2.2.1 Thuác thử, hóa chÃt 18

2.2.2 Máy móc, thiÁt bá, dăng că 19

2.3 Nái dung nghiên cću 20

2.4 Ph°¡ng pháp nghiên cću 20

2.4.1 Xây dựng quy trình chiÁt xuÃt d°āc liệu 20

2.4.2 Nghiên cću tác dăng ćc chÁ enzyme tyrosinase in vitro cąa cao chiÁt các d°āc liệu 22

2.4.3 Ph°¡ng pháp xử lý sá liệu 25

CH¯¡NG 3 - K¾T QUÀ NGHIÊN CĄU 26

3.1 KÁt quÁ chiÁt xuÃt d°āc liệu 26

3.2 KÁt quÁ đánh giá tác dăng ćc chÁ tyrosinase in vitro cąa cao EtOH các d°āc liệu 27

3.3 KÁt quÁ đánh giá tác dăng ćc chÁ enzym tyrosinase in vitro cąa các cao phân đo¿n từ d°āc liệu có khÁ năng ćc chÁ tyrosinase tát nhÃt 30

CH¯¡NG 4 – BÀN LUÀN 32

4.1 Về kÁt quÁ đánh giá tác dăng ćc chÁ tyrosinase in vitro cąa cao EtOH 32

4.2 Về kÁt quÁ đánh giá tác dăng ćc chÁ tyrosinase in vitro cąa cao phân đo¿n Cam thÁo 34

K ¾T LUÀN VÀ KI¾N NGHÞ 36

KÀT LUÀN 36

KIÀN NGHà 36

TÀI LI ÞU THAM KHÀO

1

ĐẶT VÂN ĐÀ

Melanin là mát hāp chÃt phenolic sinh hãc cao phân tử có vai trò quan trãng trong việc t¿o nên sÃc tá á da ng°ßi Tuy nhiên, việc gia tăng l°āng melanin táng

hāp á biểu mô s¿ gây ra hiện t°āng nám da, s¿m da Ngoài ra, mát sá bệnh về da

có thể d¿n đÁn việc tích lũy v°āt mćc l°āng melanin á biểu mô Các bệnh này bao

gßm s¿m da, rám má, ung th° tÁ bào hÃc tá và tăng sÃc tá sau viêm [1] Những

biểu hiện bên ngoài cąa những bệnh này có thể tác đáng m¿nh đÁn tâm lý ng°ßi bệnh cũng nh° làm giÁm các ho¿t đáng xã hái, hiệu quÁ trong công việc hay tự kÿ [2] Do đó, nhiều nghiên cću đ°āc tiÁn hành nhằm tìm kiÁm ho¿t chÃt có khÁ năng làm trÃng da

H¿u hÁt các sÁn phÁm làm sáng da đ°āc bán trên thá tr°ßng đều sử dăng thành ph¿n ho¿t chÃt là chÃt ćc chÁ tyrosinase – enzyme đóng vai trò quan trãng, xúc tác cho hai phÁn ćng đ¿u tiên cąa quá trình táng hāp melanin Tuy nhiên, việc

sử dăng các sÁn phÁm này bá Ánh h°áng bái các mái lo ng¿i về tính an toàn và

hiệu quÁ Mặc dù vÁy, t¿i nhiều quác gia, các chÃt làm trÃng da nh° hydroquinone, corticosteroids, các hāp chÃt chća thąy ngân v¿n còn đ°āc sử dăng bÃt chÃp tác

dăng nguy h¿i cąa chúng [3-5] Mát sá chÃt khác nh° arbutin, acid kojic, vitamin

C cũng đ°āc sử dăng nh°ng những chÃt này có nh°āc điểm là hiệu quÁ không cao

hoặc không bền Do đó, nhiều công trình đang đ°āc tiÁn hành để tìm ra các hāp

chÃt làm trÃng da mới, an toàn và hiệu quÁ h¡n

Những hāp chÃt làm trÃng da lý t°áng để sử dăng trong mā phÁm là những

hāp chÃt có thể ćc chÁ quá trình sÁn xuÃt melanin nh°ng không gây chÁt tÁ bào Trong bái cÁnh đó, các d°āc liệu và hāp chÃt có ngußn gác thiên nhiên ngày càng đ°āc °a chuáng do đặc tính an toàn so với các hóa chÃt táng hāp [6-8]

Việt Nam nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa nóng Ám quanh năm, do

vÁy mà hệ tháng thực vÁt t°¡ng đái đa d¿ng và phong phú, t¿o điều kiện thuÁn lāi cho việc phát triển thuác chữa bệnh từ các lo¿i thÁo d°āc Trên c¡ sá đó, đề tài

<Sàng lác tác dāng ąc ch¿ enzyme tyrosinase căa mßt sß d°ÿc lißu Vißt Nam=

đ°āc thực hiện với măc tiêu:

