cndt2 nguyễn thị lan anh 21126014 thứ 2 789

Đặt vấn đề Hiện nay sự ra đời của GMO đã tạo nên những giống cây trồng, vật nuôi có năng suất và chất lƣợng tốt, khả năng chống chịu với những biến đổi của thời tiết cao, hạn chế việc sử

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO THỰC HÀNH

CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN 2

Ngành học

Mã ngành Chuyên ngành Sinh viên thực hiện

Mã số sinh viên Niên khóa

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC : D420201

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC : NGUYỄN THỊ LAN ANH : 21126014

: 2021 – 2025

TP Thủ Đức, 6/2024

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO THỰC HÀNH

CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN 2

TP Thủ Đức, 6/2024

i

MỤC LỤC

Trang

MỤC LỤC i

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT iii

DANH SÁCH ĐƠN VỊ ĐO LƯỜNG iv

DANH SÁCH CÁC BẢNG v

DANH SÁCH CÁC HÌNH vi

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu môn học 1

1.3 Nội dung thực hiện 1

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

2.1 Thực phẩm biến đổi gene 2

2.2 Phản ứng PCR 2

2.2.1 Nguyên lý hoạt động 2

2.2.2 Thành phần phản ứng PCR 2

2.2.3 Xây dựng phản ứng PCR 3

2.3 Kỹ thuật điện di 4

2.3.1 Định nghĩa 4

2.3.2 Nguyên lý hoạt động 4

2.3.3 Thành phần của kỹ thuật điện di trên gel agarose 4

2.3.3.1 Dung dịch đệm 4

2.3.3.2 Agarose 5

2.3.4 Phương pháp điện di 5

2.3.5 Các vấn đề cần lưu ý khi điện di 6

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 7

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 7

3.2 Vật liệu 7

3.2.1 Đối tượng nghiên cứu 7

3.2.2 Thiết bị và dụng cụ 7

3.2.3 Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu 7

3.3 Phương pháp nghiên cứu 7

ii

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 12

4.1 Kết quả 12

4.1.1 Định tính và định lượng DNA mẫu 3 12

4.1.3 Kiểm tra GMO 13

TÀI LIỆU THAM KHẢO 13

iii

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

GMO : Genetically Modified Organism – Sinh vật biến đổi gene

OD : Optical Density – Mật độ quang

PCR : Polymerase Chain Reaction

TBE : Tris-borate-EDTA

v

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Thành phần phản ứng PCR 10 Bảng 3.2 Chu trình nhiệt phản ứng PCR 11

vi

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 3.1 Đậu nành GMO 7

Hình 3.2 Mẫu sau khi thêm 600 μL SDS 8

Hình 3.3 Mẫu sau khi ly trích DNA tổng số 8

Hình 3.4 Mẫu sau khi rửa bằng ethanol 70% 9

Hình 3.5 Bồn điện di sau khi bơm mẫu số thứ tự 5 10

Hình 4.1 Kết quả điện di định tính DNA trong mẫu đậu nành 3 12

Hình 4.2 Kết quả định lƣợng DNA tổng số 12

Hình 4.3 Kết quả điện di kiểm tra GMO 13

và khó khăn vì phải xem xét, đánh giá nhiều yếu tố Trước khi đưa thực phẩm biến đổi gene ra bán trên thị trường, các nhà sản xuất đều phải tiến hành nhiều thử nghiệm chặt chẽ về chất lượng sản phẩm, kiểm định để khẳng định không có chất độc và không gây hại cho người tiêu dùng

1.2 Mục tiêu môn học

Ly trích DNA tổng số trong hạt đậu nành, định lượng DNA và xác định GMO bằng phương pháp PCR và điện di

1.3 Nội dung thực hiện

Nội dung 1: Ly trích DNA tổng số và xác định hàm lượng DNA từ hạt đậu nành GMO

Nội dung 2: Xác định GMO bằng phương pháp PCR và điện di

2

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Thực phẩm biến đổi gene

Thực phẩm biến đổi gene (GMO) là những loại thực phẩm được trồng từ hạt giống đã được biến đổi gene - DNA, hiện nay đã áp dụng đối với đậu tương, ngô, hoặc các loại thực vật khác

