Nghiên cứu thu nhận enzyme zylanase và cmcase từ xạ khuẩn ứng dụng trong trợ nghiền bột giấy

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU THU NHẬN ENZYME XYLANASE VÀ CMCASE TỪ XẠ KHUẨN ỨNG DỤNG TRONG TRỢ NGHIỀN BỘT GIẤY Giáo viên hướng dẫn : TS Phan Thị Hồng Thảo Họ tên sinh viên thực : Cấn Thị Dung Lớp : 17-01 Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Hà Nội - 2021 Khóa luận tốt nghiệp Khoa: Cơng nghệ Sinh học LỜI CẢM ƠN Để hồn thành q trình nghiên cứu hồn thiện khóa luận này, lời tơi xin chân thành cảm ơn sâu sắc đến T.S Phan Thị Hồng Thảo Người trực tiếp bảo hướng dẫn tơi suốt q trình nghiên cứu để tơi hồn thiện khóa luận Ngồi tơi xin chân thành cảm ơn anh chị công tác phịng Vi sinh vật đất- Viện Cơng nghệ sinh học tạo điều kiện thời gian cho suốt q trình nghiên cứu Tơi xin chân thành cảm ơn Thầy, Cô Khoa Công nghệ sinh học Trường Đại học Mở Hà Nội, tận tình truyền đạt kiến thức năm học tập Với vốn kiến thức tiếp thu q trình học khơng tảng cho q trình nghiên cứu khóa luận mà cịn hành trang q báu để áp dụng vào thực tế cách vững tự tin Tôi xin cảm ơn người thân, bạn bè ln bên tơi, động viên tơi hồn thành khóa học luận văn Cuối cùng, tơi xin cảm ơn kinh phí đề tài: “Nghiên cứu công nghệ chế tạo chế phẩm enzyme nghiền từ vi khuẩn-xạ khuẩn chịu nhiệt ứng dụng dây truyền sản xuất giấy Tissue: Mã số: ĐT.02.19/CNSHCB thuộc Đề án phát triển ứng dụng công nghệ sinh học lĩnh vực công nghiệp chế biến năm 2020 Bộ Công thương Trân trọng cảm ơn! Hà Nội, ngày 01 tháng 05 năm 2021 Sinh viên thực Cấn Thị Dung SV: Cấn Thị Dung K24-CNSH Khóa luận tốt nghiệp Khoa: Công nghệ Sinh học MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT MỞ ĐẦU PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Xạ khuẩn sinh tổng hợp enzyme xylanase CMCase 1.1.1 Xạ khuẩn 1.1.2 Khả sinh tổng hợp CMCase xylanase từ xạ khuẩn 1.1.3 Enzyme xylanase CMCase từ xạ khuẩn 1.1.3.1.Enzyme xylanase 1.1.3.2.Enzyme CMCase 1.2 Tổng quan ứng dụng enzyme trợ nghiền bột giấy 11 1.2.1 Ứng dụng enzyme trợ nghiền 11 1.2.2 Cơ chế tác dụng enzyme trợ nghiền 11 1.2.3 Những lợi ích sử dụng enzyme trợ nghiền 13 1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình thu nhận enzyme trợ nghiền 15 PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1 Vật liệu nghiên cứu 18 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 18 2.1.2 Hóa chất thiết bị 18 2.1.3 Môi trường nuôi cấy 18 2.2 Phương pháp nghiên cứu 19 2.2.1 Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn/ xạ khuẩn môi trường lỏng 19 2.2.2 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme xylanase CMCase 20 SV: Cấn Thị Dung K24-CNSH Khóa luận tốt nghiệp Khoa: Cơng nghệ Sinh học 2.2.2.1 Phương pháp xác định hoạt tính CMCase 20 2.2.2.2 Phương pháp xác định hoạt tính xylanase 21 2.2.3 Nghiên cứu số đặc điểm sinh học chủng xạ khuẩn chịu nhiệt tuyển chọn 23 2.2.4 Phương pháp nghiên cứu điều kiện thích hợp cho sinh tổng hợp enzyme xylanase CMCase (môi trường, pH, nhiệt độ) chủng xạ khuẩn tuyển chọn 25 PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27 3.1 Nghiên cứu đặc điểm sinh học định danh chủng tuyển chọn 27 3.1.1 Đặc điểm sinh học vi sinh vật tuyển chọn 27 3.1.2 Phân loại định danh 32 3.2 Nghiên cứu số điều kiện thích hợp sinh tổng hợp xylanase CMCase chủng S