Thu nhận enzyme alginate lyase từ xạ khuẩn biển

THU NHẬN ENZYME ALGINATE LYASE TỪ XẠ KHUẨN BIỂN 1. Tổng quan Alginate là thành phần chính trong thành tế bào của rong nâu. Nó là một polysaccharide bao gồm 1,4 -D-mannuronate và -L-guluronate được sắp xếp theo các trình tự khác nhau, thường theo 3 loại khối (block) như : block mannuronate (poly-M) hoặc block guluronate (poly-G), hoặc hỗn hợp mannuronate và guluronate (poly-MG) (Haug và cs., 1967; Wong và cs., 2000). Sự khác nhau của cấu trúc alginate là do sự khác nhau về kích thước của các block và tỷ lệ M/G, điều này phụ thuộc vào nguồn rong biển (Andriamanantoanina và Rinaudo, 2010). Alginate có thể được thủy phân thành các oligoalginate. Các oligoalginate ngày càng thu hút sự chú ý do chúng có những ứng dụng rộng rãi trong ngành công nghiệp thực phẩm và dược phẩm. Ngoài ra, chúng có thể được sử dụng làm chất kích thích sinh trưởng cho cây trồng và chất trị liệu như thuốc chống đông máu và thuốc ức chế khối u (Cao và cs, 2007; Kumar và cs, 2019). Alginate lyase là một loại enzyme xúc tác quá trình phân cắt alginate bằng cơ chế khử β, cắt liên kết 1,4-O-glycoside giữa các monomer trong phân tử alginate (Rahman và cs, 2010). Alginate có thể được phân loại dựa vào kiểu phân cắt đặc hiệu với cơ chất, như PolyM lyase phân cắt đặc hiệu block polyM và PolyG lyase phân cắt đặc hiệu block polyG (Zhu và Yin, 2015). Tuy nhiên, một số alginate lyase có thể phân cắt được cả block polyM và polyG (polyMG lyase), loại này thể hiện hoạt tính sinh học cao. Hiện nay, có khá nhiều nghiên cứu về enzyme alginate lyase được thu nhận từ nhiều nguồn như rong biển, động vật thân mềm (Littorina spp., Turbo cornutus, Haliotis spp.), và các vi sinh vật biển (Zhu và Yin, 2015). Các vi khuẩn đã được công bố là có khả năng sinh các enzyme phân giải alginate trong rong nâu như Alginovibrio aquatilis, Azotobacter vinelandii, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas maltophilia, Flavourbacterium sp. và Vibrio sp. (Kim và cs, 2013). Schaumann và Weide (1990) đã chứng minh rằng có bốn loài nấm biển có khả năng sản sinh ra alginate lyase phân cắt alginate là Asteromyces cruciatus, Dendryphiella arenaria, Dendryphiella salina, và Corollospora intermedia (Schaumann và cs, 1990). Ngoài ra, cũng có một số nghiên cứu về xạ khuẩn sinh tổng hợp alginate lyase như Streptomyces. sp ALG5 và Streptomyces sp. M3 (Kim và cs, 2009; Kim, 2010).

