coli, Enterobacter và một số vi khuẩn đường ruột khác trên những môi trường vi khuẩn ruột.. Thực phẩm cũng là một trong những nguồn bệnh lây nhiễm chính vì thực phẩm rất giàu chất dinh d
TOÅNG QUAN
TỔNG QUAN VỀ HỌ TRỰC KHUẨN ĐƯỜNG RUỘT_ ĐẶC BIỆT LÀ ESCHERICHIA COLI (E COLI)
1.1 Sơ khởi về họ Enterobacteriaceae
Enterobacteriaceae là họ vi khuẩn gồm nhiều trực khuẩn gram âm, chiều dài khoảng 1 – 4 àm, khụng bào tử, sống ở đường tiờu hoỏ của người và động vật Họ
Enterobacteriaceae có 6 tính chất chung sau:
❖ Di động hoặc không di động (nhờ chiên mao)
❖ Hiếu khí hoặc yếm khí tuỳ nghi
❖ Lên men glucose (sinh hơi hoặc không sinh hơi)
❖ Phản ứng oxidase âm tính
❖ Mọc trên các môi trường nuôi cấy thông thường
Phân loại Enterobacteriaceae phức tạp và thay đổi nhanh chóng
Có hai hệ thống phân loại chính là: Bergey’s Manual (1974), Edwards &
Theo phân loại của Edwards & Ewing cải tiến / CDC (1977, 1986) thì
Enterobacteriaceae gồm 8 tộc (tribe), trên 20 giống (genus) và hơn 100 loài
❖ TRIBE: ESCHERICHIEAE Genera: Escherichia, Shigella
❖ TRIBE: KLEBSIELLEAE Genera: Klebsiella, Enterobacter, Hafia, Serratia
❖ TRIBE: PROTEA Genera: Proteus, Morganella, Providencia
❖ TRIBE: ERWINIEAE Genus: Erwinia Trong mỗi giống có nhiều loài (species)
Bảng 2.1: Tóm lược đặc tính khóm vi khuẩn E coli, Enterobacter và một số vi khuẩn đường ruột khác trên những môi trường vi khuẩn ruột
Loại vi khuẩn Môi trường phân biệt
Môi trường ngăn chặn (Bisulfit Agar)
Escherichia coli Lớn, biên đều, đỏ gạch, bao quanh bằng một vòng đỏ
Bị chận, mọc ít, đen, xanh lá cây, nâu
Enterobacter Lớn , bóng, tâm đỏ, biên không đều
Proteus Nhỏ, không màu, vài gốc mọc tràn
Khóm phẳng, hay hơi lồi, xanh lá cây
Pseudomonas Nhỏ, không màu, biên không đều, thơm nhẹ
- Kháng nguyên O (kháng nguyên thân - somatic antigen): chịu nhiệt, có thể tồn tại ở 100 O C / 1 giờ Bản chất kháng nguyên O là polysaccarite, không bị phá hủy bởi cồn, kháng thể IgM có thể chống lại kháng nguyên này
- Kháng nguyên H (kháng nguyên lông - flagella antigen): không chịu nhiệt, tính chất của kháng nguyên H phụ thuộc vào chuỗi acid amin của protein loâng
- Kháng nguyên K (kháng nguyên vỏ - surface antigen): bao gồm kháng nguyên O, ngăn chặn sự kết dính của nó với kháng huyết thanh O Kháng nguyên K không chịu nhiệt, chỉ có ở một vài dòng của họ vi khuẩn ruột Gồm 3 loại: A, L, B trong đó L tạo ngưng kết giống như O khi vi khuẩn còn sống, do đó cần đun nóng 100 O C để giết chết L Loại kháng nguyên này gây viêm màng não
Hiện nay đã tìm ra hơn 150 loại kháng nguyên O, hơn 100 loại kháng nguyên K và hơn 50 loại kháng nguyên H
- Ngoại độc tố LT (Thermolabile hay heat-labile toxin): không chịu nhiệt
- Nội độc tố chịu nhiệt (Thermostable hay heat-stable toxin) STa: nhiều dòng sản xuất STa thì cũng sản xuất LT
- Nội độc tố chịu nhiệt STb - Verotoxin: khả năng gây tiêu chảy
- Bacterioxin: một số dòng sản xuất bacterioxin để diệt một vài dòng khác gần gũi với nó Sự sản sinh độc tố này được điều khiển bởi plasmid E coli sản xuaát ra colixin
1.1.5 Tính gây bệnh của một số loài trong họ Enterobacteriaceae
- Nhiễm trùng đường niệu đạo: 90% trường hợp xảy ra ở phụ nữ, chủ yếu do nhóm O4, O7, O75 gây nên
- Tiêu chảy: do các độc tố LT, ST, Verotoxin gây ra; thường gặp ở các nhóm O78H11, O6H16, O78H12
- Nhiễm trùng: thường xảy ra ở các nơi khác ngoài ruột Đây là kết quả của nhiễm trùng niệu đạo, có nguy cơ dẫn đến nhiễm trùng toàn thân: họng, não…
- Viêm màng não: là sự kết hợp của E coli và Streptococcus nhóm B, ở trẻ sơ sinh 40% trường hợp là do E coli trong đó 75% là có kháng nguyên K
❖ Enterobacter: là một trong những mầm gây nhiễm trùng niệu đạo, giống nhử E coli
❖ Proteus: chỉ gây bệnh nhiễm trùng khi rời khỏi đường ruột, cũng gây nhiễm trùng niệu đạo và một vài nhiễm trùng khác
1.2 ẹũnh nghúa chung veà Coliforms, Colifroms chũu nhieọt, Coliforms phaõn và E coli
Coliforms thuộc họ Enterobacteriaceae (tộc Escherichia) còn có tên gọi là Aerobacteracrogen Đây là vi khuẩn nằm trong nhóm có dạng coli, gồm 4 giống:
Escherichia với 1 loài duy nhất là E coli, Citrobacter, Klebsiella và Enterobacter
