cndt2 phạm thị mỹ hạnh 21126054 thứ 2 789

Mục tiêu môn học Kiểm tra và xác định cây trồng GMO thông qua các kỹ thuật sinh học phân tử.. Sinh vật biến đổi gen GMO Sinh vật biến đổi gen Genetically Modified Organism – GMO là những

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO THỰC HÀNH

CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN II

Ngành học Chuyên ngành Sinh viên thực hiện MSSV

Nhóm lớp

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC : CÔNG NGHỆ SINH HỌC : PHẠM THỊ MỸ HẠNH : 21126054

: Sáng thứ 3 tiết 789

TP Thủ Đức, 06/2024

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO THỰC HÀNH

CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN II

Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiện

TP Thủ Đức, 06/2024

i

MỤC LỤC

Trang

MỤC LỤC i

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT iii

DANH SÁCH ĐƠN VỊ ĐO LƯỜNG iv

DANH SÁCH CÁC BẢNG v

DANH SÁCH CÁC HÌNH vi

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu môn học 1

1.3 Nội dung thực hiện 1

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

2.1 Sinh vật biến đổi gen (GMO) 2

2.2 Xác định cây trồng GMO thông qua phương pháp xác định sự có mặt của gen ngoại lai 2

2.3 Kỹ thuật ly trích DNA 2

2.4 Kỹ thuật điện di 2

2.5 Kỹ thuật đo mật độ quang 2

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 5

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 5

3.2 Vật liệu 5

3.2.1 Đối tượng kiểm tra 5

3.2.2 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất 5

3.3 Phương pháp 5

3.3.1 Ly trích DNA 5

3.3.1.Khuếch đại sản phẩm PCR và điện di kiểm tra sự có mặt của promoter 35S 6

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 7

ii

4.1 Kết quả 7

4.1.1 Kiểm tra chất lượng DNA ly trích 7

4.1.2 Điện di kiểm tra sự có mặt của promoter 35S 7

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 9

5.1 Kết luận 9

5.2 Kiến nghị 9

TÀI LIỆU THAM KHẢO 10

iii

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

iv

DANH SÁCH ĐƠN VỊ ĐO LƯỜNG

v

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Hình 3.1 Thành phần của phản ứng PCR 5 Hình 3.2 Chu trình nhiệt của phản ứng 5

vi

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 3.1 Quá trình ly trích DNA 6

Hình 4.1 Kết quả chạy điện di DNA sau khi ly trích 7

Hình 4.2 Kết quả đo mật độ DNA trong mẫu ly trích 7

Hình 4.3 Kết quả chạy điện di kiểm tra sự hiện diện của promoter 35S 8

1

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Trong những thập niên gần đây, các loại cây trồng GMO được thương mại hóa ngày càng tăng Tính riêng 2014, cây trồng GMO được trồng tại 28 nước với tổng diện tích khoảng 181,5 triệu ha với tỉ lệ tăng trưởng hằng năm khoảng 3-4% Trong đó, Mỹ

là quốc gia đứng đầu về diện tích cây GMO Tuy nhiên, cây trồng này vẫn còn vấp phải nhiều tranh cãi về các tác động tới môi trường Chính vì vậy, hiện nay, ngô biến đổi gen

là cây trồng duy nhất được cấp phép trồng tại Việt Nam Trong năm 2005, “Quy chế quản lý an toàn sinh học đối với các sinh vật biến đổi gen; sản phẩm, hàng hóa có nguồn gốc từ sinh vật biến đổi gen” đã được Thủ tướng Chính phủ ban hành, Quyết định 212/2005/QĐ-TTg, và Quyết định số 79/2007/QĐ-TTg về việc phê duyệt “Kế hoạch hành động quốc gia về Đa dạng sinh học đến năm 2010 và định hướng đến năm 2020 thực hiện Công ước sinh học và Nghị định thư Cartagena về An toàn sinh học” Xác định GMO và nguồn gốc GMO là việc làm cần thiết nhằm đảm bảo tính minh bạch về chất lượng sản phẩm nông sản trong tiêu thụ và chế biến thực phẩm