MỤC LỤC

1 Tổng quan 2

2 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 3

2.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước 3

2.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 4

3 Tính cấp thiết 4

4 Phương pháp thu nhận enzyme aginate lyase từ xạ khuẩn biển 5

4.1 Phương pháp chung 5

4.2 Phương pháp phân lập 5

4.2 Phương pháp khảo sát khả năng sinh enzyme alginate lyase của chủng xạ khuẩn phân lập được 6

4.3 Phương pháp tách chiết 7

4.4 Phương pháp tinh sạch enzyme 8

4.5 Phương pháp kiểm tra hoạt tính enzyme 9

4.7 Phương pháp cô đặc và ổn định enzyme 10

Tài liệu tham khảo 11

THU NHẬN ENZYME ALGINATE LYASE TỪ XẠ KHUẨN BIỂN

1 Tổng quan

Alginate là thành phần chính trong thành tế bào của rong nâu Nó là một polysaccharide bao gồm 1,4 -D-mannuronate và -L-guluronate được sắp xếp theo các trình tự khác nhau, thường theo 3 loại khối (block) như : block mannuronate (poly-M) hoặc block guluronate (poly-G), hoặc hỗn hợp mannuronate và guluronate (poly-MG) (Haug và cs., 1967; Wong và cs., 2000) Sự khác nhau của cấu trúc alginate là do sự khác nhau về kích thước của các block và tỷ lệ M/G, điều này phụ thuộc vào nguồn rong biển (Andriamanantoanina và Rinaudo, 2010) Alginate có thể được thủy phân thành các oligoalginate Các oligoalginate ngày càng thu hút sự chú ý do chúng có những ứng dụng rộng rãi trong ngành công nghiệp thực phẩm và dược phẩm Ngoài ra, chúng có thể được sử dụng làm chất kích thích sinh trưởng cho cây trồng và chất trị liệu như thuốc chống đông máu và thuốc ức chế khối u (Cao và cs, 2007; Kumar và cs, 2019)

Alginate lyase là một loại enzyme xúc tác quá trình phân cắt alginate bằng

cơ chế khử β, cắt liên kết 1,4-O-glycoside giữa các monomer trong phân tử alginate (Rahman và cs, 2010) Alginate có thể được phân loại dựa vào kiểu phân cắt đặc hiệu với cơ chất, như PolyM lyase phân cắt đặc hiệu block polyM và PolyG lyase phân cắt đặc hiệu block polyG (Zhu và Yin, 2015) Tuy nhiên, một số alginate lyase có thể phân cắt được cả block polyM và polyG (polyMG lyase), loại này thể hiện hoạt tính sinh học cao Hiện nay, có khá nhiều nghiên cứu về enzyme alginate

lyase được thu nhận từ nhiều nguồn như rong biển, động vật thân mềm (Littorina spp., Turbo cornutus, Haliotis spp.), và các vi sinh vật biển (Zhu và Yin, 2015)

Các vi khuẩn đã được công bố là có khả năng sinh các enzyme phân giải alginate

trong rong nâu như Alginovibrio aquatilis, Azotobacter vinelandii, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas maltophilia, Flavourbacterium sp và Vibrio sp (Kim

và cs, 2013) Schaumann và Weide (1990) đã chứng minh rằng có bốn loài nấm

biển có khả năng sản sinh ra alginate lyase phân cắt alginate là Asteromyces

cruciatus, Dendryphiella arenaria, Dendryphiella salina, và Corollospora intermedia (Schaumann và cs, 1990) Ngoài ra, cũng có một số nghiên cứu về xạ khuẩn sinh tổng hợp alginate lyase như Streptomyces sp ALG5 và Streptomyces

sp M3 (Kim và cs, 2009; Kim, 2010)

Các vi sinh vật biển phân lập từ rong biển được coi là nguồn tốt cho các enzyme phân cắt polysaccharide, cụ thể là enzyme alginate lyase phân cắt alginate Thông thường, vi khuẩn biển sinh alginate lyase trong điều kiện môi trường có chứa 0.3% đến 0.5% natri alginate với vai trò là chất cảm ứng, 2-3% NaCl, pH môi trường trong khoảng từ 7,0 đến 9,5 và nuôi ở nhiệt độ từ 25oC đến 30oC Với mục đích tăng hoạt tính của enzyme alginate lyase, các điều kiện nuôi cấy vi sinh vật, đặc biệt là ảnh hưởng của các thành phần trong môi trường và thời gian nuôi cấy cần được xác định để thu enzyme alginate lyase có hoạt tính cao nhất

2 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

2.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Xạ khuẩn là một nhóm vi khuẩn gram dương, có nhiều loại sống trong môi trường biển và có khả năng sản xuất nhiều loại enzyme có ích cho con người và môi trường