3

CH¯¡NG 1 - TâNG QUAN 1.1 T ãng quan vÁ melanin

1.1.1 Các r ối loạn tăng sắc tố da

Nám da đ°āc đề cÁp đÁn nh° là mát tình tr¿ng tăng sÃc tá da mÃc phÁi, trong

đó các mÁng da không đều màu từ sáng đÁn nâu s¿m hoặc nâu xám xuÃt hiện trên các ph¿n da tiÁp xúc với ánh nÃng mặt trßi [71] Về mặt mô hãc, nám đ°āc đặc tr°ng bái sự tăng sÃc tá biểu bì, sá l°āng tÁ bào hÃc tá không tăng Các tÁ bào hÃc

tá phì đ¿i, sá l°āng đuôi gai và bào quan tÁ bào chÃt nhiều h¡n, điều này d¿n đÁn

ho¿t đáng trao đái chÃt cao h¡n và sự gia tăng l°āng hÃc tá trong tÃt cÁ các lớp

cąa biểu bì, tăng sá l°āng melanosome tr°áng thành [71]

Nguyên nhân chính xác cąa nám v¿n ch°a đ°āc biÁt, tuy nhiên mát sá yÁu

tá ho¿t hóa đã đ°āc mô tÁ, chẳng h¿n nh° tiÁp xúc với ánh nÃng mặt trßi, mang thai, rái lo¿n nái tiÁt tá, sử dăng mā phÁm hoặc thuác gây nh¿y cÁm với ánh sáng

và tình tr¿ng viêm da, [72] Điều này cho thÃy rằng sự xuÃt hiện và phát triển

cąa nám bá Ánh h°áng bái nhiều yÁu tá và phă thuác vào sự t°¡ng tác cąa cąa c¡

thể với các yÁu tá này

TiÁp xúc với ánh nÃng mặt trßi là yÁu tá kích ho¿t quan trãng nhÃt gây nám

da UVA và UVB là những bćc x¿ chính gây nên sự gia tăng ho¿t đáng t¿o hÃc tá,

d¿n đÁn sự phát triển quá mćc cąa sÃc tá biểu bì và xÁy ra á những vùng bá nám nhiều h¡n so với vùng da lân cÁn [72]

Mang thai và liệu pháp thay thÁ hormone là những yÁu tá kích ho¿t th°ßng đ°āc nhÃc tới nhÃt Các hormone sinh dăc nh° estrogen và progestin cũng liên quan đÁn sự xuÃt hiện cąa nám Sự gia tăng hormone estrogen và progesterone d¿n đÁn tăng phiên mã cąa tyrosinase và dopachrom tautomerase, từ đó kích thích tÁ bào hÃc tá tăng sinh và điều này có thể liên quan đÁn sự phát triển cąa sÃc tá trong giai đo¿n mang thai á phă nữ [72] Trong mát nghiên cću á Ân Đá, tÿ lệ bá nám

á phă nữ mang thai là 50,8% đ°āc báo cáo á 2.000 phă nữ mang thai đ°āc chãn

ng¿u nhiên [74] Tÿ lệ 63,5% đ°āc ghi nhÁn á mát quác gia Đông Nam Á khác

4

[75] Tuy nhiên, tÿ lệ thÃp 5% đã đ°āc quan sát thÃy á mát nhóm 60 phă nữ mang thai từ Pháp [76]

Việc sử dăng mā phÁm và uáng mát sá lo¿i thuác nh° thuác cháng co giÁt

và các chÃt nh¿y cÁm với ánh sáng khác cũng đ°āc coi là yÁu tá nguy c¡ gây nám

bằng cách lÃng đãng tÁ bào hÃc tá á các lớp bề mặt hoặc bằng cách kích thích quá trình t¿o hÃc tá

Ngoài nám da, tàn nhang và đßi mßi cũng là hai rái lo¿n tăng sÃc tá da th°ßng gặp Tàn nhang nói chung là những đám sÃc tá nhß (đ°ßng kính th°ßng là

1–2 mm, nh°ng có thể lớn h¡n), có màu từ đß đÁn nâu nh¿t, đ°āc quan sát thÃy á

những ng°ßi da trÃng và/hoặc tóc vàng Tàn nhang th°ßng bÃt đ¿u xuÃt hiện từ khi 2–3 tuái, sau đó tăng lên trong thßi niên thiÁu và th°ßng biÁn mÃt mát ph¿n theo tuái tác Tàn nhang th°ßng xuÃt hiện nhiều nhÃt trên mặt, cánh tay, cá và ngực và trá nên đÁm màu h¡n vào mùa hè [73]

Đßi mßi lớn h¡n tàn nhang, có đ°ßng kính từ vài milimet đÁn centimet, và màu cąa chúng có thể là màu nâu s¿m Đßi mßi là rái lo¿n tăng sÃc tá da phá biÁn h¡n á nh°ng ng°ßi trên 50 tuái và th°ßng xuÃt hiện á những vùng da tiÁp xúc lâu dài với ánh nÃng mặt trßi (chą yÁu á mặt, mu bàn tay và ph¿n tr°ớc bên cąa cẳng tay) [73]

Nhìn chung các rái lo¿n tăng sÃc tá da đều ít nguy hiểm đÁn tính m¿ng nh°ng l¿i Ánh h°áng nhiều thÁm mā, nhÃt là vùng mặt và cá, do đó có thể tác đáng tiêu cực đÁn tr¿ng thái tâm lý, làm giÁm sự tự tin ván có cąa ng°ßi bệnh cũng nh°

giÁm các ho¿t đáng xã hái và hiệu quÁ trong công việc

1.1.2 Vai trò c ủa melanin

Melanin là mát lo¿i sÃc tá màu nâu hoặc đen, đ°āc tìm thÃy trong rÃt nhiều các sinh vÁt sáng, từ nÃm, thực vÁt đÁn đáng vÁt có vú và có chćc năng khác nhau