Coliforms là những trực khuẩn gram âm không sinh bào tử, hiếu khí hoặc kị khí tuỳ nghi, có khả năng lên men latose sinh acid và sinh hơi ở 37 0 C trong 24 – 48 giờ Trong thực tế phân tích, coliforms còn được định nghĩa là các vi khuẩn có khả năng lên men đường, sinh hơi trong khoảng 48 giờ khi được ủ ở 37 0 C trong môi trường canh lauryl sulphate và canh brilliant green lactose bile salt Nhóm coliforms hiện diện rộng rãi trong tự nhiên, trong ruột người, động vật, ngoài nguồn gốc từ phân người và động vật nó còn có trong đất, nước, không khí…
Coliforms được xem là nhóm vi sinh vật chỉ thị: số lượng hiện diện của chúng trong thực phẩm, nước hay các loại mẫu môi trường được dùng để chỉ thị khả năng hiện diện của các vi sinh vật khác Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng khi số coliforms của thực phẩm cao thì khả năng hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh khác cũng cao Tuy nhiên, mối liên hệ vi sinh vật gây bệnh và vi sinh vật chỉ thị này vẫn còn nhiều tranh cãi Tính chất sinh hoá đặc trưng của nhóm này được thể hiện qua các thử nghiệm indol (I), methyl red (MR), voges-proskauer (VP) và citrate (iC) thường được gọi chung là IMVIC
Coliforms chịu nhiệt là những coliforma có khả năng lên men lactose sinh hơi trong khoảng 24 giờ khi được ủ ở 44 0 C trong môi trường canh EC
Coliforms phân (Faecal coliforms hay E coli giả định) là coliforms chịu nhiệt có khả năng sinh indole khi được ủ khoảng 24 giờ ở 44,5 0 C trong canh trypton
Coliforms phân là một thành phần của hệ vi sinh đường ruột ở người và các động vật máu nóng khác, chúng được sử dụng để chỉ thị mức độ vệ sinh trong quá trình chế biến, bảo quản, vận chuyển thực phẩm, nước uống cũng như để chỉ thị sự ô nhiễm phân trong mẫu môi trường
E coli là coliforms phân cho kết quả thử nghiệm IMViC là + + - - (Trần Linh
VI KHUAÅN E COLI
Giới: Bacteria Ngành: Proteobacteria Lớp: Gramma Proteobacteria Họ: Enterobacteriaceae Gioáng: Escherichia Loài: E coli
❖ Tên khoa học: Escherichia coli
2.1 Lịch sử và sự phân bố
Vào năm 1885, ở Munich một nhà khoa học trẻ tuổi người Đức tên là Theodor Escherich đã đi sâu nghiên cứu các thí nghiệm lâm sàng Vì là một bác sĩ khoa nhi nên ông càng để tâm đối với vi sinh vật đường ruột ở trẻ em Cùng năm đó, ông phát biểu luận văn: “Vi khuẩn đường ruột của trẻ em sơ sinh và trẻ em” và nêu lên cái tên cúng cơm của vi khuẩn này là: Bacterium Coli Commune
Vi khuẩn này sau khi được phát hiện, chỉ mấy năm đã được đổi tên mấy lần:
- Năm 1889 người ta gọi nó là vi khuẩn Escherichia để kỷ niệm người có công phát hiện
- Năm 1895 gọi nó là Bacillus coli
- Năm 1896 gọi nó là Bacterium coli
- Đến năm 1991, khi xuất bản cuốn “Sổ tay y học nhiệt đới” người ta mới xác định chính thức là Escherichia coli Đồng thời vẫn giữ tên Escherichia để làm tên chung cho cả các vi khuẩn nhóm đường ruột
Vi khuẩn Escherichia coli có nhiều trong tự nhiên, sống bình thường trong đường ruột của người và gia súc Trong đường ruột chúng có nhiều ở đại tràng E coli nhiễm vào đất, nước… từ phân của động vật Chúng trở nên gây bệnh khi gặp điều kiện thuận lợi
- E coli có hình trực khuẩn, gram âm, đứng riêng lẻ, đôi khi tạo thành chuoãi ngaén
- Kớch thước trung bỡnh 0,5 àm x 1 – 3 àm, hai đầu trũn
- Vi khuẩn có giáp mô mỏng, có lông xung quanh thân, một số có pili, không tạo bào tử, loại không có độc lực không có capsul, loại có độc lực có capsul
- Trong bẹânh phẩm có khi bắt màu lưỡng cực
E coli là vi khuẩn hiếm khí hay hiếm khí tuỳ nghi Nhiệt độ thích hợp 37 0 C (10 – 46 0 C) nhưng có thể mọc trên 40 0 C (cho nên đây sẽ là nguyên nhân gây ngộ độc cho người tiêu dùng) Trong môi trường nuôi cấy xác định chỉ số vệ sinh E coli duứng 42 0 C – 44,5 0 C, pH = 7,4
- Trên môi trường thạch dinh dưỡng Nutrient Agar (NA) E coli tạo khóm tròn ướt _ dạng S (Smooth) màu trắng đục Để lâu, khóm trở nên khô nhăn _ dạng R (Rough), kích thước khóm 2 – 3 mm
- Trên thạch máu Blood Agar (B.A): khuẩn lạc tròn gọn, vồng, trơn láng màu trắng đục ở phần tâm, đường kính khoảng 1 – 2 mm, chủng không dung huyeát (α), chuûng dung huyeát (β)