Có nhiều nghiên cứu về actinobacteria biển sinh enzyme aginate lyase Những nghiên cứu này cho thấy rằng xạ khuẩn biển có khả năng sản xuất enzyme aginate lyase và có tiềm năng trong việc tái chế chất thải tảo biển Tuy nhiên, cần thêm nghiên cứu để đánh giá khả năng ứng dụng của enzyme này

Nghiên cứu của Kim và cộng sự (2021) về việc phân lập và đánh giá hoạt

độ của enzyme aginate lyase từ xạ khuẩn biển Họ đã phân lập thành công một chủng xạ khuẩn mới và xác định hoạt độ của enzyme aginate lyase của nó Hay nghiên cứu của Venugopal và cộng sự (2020) về sự sản xuất và tinh chế enzyme

aginate lyase từ xạ khuẩn biển thuộc chi Streptomyces Họ đã đánh giá hoạt độ của

enzyme trong nhiều điều kiện khác nhau và xác định điều kiện tối ưu để sản xuất

enzyme Và nghiên cứu của Rani và cộng sự (2018) về sự ứng dụng của enzyme

aginate lyase từ xạ khuẩn biển Streptomyces coelicolor Họ đã sử dụng enzyme để

giải phóng phân giải aginate và đánh giá khả năng giải phóng và tái chế aginate của enzyme

2.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Ở Việt Nam, cũng đã có một số nghiên cứu về actinobacteria biển sinh enzyme aginate lyase

Nghiên cứu của Trinh và cộng sự (2020) về việc phân lập và xác định hoạt

độ của enzyme aginate lyase từ xạ khuẩn biển được thu thập tại vịnh Hạ Long Họ

đã phân lập thành công hai chủng xạ khuẩn mới và xác định hoạt độ của enzyme aginate lyase của chúng Cũng trong nghiên cứu của Nguyễn và đồng nghiệp (2019) về việc tìm kiếm và đánh giá hoạt độ của enzyme aginate lyase từ các chủng

xạ biển ở đảo Côn Đảo Họ đã phân lập thành công một chủng xạ khuẩn mới và xác định hoạt độ của enzyme aginate lyase của nó Nghiên cứu của Phan và đồng nghiệp (2021) về việc tìm kiếm và xác định hoạt độ của enzyme aginate lyase từ

xạ khuẩn biển thu thập tại vịnh Nha Trang Họ đã phân lập thành công một chủng

xạ khuẩn mới và xác định hoạt độ của enzyme aginate lyase của nó

3 Tính cấp thiết

Thu nhận enzyme alginate lyase từ xạ khuẩn biển là rất quan trọng vì enzyme này có khả năng phân huỷ thành phần chính của tảo nâu - alginate, một loại polysaccharide rất phổ biến trong tảo nâu Alginate lyase có thể được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như thực phẩm, y học, môi trường và sản xuất sinh học Việc thu nhận enzyme alginate lyase từ xạ khuẩn biển có thể giúp cải thiện hiệu suất sản xuất và tiết kiệm chi phí so với các phương pháp truyền thống khác

Tại sao lại chọn xạ khuẩn mà không chọn nhóm vi khuẩn khác cũng là một vấn đề quan trọng Xạ khuẩn biển là một loại vi khuẩn có khả năng sống trong môi trường biển, nơi có độ mặn cao, nhiệt độ thay đổi và các tác nhân môi trường khác khắc nghiệt Xạ khuẩn sản xuất nhiều enzyme có hoạt tính cao ứng dụng trong sản

xuất sinh học Xạ khuẩn biển còn có khả năng tự sản xuất alginate lyase để phân hủy thành phần alginate trong tảo nâu, giúp chúng tồn tại trong môi trường khắc nghiệt Vì vậy, việc chọn xạ khuẩn biển là nguồn nguyên liệu để thu nhận enzyme alginate lyase sẽ mang lại nhiều lợi ích cho quá trình sản xuất và ứng dụng enzyme này