Các loại hạt giống biến đổi gene được tạo ra với nhiều mục đích như tăng khả năng kháng lại sâu bệnh, giúp cây trồng cứng cáp hơn, nông sản thu được có màu sắc đẹp, vòng đời lâu hơn hoặc để tạo ra những loại thực vật không hạt như dưa hấu và nho… Một số loại thực vật biến đổi gene cũng chứa hàm lượng các chất dinh dưỡng cao hơn như protein, calcium và folate Những người ủng hộ thực phẩm biến đổi gene cho rằng công nghệ là một phương pháp phát triển bền vững để cung cấp thực phẩm cho người dân ở những quốc gia đang thiếu lương thực cũng như chưa được tiếp xúc với những loại thực phẩm giàu dinh dưỡng Vòng đời dài hơn của một số thực phẩm biến đổi gen cho phép chúng được trồng phổ biến hơn ở khu vực xa xôi, hẻo lánh

Theo Cơ quan Quản lý dược phẩm và thực phẩm Hoa Kỳ (FDA), các loại thực phẩm từ thực vật biến đổi gene cần phải đáp ứng quy định an toàn như các loại thực phẩm không biến đổi gene Tuy nhiên, vẫn có nhiều quan ngại về những ý kiến cho rằng thực phẩm biến đổi gên có thể gây dị ứng, ức chế miễn dịch, kháng kháng sinh hay ung thư Do đó, thực phẩm biến đổi gene bao gói sẵn có ít nhất một thành phần nguyên liệu biến đổi gene lớn hơn 5% tổng nguyên liệu được sử dụng đều phải ghi nhãn khi lưu thông tại thị trường Việt Nam

2.2 Phản ứng PCR

2.2.1 Nguyên lý hoạt động

Nguyên lý hoạt động của máy PCR là tạo lượng lớn các đoạn DNA đặc thù từ DNA khuôn ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao thông qua hoạt động của enzyme polymerase và một cặp mồi đặc hiệu cho đoạn DNA này

2.2.2 Thành phần phản ứng PCR

Các yếu tố cơ bản để thực hiện phản ứng PCR (tổng thể tích dao động khoảng 20-50 µl) bao gồm:

iii) Dung dịch đệm;

iv) Có đầy đủ các loại nucleotide dATP, dTTP, dGTP, dCTP;

v) Môi trường đệm cung cấp ion Mg và nước tinh khiết không có enzyme RNase và ADNse;

vi) Enzyme chịu nhiệt Taq

2.2.3 Xây dựng phản ứng PCR

Một chu kỳ nhiệt của PCR sẽ gồm 3 giai đoạn nhiệt độ:

Giai đoạn biến tính: nhiệt độ sẽ được đưa lên 94 oC, các liên kết hydro sẽ bị phá

vỡ khiến DNA bị biến tính trở thành dạng mạch đơn

Giai đoạn bắt cặp: nhiệt độ được hạ xuống 55 – 65 oC, các đoạn mồi sẽ bắt cặp

bổ sung vào 2 đầu trình tự mục tiêu

Giai đoạn kéo dài: nhiệt độ được đưa lên 72 oC, Taq polymerase sẽ sử dụng dNTP để kéo dài đầu 3' của mồi và tạo ra mạch bổ sung

Như vậy, cứ qua một chu kỳ nhiệt, số mạch DNA sẽ được nhân đôi Nếu chu kỳ nhiệt lặp lại liên tục 30 - 40 lần thì số bản sao sẽ là 230 ~ 240 bản sao Số lượng bản sao DNA khổng lồ này khi được gắn các phân tử phát tín hiệu (ví dụ Ethidium Bromide) có thể nhìn thấy bằng mắt thường trên gel điện di dưới ánh đèn UV

2.2.4 Các vấn đề cần lưu ý thực hiện với kỹ thuật PCR

Trong phản ứng PCR, chúng ta thường dựa vào các bộ kit hoá chất thương mại

có khả năng mang lại năng suất tối ưu cùng với quy trình nhanh hơn Tuy nhiên, việc chuẩn bị mẫu, cũng như các thiết bị và vật tư tiêu hao trong quy trình làm PCR sẽ ảnh hưởng đến kết quả phản ứng theo những cách không được đánh giá thường xuyên Vì vậy, một số giải pháp đã được đưa ra nhằm cải thiện và tăng tốc độ của phản ứng PCR như tối ưu hóa các kết quả PCR thông qua các điều chỉnh thiết kế mồi, thành phần của hỗn hợp PCR master mix hoặc quy trình chuẩn bị mẫu; sự kết nối của nhiệt độ biến tính và nhiệt độ gắn mồi cũng như thời gian kéo dài chuỗi có thể rất quan trọng đối với lượng DNA cụ thể, độ tinh khiết và chất lượng của nó