- Trên môi trường chuẩn đoán chuyên biệt Eozin Methyl Blue (EMB) tạo khóm tròn gọn, vồng trên mặt thạch, có màu tím đen, ánh kim
- Trên môi trường MacConkey (MC), Endo, Shigella _ Salmonella (SS): E coli tạo khóm hồng đỏ
- Trên môi trường canh thịt: phát triển tốt, môi trường rất đục có cặn lắng xuống đáy, màu tro nhạt, canh có mùi phân thối
- Môi trường Kristensen hay môi trường Brillian Green Agar (BGA) E coli có màu xanh lá mạ
- Trên BromoCresol Pulple (BCP): hình thành những khuẩn lạc màu vàng
- Môi trường Wilson Blair: E coli bị ức chế, có khuẩn lạc màu nâu
- Vi khuẩn E coli trên môi trường KIA (TSI) tạo màu vàng / vàng
- Trên các môi trường đường: E coli lên men sinh hơi nhiều loại đường như lactose, glucose, galactose, mannitol Lên men không đều saccarose và khoâng leân men dextrin, glycogen
- Các phản ứng sinh hoá của E coli: Indol dương tính, Methyl Red (phản ứng MR) dương tính, Voges-Prokauer (phản ứng VP) âm tính và Citrat âm tính
- E coli không phân giải ure, không sinh H2S
- Hoàn nguyên nitrat thành nitric
- Phản ứng lysin decacboxylaza dương tính
Bảng 2.2: Môi trường trắc nghiệm sinh hoá và định tên vi khuẩn E coli
Môi trường trắc nghiệm Dung dịch thử Phản ứng âm tính
Idol Kowac’s Không có vòng đỏ
Có vòng đỏ xuất hiện trên bề mặt môi trường
MR Methyl red Môi trường có màu vàng
Simmon Citrate Không dùng Không có sự chuyển màu Xanh dương
2.5 Cấu tạo kháng nguyên và độc tố
E coli có cấu trúc kháng nguyên rất phức tạp, chia làm 4 loại: O, H, K, F
- Là kháng nguyên vách tế bào (phân bố thành tế bào), cấu tạo bởi lipo- polySaccharic-Protein
- Bền với nhiệt (100 0 C / 2 giờ), kháng cồn 50%, bị huỷ bởi formol 5%
- Kháng nguyên O chia làm 4 nhóm lớn: OI, OII, OIII, OIV và có đến 164 loại
- Rất độc (0,05 mg đủ giết chết chuột nhắt sau 24 giờ)
- Thực nghiệm: gây sốt, giảm bạch cầu sau đó tăng bạch cầu, đông máu nội mạch lan toả (DIC), sốt nội độc tố và tử vong
- Là kháng nguyên nang, giúp vi khuẩn bám vào tế bào biểu mô trước khi xâm lấn (cơ quan tiêu hoá, niệu), cấu tạo bởi polysaccharides
- Vi khuẩn có kháng nguyên K tạo khóm dạng S (Smooth) Mất kháng nguyên K, dạng S trở thành dạng R (Rough)
- Keựm chũu nhieọt (heat-labile)
- Chia thành 4 nhóm lớn KA, KB, KL, M có đến trên 100 loại Loại E coli có giáp mô (kháng nguyên K) gây ngộ độc mạnh hơn loại không giáp mô
- Là kháng nguyên chiên mao, cấu tạo là protein
- Không bền với nhiệt (heat-labile), bị huỷ bởi cồn 50% và các proteinase, không bị huỷ bởi formol 5%
- Gồm trên 50 loại, ít gây bệnh
- Đặc thù cho một số loại E coli gây bệnh
- Giúp cho vi khuẩn bám vào niêm mạc ruột và tiết độc tố
Nhìn chung E coli có 2 loại độc tố:
❖ Nội độc tố: gây bệnh tiêu chảy, gồm 2 loại: chịu nhiệt và không chịu nhiệt
❖ Ngoại độc tố: ngoại độc tố làm tan huyết, phù thủng và ngoại độc tố ruột
Khả năng gây bệnh: E coli là loại vi khuẩn có sẵn trong đường ruột động vật và người, bình thường chúng chỉ ký sinh mà không gây bệnh, nhưng có lúc trở nên động lực gây bệnh khi sức đề kháng của người và động vật yếu đi Chúng gây ngộ độc cho người khi cơ thể ăn phải thức ăn bị nhiễm một số lượng lớn vi khuẩn và vi khuẩn này tiết ra độc tố
Cơ chế: vi khuẩn theo thức ăn vào đường ruột Ở ruột chúng tiết ra độc tố, độc tố thấm vào máu gây ngộ độc, thường có biểu hiện tiêu chảy, nặng hơn là viêm dạ dày
Ngoài ra E coli còn gây viêm nhiễm bộ phận niệu sinh dục, viêm màng bụng, nhiễm trùng huyết E coli gây bệnh tiêu chảy ở trẻ em, phân trắng của heo con, bò con, lúc đó vi khuẩn lây lan và có thể gây tử vong
2.7 Phân nhóm và các yếu tố gây bệnh
Dựa vào tính kháng nguyên và tính chất gây bệnh, người ta chia E coli ra làm nhiều nhóm Những nhóm này được sắp xếp dựa vào độc tố của chúng và có thể dựa vào đặc điểm này để nhận dạng Nhóm E coli gây bệnh gồm: Enterotoxigenic E coli (ETEC), Enteropathogenic E coli (EPEC), Enterohemorrhagic E coli
E coli gây bệnh có thể được phân loại thành một số nhóm dựa trên đặc điểm độc lực, bao gồm EHEC (E coli gây hội chứng tan máu tăng urê), EIEC (E coli xâm lấn ruột), EAEC (E coli gắn kết thành cụm), DAEC (E coli bám khuếch tán) Đặc biệt, có 4 nhóm E coli liên quan đến các bệnh phát sinh từ thực phẩm và nước.