4 Phương pháp thu nhận enzyme aginate lyase từ xạ khuẩn biển

4.1 Phương pháp chung

Hình 1: Sơ đồ tổng quát 4.2 Phương pháp phân lập

Rong nâu Sargassum sp được thu gom (n=10) vào được lưu giữ trong bị

plastic ở 27oC tại phòng thí nghiệm Vi sinh, trong vòng 7-14 ngày trước khi tiến hành các bước phân lập Môi trường phân lập xạ khuẩn được sử dụng là Humic acid vitamin B agar (HVA), glycerol asparagine agar (GAA) và Yeast Extract Malt Extract Agar (YEME) Các đĩa cấy sẽ được ủ ở 30oC trong 6 ngày để quan sát sự

hình thành khuẩn lạc, sau đó cấy chuyển khuẩn lạc sang môi trường Half potato destro agar (HPDA) để quan sát hình thái, màu sắc Các chủng xạ khuẩn phân lập được sẽ được lưu trữ trong glycerol 25% ở -18oC Ngoài ra, rong nâu (Sargassum

sp.) còn được đem sấy khô ở 40oC, sử dụng làm cơ chất cung cấp nguồn carbon

cho quá trình nuôi cấy xạ khuẩn sinh enzyme alginate lyase

Hình 2: Quy trình phân lập xạ khuẩn từ rong nâu 4.2 Phương pháp khảo sát khả năng sinh enzyme alginate lyase của chủng xạ khuẩn phân lập được

Đánh giá khả năng của xạ khuẩn bằng phương pháp cấy chấm điểm trên đĩa thạch có chứa 0,5% alginate (120 – 190 Kda, Sigma-Aldrich) với thuốc thử Lugol (Gacesa và Wusteman, 1990; Kim và cs, 2013) Lựa chọn các chủng xạ khuẩn có khả năng sinh tổng hợp alginate lyase có hoạt tính cao dựa vào đường kính vòng tròn phân giải tạo thành trên đĩa thạch (>15mm)

Chủng xạ khuẩn sinh alginate lyase có hoạt tính cao được bảo quản trong glycerol 15-20% ở nhiệt độ -200C

Các chủng xạ khuẩn được lựa chọn sẽ được cấy vào 50 ml môi trường

ISP-2 trong bình tam giác ISP-250 ml và được nuôi ở 30oC trên máy lắc với tốc độ 150 vòng/phút trong 3 ngày Sau đó, 5 ml dịch nuôi cấy được chuyển vào 100 ml môi trường sinh tổng hợp alginate lyase có sử dụng rong nâu làm cơ chất và được ủ ở

27oC trên máy lắc với tốc độ 150 vòng/phút trong vòng 5 ngày Thu nhận enzyme thô bằng cách ly tâm 10000 rpm trong 10 phút Mẫu được ủ ở 37oC trong 2 giờ cho phản ứng thuỷ phân xảy ra

4.3 Phương pháp tách chiết

Chủng xạ khuẩn tiềm năng sẽ được nuôi cấy trên môi trường

Sau khi nuôi cấy, dịch được ly tâm ở tốc độ 10000 rpm trong 20 phút ở nhiệt độ 4°C Phần nổi trên bề mặt sẽ được bổ sung muối amoni sunfat từ từ để thu tủa protein Enzyme thô được thu bằng cách ủ qua đêm ở 4°C với độ bão hòa 60%

Tiếp theo, dung dịch được ly tâm ở tốc độ 10.000×g trong 15 phút, sau đó tiến hành thu tủa và hòa tan lại trong dung dịch đệm Tris-HCl 20 mM

Để loại bỏ muối, enzyme hòa tan sẽ được thẩm tách bằng cách sử dụng ống thẩm tách bằng màng cellulose (trọng lượng phân tử tối đa 14 kDa, Sigma Aldrich, Sydney, Úc) trong 1L của cùng bộ đệm ở 4°C Bộ đệm được thay thế liên tục sau mỗi hai giờ trong 6 giờ