á mßi loài sinh vÁt [9] à ng°ßi, melanin là yÁu tá chính quyÁt đánh đÁn màu da

và màu tóc Melanin cũng đ°āc tìm thÃy trong các mô sÃc tá nằm bên d°ới tròng

5

đen cąa mÃt, tÁ bào th¿n kinh vàc tá mang trong các khu vực cąa não, chẳng h¿n nh° các locus coeruleus nằm á c¿u não và chÃt đen [10]

Vai trò cąa melanin là bÁo vệ da khßi tác h¿i cąa tia cực tím (UV) bằng cách

hÃp thă UV cąa ánh sáng mặt trßi và lo¿i bß các gác oxy hóa tự do Các rái lo¿n tăng sÃc tá bÃt th°ßng á da th°ßng thÃy là kÁt quÁ cąa sự tích tă quá mćc sÃc tá á

biểu bì, bao gßm nám da, đám nâu, tàn nhang và s¿m da Tăng sÃc tá có thể do tăng tÁ bào t¿o sÃc tá hoặc do tăng ho¿t đáng cąa các enzyme hình thành sÃc tá [11] Quá trình t¿o hÃc tá là mát quá trình phćc t¿p đ°āc táng hāp qua nhiều phÁn ćng enzym và hóa hãc Có ba lo¿i enzyme tham gia vào quá trình t¿o hÃc tá là tyrosinase, TRP-1 và TRP-2, nh°ng các ph°¡ng pháp hiện nay chą yÁu tÁp trung vào ćc chÁ tyrosinase bái vai trò quan trãng cąa enzyme này trong quá trình hình thành hÃc tá da [12]

1.1.3 Quá trình sinh t ổng hợp melanin

à ng°ßi, melanin có thể đ°āc tìm thÃy á 2 d¿ng: eumelanin (sÃc tá đen và nâu) và pheomelanin (sÃc tá đß và vàng) [13] CÁ eumelanin và pheomelanin đều đ°āc táng hāp thông qua mát lo¿t các phÁn ćng oxy hóa tyrosinase hoặc L-3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) thành dopaquinon, đ°āc xúc tác bái enzyme tyrosinase

Sau khi hình thành dopaquinone, con đ°ßng melanin đ°āc chia thành táng

hāp eumelanin và pheomelanin n¡i có sự chuyển đái tự phát thành leuco dopachrome và dopachrome

Trong con đ°ßng eumelanin, dopachrome hoặc đ°āc chuyển đái mát cách

tự nhiên thành 5,6-dihydroxyindole hoặc thành axit carboxylic nhß enzyme dopachrome tautomerase (DCT), còn đ°āc gãi là protein liên quan đÁn tyrosine- 2 (TRP-2) [14] TRP-1 và TRP-2 là hai protein có cÃu trúc liên quan đÁn tyrosinase [15-17] Hai protein này c° trú trong các melanosome,

5,6-dihydroxyindole-2-trÁi dài trên màng tÁ bào hÃc tá giáng nh° tyrosinase và đã đ°āc chćng minh là làm tăng tính án đánh cąa tyrosinase [18-20] Tuy nhiên, vai trò cąa TRP-1 và

hydroxyl dihydrobenzothazine và polyme hóa thành pheomelanin (Hình 1.1)

Hình 1.1 Con đường sinh tổng hợp melanin [13]

1.2 T ãng quan vÁ enzyme tyrosinase

1.2.1 Khái ni ệm enzyme tyrosinase

Tyrosinase (còn đ°āc gãi là monophenol monooxygenase, EC 1.14.18.1)

có hai nguyên tử đßng á vá trí ho¿t đáng cąa nó là Cu(II) A và Cu(II) B [22]

7

Tyrosinase xúc tác quá trình hydroxyl hóa monophenol thành o -diphenol

và oxy hóa o -diphenol thành o-quinones, chÃt t¿o ra hÃc tá và đ°āc coi là enzyme chą chát trong quá trình táng hāp melanin á đáng vÁt có vú, vi khuÁn, thực vÁt và

nÃm [23, 24]

Sự ćc chÁ tyrosinase không chß liên quan đÁn việc làm giÁm chćng tăng sÃc

tá da mà còn liên quan đÁn quá trình thoái hóa th¿n kinh liên quan đÁn bệnh Parkinson Tyrosinase oxy hóa dopamine để hình thành hÃc tá trong não Dopaquinone gây ra tán th°¡ng tÁ bào th¿n kinh trong não do thiÁu hăt tÁ bào th¿n kinh dopaminergic d¿n đÁn bệnh Parkinson Do đó tyrosinase cũng đóng vai trò

trong c¡ chÁ bệnh sinh cąa bệnh Parkinson [25] Mặt khác, tyrosinase có thể d¿n đÁn màu nâu do enzym không thuÁn lāi trong rau và trái cây và làm giÁm giá trá dinh d°ÿng và giá trá thá tr°ßng cąa chúng trong ngành công nghiệp thực phÁm [26]