1.2 Mục tiêu môn học

Kiểm tra và xác định cây trồng GMO thông qua các kỹ thuật sinh học phân tử

1.3 Nội dung thực hiện

Nội dung 1: Ly trích DNA và kiểm tra chất lượng DNA

Nội dung 2: Điện di kiểm tra sự có mặt của promoter 35S

2

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Sinh vật biến đổi gen (GMO)

Sinh vật biến đổi gen (Genetically Modified Organism – GMO) là những cây trồng, động vật hay vi sinh vật có bộ gen được chỉnh sửa Con người đã sử dụng kĩ thuật di truyền để thay đổi gen của sinh vật nhằm tạo ra những đặc tính mới hoặc cải thiện những đặc tính vốn có Hiện nay, sinh vật biến đổi gen được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như nông nghiệp, công nghiệp, dược phẩm, môi trường và thực phẩm

Qui trình tạo sinh vật biến đổi gen có các bước cơ bản bao gồm:

Xác định đặc điểm mong muốn: người ta thường sàng lọc những sinh vật tự nhiên mang các đặc điểm có thể làm tăng giá trị cho sản phẩm

Phân lập đặc điểm di truyền mong muốn: bằng cách so sánh bộ gen giữa các sinh vật, người ta xác định được gen qui định đặc điểm đó Trường hợp không có dữ liệu so sánh, các nhà nghiên cứu sẽ xóa bỏ dần các gen cho đến khi đặc điểm mong muốn mất

đi, từ đó họ xác định ra gen mục tiêu

Chèn đặc điểm di truyền mong muốn vào bộ gen mới: người ta thường sử dụng súng bắn gen, vi khuẩn, virus, vi tiêm hoặc xung điện nhằm chuyển gen mục tiêu vào trong bộ gen sinh vật đích

Kiểm tra và nuôi sinh vật biến đổi gen: sau khi chuyển gen, các nhà khoa học cần kiểm tra và xác nhận gen mong muốn đã vào đúng vị trí Cuối cùng, họ trồng hoặc nuôi sinh vật biến đổi gen trong điều kiện được kiểm soát nhằm đảm bảo chúng phát triển và sinh sản bình thường

2.2 Xác định cây trồng GMO thông qua phương pháp xác định sự có mặt của gen ngoại lai

Promoter là một thành phần quan trọng trong cấu trúc của tất cả các gen và đóng vai trò trong hoạt động của gen Trong công nghệ chuyển gen thực vật, các promoter được sử dụng rất rộng rãi để điều khiển các gen ngoại lai trong cây trồng biến đổi gen nói riêng và thực vật nói chung Trong đó, promoter 35S và terminator NOS là hai cấu trúc thường được sử dụng phổ biến nhất (Lê Thị Thu Hiền và ctv, 2007) Vì vậy, phát hiện cây trồng biến đổi gen bằng kỹ thuật MultiplexPCR là dựa vào các cặp mồi đặc hiệu cho vùng promoter và terminator Kết quả điện di sản phẩm PCR sẽ giúp xác nhận

3

nguồn gốc của vật liệu đánh giá (mẫu phân tích) Một phương pháp khác, Realtime – PCR, sẽ cho phép định lượng chính xác hàm lượng vật liệu biến đổi gen (Bonfini L và ctv, 2001)

2.3 Kỹ thuật ly trích DNA

Ly trích DNA là một quá trình quan trọng trong nghiên cứu di truyền và công nghệ sinh học Nó cho phép chúng ta thu được DNA từ các mẫu sinh học khác nhau, bao gồm việc lấy DNA từ tế bào, mô, máu, thức ăn, hoặc các mẫu khác

Ly trích DNA bằng Phenol/Chloroform: Phương pháp này sử dụng phenol và chloroform để tách DNA khỏi các thành phần khác trong mẫu Sau khi phá vỡ tế bào, DNA được phân cực vào một dung môi hữu cơ (phenol/chloroform) và nước Sau đó, DNA được tách ra khỏi nước bằng cách sử dụng ethanol để kết tủa