Vài đặc điểm và triệu chứng của 4 nhóm sau được xem là điển hình của E coli:
Nhóm sinh độc tố ruột này bao gồm các chủng E coli có lông bám K88 (F4),
K99 (F5), 987P (F6) và một số chủng khác Các chủng E coli này sản sinh độc tố enterotoxin không chịu nhiệt LT (Thermolabile hay heat-labile toxin) và chịu nhiệt ST (Thermostable hay heat-stable toxin) Độc tố ST có thể đề kháng với nước sôi trong 30 phút Hai độc tố này là nguyên nhân gây bệnh tiêu chảy ở heo sơ sinh và heo cai sữa; gây tiêu chảy ở trẻ em, tiêu chảy khi du lịch đến chỗ lạ
Liều gây bệnh ở người lớn được ước lượng tối thiểu là 10 8 vi khuẩn Ngoại trừ thanh niên khoẻ mạnh thì người già và người sức khoẻ yếu có thể nhiễm bệnh ở mức thấp hơn Vì nhóm này có liều gây bệnh cao nên những nghiên cứu về ETEC thường chỉ được thực hiện khi thức ăn nghi nhiễm lượng E coli cao Cũng vậy, nếu ETEC được tìm ra, thì sẽ ước lượng được mối nguy tiềm tàng trong thức ăn ô nhiễm
Bảng 2.3: So sánh một số tính chất đặc trưng của 2 loại độc tố ruột của E coli
Các chủng E coli thuộc nhóm này không sản sinh độc tố ruột enterotoxin và verotoxine, nhưng chúng có thể gây ra viêm ruột và tiêu chảy
Tính chaát Enterotoxin ST Enterotoxin LT
1) Tính chất phân tử 2) Tính bền vững với nhiệt độ
3) Tính kháng nguyên 4) Tính trung hoà kháng thể 5) Thời gian xuất hiện và tồn tại 6) Tác động lên Adenyle Cyclase
7) Tác động lên Guanylate Cyclase
8) Thử nghiệm nuôi cấy trên mô thỏ
9) Thử nghiệm trên mô chuột
Rất nhỏ, peptide Đề kháng 121 0 C trong
Khoâng ( - ) Khoâng ( - ) Nhanh và ngắn
Bị phá hủy bởi nhiệt độ 60 0 C trong 3 phút
Có ( + ) Có ( + ) Chậm và dài
Các chủng E coli này gồm nhiều serotype (các type thường gặp O26 : B6, O44, O55 : B5, O112 : B11, O124, O125 : B15, O142 ) là nguyên nhân chính gây bệnh tiêu chảy cho trẻ em dưới 2 tuổi
Liều gây bệnh của EPEC với sức khoẻ người lớn được ước lượng là 10 6 tế bào
EIEC còn được gọi là E coli xâm lấn Sự gây bệnh của EIEC chủ yếu do khả năng xâm lấn và phá hủy mô tế bào Các chủng E coli này xâm nhập vào tế bào của phần dưới ruột non và đi sâu vào lớp niêm mạc ruột làm tróc niêm mạc, gây loét niêm mạc, do đó gây tiêu chảy có đàm lẫn máu giống Shigella
Mặc dù liều gây bệnh ở Shigella thấp và giới hạn từ 10 đến vài 100 tế bào nhưng liều gây bệnh ở người lớn của EIEC tối thiểu là 10 6 tế bào Chúng đi đến hệ thống lympho, một số E coli bị phân giải tiết ra độc tố Các yếu tố độc lực khác như giáp mô, lông bám, yếu tố cạnh tranh, dung huyết… là những yếu tố quan trọng của E coli xâm lấn đưa đến những khuẩn huyết
CÁC PHƯƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM E COLI TRONG THỰC PHAÅM
3.1 Các phương pháp kiểm tra số lượng vi sinh vật
Có nhiều phương pháp để kiểm tra và định lượng vi sinh vật Trong thực phẩm, hai phương pháp kiểm tra thông dụng nhất đó là: phương pháp MPN (Most Probable Number) và phương pháp xác định số lượng khuẩn lạc trên môi trường thạch chọn lọc
3.1.1 Kĩ thuật đếm số có xác suất lớn nhất MPN (Most Probable Number)