1.2.2 Vai trò c ủa tyrosinase trong quá trình tổng hợp melanin

Tyrosinase (EC 1.14.18.1) là enzyme đóng vai trò quan trãng tham gia vào hai phÁn ćng chính để hình thành melanin

Đ¿u tiên L-tyrosin đ°āc hydroxyl hóa thành 3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) bái enzyme tyrosinase và đ°āc gãi là quá trình monophenolase Đây

là b°ớc bÃt buác cąa quá trình sinh táng hāp melanin

TiÁp theo L-DOPA đ°āc oxy hóa thành DOPA-quinon cũng bái enzyme tyrosinase và đ°āc gãi là quá trình diphenolase Sau đó, DOPA-quinon tham gia

mát lo¿t các phÁn ćng để t¿o thành melanin (Hình 1.2) [27]

8

Hình 1.2 H ai bước đầu của quá trình tổng hợp melanin xúc tác bởi enzyme

tyrosinase 1.2.3 Các y ếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme tyrosinase

Nßng đá c¡ chÃt: Khi nßng đá c¡ chÃt L-tyrosine hoặc L-DOPA tăng thì tác

đá phÁn ćng tăng, l°āng DOPA-quinon t¿o ra càng nhiều Tuy nhiên đÁn mát mćc nào đó, tác đá phÁn ćng s¿ không tăng thêm nữa khi enzyme đã bão hòa c¡ chÃt [28]

Nßng đá enzym: Khi nßng đá enzyme tăng thì tác đá phÁn ćng tăng Tuy nhiên, nßng đá enzym tăng đÁn mát mćc nhÃt đánh, sÁn phÁm t¿o ra quá nhiều s¿ tác đáng vào trung tâm dá lÁp thể cąa enzyme, phÁn ćng bão hòa và tác đá phÁn ćng s¿ không tăng lên nữa [28]

Nhiệt đá: Ho¿t đáng cąa enzyme phă thuác nhiều vào nhiệt đá Thông th°ßng, khi tăng 100C thì tác đá phÁn ćng tăng lên 2-3 l¿n [29] Tuy nhiên, nhiệt

đá quá cao enzyme s¿ bá biÁn tính Nhiệt đá cũng Ánh h°áng trong quá trình bÁo

quÁn enzyme Tyrosinase nên đ°āc bÁo quÁn á nhiệt đá -20oC [30]

pH: pH đ°āc đánh giá là có Ánh h°áng đÁn ho¿t đáng cąa enzyme Mćc tái

°u cho ho¿t đáng cąa enzyme tyrosinase là á pH 6,0–7,0 [31]

9

1.2.4 M ột số chất ức chế enzym tyrosinase có nguồn gốc tổng hợp đã được sử

d ụng

Acid kojic (5-hydroxy-2(hydroxymethyl)-g-pyron), mát chÃt chuyển hoá

cąa nÃm đ°āc sÁn xuÃt bái nhiều loài Aspergillus và Penicillium [32], có thể đ°āc

táng hāp hóa hãc hoặc đ°āc chiÁt xuÃt từ sÁn phÁm tự nhiên Acid kojic ćc chÁ sự hình thành sÃc tá từ phÁn ćng oxy hoá L-DOPA, norepinephrin và dopamin d°ới

sự xúc tác cąa tyrosinase Điều này có nghĩa rằng acid kojic có thể giÁm chuyển hoá dopaquinon thành O-dephenol ngăn cÁn t¿o thành các sÃc tá và đ°āc oxy hoá thành mát sÁn phÁm màu vàng bằng cách t°¡ng tác hoá hãc với dopaquinon

Hydroquinon có khÁ năng ćc chÁ 90% ho¿t tính cąa tyrosinase [33], là mát hoá chÃt phá biÁn có trong mā phÁm và sÁn phÁm làm sáng da Nó đ°āc coi là mát trong các chÃt ćc chÁ hiệu quÁ nhÃt quá trình sÁn xuÃt melanin và đã từng đ°āc sử dăng ráng rãi để điều trá các rái lo¿n sÃc tá nh° làm trÃng da để điều trá nám, điều

trá tăng sÃc tá sau viêm và các rái lo¿n tăng sÃc tá khác Do các tác dăng phă liên quan tới việc sử dăng các sÁn phÁm không c¿n kê đ¡n có chća hydroquinon nên hydroquinon đã bá FDA (Căc quÁn lý Thực phÁm và D°āc phÁm Hoa Kỳ) quy đánh h¿n chÁ sử dăng các sÁn phÁm OTC (thuác không kê đ¡n) có chća nßng đá hydroquinon cao Ành h°áng tới sćc khoẻ nghiêm trãng nhÃt có liên quan đÁn hydroquinon là Ánh h°áng đÁn sÃc tá cąa mÃt, và trong mát sá ít tr°ßng hāp hydroquinon gây tán th°¡ng giác m¿c vĩnh viễn Vì lý do này, hydroquinon đã bá

cÃm sử dăng trong các chÁ phÁm mā phÁm á châu Âu vì không an toàn khi sử

dăng trong thßi gian dài [34]

Arbutin, mát hāp chÃt chuyển hoá thć cÃp cąa cây Bearberry (tên khoa hãc

là Arctostaphylos uva-ursi), đ°āc sử dăng ráng rãi với hiệu quÁ làm sáng da Arbutin tự nhiên t°¡ng đái an toàn tuy nhiên l¿i có đá án đánh thÃp và dễ dàng chuyển hoá thành hydroquinon Vì thÁ vào năm 2008, Hiệp hái Mā phÁm Châu

