cndt2 nguyễn thị thùy 21126529 thứ 2 789

GMO là viết tắt của Genetically Modified Organism, hay sinh vật biến đổi gen, là sinh vật đƣợc thay đổi về vật liệu di truyền bộ gen/DNA bằng công nghệ sinh học hiện đại, gọi là công ngh

TP Thủ Đức, 6/2024

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO THỰC HÀNH CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN II

Sinh viên thực hiện : NGUYỄN THỊ THÙY

Giảng viên hướng dẫn : TS PHẠM ĐỨC TOÀN

TP Thủ Đức, 6/2024

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA

KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO THỰC HÀNH CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN II

Giảng viên hướng dẫn Sinh viên thực hiện MSSV

TS PHẠM ĐỨC TOÀN Nguyễn Thị Thùy 21126529

MỤC LỤC

MỤC LỤC i

DANH SÁCH HÌNH ii

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu thực hành 2

1.3 Nội dung thực hiện 2

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 4

3.1 Thời guan và địa điểm nghiên cứu 4

3.2 Vật liệu và phương pháp 4

3.2.1 vật liệu và dụng cụ 4

3.2.2 Phương pháp nghiên cứu 4

3.2.2.1 Ly trích DNA mẫu 4

3.2.2.2 Điện di mẫu DNA sau ly trích 6

3.2.2.3 PCR khuếch đại vùng trình tự 35S 6

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 8

4.1 kết quả và thảo luận điện di tổng số DNA mẫu 5 8

4.1.1 Kết quả 8

4.1.2 Thảo luận 8

4.2 Kết quả và thảo luận đo hàm lượng DNA trong mẫu bằng thiết bị BioDrop 8

4.2.1 Kết quả 9

4.2.2 Thảo luận 9

4.3 Kết quả và thảo luận mẫu PCR chạy điện di 9

4.3.1 Kết quả 9

4.3.2 Thảo luận 9

DANH SÁCH HÌNH

Hình 3.1 mẫu bắp số số 5 mẫu âm tính 4

Hình 3.2 Nghiền hỗn 0,05 g hợp với 600 µl SDS 4

Hình 3.3 500 µl dịch nổi 5

Hình 3.4 dung dịch sau cho CI 5

Hình 3.5 Dịch chứa DNA 6

Hình 4.1 Kết quả điện di tổng số DNA của mẫu bắp số 27 8

Hình 4.2 Kết quả đo hàm lƣợng DNA trong mẫu bằng thiết bị BioDrop 8

Hình 4.3 Kết quả điện di mẫu 27 xác định GMO 9

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Đặt vấn đề

Thực phẩm tiêu thụ hằng ngày ảnh hưởng trực tiếp tới sức khỏe và chất lượng sống của chúng ta Chính vì vậy, khi thực phẩm có nguồn gốc GMO (Genetically modified organism) hay chính xác hơn là thực phẩm biến đổi gen đang có xu hướng chiếm ưu thế trên thị trường thực phẩm toàn cầu, những tranh luận về GMO đã và đang nóng lên trong vòng 10 năm trở lại đây

GMO là viết tắt của Genetically Modified Organism, hay sinh vật biến đổi gen, là sinh vật được thay đổi về vật liệu di truyền (bộ gen/DNA) bằng công nghệ sinh học hiện đại, gọi là công nghệ gen, để tạo ra một đặc tính mới cho sinh vật (ví dụ như sức đề kháng của thực vật, côn trùng hoặc hạn hán, khả năng chịu thuốc diệt cỏ, hay tăng chất lượng thực phẩm hoặc giá trị dinh dưỡng, tăng sản lượng) Thực phẩm có chứa thành phần có nguồn gốc từ sinh vật biến đổi gen, hoặc được tạo ra từ sinh vật biến đổi gen được gọi là thực phẩm biến đổi gen Ở Việt Nam, thực phẩm biến đổi gen được gọi là thực phẩm GMO

Trong hiện tại, thực phẩm biến đổi gen trên thị trường hoàn toàn có nguồn gốc từ thực vật Organic: Thực phẩm Organic, hay còn gọi là thực phẩm hữu cơ là những loại thực phẩm được sản xuất bởi các quy trình nông nghiệp hữu cơ Những quy trình này phải đảm bảo quá trình canh tác thúc đẩy sự đa dạng sinh thái và các quy trình sinh học, bao gồm sử dụng phân bón có nguồn gốc hữu cơ (có nguồn gốc từ sinh vật), giới hạn loại và số lượng thuốc trừ sâu và chu trình canh tác đất luân canh (thay đổi loại cây trồng theo mùa)