Nguyên tắc: mẫu được pha loãng thành một dãy thập phân (ba nồng độ kế tiếp nhau khác nhau 10 lần); 3 hoặc 5 mẫu có độ pha loãng thập phân liên tiếp được ủ trong ống nghiệm chứa môi trường thích hợp có ống druham Mỗi nồng độ pha loãng được ủ từ 3 đến 5 ống lặp lại Theo dõi sự sinh hơi và đổi màu để định tính sự hiện diện của vi khuẩn trong từng ống thử nghiệm: đây là các ống dương tính Ghi nhận số ống nghiệm cho phản ứng dương tính ở mỗi nồng độ pha loãng và dựa vào bảng MPN để suy ra số lượng nhóm vi sinh vật tương ứng hiện diện trong 1 g (hoặc 1 ml) mẫu ban đầu
Phương pháp này được gọi là phương pháp pha loãng tới hạn, được sử dụng để ước đoán mật độ vi khuẩn sống trong mẫu Trong phương pháp này, mẫu càng được pha loãng để số ống nghiệm cho kết quả dương tính càng ít đi, biểu hiện bởi acid sinh ra ứng với sự xuất hiện sinh trưởng của vi khuẩn Số các độ pha loãng cần chuẩn bị phải dựa trên số lượng tế bào vi khuẩn cần có trong mẫu
Kết quả xét nghiệm tin cậy khi tất cả các ống nghiệm có độ pha loãng thấp nhất đều dương tính, còn tất cả các ống nghiệm có độ pha loãng cao nhất đều âm tính Độ tin cậy của phương pháp cũng tăng lên khi số lượng ống nghiệm được cấy vi khuẩn trong mỗi loạt ống tăng lên.
3.1.2 Kĩ thuật đếm số lượng các khuẩn lạc phát triển trên môi trường thạch chọn lọc
Nguyên tắc: một tế bào có thể phân chia theo cấp số nhân cho đến khi hình thành một khuẩn lạc có thể trông thấy được Đây là cơ sở của việc định lượng tế bào trên thạch đĩa, bởi vì số lượng khuẩn lạc sinh ra từ một thể tích giống vi sinh vật nhất định chỉ số lượng khuẩn lạc đếm được gần như tương đương với số lượng tế bào sống Để định lượng chính xác, cần phải thực hiện sao cho mỗi một khuẩn lạc chỉ được hình thành từ một tế bào Do mẫu thực phẩm thường có nồng độ vi khuẩn cao nên cần thiết phải được pha loãng trước khi cấy (Nguyễn Đức Lượng, Phan Thị Huyền, Nguyễn Aùnh Tuyết, 2003)
Quy trỡnh chung cho kieồm nghieọm vi sinh:
3.2 Các quy trình kiểm tra E coli trong thực phẩm được khảo sát
3.2.1 Quy trình 1: Phương pháp MPN (Most Probable Number)
❖ Tăng sinh chọn lọc: trên môi trường BGBL (Brilliant Green Bile Lactose) Đây là môi trường nuôi cấy thích hợp của nhóm coliforms tổng số Coliforms lên men đường lactose, tạo acid trong môi trường dịch thể BGBL (có ống druham) trong vòng 24 - 48 giờ ở nhiệt độ 37 0 C, làm môi trường đục và sinh hơi
❖ Môi trường chuyên biệt: EC (Enrichment Coli)
Từ môi trường tăng sinh BGBL có vi sinh vật phát triển cấy sang môi trường canh chuyên biệt EC (có ống druham) để 44,5 0 C / 24 giờ EC là môi trường chuyên biệt của E coli E coli lên men đường lactose, sinh acid làm môi trường đục và sinh hơi, trong khi những coliforms khác bị ức chế ở nhiệt độ nuôi cấy 44,5 0 C
❖ Phân lập E coli trên môi trường EMB (Eozin Methyl Blue agar)
Từ môi trường EC dương tính, phân lập E coli trên môi trường EMB Vi khuẩn
E coli tạo khóm màu tím ánh kim
❖ Thử phản ứng sinh hoá:
Chọn các khóm điển hình trên EMB cấy vào các môi trường sinh hoá Từ các kết quả sinh hoá nghiệm đúng E coli kết luận số ống nghiệm môi trường EC có
VSV phát triển ở từng độ pha loãng, lập chỉ số MPN gồm các ống cho kết quả dương tính (E coli phát triển)
❖ Tra chỉ số trên theo bảng MPN của Mac Crady (theo thứ tự giảm dần của nồng độ)
Xác định số lượng vi sinh vật trong 1 ml mẫu nguyên
3.2.2 Quy trình 2: Đếm số lượng các khuẩn lạc phát triển trên môi trường thạch