Âu đã cÃm sử dăng các đßng d¿ng cąa β-arbutin [35]

Acid azelaic (acid 1,7-heptanedicarboxylic) hiện nay đang đ°āc sử dăng để điều trá măn trćng cá từ nhẹ đÁn trung bình, điều trá bệnh tăng sÃc tá da đặc biệt á

10

những ng°ßi s¿m da Tuy nhiên thì acid azelaic l¿i ćc chÁ tyrosinase yÁu và ćc

chÁ theo c¡ chÁ c¿nh tranh [36]

1.2.5 Các dược liệu có tác dụng ức chế enzyme tyrosinase

Hydroquinone, axit kojic, và arbutin là những chÃt ćc chÁ tyrosinase đ°āc

biÁt đÁn nhiều nhÃt nh°ng chúng có tác dăng phă nghiêm trãng nh° mÃt sÃc tá vĩnh viễn, nái ban đß và viêm da tiÁp xúc, Với °u điểm an toàn, lành tính nhiều d°āc liệu đã đ°āc nghiên cću đánh giá khÁ năng ćc chÁ enzyme tyrosinase

Hòe (Styphnolobium japonicum (L.) Schott.), thuác hã ĐÁu (Fabaceae) là

mát mát vá thuác nam quý, đã và đang đ°āc sử dăng ráng rãi trong y hãc cá truyền

Hình 1.3 N ụ hoa Hòe

Hiện nay đã có nhiều nghiên cću về thành ph¿n hóa hãc cąa hoa Hòe, các thành ph¿n chính mang l¿i tác dăng cąa cây bao gßm triglycoside flavonol, isoflavone, coumaronochromone, saponin, triterpene glycoside, phospholipid, alkaloid, axit amin, polysacarit và axit béo [37]

Hoa và nă hoa cąa cây Hòe th°ßng đ°āc sử dăng để điều trá các rái lo¿n liên quan đÁn chÁy máu nh° đ¿i tiện ra máu, chÁy máu trĩ, chÁy máu do rái lo¿n

11

chćc năng tử cung và tiêu chÁy [37] Các đặc tính chćc năng cąa nă hoa Hòe nh°

cháng oxy hóa, lo¿i bß gác tự do, cháng viêm, c¿m máu, h¿ đ°ßng huyÁt, h¿ axit uric, đã đ°āc ghi nhÁn qua nhiều nghiên cću sâu ráng [38] Ngoài ra, chiÁt xuÃt

cąa nă hoa Hòe cũng thể hiện ho¿t tính ćc chÁ tyrosinase m¿nh và đác tính tÁ bào

thÃp Theo kÁt quÁ nghiên cću cąa Wang KH và cáng sự, IC50 cąa chiÁt xuÃt EtOH 95% nă hoa Hòe là 92,51 ± 1,73 µg/mL, bên c¿nh đó khÁ năng ćc chÁ tyrosinase

cąa cao chiÁt MeOH á nßng đá 100 μg/mL là 38,7% cũng đ°āc Kim Soo Jin và cáng sự báo cáo [39, 40] Từ các kÁt quÁ nghiên cću này có thể thÃy hoa Hòe có

rÃt nhiều triển vãng ćng dăng trong mā phÁm nh° là mát thành ph¿n an toàn trong các sÁn phÁm chăm sóc và làm trÃng da

HÃc kÿ tử (Lycium ruthenicum Murr.) là mát loài thuác chi Lycium, hã

Solanaceae Các hāp chÃt chính đ°āc tìm thÃy trong quÁ HÃc kÿ tử bao gßm carotenoid, vitamin C và các hāp chÃt phenolic nh° anthocyanin, axit phenolic, stilben và flavonol Nghiên cću d°āc lý hiện đ¿i đã khẳng đánh rằng HÃc kÿ tử có nhiều tác dăng nh° cháng oxy hóa, tăng c°ßng miễn dách và cháng lão hóa [41] Ngoài ra, ho¿t đáng ćc chÁ tyrosinase cąa dách chiÁt với dung môi n°ớc và anthocyanins phân lÁp từ quÁ khô HÃc kÿ tử đã đ°āc tiÁn hành nghiên cću bái Shen M và cáng sự [42] KÁt quÁ là anthocyanins tinh khiÁt có tác dăng ćc chÁ

c¿nh tranh đái với tyrosinase monophenolase (IC50 = 1,483 ± 0,058 mg/mL) tát h¡n so với dách chiÁt n°ớc (IC50 = 2,948 ± 0,022 mg/mL) nh°ng kém h¡n so với acid kojic (IC50 = 2,974 ± 0,015 µg/mL) Do đó, anthocyanins từ quÁ khô hÃc kÿ

tử có thể đ°āc sử dăng nh° chÃt ćc chÁ tyrosinase để điều trá hiệu quÁ các rái lo¿n tăng sÃc tá da

