phạm thị mỹ hạnh 21126054

Trang 1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC BÁO CÁO THỰC HÀNH PHÁT TRIỂN SẢN PHẨM SINH HỌC QUY TRÌNH SẢN XUẤT NẤM ĐỐI KHÁNG Tricho

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO THỰC HÀNH

PHÁT TRIỂN SẢN PHẨM SINH HỌC

QUY TRÌNH SẢN XUẤT NẤM ĐỐI KHÁNG Trichoderma

TP Thủ Đức, 03/2023

Hướng dẫn khoa học

ThS TRẦN THỊ VÂN

Sinh viên thực hiện

PHẠM THỊ MỸ HẠNH MSSV: 21126054

MỤC LỤC

MỤC LỤC 1

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT 3

DANH SÁCH CÁC BẢNG 4

DANH SÁCH CÁC HÌNH 5

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU 6

1.1 Đặt vấn đề 6

1.2 Mục tiêu môn học 6

1.3 Nội dung thực hiện 6

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 7

2.1 Tổng quan về nấm Trichoderma 7

2.1.1 Giới thiệu về Trichoderma 7

2.1.2 Đặc điểm hình thái và sinh học Trichoderma 8

2.2 Tổng quan về vi khuẩn Bacilus thuringiensis 9

2.2.1 Giới thiệu chung về Bacilus thuringiensis 9

2.2.2 Đặc điểm hình thái và sinh học của Bacilus thuringiensis 9

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 10

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 10

3.2 Vật liệu nghiên cứu và thiết bị 10

3.2.1 Vật liệu nghiên cứu 10

3.2.2 Dụng cụ 10

3.2.3 Môi trường sử dụng 10

3.2.3.1 Ống pha loãng 10

3.2.3.2 Môi trường PCA 10

3.2.3.3 Môi trường nuôi cấy nấm Trichoderma 10

3.3 Phương pháp nghiên cứu 11

3.3.1 Nội dung 1: Quy trình sản xuất chế phẩm sinh học từ nấm đối kháng Trichoderma spp 11

3.3.1.1 Mô tả thí nghiệm 11

3.3.2 Nội dung 2: Kiểm tra mật số vi khuẩn Bacillus Thuringiensis trong chế phẩm sinh học 13

3.3.2.1 Mô tả thí nghiệm 13

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 14

4.1 Kết quả và thảo luận 14

4.1.1 Nuôi cấy nấm đối kháng Trichoderma 14

4.1.2 Kiểm tra mật số vi khuẩn trong chế phẩm sinh học 14

TÀI LIỆU THAM KHẢO 17

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Ctv: Cộng tác viên

PCA: Plate Count Agar

Bt: Bacillus thuringiensis

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Môi trường nuôi cấy nấm Trichoderma 10

Bảng 4.1 Mật độ khuẩn lạc trên các đĩa ứng với các độ pha loãng -4, -5,-6 15

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1 Trichoderma quan sát dưới kính hiển vi 7

Hình 2.2 Hình thái Trichoderma trên đĩa thạch 8

Hình 2.3 Hình dạng Bt dưới kính hiển vi 9

Hình 3.1 Quá trình trộn đều môi trường 11

Hình 3.2 Quá trình chia đều môi trường, đậy kín và hấp khử trùng 12

Hình 3.3 Cấy giống vào môi trường đã chuẩn bị 12

Hình 3.4 Chuẩn bị dụng cụ và thao tác 13

Hình 4.1 Nấm Trichoderma sau 7 ngày nuôi 14

Hình 4.2 Mật độ vi khuẩn 15

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Nấm Trichoderma spp đã được biết đến nhờ khả năng hoạt động như tác nhân

kiểm soát sinh học chống lại mầm bệnh thực vật Những công trình nghiên cứu gần đây

chứng minh tác dụng của Trichoderma spp đối với cây trồng, bao gồm khả năng kháng bệnh toàn thân và cục bộ Đồng thời, Trichoderma spp cũng đã bắt đầu được sử dụng

với số lượng khá lớn trong nông nghiệp trồng trọt, nhằm kiểm soát dịch bệnh và tăng năng suất (Harman GE,2006)

