cndt2 phạm nguyễn bảo nhi 21126445 thứ 2 789

Trang 1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC BÀI THU HOẠCH MÔN HỌC THỰC HÀNH CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN 2 Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC S

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÀI THU HOẠCH

MÔN HỌC THỰC HÀNH CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN 2

Sinh viên thực hiện : PHẠM NGUYỄN BẢO NHI

Mã số sinh viên : 21126445

Niên khóa : 2021 – 2025

TP Thủ Đức, 06/2024

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÀI THU HOẠCH

MÔN HỌC THỰC HÀNH CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN 2

MỤC LỤC

Trang

DANH SÁCH CÁC HÌNH i

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1

1.1 Tình hình cây trồng GMO trên thế giới và Việt Nam hiện nay 1

1.2 Một số nguy cơ về cây trồng GMO 1

CHƯƠNG 2 LY TRÍCH VÀ ĐIỆN DI TỔNG SỐ DNA MẪU BẮP 3

2.1 Địa điểm/ Thời gian thực hiện 3

2.2 Vật liệu, hóa chất, thiết bị 3

2.3 Phương pháp thực hiện 3

2.3.1 Quy trình ly trích SDS 3

2.3.2 Quy trình điện di tổng số mẫu bắp 3

2.4 Kết quả 4

2.5 Kết luận 5

CHƯƠNG 3 PCR VÀ ĐIỆN DI PHÁT HIỆN GEN GMO 6

3.1 Địa điểm/ Thời gian thực hiện 6

3.2 Vật liệu, hóa chất, thiết bị 6

3.3 Phương pháp thực hiện 6

3.3.1 Quy trình PCR 6

3.3.2 Quy trình điện di phát hiện gen GMO 6

3.4 Kết quả 7

3.5 Kết luận 7

i

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 2.1 Kết quả điện di mẫu bắp số 1 4

Hình 2.2 Kết quả kiểm tra độ tinh sạch của mẫu bắp số 1 4

Hình 2.3 Kết quả kiểm tra hàm lượng DNA có trong mẫu 5

Hình 3.1 Kết quả điện di phát hiện gen GMO 7

1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tình hình cây trồng GMO trên thế giới và Việt Nam hiện nay

Theo số liệu báo cáo của Trung tâm dịch vụ quốc tế về tiếp thu các ứng dụng công nghệ sinh học trong nông nghiệp (ISAAA) năm 2015, sau 20 năm phát triển (từ năm 1996), các loại cây trồng GMO được thương mại hóa ngày càng tăng qua các năm Mỹ

là quốc gia đứng đầu về diện tích cây trồng GMO trên thế giới (73,1 triệu ha, chiếm 40%), tiếp đến là Brazil (42,2 triệu ha), Ác-hen-ti-na (24,3 triệu ha), Ấn Độ (11,6 triệu ha), Canađa (11,6 triệu ha) Mặc dù có nhiều gen được ứng dụng chuyển vào trong cây nhưng đến nay mới chỉ có 7 nhóm cây trồng GMO được phép thương mại hóa (khả năng chống chịu các stress phi sinh học, năng suất hạt, kháng côn trùng, kháng thuốc diệt cỏ, nâng cao chất lượng, kiểm soát sự thụ phấn ) Trong đó, các cây trồng GMO như đậu tương, bông, ngô và cây cải dầu được canh tác rộng rãi

Tại Việt Nam, năm 2005, Ban Bí thư Trung ương Đảng đã ban hành Chỉ thị số 50-CT/TW về đẩy mạnh phát triển và ứng dụng công nghệ sinh học phục vụ sự nghiệp công nghiệp hóa, hiện đại hóa đất nước, trong đó nêu rõ: “Làm chủ được công nghệ gen nhằm tạo ra các GMO thực vật, động vật theo hướng có lợi” Mục tiêu đến năm 2015, phát triển công nghệ sinh học hiện đại, tập trung vào công nghệ gen, đưa một số giống cây trồng GMO vào sản xuất và đến năm 2020 diện tích trồng trọt các giống cây trồng GMO chiếm 30 - 50%

1.2 Một số nguy cơ về cây trồng GMO

Nguy cơ đầu tiên là việc GMO mang các yếu tố chọn lọc (chịu lạnh, hạn, mặn hay kháng sâu bệnh…) phát triển tràn lan trong quần thể thực vật Điều này làm mất cân bằng hệ sinh thái và giảm tính đa dạng sinh học (ĐDSH) của loài cây được chuyển gen Bên cạnh đó, việc chuyển gen từ cây trồng vào các vi khuẩn trong đất sẽ làm đất nhanh bạc màu Hiện nay, các chuyên gia công nghệ sinh học đang nỗ lực giảm thiểu các rủi

ro nêu trên và theo dõi các thử nghiệm GMO trong phòng thí nghiệm, cũng như ngoài đồng ruộng trước khi đưa ra thị trường thương mại