Chùm ngây (Moringa oleifera Lam.) là mát lo¿i thÁo d°āc thuác hã Chùm ngây (Moringaceae) Tác dăng cąa Chùm ngây đã đ°āc công nhÁn để điều trá các

bệnh nhiễm trùng khác nhau, điều chßnh hệ tháng miễn dách và thể hiện tác dăng

cháng oxy hóa, cháng bệnh tiểu đ°ßng hoặc cháng khái u [43]

12

Hình 1.4 Cây Chùm ngây

Năm 2021, Ni Putu Linda Laksmiani và cáng sự đã nghiên cću và cho thÃy

hāp chÃt quercetin chiÁt xuÃt từ lá Moringa oleifera L có tác dăng ćc chÁ

tyrosinase và là mát chÃt tiềm năng giúp làm sáng da [44] Cũng trong thử nghiệm này, cao chiÁt MeOH cąa lá Chùm ngây cũng đ°āc ghi nhÁn là có tác dăng ćc chÁ tyrosinase tát với IC50 là 115,36 µg/mL, trong khi đó đái chćng là acid kojic có IC50 là 48,90 µg/mL Bên c¿nh đó, năm 2022 An Nisaa Nurzak và cáng sự đã đánh giá và cho thÃy dách chiÁt lá Chùm ngây có tác dăng ćc chÁ enzyme tyrosinase tát,

có thể phát triển thành kem làm trÃng da [45]

DiÁp cá có tên khoa hãc là Houttuynia cordata Thunb, thuác hã lá GiÃp

(Saururaceae) DiÁp cá là mát lo¿i cây thÁo mãc rÃt phá biÁn á Việt Nam và mát

sá n°ớc châu Á khác Ngoài việc dùng để làm rau ăn, DiÁp cá còn là mát loài cây

có khÁ năng chữa đ°āc nhiều bệnh nh° lỵ, cÁm, sát, viêm, thanh nhiệt, giÁi đác, Trong các nghiên cću d°āc lý, DiÁp cá cho thÃy ho¿t đáng bÁo vệ các c¡ quan trong c¡ thể , chẳng h¿n nh° giÁm giÁi phóng các yÁu tá gây viêm để giÁm bớt tán

13

th°¡ng phái, tăng c°ßng hàng rào miễn dách cąa âm đ¿o, khoang miệng và đ°ßng

ruát [46] Ngoài ra, ho¿t tính làm trÃng da cũng nh° đác tính cąa cây DiÁp cá trên dòng tÁ bào da u sÃc tá B16F10 đã đ°āc nghiên cću bái Nguyễn Hoàng Dũng và

cáng sự, năm 2016 KÁt quÁ nhÁn đ°āc đã cho thÃy cây DiÁp cá có rÃt nhiều triển

vãng ćng dăng trong mā phÁm nh° là mát thành ph¿n an toàn và làm trÃng da [47]

Cây mß qu¿ còn đ°āc gãi là xuyên phá th¿ch, hoàng lß hoặc móc câu, tên khoa hãc là Cudrania cochinchinensis, thuác hã Dâu tằm (Moraceae) Trong bài thuác dân gian cąa Việt Nam, lá cây mß qu¿ đ°āc cho là mát tác nhân giúp chữa lành vÁt th°¡ng Đặc tính d°āc lý này cąa lá cây mß quÁ đ°āc chćng minh thông qua các nghiên cću trên đáng vÁt và quan sát lâm sàng t¿i Việt Nam [48] Trong nghiên cću cąa Zheng ZP và cáng sự năm 2011 [49], các thành ph¿n hóa hãc trong chiÁt xuÃt 95% EtOH cąa thân cây mß qu¿ đã đ°āc phân lÁp và đánh giá ho¿t đáng

ćc chÁ cąa chúng trên tyrosinase nÃm KÁt quÁ cho thÃy ho¿t đáng ćc chÁ tyrosinase cąa 2,3-cis-dihydromorin (IC50 = 31,1 μM), 2,3-trans-dihydromorin (IC50= 21,1 μM) và oxyresveratrol (IC50= 2,33 μM) m¿nh h¡n axit kojic (IC50= 50,8 μM) Do đó, chiÁt xuÃt từ thân cây mß qu¿ có thể là mát ćng cử viên đ¿y hća hẹn cho các sÁn phÁm mā phÁm làm trÃng da

ThÁo quyÁt minh còn gãi là quyÁt minh, mußng, có tên khoa hãc là Cassia

tora L., thuác hã ĐÁu (Fabaceae) ChiÁt xuÃt methanol thô, n-hexan, EtOAc, BuOH và phân đo¿n n°ớc cąa h¿t cây C.tora có tÿ lệ ćc chÁ tyrosinase t°¡ng ćng

là 35,9%; 58,1%; 90,0%; 52,3% và 27,7% á nßng đá 300 μg/mL Các hāp chÃt chryso-obtusin, 7-methoxy-obtusifolium và obtusifolin-2-O-glucoside đ°āc phân

lÁp từ h¿t cąa cây C.tora đã thể hiện khÁ năng ćc chÁ ho¿t đáng cąa enzyme tyrosinase nh° mát chÃt ćc chÁ c¿nh tranh KÁt quÁ này cho thÃy rằng các hāp chÃt này có thể là các ćng cử viên tiềm năng trong việc sử dăng chiÁt xuÃt từ thực vÁt

tự nhiên để làm trÃng da [50]