2.3.2 Nguyên lý hoạt động

Phân tử DNA được cấu tạo từ các nucleobase được nối với nhau bởi khung sườn (backbone) từ đường dideoxybose và một nhóm phosphate Theo cấu trúc này, mỗi một nucleotide sẽ đều mang điện tích âm, điều này khiến DNA có điện tích âm tỷ lệ thuận với khối lượng (mass-to-charge) Do DNA có điện tích âm, việc sử dụng điện trường có thể khiến DNA di chuyển về phía điện cực dương

2.3.3 Thành phần của kỹ thuật điện di trên gel agarose

Dung dịch đệm TBE (Tris-borate-EDTA) là đệm được sử dụng phổ biến nhất trong điện di các phân tử DNA và RNA Đệm TBE giúp giữ ổn định pH qua đó giữ ổn định sự tích điện của phân tử axit nucleic Do đó, sự phân tách phân tử ADN trong điện di bởi kích thước phân tử của nó Ngoài sử dụng để chạy điện di, TBE còn được

5

sử dụng để tạo gel Do đó việc lựa chọn dung dịch TBE là quan trọng để đảm kết quả của điện di Đệm TBE thường được sử dụng với các đoạn DNA nhỏ, vì nó cung cấp khả năng phân tách tốt hơn cho các kích thước <1 kb

Dung dịch đệm TAE (Tris-acetate EDTA) có khả năng đệm tốt hơn vì trong TBE

có chứa borate, chất này ức chế các enzyme nên các sản phẩm sau điện di cần được phân lập cho các ứng dụng liên quan đến enzyme thì dung dịch đệm TAE là lựa chọn tốt hơn Đệm TAE thường được sử dụng để điện di các đoạn acid nucleic >1 kb nhờ gốc acetate Tương thích với các phản ứng enzyme và được khuyên dùng cho điện di gel

2.3.3.2 Agarose

Agarose là polysaccharide tự nhiên được phân lập từ tảo biển, có kích thước lỗ gel lớn, thích hợp cho phân tách các phân tử DNA có kích thước lớn và điện di dựa trên độ tích điện

Thông thường gel có nồng độ agarose cao thì kích thước lỗ càng nhỏ, do đó có thể phân tách phân tử có khối lượng nhỏ hơn trong khi gel có nồng độ agarose thấp sẽ phân tách được phân tử có khối lượng lớn hơn Phạm vi phân tách hiệu quả của gel agarose với nồng độ agarose khác nhau Ngoài ra đảm bảo sử dụng cùng bộ đệm với

bộ đệm trong bể điện di (không trộn lẫn các bộ đệm khác nhau và không sử dụng nước)

đó protein không tích điện gọi là pH đẳng điện hay pHi Nếu pH môi trường lớn hơn pHi, protein sẽ mang điện âm và sẽ di chuyển về phía cực dương Nếu pH môi trường nhỏ hơn pHi, protein mang điện dương và di chuyển về phía cực âm Khi pH môi trường bằng pH, trung hòa về điện nên sẽ không di chuyển trong điện trường

Các phân tử tích điện khác như DNA, RNA cũng điện di theo nguyên tắc trên Ở môi trường pH ≥ 8, DNA tích điện âm, dưới tác dụng của dòng điện nó sẽ di chuyển về cực dương

2.3.5 Các vấn đề cần lưu ý khi điện di

Chọn tỷ lệ agarose để điện di cho phù hợp với kích thước sản phẩm khuếch đại Trung bình nhất là dùng tỷ lệ 2% Đối với các sản phẩm khuếch đại lớn trên 500bps thì nên dùng agarose 1.5%, còn đối với các sản phẩm khuếch đại kích thước dưới 100bps thì nên dùng agarose trên 2.5%

Khi pha gel agarose cần làm tan hoàn toàn agarose trong đệm điện di bằng cách lắc trộn để agarose hòa đều trong dung dịch đệm Trước khi đổ agarose vào khuôn, phải đảm bảo khuôn nằm trên mặt phẳng nằm ngang kiểm tra bằng bóng khí để bề dày của agarose thật sự dày đều như nhau và kết quả điện di sẽ chính xác hơn

Thể tích mẫu cho vào giếng không nên quá ít mà phải từ 15l trở lên để có thể phát hiện được các kết quả dương tính yếu Khi điện di cần đối chứng dương là thang DNA để xác định kích thước của các vạch điện di trong các mẫu, kiểm soát chất lượng của điện di

Gel agarose thường được đổ với độ dày từ 0,5 đến 1 cm Khi miếng gel quá dày

sẽ cho ra hình ảnh không đẹp; đối với miếng gel quá mỏng, khi bơm mẫu vào giếng có thể tràn giếng gây sai lệch về kết quả thực tế