Hầu hết cây trồng GMO đang được canh tác, do gen bị làm thay đổi nên miễn dịch với một số thuốc trừ cỏ Qua canh tác trên đồng ruộng trồng cây GMO, những loại

cỏ dại lại kháng thuốc diệt cỏ Hầu hết những trường hợp kháng thuốc đều diễn ra ở Mỹ,

2

nơi canh tác đến 90% đậu tương, ngô và bông GMO Để khắc phục vấn đề này, các nhà khoa học Mỹ đã đưa ra giải pháp với việc kết hợp các gen di truyền với nhau Điều này tạo ra một cuộc chạy đua chất độc hại trên cánh đồng nông nghiệp

Với công nghệ bắn gen và chuyển gen gián tiếp thông qua vi khuẩn vào nhiều cây trồng đã tạo ra những chất độc hại cho côn trùng chuyên diệt sâu bọ Ví dụ cải dầu với thành phần dầu chuyển đổi, ngô bắp có vi khuẩn Bacillus thuringiensis (Bt), bông kháng thuốc diệt cỏ bromoxynil, bông kháng côn trùng, đậu nành kháng thuốc diệt cỏ glyphosate, bí kháng vi rút và cà chua chín chậm Do vậy, người nông dân phải sử dụng

bổ sung thêm thuốc diệt cỏ Việc sử dụng rộng rãi thuốc diệt cỏ roundup (có chứa hoạt chất Glyphosat) cho cây GMO gây độc hại đối với tế bào người Từ năm 2015, loại hóa chất này được Tổ chức nghiên cứu ung thư của WHO (IARC) xếp vào "chất nguy cơ gây ung thư"

Sau năm 2000, Tòa án tư pháp tối cao ở châu Âu, Viện khiếu kiện của Tổ chức cấp bằng sáng chế châu Âu ở Munich (EPA) đã quyết định, cây trồng GMO về nguyên tắc có thể cấp bằng sáng chế Những giống cây được cấp bằng sáng chế không được phép nhân rộng nếu không được phép của chính đơn vị cấp bằng sáng chế Do đó, người trồng trọt bị hạn chế tiếp cận nguồn nguyên liệu gen Những người nông dân muốn phát triển cây trồng GMO, hàng năm phải chi trả lệ phí sáng chế cho hạt giống Như vậy, các bằng sáng chế đã gây ra những giới hạn đối người nông dân trong sản xuất nông nghiệp

3

CHƯƠNG 2 LY TRÍCH VÀ ĐIỆN DI TỔNG SỐ DNA

MẪU BẮP

2.1 Địa điểm/ thời gian thực hiện

Địa điểm: phòng 101, tòa nhà A2 Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường Thời gian: 8h sáng, ngày 23/05/2024

2.2 Vật liệu, hóa chất, thiết bị

Vật liệu: mẫu bắp số 1

Dụng cụ: chày nghiền mẫu, pipet, đầu tuýp, găng tay, eppendorf,

Hóa chất: dịch trích SDS, PCI, CI, isopropanol, Ethanol, TE, loading dye, Gel red, TBE buffer, Agarose

Thiết bị: máy PCR, bồn điện di, máy ly tâm, máy chụp UV

2.3 Phương pháp thực hiện

2.3.1 Quy trình ly trích SDS

Bước 1: Cân 0,05g mẫu, cho vào eppendorf và giữ trên đá

Bước 2: Bổ sung 600 μL dịch trích SDS vào eppendorf chứa mẫu, sau đó dùng chày nghiền nát mẫu

Bước 3: Bổ sung 300 μL PCI và lắc mạnh

Bước 4: Ly tâm 10000 vòng/phút trong 5 phút và hút 500 μL dịch nổi cho vào tube mới

Bước 5: Cho 1V CI vào tube và lắc mạnh

Bước 6: Ly tâm 10000 vòng/phút trong 5 phút, hút dịch nổi và chuyển vào tube mới

Bước 7: Cho 0,6 V isopropanol vào tube Ủ ở 20oC trong trong 30 phút

Bước 8: Ly tâm 10000 vòng/ phút trong 10 phút và loại bỏ dịch nổi

Bước 9: Thêm 500 μL Ethanol 70 % Ly tâm 10000 vòng/phút trong 3 phút Bỏ dịch nổi

Bước 10: Lặp lại bước 9

Bước 11: Phơi khô, thêm 30 μL TE vào tube Sau đó bảo quản lạnh ở nhiệt độ

- 20oC

2.3.2 Quy trình điện di tổng số mẫu bắp

Bước 1: Chuẩn bị gel Agarose và bồn điện di

4

Bước 2: Hút 5 μL mẫu DNA đã được ly trích, trộn đều với 10 μL hỗn hợp loading dye và gel red Hút hỗn hợp trên và bơm vào giếng điện di

Bước 3: Sau khi bơm vào mẫu vào giếng, đậy nắp bồn điện đi cẩn thận Tiến hành điện di tại hiệu điện thế 100 V trong 20 – 30 phút