Hiện tại, Liên minh Châu Âu, Hoa Kỳ, Canada, Mexico, Nhật Bản và nhiều nước khác yêu cầu các nhà sản xuất phải có giấy chứng nhận đặc biệt để bán thực phẩm làm thực phẩm hữu cơ trong phạm vi biên giới Trong bối cảnh của các quy định này, thực phẩm hữu cơ được sản xuất tuân thủ theo các tiêu chuẩn hữu cơ do các tổ chức khu vực, các chính phủ quốc gia và các tổ chức quốc tế đặt ra Mặc dù sản phẩm vườn nhà bếp có thể hữu cơ, để được dán nhãn hữu cơ chính thức phải được thông qua bởi các

cơ quan an toàn thực phẩm của chính phủ như Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ (USDA) hoặc

Ủy ban châu Âu (EC) Tại Việt Nam hiện vẫn chưa có quy định và nhãn dán chính thức cho thực phẩm hữu cơ được bày bán trong nước Do vậy, bất kì nhãn dán nào

được ghi là “Organic” hay “Thực phẩm hữu cơ” ở Việt Nam đều có thể xem như chưa

qua kiểm định chính thức nào Thực phẩm GMO hay được dán nhãn Organic đều phải được thông qua các quy trình giám sát và kiểm tra cụ thể, tùy theo từng quốc gia Tất

cả các thực phẩm ngoài thị trường không qua biến đổi gen nhưng cũng không qua những quy trình kiểm định Organic, hay những thực phẩm không đóng gói đều được xếp vào loại thực phẩm non-GMO

Thực phẩm GMO được sản xuất rộng rãi và có tiềm năng giải quyết nhu cầu dinh dưỡng trên thế giới, với tình hình tăng trưởng dân số thế giới Các tổ chức khu vực quốc tế như National Academy of Sciences (NAS), FDA, ESFA, và WHO liên tục đưa

ra bằng chứng khoa học và khẳng định sự an toàn của thực phẩm GMO đối với sức khỏe con người Tuy nhiên, những tranh cãi mối liên hệ giữa can thiệp công nghệ và

sự an toàn đối với người tiêu dùng vẫn liên tục nổ ra từ khi GMO được giới thiệu ra thị trường cho tới tận bây giờ Cả hai phía, phản đối và ủng hộ đều đưa ra những bằng chứng khoa học, có cơ sở lẫn không có cơ sở để củng cố cho luận điểm của mình

1.2 Mục tiêu thực hành

Kiểm tra 5 loại mẫu xác định xem mẫu chứa GMO, Non-GMO, nghi ngờ có chứa hoặc không chưa GMO

1.3 Nội dung thực hiện

Nội dung 1:Tiến hành ly trích DNA, chạy điện di kiểm tra trong mẫu có DNA tổng số hay không

Nội dung 2: Chạy PCR và điện di mẫu xem band của mẫu biến đổi gen hay không

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Trong vòng 20 năm trở lại đây, việc sản xuất trồng trọt GMO trên toàn cầu tăng cao gấp 94 lần, chiếm 180 triệu hecta diện tích canh tác Mỹ là nơi trồng nhiều thực phẩm biến đổi gen nhất, theo sau là các nước Nam Mỹ như Brazil, Argentina Tại châu Á,

Ấn Độ, Trung Quốc, Pakistan là những nguồn sản xuất GMO hàng đầu Khoảng hơn

30 triệu tấn bắp ngô, đậu nành và sản phẩm chăn nuôi GMO được nhập vào châu Âu hàng năm Chỉ có 6 quốc gia hoàn toàn cấm trồng trọt, nhập khẩu và tiêu thụ GMO bao gồm: Nga (GMO chỉ được dùng trong nghiên cứu), Bhutan, Algeria, Kyrgyzstan, Mdagascar, và Peru Tại Việt Nam, 3 giống ngô có khả năng kháng sâu bệnh GMO được phép trồng và sản xuất kinh doanh theo Thông tư số 08/2013/TT-BTNMT ngày 16/5/2013 của Bộ Tài nguyên và Môi Trường 3 giống ngô này là đều phát triển từ giống nền NK66 của công ty Syngenta và đều được bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn chứng nhận an toàn sinh học Do vẫn còn số lượng có hạn thực phẩm biến đổi gen được sản xuất và canh tác, hệ thống quản lý thực phẩm GMO còn chưa được hoàn chỉnh Ngày 8/1/2016: Thông tư liên tịch số 45 giữa Bộ Khoa học Công nghệ và

Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn ban hành: tất cả các thực phẩm GMO có trên 5% tổng nguyên liệu đều phải được dán nhãn Việc dán nhãn sản phẩm chỉ áp dụng cho thực phẩm đóng gói sẵn; thực phẩm tươi sống, thực phẩm được chế biến không phải tuân thủ các quy định này Hoạt động nuôi trồng sinh vật biến đổi gen để sản xuất hay nghiên cứu phải được chấp hành theo Nghị định số 69/2010/NĐ-CP ngày 21 tháng 6 năm 2010 của Chính phủ về an toàn sinh học đối với sinh vật biến đổi gen, được chỉnh sửa thêm vào ngày 30 tháng 11 năm 2011 Đối với việc nhập khẩu thực phẩm GMO, ở Việt Nam chưa có quy định cụ thể

Thực phẩm biến đổi gen là một sản phẩm của khoa học kĩ thuật Do đó, những vấn đề

về an toàn thực phẩm và an toàn sinh học cũng như sự ảnh hưởng tới sinh thái của GMO đều phải được kiểm soát nghiêm ngặt Năm 1992, Liên hợp quốc, thông qua hội thảo Agenda-21 nhấn mạnh việc quản lý sinh vật biến đổi gen và ban hành những hướng dẫn về việc kiểm soát, tiêu chuẩn thử nghiệm, quy trình chứng nhận, đóng gói

và dán nhãn cho thực phẩm GMO Năm 2003, Ủy ban Tiêu Chuẩn Thực Phẩm Codex (CAC), một tổ chức được thành lập bởi Tổ chức Nông lương thế giới FAO và Tổ chức

Y tế thế giới WHO ban hành Codex guideline, bao gồm những hướng dẫn cụ thể về việc thẩm định an toàn của sinh vật biến đổi gen

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời guan và địa điểm nghiên cứu

Thời gian: 20/05/2024 đến 27/05/2024

Địa điểm: Phòng thí nghiệm sinh học phân tử, Viện nghiên cứu Công nghệ Sinh học

và Môi Trường, Trường đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh

3.2 Vật liệu và phương pháp

3.2.1 vật liệu và dụng cụ

Vật liệu: 4 mẫu bắp và 1 mẫu đậu nành

Hóa chất: mồi 35S, Master mix, mẫu DNA, gel agarsose, gelred, loading dye, isopropanol, ethanol, SDS, nước khử ion (9TE) và nhiều hóa chất khác

Dụng cụ: micropipette, tube, cối chày giã, bồn ly tâm, máy điện di,máy chạy PCR

3.2.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.2.1 Ly trích DNA mẫu

Các bước ly trích DNA từ mẫu hạt bắp (mẫu 5)

Bước 1: Nghiền nhỏ mẫu hạt bắp sau đó lấy 0.05 g cho vào tube và cho 600 µl dịch trích SDS dùng dụng cụ để nghiền mẫu với dịch trích đến khi nhuyễn và đều

Hình 3.1 mẫu bắp số số 5 mẫu âm tính

Hình 3.2 Nghiền hỗn 0,05 g hợp với 600 µl SDS

Bước 2: Đem tube đã nghiền đều đi ly tâm 10000 vòng/phút trong vòng 5 phút

Bước 3: sau ly tâm hút 500 µl phần dịch nổi sang tube mới

Hình 3.3 500 µl dịch nổi

Bước 4: Cho 1V PCI (500 µl) trộn đều rồi đem đi ly tâm 10000 vòng/phút trong vòng

5 phút

Bước 5: Hút 300 µl bỏ dịch nổi sang tube mới sau đó thêm 1V CI (300 µl) vào trộn đều

Hình 3.4 dung dịch sau cho CI

Bước 6: Ly tâm 10000 vòng/phút trong 5 phút

Bước 7: hút dịch nỗi 300 µl sang tube mới sau đó thêm 180 µl Isopropanol, đảo nhẹ, ủ lạnh ở -20o

C trong 30 phút

Hình 3.5 Dịch chứa DNA

Bước 8: Đem đi ly tâm 10000 vòng/phút, và bỏ dịch nổi

Bước 9: Thêm 500 µl Ethanol 70o, sau đó ly tâm 10000 vòng/phút trong 3 phút Lặp lại bước này 2 lần

Bước 10: Thêm vào 50 µl TE (nước khử ion) vào bảo quản ở -20 oC

3.2.2.2 Điện di mẫu DNA sau ly trích

Bước 1: Chuẩn bị DNA cần điện di

Bước 2: Chuẩn bị gel agarose 1% pha từ 0.2 g agarose và 20 ml TBE 0,5X Quay trong lò vi sóng rồi đổ vào khay để tạo các giếng đợi gel đông lại