Sau khi lọc, phần nổi phía trên được sử dụng làm enzyme tinh khiết như một phần để kiểm tra hoạt tính của enzyme

Hình 3: Quy trình tách chiết enzyme aginate lyase

4.4 Phương pháp tinh sạch enzyme

Hình 4: Quy trình tinh sạch enzyme bằng sắc ký trao đổi ion

Enzyme cô đặc chạy trên cột trao đổi anion (cột Mono-QTM, 5/50 GL, GE Healthcare/Cytiva, Marlborough, MA, USA) và được nối vào FPLC (ÄKTA™ pure, Cytiva, Marlborough, MA, USA) Cột được cân bằng trước đó bằng dung dịch đệm A (20 mM Tris-HCl pH 8,0) trước khi đưa mẫu vào Bơm được đặt với tốc độ dòng chảy 1 mL/phút Enzym được rửa giải bằng gradient tuyến tính 0-1 M NaCl trong dung dịch đệm B (NaCl 1 M, 20 mM Tris-HCl pH 8,0) Sử dụng Bộ xét nghiệm protein Pierce BCA (Thermo Science, Waltham, MA, USA) để đánh giá về hoạt tính của enzyme và nồng độ protein thông qua các phân đoạn thu được

từ sắc ký trao đổi anion Các phân đoạn có hoạt tính enzym đặc hiệu cao nhất được gộp lại và trữ trong tủ đông ở -20°C trước khi nạp vào cột SuperdexTM 75 (10/300

GL, GE Healthcare/Cytiva, Marlborough, MA, USA)

4.5 Phương pháp kiểm tra hoạt tính enzyme

Hình 5: Quy trình kiểm tra hoạt tính enzyme

Hoạt tính Alginate Lyase được xác định bằng phương pháp so màu, dựa trên lượng đường khử được giải phóng bằng cách sử dụng thuốc thử axit 3-5-dinitrosalicylic (DNS)

Hỗn hợp phản ứng chứa 0,5 mL enzym tinh khiết và 0,5 mL cơ chất (0,5%, natri alginat) trong dung dịch đệm Tris-HCl 0,02 M (pH 7,5) được ủ ở 37°C trong 2 giờ Sau khi ủ, phản ứng được dừng lại bằng cách thêm 1 mL thuốc thử DNS và đun sôi hỗn hợp trong 5 phút

Độ hấp thụ thu được từ phản ứng với các loại đường khử được đo tại bước sóng

540 nm bằng máy đo quang phổ UV Nồng độ đường khử giải phóng vào môi trường được xác định bằng cách sử dụng D-glucose làm chuẩn Một đơn vị hoạt tính enzyme được định nghĩa là lượng enzyme cần thiết để sản xuất 1µmol đường khử mỗi phút

Hoạt tính tương đối được tính bằng tỷ lệ phần trăm của hoạt tính ở một độ pH/nhiệt

độ nhất định so với hoạt tính ở độ pH/nhiệt độ tối ưu

Phân tích thống kê: tất cả các kết quả đều dựa trên giá trị trung bình của ba thí nghiệm Kết quả được phân tích thống kê bằng ANOVA một chiều trong SPSS

4.7 Phương pháp cô đặc và ổn định enzyme

Phương pháp cô đặc alginate lyase phổ biến là sử dụng kỹ thuật lyophilization (sấy khô đông lạnh) để cô đặc enzyme

Dung dịch enzyme điều chế được đưa vào máy sấy khô đông lạnh để loại

bỏ nước ở nhiệt độ -400C đến -800C, tùy vào mức độ cần cô đặc thời gian sấy có thể từ vài giờ đến vài ngày Quá trình này giúp tăng cường độ cô đặc của enzyme

và làm cho nó dễ dàng để lưu trữ và vận chuyển

Một trong những phương pháp ổn định enzyme được sử dụng phổ biến nhất

là sử dụng chất bảo vệ để bảo vệ enzyme khỏi các tác nhân gây hư hại Các chất bảo vệ như glycerol, sucrose, trehalose, hoặc dextran có thể được sử dụng để tăng