EMB (Eozin Methyl Blue agar) Đây là một quy trình đơn giản và thông dụng Sử dụng môi trường chuyên biệt cho E coli là EMB Dựa vào đặc điểm nuôi cấy trên EMB để kiểm tra và đếm số lượng E coli có trong mẫu thực phẩm
Các vi khuẩn gram (+) bị ngăn chặn bởi thuốc nhuộm eosin và methylene blue trong môi trường EMB Dựa vào dạng lên men đường latose vi khuẩn E coli tạo những khóm tròn gọn, vồng trên mặt thạch, có màu tím đen, ánh kim
Thử sinh hoá những khuẩn lạc nghi ngờ E coli Từ các kết quả sinh hoá nghiệm đúng E coli tính số lượng E coli có trong 1 g hay 1 ml mẫu thực phẩm
3.2.3 Quy trình 3: Đếm số lượng các khuẩn lạc phát triển trên môi trường thạch
BGBA (Brilliant Green Bile Agar)
❖ Môi trường nuôi cấy: môi trường thạch BGBA (Brilliant Green Bile Agar)
Dựa vào đặc điểm nuôi cấy của E coli trên môi trường BGBA để kiểm tra và đếm số lượng E coli có trong mẫu thực phẩm
Oxgall (muối mật) và brilliant green trong BGBA ngăn chặn sự phát triển của vi khuẩn gram (+) và hầu hết vi khuẩn gram (-) trừ coliforms Sự phân biệt coliforms dựa trên sự lên men lactose Vi khuẩn lên men lactose sản sinh acid và trong sự hiện diện của basic fuchsin sẽ tạo khóm đỏ tía với vòng hồng Vi khuẩn không lên men lactose có dạng màu hồng lợt đến không màu
Vi khuẩn E coli trên BGBA tạo những khóm tròn, màu đỏ tía (tím đậm)
❖ Môi trường chuyên biệt: EC (Enrichment Coli)
Từ số lượng khuẩn lạc nghi ngờ E coli trên BGBA cấy sang môi trường canh chuyên biệt EC (có ống druham) để 44,5 0 C / 24 giờ E coli lên men đường lactose làm môi trường đục và sinh hơi, trong khi những coliforms khác bị ức chế ở nhiệt độ nuôi cấy 44,5 0 C
❖ Thử phản ứng sinh hoá:
Từ môi trường EC dương tính, cấy vào các môi trường sinh hoá
Từ các kết quả sinh hoá nghiệm đúng E coli kết luận số ống nghiệm môi trường EC có vi sinh vật phát triển
❖ Tính số lượng E coli có trong 1 g hay 1 ml mẫu thực phẩm
3.2.4 Quy trình 4: Đếm số lượng các khuẩn lạc phát triển trên môi trường thạch
Rapid’E coli 2 Agar (gọi tắt là môi trường Rapid)
Phương pháp đếm E coli trên môi trường Rapid’E coli 2 Agar đã được Hiệp hội tiêu chuẩn của Pháp AFNOR công nhận theo tiêu chuẩn NF ISO 16649-2 Đây là môi trường nuôi cấy thế hệ mới Phương pháp này cho phép ước lượng E coli ở nhiệt độ 44,50 C (dành cho các sản phẩm thức ăn của người) mà không cần bất cứ sự kiểm tra thêm về tính chất sinh hóa của vi khuẩn.
E coli và coliforms trong thực phẩm và nước
Nguyên lý: dựa trên sự hiện diện đồng thời của 2 tác động enzyme: Bêta-D-Glucuronidase (GLUC) và Bêta-D-Galactosida (GAL) Môi trường Rapid’E coli 2 Agar bao goàm 2 cô chaát chromogenic:
• Một cơ chất đặc trưng với GAL làm xuất hiện những khóm màu xanh, dương tính với enzyme này
• Một cơ chất đặc trưng với GLUC làm xuất hiện những khóm màu hồng, dương tính với enzyme này
Coliforms (GAL + / GLUC - ) có dạng khóm màu từ xanh dương đến xanh lá
E coli (GAL + / GLUC +) có khóm màu từ hồng đến tím
Quá trình sàng lọc dựa trên sự hiện diện của enzyme glucuronida và galactosidase: vi khuẩn E coli có men β- D- glucuronidase (gần 97%) tác động lên cơ chất chromogenic (5-bromo-6-chloro-3-indolyl- β- D- glucuronide) có trong môi trường Sự thủy phân cơ chất chromogen (thành acid glucuroric) tạo nên các khóm.