Cây Rau má (Centella asiatica Urban) thuác chi Centella cąa hã Apiaceae

à Việt Nam, cây Rau má mãc hoang hoặc đ°āc trßng phá biÁn khÃp n¡i ChiÁt

14

xuÃt cąa Rau má đ°āc sử dăng ráng rãi để điều trá các rái lo¿n viêm da, bao gßm

bệnh phong, lupus, loét giãn tĩnh m¿ch, chàm, viêm da dá ćng và bệnh vÁy nÁn [51] Ngoài ra, axit asiatic, axit madecassic và asiaticoside là các thành ph¿n chính trong chiÁt xuÃt Rau má đ°āc nghiên cću là có tác dăng kích thích táng hāp collagen [52] G¿n đây, nghiên cću cąa Saraf và cáng sự đã chß ra rằng mát công

thćc mā phÁm chća Rau má có khÁ năng làm trÃng da [53]

Cam thÁo có tên khoa hãc là Glycyrrhiza glaba L., thuác chi Glycyrrhiza,

hã Fabaceae Thân rễ Cam thÁo đã đ°āc ćng dăng từ xa x°a để điều trá các bệnh

hệ tiêu hóa, lo¿i bß đßm, giÁm ho, d°ÿng khí, giÁi lo âu và giÁm đau Điều này đ°āc cho là nhß đặc tính cháng viêm từ các triterpene saponin, flavonoid, coumarin cąa Cam thÁo [54]

Hình 1.5 Cây Cam th ảo

Ngoài ra, Glabridin – pyranoisoflavan - mát trong những thành ph¿n chính cąa Cam thÁo đã cho thÃy ho¿t đáng cháng hình thành hÃc tá đ¿y hća hẹn trên các

tÁ bào u ác tính B16 cąa chuát Glabridin ćc chÁ ho¿t đáng tyrosinase cąa tÁ bào

u ác tính á nßng đá 1,0 µg/ml mà không Ánh h°áng đÁn quá trình táng hāp DNA Glabridin cũng đ°āc chćng minh ćc chÁ tác dăng cąa tia UVB gây ra sÃc tá và viêm trên da chuát lang á nßng đá 0,5% w/v [55]

15

Dâu tằm (Morus alba L.) hay dâu tằm trÃng, dâu tằm th°ßng, dâu trÃng, dâu

ta là loài thực vÁt có hoa thuác chi Dâu tằm (Morus), hã Moraceae ChiÁt xuÃt dâu tằm hoặc các thành ph¿n đặc biệt là flavonoid nh° quercetin , rutin và isoquercitrin giúp lo¿i bß các gác tự do cho thÃy khÁ năng cháng l¿i stress oxy hóa [56] Ngoài

ra, các chÃt cháng oxy hóa này giúp bÁo vệ tim m¿ch vì chúng ćc chÁ quá trình oxy hóa LDL và do đó gây x¡ vữa đáng m¿ch [56] Ngoài ra, chiÁt xuÃt ethanol

từ cành cąa cây dâu tằm và các thành ph¿n ho¿t tính có trong chiÁt xuÃt đã thể hiện ho¿t tính ćc chÁ tyrosinase m¿nh m¿ qua nghiên cću cąa Zhang L và cáng sự, năm

2016 Theo kÁt quÁ thử nghiệm thử nghiệm, các hāp chÃt steppogenin (IC50 = 0,98

± 0,01 µM); 2,4,2,4'-tetrahydroxychalcone (IC50 = 0,07 ± 0,02 µM); morachalcone

A (IC50 = 0,08 ± 0,02 µM); oxyresveratrol (IC50 = 0,10 ± 0,01 µM) và moracin M (IC50 = 8,00 ± 0,22 µM) thể hiện ho¿t đáng ćc chÁ tyrosinase m¿nh h¡n nhiều so với axit kojic (IC50 = 58,30 ± 1,60 µM) [57]

Nho (Vitis vinifera L.) không chß đ°āc biÁt đÁn nh° mát lo¿i cây ăn quÁ mà

còn là d°āc liệu Các ho¿t đáng cháng oxy hóa, cháng viêm và giÁm đau cąa chiÁt

xuÃt n°ớc Nho đã đ°āc nghiên cću bằng ph°¡ng pháp in vitro và in vivo [58]

Ho¿t đáng ćc chÁ tyrosinase cąa chiÁt xuÃt n°ớc lá cây nho đß (RVLE) có chća axit gallic, axit chlorogenic, epicatechin, rutin và resveratrol cũng đã đ°āc nghiên cću là có hiệu quÁ đái với chćng tăng sÃc tá da Nghiên cću đáng hãc cho thÃy sự

ćc chÁ tyrosinase cąa RVLE thông qua c¡ chÁ phÁn ćng c¿nh tranh với L-DOPA Mặc dù RVLE có tác dăng ćc chÁ tyrosinase không tát bằng axit kojic, nh°ng nó v¿n đ°āc công nhÁn là mát thành ph¿n tự nhiên an toàn và có thể đ°āc sử dăng mát cách an toàn trong các sÁn phÁm mā phÁm [59]

Cây NgÁi cću (Artemisia vulgaris L.) còn có tên thuác cću, nhÁ ngÁi, bÃc

ngÁi, thuác chi Artemisia, hã Asteraceae Cây NgÁi cću có mát lách sử lâu dài đ°āc sử dăng để chữa bệnh cho con ng°ßi Những tác dăng d°āc lý nái bÁt cąa