2.4 Kỹ thuật đo mật độ quang

Dựa vào mức hấp thụ ánh sáng của các phân tử vật chất trong môi trường lỏng người ta có thể tính được nồng độ của chúng Mỗi phân tử có một đỉnh hấp thụ (nơi chúng hấp thụ ánh sáng mạnh nhất) ở một độ dài sóng nhất định tùy thuộc vào cấu trúc của chúng Sự hấp thụ này là do sự tương tác giữa các proton với các electron của vòng purin và pyrimidin Đỉnh hấp thụ của nucleic acid là 260 nm trong vùng tử ngoại Sự hấp thụ được tính bằng giá trị OD (Optical Density) Một đơn vị OD ở bước sóng 260nm tương ứng với:

- 50 μg/mL DNA sợi đôi

- 40 μg/mL DNA sợi đơn hay RNA

- 20 μg/mL oligonucleotide sợi đơn

Từ giá trị OD đo được, ta suy ra được nồng độ acid nucleic trong dung dịch Dung dịch acid nucleic được xem là sạch khi tỉ lệ OD260/OD280 nằm trong khoảng 1,8-2,0 Nếu mẫu nhiễm protein hay phenol tỉ lệ này sẽ thấp hơn; sự hiện diện của guanidine sẽ làm tăng giá trị OD260

2.5 Kỹ thuật điện di

Quá trình điện di sử dụng gel agarose hay polyacrylamide thường được dùng để phân tích nucleic acid dựa vào kích thước Kỹ thuật điện di có thể được sử dụng trong phân tích hay phối hợp với các kỹ thuật khác, có thể định tính và định lượng Những đoạn DNA lớn như là nhiễm sắc thể có thể được phân tách bằng kỹ thuật điện di cải biến

4

pulsed field gel electrophoresis (PFGE), sử dụng sự thay đổi chiều di chuyển của DNA

Kỹ thuật điện di đơn giản nhất và được sử dụng rộng rãi nhất là kỹ thuật điện di theo phương ngang

Để quan sát DNA, cần phải nhuộm phân tử này Ethidium bromide (EtBr) đã từng

là chất nhuộm DNA phổ biến Phân tử EtBr chèn vào giữa các cặp base đối diện nhau trên phân tử DNA và tạo huỳnh quang cam/đỏ khi được chiếu tia UV (~ 300 nm) Các chất nhuộm thay thế khác với độ nhạy tương đương và ít nguy nguy hiểm hơn, đó là SYBRGreen, GelRed hay Gelstar

Gel agarose có thể được sử dụng để phân tách các phân tử lớn hơn khoảng 100

bp Agarose là một dạng polymer có thể được đun hòa tan, đổ khuôn và tạo thành nhiều miếng gel với kích thước khác nhau (thường là minigel có chiều dài 10 cm) Các giếng (well) được định hình bằng lược gel (comb) sau khi đổ gel vào khuôn Miếng gel được đặt ngập chìm trong dung dịch điện di và DNA được thêm vào các giếng Dòng điện đi qua bồn điện di, theo chiều dài gel làm các phân tử DNA tích điện âm di chuyển về phía cực dương.Agarose gel là một ma trận gồm các lỗ và các phân tử DNA có kích thước nhỏ sẽ di chuyển qua dễ dàng hơn các phân tử DNA có kích thước lớn hơn Với yêu cầu

độ phân giải cao hơn hay việc tách chiết các phân tử DNA ngắn hơn nên sử dụng gel polyacrylamide

5

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thời gian thực hiện nghiên cứu từ ngày 01/06/2024 đến ngày 03/06/2024

Địa điểm được thực hiện tại phòng thí nghiệm RIBE 101 Tòa A2 Viện nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh

3.2 Vật liệu

3.2.1 Đối tượng kiểm tra

Mẫu 3 (đậu nành)

3.2.2 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất

Bảng 3.1 Thành phần của phản ứng PCR

Bảng 3.2 Chu trình nhiệt của phản ứng

3.3 Phương pháp

3.3.1 Ly trích DNA

Bước 1: cho vào tube có chứa bột đã nghiền 400 μl dung dịch SDS Nghiền đều bột trong dung dịch và tiếp tục bổ sung 200 μl SDS vào tube