E coli có màu đỏ tía (purple) Phần lớn coliforms có men β- D- galactosidase, tạo khóm có màu xanh lơ (blue – green)
Dựa vào hình thái, đếm và tính số lượng E coli có trong 1 g (ml) mẫu
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
NGUYÊN LIỆU VÀ CÁCH LẤY MẪU
1.1 Nguyên liệu và chỉ tiêu E coli
Với mục đích so sánh hiệu quả kiểm tra vi khuẩn E coli giữa 4 quy trình kiểm tra E coli trong thực phẩm, nguyên liệu được chọn kiểm nghiệm là nhóm thực phẩm đường phố với nguy cơ nhiễm E coli khá cao
Tổng số lượng mẫu kiểm tra là 78 mẫu được thu mua tại địa bàn Quận Thủ Đức bao gồm cả dạng thực phẩm đặc và dạng thực phẩm lỏng
1.1.2 Quy định chỉ tiêu E coli trong mẫu thực phẩm
❖ Trà đá: 3 vk / ml (Tiêu chuẩn vi sinh theo Quy Định 867/198/QĐ BYT của nước giải khát chưa thanh trùng - tính theo phương pháp MPN)
❖ Nước mía: 3 vk / ml (Tiêu chuẩn vi sinh theo Quy Định 867/198/QĐ BYT của nước giải khát chưa thanh trùng - tính theo phương pháp MPN)
❖ Pate: 30 vk / g thực phẩm.(Theo quy định TCVN 7049 2002)
❖ Thịt tươi: 2 mẫu / 5 mẫu kiểm tra có dưới 100 vk / g (Theo tiêu chuẩn Quy Định Bộ Công Nghiệp Thực Phẩm)
1.2 Nguyeân taéc chung khi laáy maãu
Lấy mẫu là công tác đầu tiên của kiểm tra
Mẫu thực phẩm phải được đựng trong các bao bì của nó, hoặc dụng cụ lấy mẫu, chứa mẫu phải vô khuẩn
Mẫu được lấy một cách ngẫu nhiên, đồng đều và đại diện cho mẫu tại nơi khảo sát
Tuỳ theo loại thực phẩm cần xác định mà ta lấy mẫu để nghiên cứu với số lượng và khối lượng khác nhau cho phù hợp Thông thường khối lượng mỗi lần lấy mẫu là 100 - 250 gram với thực phẩm đặc và khoảng 300 ml đối với mẫu thực phẩm lỏng
Mẫu sau khi thu phải được phân tích ngay khi có thể Trường hợp không phân tích ngay thì mẫu phải được bảo quản trong tủ lạnh với nhiệt độ thích hợp và không được quá 36 giờ.
PHƯƠNG PHÁP KIỂM TRA
Trước khi tiến hành kiểm tra mẫu thực phẩm, việc pha loãng mẫu là khâu quan trọng Quá trình pha loãng được tiến hành trong phòng vô trùng để bảo đảm vệ sinh và độ chính xác của mẫu Các dụng cụ sử dụng trong quá trình pha loãng như thìa, dao, cối, chày, bercher đều phải được vô trùng để tránh làm ảnh hưởng đến kết quả kiểm tra.
Dùng pipet vô trùng hút 25 ml (đối với mẫu thực phẩm lỏng) hay cân chính xác 25 g mẫu cho vào bình có chứa sẵn 225 ml nước muối sinh lý (đã hấp vô trùng ở 121 0 C / 15 phút, để nguội) và lắc đều trong vòng 30 phút Ta được mẫu pha loãng ứng với nồng độ 10 -1
Tiếp tục hút 1 ml dung dịch từ mẫu pha loãng nồng độ 10 -1 pha vào 9 ml nước muối sinh lý vô trùng, trộn đều Ta được mẫu pha loãng nồng độ 10 -2 Tiếp tục pha loãng mẫu đến các nồng độ 10 -3 , 10 -4 , … 10 -n cho tới khi ước đoán có lượng vi khuẩn phù hợp để đếm (tùy mức độ vệ sinh của thực phẩm)
Chú ý: tất cả các thao tác tiến hành pha loãng mẫu đều được thực hiện trong ủieàu kieọn voõ truứng
2.2 Tiến hành thí nghiệm kiểm tra E coli
2.2.1 Quy trình 1: Phương pháp MPN (Most Probable Number)
2.2.1.1 Môi trường và hoá chất
Môi trường dịch thể Brilliant Green Bile Lactose (BGBL) Môi trường Enrichment Coli (EC)
Môi trường thạch Eosin-Methylene Blue (EMB) Môi trường thạch nghiêng Nutrient Agar (NA) Môi trường thạch bán nghiêng Kligler Iron Agar (KIA) Môi trường Nutrient Broth (NB)
Môi trường Clark Lub (hay MR-VP) Môi trường Simmons Citrate
Thuốc thử Kowac’s Thuốc thử Voges-Prokauer Chaỏt chổ thũ Methyl red Thuốc nhuộm Gram
2.2.1.2 Tiến hành Pha loãng mẫu ở 3 nồng độ liên tiếp thích hợp
Mỗi nồng độ pha loãng cấy vào 3 ống chứa môi trường BGBL có ống druham, mỗi ống cấy 1 ml mẫu Ủ 37 0 C trong 24 – 48 giờ trong tủ ấm, quan sát sự chuyển màu hoặc sinh hơi làm đục môi trường
Chọn những ống BGBL dương tính: môi trường đục và ống druham có bọt khí cấy sang môi trường EC (có ống druham) Mỗi ống cấy vào 0,1 ml, để vào tủ ấm nhiệt độ 44,5 0 C / 24 giờ
Dùng que cấy vô trùng để lấy một vòng canh khuẩn từ các ống môi trường EC dương tính (xuất hiện đục, bọt khí), tiến hành cấy phân lập lên môi trường thạch đĩa EMB, sau đó để tủ ấm ở nhiệt độ 37 độ C trong vòng 24 giờ.