Bước 4: Quan sát kết quả dưới đèn UV

2.4 Kết quả

Hình 2.1 Kết quả điện di mẫu bắp số 1

Kết quả: sau khi điện di thì có xuất hiện band sáng rõ chứng tỏ quy trình thực hiện

để kiểm tra mẫu GMO bước đầu đúng thao tác thực hiện

Hình 2.2 Kết quả kiểm tra độ tính sạch của mẫu bắp số 1

Kết quả: từ kết quả có thể thấy hàm lượng DNA được ly trích từ mẫu bắp số 1 là 117,0 ng/ μL và giá trị OD260/OD280 là 1,950

5

Hình 2.3 Kết quả kiểm tra hàm lượng DNA có trong mẫu

2.5 Kết luận

Từ giá trị OD đo được, ta suy ra được nồng độ acid nucleic trong dung dịch Dung dịch acid nucleic được xem là sạch khi tỉ lệ OD260/OD280 nằm trong khoảng 1,8 – 2,0 Nếu mẫu nhiễm protein hay phenol tỉ lệ này sẽ thấp hơn Vậy từ kết quả đo OD trên, có thể suy ra mẫu đã được tinh sạch Đem bảo quản ở nhiệt độ thích hợp để chuẩn bị cho quy trình kiểm tra GMO tiếp theo

Mẫu số 1 sau khi điện điện di tổng số DNA nghi ngờ có thể mang gen GMO Cần thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi chuyên biệt để nhận định chính xác hơn

6

CHƯƠNG 3 PCR VÀ ĐIỆN DI PHÁT HIỆN GEN GMO

3.1 Địa điểm/ thời gian thực hiện

Địa điểm: phòng 101, tòa nhà A2 Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường Thời gian: 8h sáng, ngày 04/06/2024

3.2 Vật liệu, hóa chất, thiết bị

Vật liệu: mẫu bắp số 1

Dụng cụ: pipet, đầu tuýp, găng tay, eppendorf

Thiết bị: máy PCR, bồn điện di, máy chụp UV

Bảng 3.1 Thành phần phản ứng PCR phát hiện GMO

Thành phần Nồng độ ban đầu Nồng độ cuối Thể tích (μL)

Cặp mồi chuyên biệt phát hiện GMO: 35S-1 5’ GCTCCTACAAATGCCATCA 3’

và 35S-2 5’ GATAGTGGGATTGTGCGTCA 3’

3.3 Phương pháp thực hiện

3.3.1 Quy trình PCR

Bước 1: Chuẩn bị hỗn hợp Mister mix ( My Taq mix, Primer F, Primer R, Nước khử ion)

Bước 2: Hút 11,5 μL hỗn hợp trên và mix đều với 1 μL mẫu DNA đã được ly trích

từ buổi trước (làm tương tự với đối chứng dương và đối chứng âm)

Bước 3: Cho các tube vào máy PCR và đợi 1 giờ 30 phút

3.3.2 Quy trình điện di phát hiện gen GMO

Bước 1: Chuẩn bị gel Agarose và bồn điện di

Bước 2: Hút 5 μL mẫu DNA đã được ly trích, trộn đều với 10 μL hỗn hợp loading dye và gel red Hút hỗn hợp trên và bơm vào giếng điện di

7

Bước 3: Sau khi bơm vào mẫu vào giếng, đậy nắp bồn điện đi cẩn thận Tiến hành điện di tại hiệu điện thế 100 V trong 20 – 30 phút

Bước 4: Quan sát kết quả dưới đèn UV

3.4 Kết quả

Hình 3.1 Kết quả điện di phát hiện gen GMO (a) Ladder; (b) Đối chứng âm;

(c) Đối chứng dương; (d) Mẫu bắp số 1

Kết quả: có xuất hiện band sáng ở vị trí 195 bp và có xuất hiện vệt RNA

3.5 Kết luận

Từ kết quả điện di cho thấy, so với đối chứng dương thì ở giếng số 9 có xuất hiện

band sáng ở vị trí 195 bp tuy nhiên rất mờ Band rất mờ có thể do nồng độ DNA gây ức chế phản ứng PCR và trong lúc thao tác điện di hút mẫu chưa đúng thể tích hoặc mix mẫu chưa đều

Ngoài ra còn có vệt RNA Có thể loại bỏ RNA, giúp mẫu tinh sạch hơn bằng cách:

bỏ mẫu ở nhiệt độ thường trong 1 ngày, để mẫu trong bồn ủ nhiệt 30 phút hoặc sử dụng enzyme RNase

Kết luận: mẫu bắp số 1 là mẫu GMO Đúng với nguồn gốc của mẫu, vì đây là bắp

ăn bán ngoài chợ ( mẫu non GMO hoặc GMO) Nếu là mẫu GMO thì có thể giải thích bằng hiện tượng giao phấn chéo từ các ruộng bắp GMO khác (nhờ gió, côn trùng…)