Tại hội nghị “Phát triển sản xuất và sử dụng thuốc bảo vệ thực vật sinh học”, cục trưởng Cục Bảo vệ thực vật Huỳnh Tấn Đạt cho biết “cả nước hiện có 99 cơ sở sản xuất thuốc bảo vệ thực vật đủ điều kiện sản xuất; trong đó có 85 cơ sở có sản xuất thuốc bảo

vệ thực vật sinh học” Tính đến năm 2021, 21 sản phẩm có chứa các chủng Trichoderma

spp nằm trong danh mục thuốc Bảo vệ thực vật được phép sử dụng tại Việt Nam

1.2 Mục tiêu môn học

Môn học hướng đến tìm hiểu quy trình tạo chế phẩm sinh học từ nấm đối kháng

Trichoderma spp và kiểm tra mật số vi khuẩn/ nấm trong chế phẩm sinh học

1.3 Nội dung thực hiện

Nội dung 1: Quy trình sản xuất chế phẩm sinh học từ nấm đối kháng Trichoderma

spp

Nội dung 2: Kiểm tra mật số vi khuẩn Bacillus thuringiensis trong chế phẩm sinh

học

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tổng quan về nấm Trichoderma

2.1.1 Giới thiệu về Trichoderma

Trichoderma được mô tả đầu tiên vào năm 1794 (Persoon, 1794) Tính đến năm

2006, chi nấm này đã có hơn 100 loại được xác định về mặt phát sinh loài (Druzhinina

và ctv, 2006)

Giới (regnum): Fungi

Ngành (phylum): Ascomycota

Lớp (class): Sordariomycetes

Bộ (order): Hypocreales

Họ (family): Hypocreaceae

Chi (genus): Trichoderma Hình 2.1 Trichoderma quan sát dưới kính hiển vi

(Gohel và ctv, 2022)

Trichoderma là một loại nấm thuộc họ Hypocreaceae được tìm thấy trong tất cả

các loại đất (Chen và ctv, 2021) Phần lớn các loài Trichoderma được nghiên cứu cư trú

trên bề mặt rễ hoặc sống dưới dạng nội sinh trong mô rễ; tuy nhiên, một số loài có thể được phân lập từ các bộ phận trên không của thực vật (Ruano-Rosa và ctv, 2016;

Samolski và ctv, 2012; Tseng và ctv, 2020) Các chủng Trichoderma ban đầu có màu

trắng và bông, sau đó phát triển thành các chùm nhỏ gọn màu xanh lục vàng đến xanh đậm, đặc biệt ở trung tâm điểm phát triển

Các loài Trichoderma có thể thúc đẩy sự phát triển của vật chủ đồng thời bảo vệ

chúng khỏi các cuộc tấn công của mầm bệnh (Tseng và ctv, 2020) Ngoài ra, các loài Trichoderma khác nhau có thể cải thiện sự tăng trưởng và phát triển của rễ, mang lại khả năng chống chịu stress phi sinh học, đồng thời cải thiện hiệu quả sử dụng và hấp thu các chất dinh dưỡng vi lượng và đa lượng, dẫn đến tăng năng suất cây trồng (Mehetre

và Mukherjee, 2015) 2019) Do đó, những loài này có thể tạo ra mối quan hệ nội sinh tương hỗ với một số loài thực vật

2.1.2 Đặc điểm hình thái và sinh học Trichoderma

Đặc điểm hình thái chung của nấm Trichoderma là sợi nấm không màu, có vách

ngăn, có khả năng phân nhánh nhiều, cành bào tử không màu, bào tử rất nhiều, đính ở

đỉnh của cành bào tử Bào tử định của Trichoderma là một khối tròn mọc lên ở đầu cuối

của cuống sinh bào tử (phân nhiều nhánh), mang các bào tử trần bên trong không có vách ngăn, không màu, liên kết nhau thành chùm nhỏ nhờ chất nhầy Bào tử thường có màu xanh, đơn bào, hình trứng, tròn, elip, hoặc oval tùy theo từng loài Cuống bào tử là một nhóm sợi nấm bện vào nhau, có kích thước từ 1 – 7µm, có hình đệm rất rắn chắc (Trinh, 2014)

Trên cùng một môi trường nuôi cấy, mỗi loài Trichoderma có hình dạng khuẩn lạc

khác nhau Đây là một trong những đặc điểm để nhận dạng và phân biệt Khuẩn lạc

Trichoderma phát triển rất nhanh và thành thục trong vòng 5 – 7 ngày Trên môi trường

PDA khi ủ ở nhiệt độ ở 25oC, khuẩn lạc nắm Trichoderma lúc đầu có màu trắng, sau

chuyển sang màu xanh đậm hoặc xanh vàng khi có bảo từ xuất hiện Đặc điểm nổi bật

của nấm Trichoderma là bào tử có màu xanh đặc trưng, một số ít có màu trắng , vàng hay xanh xám Ở một số loài Trichoderma còn có khả năng tiết ra một số chất làm thạch (môi trường PDA) có màu vàng Một số loài Trichoderma còn tạo mùi đặc trưng như

Trichoderma viride tạo mùi dừa (Trinh, 2014)