Chọn những khuẩn lạc có màu tím ánh kim, tròn, bờ đều, mặt phẳng hoặc hơi lồi cấy sang môi trường NA (thạch nghiêng), ủ 37 0 C / 24 giờ
Từ môi trường NA, lấy vi khuẩn cấy vào môi trường KIA (37 0 C / 24 giờ) Đồng thời nhuộm gram quan sát hình dạng và cấy trên các môi trường sinh hóa thử IMVIC
Vikhuẩn E coli cho kết quả:
• Hình dạng : bắt màu gram (-) (màu hồng), dạng trực nhỏ
Từ các kết quả sinh hoá nghiệm đúng E coli kết luận số ống nghiệm môi trường EC có vi sinh vật phát triển ở từng độ pha loãng, lập chỉ số MPN gồm các ống cho kết quả dương tính (E coli phát triển)
2.2.1.3 Kết quả Tra chỉ số trên theo bảng MPN của Mac Crady (theo thứ tự giảm dần của nồng độ)
Nhân chỉ số MPN với tỷ lệ nghịch của độ pha loãng thấp nhất được chọn (nghĩa là nồng độ mẫu thử cao nhất) cho ra số có xác suất lớn nhất (MPN) của E coli có trong 1 ml hoặc trong 1 gram thực phẩm
Nếu như chỉ số MPN nhỏ hơn 0,3 E coli giả định trong 1 ml (1 g) sản phẩm thì kết quả được biểu thị như sau: “không có E coli giả định trong 1 ml hoặc 1 g sản phẩm” (Tiêu Chuẩn Việt Nam - TCVN 6505 -1 :1999 và ISO 11866 -1 : 1997)
2.2.1.4 Sơ đồ kiểm nghiệm E coli theo phương pháp tới hạn MPN
2.2.2 Quy trình 2: Đếm số lượng các khuẩn lạc phát triển trên môi trường thạch
EMB (Eozin Methyl Blue agar)
2.2.2.1 Môi trường và hoá chất Môi trường thạch Eosin-Methylene Blue (EMB) Môi trường thạch nghiêng Nutrient Agar (NA) Môi trường thạch bán nghiêng Kligler Iron Agar (KIA) Môi trường Nutrient Broth (NB)
Môi trường Clark Lub (hay MR-VP) Môi trường Simmons Citrate
Thuốc thử Kowac’s Thuốc thử Voges-Prokauer Chaỏt chổ thũ Methyl red Thuốc nhuộm Gram
2.2.2.2 Tiến hành Pha loãng mẫu thực phẩm ở nồng độ thích hợp
Pha loãng mẫu cần cấy với nồng độ thích hợp Sử dụng pipet đã tiệt trùng để đưa 1 ml mẫu vào đĩa Petri Tiếp theo, đổ khoảng 15 ml môi trường thạch EMB (Eozin Methylene Blue) đã được làm nguội khoảng 50 độ C vào đĩa Xoay nhẹ đĩa theo chiều kim đồng hồ và ngược lại để đảm bảo mẫu cấy được phân bố đều trên đĩa.
Sau khi hỗn hợp đặc hoàn toàn, phủ lên bề mặt một lớp từ 6 ml đến 10 ml môi trường EMB đã được chuẩn bị và làm nguội như trên, để tránh vi khuẩn mọc lan và có được điều kiện bán yếm khí Nuôi cấy trong tủ ấm 37 0 C / 24 giờ
Trên EMB chọn những khuẩn lạc nghi ngờ E coli có màu tím ánh kim, tròn, bờ đều, mặt phẳng hoặc hơi lồi cấy sang môi trường NA (thạch nghiêng) ủ 37 0 C / 24 giờ Nếu số lượng khuẩn lạc nghi ngờ E coli nhiều thì lấy tỉ lệ số khóm để cấy vào NA
Từ môi trường NA, lấy vi khuẩn cấy vào môi trường KIA (37 0 C / 24 giờ) Đồng thời nhuộm gram quan sát hình dạng và cấy trên các môi trường sinh hóa thử IMVIC
Vi khuẩn E coli cho kết quả:
• Hình dạng : bắt màu gram (-) (màu hồng), dạng trực nhỏ
Từ các kết quả sinh hoá nghiệm đúng E coli suy ra số lượng khuẩn lạc trên đĩa thạch EMB
Tính số lượng E coli có trong 1 g hay 1 ml mẫu thực phẩm theo công thức:
• n – số khuẩn lạc trong một đĩa petri ở một độ pha loãng nhất định
• v – thể tích dịch mẫu đem cấy (bằng 0,1 ml đối với phương pháp cấy gạt và 1 ml đối với phương pháp đổ đĩa)
MỘT SỐ HÌNH ẢNH TRONG QUÁ TRÌNH LÀM LUẬN VĂN
Hình 3.1: Coliforms trong môi trường BGBL
Hình 3.2: E coli trong môi trường EC
Hình 3.3: E coli trên môi trường EMB (cấy ria)
Hình 3.4: E coli và coliforms trên môi trường EMB (đổ đĩa)
Hình 3.5: E coli và coliforms trên môi trường BGBA
Hình 3.6: Coliforms trên môi trường Rapid’E coli 2 Agar
Hình 3.7: E coli trên môi trường Rapid’E coli 2 Agar
Hình 3.9: Môi trường tổng hợp Rapid’E coli 2 Agar
Hình 3.9: Xác định E coli bằng phản ứng IMVIC và KIA
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