Bước 3: Hút 5 µl DNA và 10 µl thuốc nhuộm loading dye mix đều hồn hợp trên rồi bơm 15 µl hỗn hợp trên vào giếng Điện di ở 100V trong vòng 25 phút

Bước 4 Sau khi có được kết quả điện di, tiến hành kiểm tra chất lượng và hàm

lượng của DNA trên máy BioDrop, hút 3 μl DNA và tiến hành đo ở bước sóng 260nm

là bước sóng phát hiện DNA, lưu ý A260:280 nên nằm trong khoảng 1,8 – 2,2 Xem kết quả

3.2.2.3 PCR khuếch đại vùng trình tự 35S

Bước 1: chuẩn bị các thành phần chạy phản ứng PCR Gồm My Taqmix: dNTPs, PCR primer, MgCl2 , Taq polymerase Với cặp mồi primer phát hiện trình tự 35S có kích thước 189 bp

Cặp primer 35S

Primer xuôi: 5’-GCTCCTACAAATGCCATCA-3’

Primer ngược: 5’-GATAGTGGGATTGTGCGTCA-3’

Bảng 1.1 thành phần phản ứng

Bước 2: Tiến hành hút lần lượt 6,25 μL My TaqMix; 0,25 μL primer ngược, 0,25 μL primer xuôi; 1 μL DNA template; 4,75 μL nước khử ion vào 1 cái tube

Bước 3: Chạy PCR trong vòng 1h30 phút với chu kỳ nhiệt

Bước 4: Sau khi chạy PCR ta tiến hành điện di với 5 μL mẫu với 10 μL thuốc nhuộm vào giếng và tiền hành trong 25 phút ở 100V Đợi và xem kết quả

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 kết quả và thảo luận điện di tổng số DNA mẫu 5

4.1.1 Kết quả

Hình 4.1 Kết quả điện di tổng số DNA của mẫu bắp số 27

Sau khi điện di không thấy xuất hiện band sáng, xác định không có sự xuất hiện của DNA trong mẫu cũng như DNA chứa các kích thước đăc trưng của bộ gen tự nhiên của bắp

4.1.2 Thảo luận

Sau khi điện di tổng số DNA, không thấy có băng sáng xuất hiện Có thể do quá trình thao tác chưa hút được DNA của mẫu cũng như hút sai tỷ lệ hóa chất nên lượng DNA không có Có thể thực hiện lại điện di để chắc chắn kết quả

4.2 Kết quả và thảo luận đo hàm lượng DNA trong mẫu bằng thiết bị BioDrop

Hình 4.2 Kết quả đo hàm lượng DNA trong mẫu bằng thiết bị BioDrop

27

4.2.1 Kết quả

Dựa vào kết quả đo DNA trên thiết bị BioDriop cho thấy A260:280= 2000 thảo tỷ lệ cho phép từ khoảng 1,8-2,2 Hàm lượng của DNA có trong mẫu máy đo được là

0,002 µg/µl

4.2.2 Thảo luận

Chỉ số đo độ tinh khiết của mẫu là 2000 nằm trong khoảng cho phép Tuy nhiên nồng

độ DNA của mẫu là 0,002 µg/µl nồng độ rất thấp có thể do mẫu DNA trong mẫu thấp quá trình ly trích DNA không hiệu quả Cần thực hiện lại để đo mẫu tốt hơn

4.3 Kết quả và thảo luận mẫu PCR chạy điện di

4.3.1 Kết quả

Hình 4.3 Kết quả điện di mẫu 27 xác định GMO

Sau khi điện di, quan sát thấy có vùng sáng nhạt màu của gel red còn dư lại trong quá trình điện di Cho thấy mẫu số 5 là mẫu âm tính Có thể kết luận hạt bắp sử dung ở giếng 27 mẫu 5 là non GMO

4.3.2 Thảo luận

Kết quả điện di mẫu bắp âm tính Non-GMO trên primer 35S cho thấy mẫu không chứa gen biến đổi được khuếch đại bởi primer 35S Primer 35S là một trình tự DNA đặc biệt thường được sử dụng để khuếch đại gen promotor CaMV 35S, một promotor mạnh có nguồn gốc từ virus cây cải Mosaic Promotor này được sử dụng trong nhiều cấu trúc gen biến đổi gen (GMO) để điều khiển biểu hiện của gen ngoại lai

27