7

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thời gian thực hiện nghiên cứu từ ngày 01/6/2024 đến ngày 03/6/2024

Địa điểm được thực hiện tại RIBE105 Tòa A2 Viện nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh

3.2 Vật liệu

3.2.1 Đối tượng nghiên cứu

Đậu nành GMO, viện nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh

3.2.2 Thiết bị và dụng cụ

Thiết bị: Máy luân nhiệt PCR (Eppendorf, Mỹ), hệ thống điện di ngang gel agarose (Mupid – One, Nhật), máy đo quang phổ hấp thu phân tử (BioDrops, Anh) Dụng cụ: eppendorf các loại (0,5 mL và 1,5 mL), micro pipet các loại (10 L và

100 L), đầu tip, cốc thủy tinh

3.2.3 Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu

Phenol, Chloroform, Isoamyl acohol, Tris – HCl, EDTA, NaCl; Isopropanol; Ethanol; TE buffer, Master mix; Gelred; SDS; loading dye; gel agarose; dung dịch đệm điện di (TAE hoặc TBE)

3.3 Phương pháp nghiên cứu

8

Bước 2: thêm 400 μL SDS vào eppendorf sau đó dùng chày hòa tan mẫu trong dung dịch, bổ sung thêm 200 μL SDS (tránh bị thất thoát mẫu nếu cho tất cả vào cùng một lúc)

Hình 3.2 Mẫu sau khi thêm 600 μL SDS a) mẫu sau khi thêm 400 μL SDS; b) mẫu sau

Bước 8: đổ bỏ từ từ dịch nổi, thêm 500 μL nước cất, rửa nhẹ

Bước 9: đổ bỏ từ từ dịch nổi, thêm 500 μL Ethanol 70%, rửa nhẹ

Hình 3.4 Mẫu sau khi rửa bằng ethanol 70%

Bước 10: ly tâm ở 10000 rpm trong 3 phút, đổ bỏ dịch và sấy khô Tiếp theo hút

30 μL TE cho vào 2 tube

3.3.2 Định tính và định lượng DNA mẫu 3

Bước 1: chuẩn bị bồn điện di, đặt miếng gel agarose và cố định ở bồn

Bước 2: chuẩn bị mẫu, hút 5μL mẫu DNA trộn 10 μL loading dye (bromophenol blue, glycerol)

Bước 5: chụp gel và quan sát kết quả

Bước 5: tiến hành đo nồng độ bằng máy Biodrop, hút 2 - 3 μL mẫu bỏ vào máy

và đợi kết quả đo được

3.3.3 Kiểm tra GMO

Bước 1: Phản ứng PCR với primer là đoạn đặc hiệu phát hiện GMO Chuẩn bị

mẫu PCR với các thành phần tương ứng lần lượt theo Bảng 3.1 và cài đặt chương trình nhiệt theo Bảng 3.2

Bước 2: Sử dụng mẫu đã khuyếch đại bằng phản ứng PCR để điện di kiểm tra phát hiện GMO Chuẩn bị mẫu với 5 μL mẫu và 10 μL Gelred, điện di trong vòng 45 phút ở 100V

12

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Kết quả

4.1.1 Định tính và định lượng DNA mẫu 3

Hình 4.1 Kết quả điện di định tính DNA trong mẫu đậu nành 3

Dựa vào Hình 4.1 cho thấy quá trình ly trích DNA hạt đậu nành thành công, kết

quả điện di kiểm tra DNA tổng số có band

Hình 4.2 Kết quả định lượng DNA tổng số

Dựa vào Hình 4.2 cho thấy tỉ số OD260/OD280 là 2,098 và hàm lượng DNA

tổng số ly trích được từ mẫu số 3 hạt đậu nành là 389,8 ng/L Các kết quả ở mức bình thường (lớn hơn 1,8 và nhỏ hơn 2,2 đối với tỉ số OD) và có thể tiếp tục tiến hành điện

di xác định GMO

STT 5 Mẫu 3

13

4.1.3 Kiểm tra GMO

Hình 4.3 Kết quả điện di kiểm tra GMO

Từ kết quả Hình 4.3 cho thấy band mẫu 3 hạt đậu nành có band trùng với band

mục tiêu là 195 bp (so với ladder) nên mẫu 3 là đậu nành GMO

STT 5 Mẫu 3

13

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu tiếng Việt

1 Chu, Đ H., & Trần, V D (2019) Một số giải pháp để tối ưu và tăng tốc phản ứng PCR

Tài liệu tiếng nước ngoài

2