6

Bước 2: Thêm 600 μl dung dịch Phenol/CHCl3/Isoamyl và ly tâm 10000 vòng trong 5 phút

Bước 3: Hút 500 μl dịch nổi vào tube mới Thêm 500 μl dung dịch CI và ly tâm Bước 4: Hút 300 μl dịch nổi vào tube mới Thêm 180 μl dung dịch iso propanol Đảo nhẹ hỗn hợp và ủ lạnh ở -20oC trong 30 phút

Bước 5: Đổ bỏ phần dung dịch và rửa 2 lần với dung dịch Ethanol 70o (500 μl/lần) Bảo quản mẫu DNA đã ly trích trong 50 μl TE ở -20oC

3.3.1.Khuếch đại sản phẩm PCR và điện di kiểm tra sự có mặt của promoter 35S

Bước 1: Cho lần lượt các thành phần ở bảng 3.1 vào tube

Bước 2 : Mix đều mẫu và cho vào máy PCR và chạy theo chương trình ở bảng 3.2 Bước 3 : 5 μl mẫu DNA được mix đều với 10 μl hỗn hợp loadingdye và gelred và bơm vào giếng Tiến hành điện di ở 100V trong 35 phút

Hình 3.1 Quá trình ly trích DNA

A Mẫu được nghiền trong 600 μl dung dịch SDS, B Mẫu ly tâm sau

khi bổ sung 600 μl dung dịch SDS, C Dịch nổi thu được, D Mẫu ly tâm

sau khi bổ sung 500 μl dung dịch Phenol/CHCl 3 /Isoamyl, E Mẫu ly tâm

sau khi ủ lạnh

7

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Kết quả

4.1.1 Kiểm tra chất lượng DNA ly trích

Kết quả sau khi đo hàm lượng và điện DNA cho thấy mẫu DNA sau khi ly trích đã tinh sạch tuy nhiên lại có hàm lượng thấp và band mờ khi điện di Nguyên nhân gây ra

là do thao tác trong quá trình thực hiện còn chưa tốt, DNA có thể bị thất thoát khi rửa với ethanol 70o

Hình 4.1 Kết quả chạy điện di DNA sau khi ly trích

Hình 4.2 Kết quả đo mật độ DNA trong mẫu ly trích

4.1.2 Điện di kiểm tra sự có mặt của promoter 35S

Sau khi điện di thu được band ở vị trí khoảng 200bp Chứng tỏ mẫu có chứa promoter 35S Tuy nhiên band rất mờ, một số nguyên nhân có thể dẫn đến điều này là

do trong quá trình mix mẫu không đều dẫn đến lượng DNA trong dịch hút không đủ, hoặc trong quá trình bơm mẫu vào giếng không đủ

8

Hình 4.3 Kết quả chạy điện di kiểm tra sự hiện diện của promoter 35S

9

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

5.1 Kết luận

Mẫu 3 (đậu nành) được xác định là cây trồng GMO

5.2 Kiến nghị

Cần thực hiện lại các thí nghiệm để kết quả chính xác nhận, nâng cao kỹ năng thao tác với các kỹ thuật

10

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu tiếng Việt

1 Sinh vật biến đổi gen (GMO) https://ihope.vn/sinh-vat-bien-doi-gen gmo/

2 Lê Thị Thu Hiền, Trần Thị Phương Liên, Nông Văn Hải, 2007 Promoter và ứng dụng trong công nghệ gen thực vật Tạp chí Công nghệ sinh học 5:1-18

Tài liệu tiếng anh

3 Bonfini L., Heinze P., Kay S., Van den Eede G., 2001 Review of GMO detection and quantification techniques European Commision, Joint Research Centre, Institute for Health and Consumer Protection, Food Products and Consumer Goods Unit, I-21020, Ispra, Italy, version: final version

4 Tổng quan phương pháp ly trích và đo nồng độ DNA https://vinmecdr.com/tong-quan-phuong-phap-ly-trich-va-do-nong-do-dna/