độ ổn định của enzyme trong quá trình lưu trữ và vận chuyển

Cụ thể, quá trình bảo vệ enzyme bằng chất bảo vệ có thể được thực hiện như sau:

- Chuẩn bị dung dịch chứa enzyme cần bảo vệ và chất bảo vệ tương ứng Chất bảo

vệ được chọn phải không gây ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme

- Thêm chất bảo vệ vào dung dịch enzyme theo tỷ lệ thích hợp và khuấy đều để đảm bảo sự phân bố đồng đều

- Tiến hành bảo quản enzyme trong điều kiện lưu trữ thích hợp, thường là ở nhiệt

độ thấp hoặc lưu trữ ở nhiệt độ phòng trong thời gian ngắn

Quá trình sử dụng chất bảo vệ giúp tạo ra một môi trường ổn định cho enzyme, giảm thiểu tác động của các tác nhân gây hư hại như nhiệt độ, độ ẩm và ánh sáng Ngoài ra, chất bảo vệ còn giúp bảo vệ màng tế bào của enzyme khỏi sự tổn thương

và giảm thiểu mất hoạt tính do tác động của các chất khác trong dung dịch

Trong một nghiên cứu được công bố trên tạp chí Enzyme and Microbial Technology vào năm 2017, các nhà nghiên cứu đã sử dụng glycerol để bảo vệ

enzyme aginate lyase Kết quả cho thấy rằng, khi được bảo vệ bởi glycerol, enzyme aginate lyase có độ ổn định cao hơn trong quá trình lưu trữ ở nhiệt độ thấp trong

30 ngày, so với các mẫu enzyme không được bảo vệ bằng glycerol

Thông thường, tỉ lệ glycerol để ổn định enzyme aginate lyase tùy thuộc vào nhiều yếu tố như điều kiện bảo quản, loại enzyme, pH, nhiệt độ và thời gian lưu trữ mong muốn Tuy nhiên, trong nhiều trường hợp, tỉ lệ glycerol thường được sử dụng là 20-50% trong dung dịch lưu trữ của enzyme Nếu enzyme được lưu trữ ở nhiệt độ thấp, ví dụ như -800C, thì có thể sử dụng tỉ lệ glycerol cao hơn, lên đến 50-60% để đảm bảo enzyme được bảo quản tốt

Tài liệu tham khảo

❖ Tài liệu Tiếng Việt:

1 Trinh, T T H., Nguyen, D T., Nguyen, H T M., & Le, T H (2020) Phân lập và xác định đặc tính của xạ khuẩn sinh lyase aginate từ Vịnh Hạ Long, Việt Nam Tạp chí Khoa học Dược phẩm Ứng dụng, 10(10), 48-55

2 Nguyễn, T T M., & Nguyễn, V T (2019) Sàng lọc, phân lập và định danh xạ khuẩn Côn Đảo có khả năng sinh enzym aginate lyase Tạp chí Khoa học và Công nghệ Biển, 19(3), 260-268

3 Phan, T N., Trần, T N N., Nguyễn, T T M., Nguyễn, V T., & Lê, T H (2021) Phân lập và xác định đặc tính của xạ khuẩn sinh lyase aginate từ vịnh Nha Trang, Việt Nam Tạp chí Khoa học và Công nghệ Việt Nam, 59(1),

63-70

❖ Tài liệu Tiếng Anh:

1 Kim, H J., Kim, D H., Kim, T Y., Kim, D., & Oh, T K (2021) Isolation and characterization of a novel Actinobacterium producing agarase and aginate lyase from the East Sea, Korea Microorganisms, 9(6), 1284

2 Venugopal, V., Pandian, S R K., Sathishkumar, R., & Arvindkumar, S (2020) Production, optimization, and purification of aginate lyase from marine