Hầu hết các loài Trichoderma không có giai đoạn sinh sản hữu tính Phương thức

sinh sản vô tính được di truyền cho thế hệ sau bằng nhiều cách như: sự tiếp hợp, đột biến, hay sự sai biệt trong quá trình phân chia tế bào (Trinh, 2014)

Hình 2.2 Hình thái Trichoderma trên đĩa thạch

(Gohel và ctv, 2022)

2.2 Tổng quan về vi khuẩn Bacilus thuringiensis

2.2.1 Giới thiệu chung về Bacilus thuringiensis

Bacilus thuringiensis được biết đến lần đầu tiên với tên Bacillus sotto vào năm

1901 với một nhà khoa học người Nhật Bản tên là Shigetane Ishiawata Sau đó vào năm

1911, nhà khoa học người Đức Ernst Berliner đã đặt tên cho chủng vi khuẩn này là

Bacilus thuringiensis

2.2.2 Đặc điểm hình thái và sinh học của Bacilus thuringiensis

Bt là vi khuẩn đất, tế bào có dạng que, kích thước 3-6 µm, có thể đứng riêng rẽ hoặc tạo thành chuỗi Bt hô hấp hiếu khí không bắt buộc, bắt màu Gram dương, có khả năng di động nhờ tiêm mao mọc trên bề mặt tế bào Khuẩn lạc của Bt có màu trắng sữa, hình tròn, bề mặt xù xì, viền khuẩn lạc nhăn, đường kính có thể đạt tới 8-10 µm

Vòng đời của Bt được đặc trưng bởi hai giai đoạn bao gồm sự phân chia tế bào sinh dưỡng và phát triển bào tử, còn được gọi là chu kỳ bào tử Tế bào sinh dưỡng có hình que (dài 2–5 µm và rộng khoảng 1,0 µm) và phân chia thành hai tế bào con giống hệt nhau bằng cách hình thành một vách ngăn phân chia bắt đầu ở giữa dọc theo màng sinh chất Mặt khác, quá trình sinh bào tử bao gồm sự phân chia tế bào không đối xứng và được đặc trưng bởi bảy giai đoạn, bao gồm (giai đoạn I) hình thành sợi trục, (giai đoạn II) hình thành vách ngăn tiền bào tử, (giai đoạn III) nhấn chìm, xuất hiện lần đầu tiên các tinh thể ký sinh và hình thành bào tử bào tử trước, (giai đoạn IV đến VI) hình thành exosporium, thành tế bào nguyên thủy, vỏ và vỏ bào tử kèm theo sự biến đổi của nucleoid bào tử và sự trưởng thành bào tử (giai đoạn VII) và sự ly giải bào tử ( Ibrahim

và ctv, 2010)

Giới (regnum):Eubacteria

Ngành (phylum):Firmicutes

Lớp (class):Bacilli

Bộ (ordo):Bacillales

Họ (familia):Bacillaceae

Chi (genus):Bacillus

Loài (species): B thuringiensis

Hình 2.3 Hình dạng Bt dưới kính hiển vi

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thời gian nghiên cứu từ 23/03/2024 đến 01/04/2024

Địa điểm nghiên cứu: Xưởng thực nghiệm vi sinh A2, Trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh

3.2 Vật liệu nghiên cứu và thiết bị

3.2.1 Vật liệu nghiên cứu

Giống nấm đối kháng Trichoderma và chế phẩm sinh học Bacillus thuringiensis

được cung cấp bởi Xưởng thực nghiệm vi sinh , Viện nghiên cứu Công nghệ Sinh học

và Môi trường, trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh

3.2.2 Dụng cụ

Nồi hấp, tủ cấy, cân, que cấy, máy lắc, dụng cụ tiêu hao

3.2.3 Môi trường sử dụng

3.2.3.1 Ống pha loãng

Ống pha loãng bao gồm 6 ống với thể tích 9ml mỗi ống

3.2.3.2 Môi trường PCA

Thành phần 1 lít môi truờng PCA (Cat#5996-10-1, Xilong) 20 g,

3.2.3.3 Môi trường nuôi cấy nấm Trichoderma

Bảng 3.1 Môi trường nuôi cấy nấm Trichoderma

Trấu 150g

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Nội dung 1: Quy trình sản xuất chế phẩm sinh học từ nấm đối kháng

Trichoderma spp

3.3.1.1 Mô tả thí nghiệm

Chuẩn bị môi trường nuôi cấy nấm: Hòa tan 100g Nitơ vào trong 1L nước, trộn đều hỗn hợp với 8kg tấm và 150g trấu

Hình 3.1 Quá trình trộn đều môi trường

Chia đều 400g hỗn hợp vào các túi nhựa, xếp miệng nhỏ miệng túi và đậy chặt bằng các nút bông và mang đi hấp khử trùng