NgÁi cću đã đ°āc nghiên cću sâu ráng là cháng sát rét, cháng viêm, cháng tăng huyÁt áp, cháng oxy hóa, cháng ung th°, điều hòa miễn dách, bÁo vệ gan, cháng

co thÃt, cháng nhiễm trùng và cháng ung th° [60, 61] Tác dăng ćc chÁ tyrosinae

cąa NgÁi cću cũng đang đ°āc nghiên cću và phát triển nh° là mát thành chính

16

trong các sÁn phÁm chăm sóc da nh° là mát chÃt giữ Ám, chÃt bÁo vệ da và làm

trÃng da [62]

Hình 1.6 Cây Ng ải cứu

1.3 T ãng quan vÁ ph°¢ng pháp đánh giá tác dāng ąc ch¿ enzyme tyrosinase

Quá trình nghiên cću, phát triển thuác mới nói chung và chÃt ćc chÁ tyrosinase nói riêng c¿n phÁi trÁi qua rÃt nhiều giai đo¿n và mát trong những giai đo¿n cąa quá trình là nghiên cću sàng lãc tác dăng

Có nhiều ph°¡ng pháp đ°āc sử dăng trong giai đo¿n này Tuy nhiên, hai ph°¡ng pháp c¡ bÁn đ°āc dùng để đánh giá tác dăng ćc chÁ enzyme tyrosinase

phá biÁn nhÃt là thử nghiệm in vitro và thử nghiệm in vivo

Thử nghiệm in vivo là ph°¡ng pháp đo ho¿t tính cąa tyrosinase thông qua

đo sự tích tă melanin trong tÁ bào á chuát hoặc á ng°ßi ¯u điểm nái bÁt cąa

ph°¡ng pháp in vivo là đánh giá đ°āc chính xác tác đáng cąa chÃt thử nghiệm lên

c¡ thể sinh vÁt Tuy nhiên ph°¡ng pháp này khó thực hiện, tán nhiều thßi gian và

c¿n sự theo dõi chặt ch¿ cąa ng°ßi làm thí nghiệm

17

Thử nghiệm in vitro đ°āc tiÁn hành bằng cách sử dăng enzyme tyrosinase

cąa nÃm làm chÃt xúc tác cho quá trình chuyển hoá tyrosine thành DOPAquinone sau đó tiÁn hành đo mćc đá t¿o thành sÁn phÁm màu L-DOPAquinone để đánh giá ho¿t tính ćc chÁ tyrosinase cąa chÃt thử Đây là ph°¡ng pháp đ°āc sử dăng ráng rãi nhÃt để đánh giá tác dăng ćc chÁ enzyme tyrosinase

L-bái thßi gian nghiên cću ngÃn, khÁ năng tự đáng hóa cao và cho phép quan sát

trực tiÁp diễn biÁn tr¿ng thái bệnh lý cąa tÁ bào Đßng thßi, có thể thực hiện cùng lúc nhiều m¿u thử khác nhau với dÁi nßng đá ráng

Mát sá máy quang phá, sÃc ký, điện di, đo phóng x¿ và điện hóa đã đ°āc các nhà nghiên cću áp dăng và phát triển G¿n đây, ph°¡ng pháp cÁm biÁn sinh

hãc huỳnh quang và sÃc ký lớp mßng dựa cũng đã đ°āc đề xuÃt để sàng lãc chÃt

ćc chÁ tyrosinase Ngoài ra, có thể sàng lãc nhanh các chÃt ćc chÁ tyrosinase thông qua sử dăng sàng lãc Áo và xây dựng mô hình liên quan đÁn cÃu trúc và tác dăng

18

CH¯¡NG 2 – ĐÞI T¯þNG VÀ PH¯¡NG PHÁP NGHIÊN CĄU 2.1 Đßi t°ÿng nghiên cąu

2.1.1 Dược liệu nghiên cứu

D°āc liệu dùng trong nghiên cću là:

+ Hòe (Styphnolobium japonicum (L.) Schott.)

+ Chùm ngây (Moringa oleifera Lam.)

+ DiÁp cá (Houttuynia cordata Thunb.)

+ Rau má (Centella asiatica Urban.)

+ Cam thÁo (Glycyrrhiza glabra L.)

+ NgÁi cću (Artemisia vulgaris L.)

Các d°āc liệu đ°āc thu hái t¿i Thái Bình, Hoà Bình, Vĩnh Phúc, và đ°āc giám đánh thực vÁt hãc bái Bá môn D°āc liệu & D°āc hãc cá truyền - Tr°ßng đ¿i hãc Y D°āc, ĐHQGHN

2.1.2 M ẫu nghiên cứu

M¿u nghiên cću trong khóa luÁn xin đ°āc gãi tÃt là cao chiÁt Bao gßm:

 Cao chiÁt EtOH toàn ph¿n cąa lá Chùm ngây, nă hoa Hòe, cây DiÁp

cá, cây Rau má, thân rễ Cam thÁo và ngãn thân cây NgÁi cću

 Cao chiÁt phân đo¿n cąa Cam thÁo

2.2 Nguyên v Át lißu thí nghißm

2.2.1 Thu ốc thử, hóa chất