Hình 3.2 Quá trình chia đều môi trường, đậy kín và hấp khử trùng

Tiến hành đổ 25 ml giống vào bịch môi trường đã được làm nguội Đảo trộn và nuôi cấy ở nơi khô ráo, nhiệt độ phòng

Hình 3.3 Cấy giống vào môi trường đã chuẩn bị

3.3.2 Nội dung 2: Kiểm tra mật số vi khuẩn Bacillus Thuringiensis trong chế phẩm

sinh học

3.3.2.1 Mô tả thí nghiệm

Đổ 9 ml nước cất đã tiệt trùng vào 6 ống thủy tinh đã chuẩn bị

Đồng nhất 10 ml mẫu với 90 ml nước cất đã hấp tiệt trùng, lắc 15p

Lấy 1ml hỗn hợp mẫu đã được đồng nhất vào ống pha loãng -1, hút 1ml từ ống pha loãng -1 vào ống pha loãng -2 Tiếp tục lặp lại cho tới hết

Hút 0,1ml dung dịch pha loãng ở các nồng độ -4, -5, -6 vào đĩa môi trường đã chuẩn bị và trang đến khi khô hoàn toàn Lặp lại 2 lần ở mỗi nồng độ pha loãng

Hình 3.4 Chuẩn bị dụng cụ và thao tác

A Ống pha loãng, B Chế phẩm cần kiểm tra, C 90ml nước cất để đồng nhất mẫu, D

Thao tác trang dung dịch

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Kết quả và thảo luận

4.1.1 Nuôi cấy nấm đối kháng Trichoderma

Kết quả thu được sau 7 ngày nuôi cấy trong điều kiện nhiệt độ phòng:

Hình 4.1 Nấm Trichoderma sau 7 ngày nuôi

Sau 7 ngày kiểm tra thấy số lượng bịch phôi nấm phát triển khá tốt Tuy nhiên, có xuất hiện 1 số bịch nấm không phát triển hoặc phát triển rất kém

Một số nguyên nhân gây nên hiện tượng này: chưa đảm bảo môi trường đủ nguội khi cấy nấm, thao tác cấy sai lầm khiến bịch phôi bị nhiễm, môi trường được trộn chưa đều dẫn đến một số bịch phôi thiếu chất dinh dưỡng cần thiết để nấm phát triển, môi trường nuôi nấm không đáp ứng đủ các yêu cầu khi nuôi nấm

4.1.2 Kiểm tra mật số vi khuẩn trong chế phẩm sinh học

Kết quả thu được sau 24h:

Hình 4.2 Mật độ vi khuẩn

Bảng 4.1.Mật độ khuẩn lạc trên các đĩa ứng với các độ pha loãng -4, -5,-6

𝑛 1 𝑉𝑓 1 +⋯+𝑛 𝑖 𝑉𝑓 𝑖

Trong đó:

A: tổng số tế bào trong 1 ml mẫu ( CFU/ml)

N: tổng số tế bào đếm được trên các đĩa đã chọn

ni: số lượng đĩa pha loãng thứ i

1×0,1×106+2×0,1×105= 2,59 × 10−3(CFU/ml)

Mật độ vi khuẩn kiểm tra được trong chế phẩm sinh học là 2,59x10-3 CFU/ml

Các đĩa trang vi khuẩn có số lượng khác biệt lớn trong cùng một nồng độ pha loãng Nguyên nhân có để do: dịch pha loãng không có sự đồng nhất khi hút, khi cấy que cấy chưa đủ nguội

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng việt

Võ Thị Tuyết Trinh (2014) Ảnh hưởng của nấm Trichoderma và xạ khuẩn

Streptomyces đến sinh trưởng phát triển và bệnh thán thư, héo xanh vi khuẩn hại ớt tại

Quảng Trị Khóa luận tốt nghiệp Đại học Nông Lâm, Đại học Huế

Tiếng nước ngoài

Gohel, N.M., Raghunandan, B.L., Patel, N.B., Parmar, H.V., Raval, D.B (2022) Role

of Fungal Biocontrol Agents for Sustainable Agriculture In: Rajpal, V.R., Singh, I.,

Navi, S.S (eds) Fungal diversity, ecology and control management Fungal Biology

Springer, Singapore

Harman GE (2006) Overview of Mechanisms and Uses of Trichoderma spp

Phytopathology 96(2): 190-4

Ibrahim, M A., Griko, N., Junker, M., & Bulla, L A (2010) Bacillus thuringiensis: a

genomics and proteomics perspective Bioengineered bugs, 1(1), 31–50