mexicanus CXVC1-28 34 3.2.1 Lựa chọn mơi trường chất thích hợp 34 3.2.2 Ảnh hưởng điều kiện pH, nhiệt độ thời gian môi trường đến khả sinh tổng hợp enzyme xylanase CMCase 36 3.3 Tách chiết sơ enzyme CMCase/xylanase 39 3.4 Bước đầu đánh giá tiềm ứng dụng enzyme thu nhận trợ nghiền bột giấy 41 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 44 Tài liệu tham khảo 46 SV: Cấn Thị Dung K24-CNSH Khóa luận tốt nghiệp Khoa: Công nghệ Sinh học DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Đặc điểm nuôi cấy chủng xạ khuẩn CXVC1- 28 môi trường 27 Bảng 3.2 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả sinh trưởng CXVC1-28 29 Bảng 3.3 Ảnh hưởng pH môi trường đến khả sinh trưởng phát triển CXVC1-28 29 Bảng 3.4 Khả sử dụng nguồn cacbon khác 31 Bảng 3.5 So sánh trình tự đoạn gen 16S rRNA chủng CXVC1-28 số chủng đại diện 33 Bảng 3.6 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả sinh tổng hợp xylanase CMCase chủng CXVC1-28 36 Bảng 3.7 Ảnh hưởng pH đến khả sinh tổng hợp xylanase CMCase chủng CXVC1-28 38 Bảng 3.8 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến khả sinh tổng hợp xylanase CMCase chủng CXVC1-28 38 Bảng 3.9 Ảnh hưởng tỷ lệ acetone đến khả thu hồi enzyme chủng CXVC1-28 40 Bảng 3.10 Ảnh hưởng nồng độ muối amoni sunfat đến khả thu hồi enzyme 40 Bảng 3.11 Khảo sát sơ khả ứng dụng enzyme từ chủng vi sinh vật cho trợ nghiền bột giấy 41 SV: Cấn Thị Dung K24-CNSH Khóa luận tốt nghiệp Khoa: Cơng nghệ Sinh học DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cơ chế hoạt động endoglucanase 10 Hình 2.1 Đồ thị đường chuẩn Glucose 21 Hình 2.2 Đường chuẩn Xylose 23 Hình 3.1 Hình thái khuẩn lạc chủng xạ khuẩn CXVC1-28 27 Hình 3.2 Khả sinh trưởng chủng CXVC1-28 môi trường ISP 28 Hình 3.3 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả sinh trưởng chủng CXVC1-28 29 Hình 3.4 Ảnh hưởng pH đến khả sinh trưởng 30 Hình 3.5 Bào tử (a) chuỗi sinh bào tử (b) xạ khuẩn CXVC1-28 30 Hình 3.6 Khả sinh trưởng chủng CXVC1-28 nguồn cacbon 31 Hình 3.7 Khả sử dụng nguồn chất chủng CXVC1-28 32 Hình 3.8.(A) Sản phẩm PCR gel agarose 1,0 % trình tự vùng gen đăng kí ngân hàng Genbank xạ khuẩn CXVC1-28 33 Hình 3.9 Ảnh hưởng môi trường đến khả sinh tổng hợp xylanase (a) CMCase (b) xạ khuẩn CXVC1-28 34 Hình 3.10 Ảnh hưởng chất đến khả sinh tổng hợp xylanase (a) CMCase (b) chủng CXVC1-28 35 Hình 3.11 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả sinh trưởng xạ khuẩn CXVC1-28 36 Hình 3.12 Ảnh hưởng pH mơi trường đến khả phát triển chủng CXVC1-28 37 Hình 3.13 Ảnh hưởng tỷ lệ acetone đến khả kết tủa enzyme 40 SV: Cấn Thị Dung K24-CNSH Khóa luận tốt nghiệp Khoa: Cơng nghệ Sinh học DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT BHKB : Bột giấy từ gỗ cứng tẩy trắng BSKB : Bột giấy từ gỗ mềm tẩy trắng CMC : Carboxymethyl cellulose CMCase : Carboxymethyl cellulase DNSA : 3,5-dinitrosalicylic acid EGI : Endoglucanse I EGII : Endoglucanase II ISP : International Streptomyces Project KTCC : Khuẩn ty chất KTKS : Khuẩn ty khí sinh OD : Mật độ quang phổ STT : Số thứ tự VSV : Vi sinh vật SV: Cấn Thị Dung K24-CNSH Khóa luận tốt nghiệp Khoa: Cơng nghệ Sinh học MỞ ĐẦU Trong năm gần đây, ngành công nghiệp Việt Nam phát triển mạnh mẽ đóng vai trị quan trọng, có ngành công nghiệp sản xuất giấy Ngành công nghiệp giấy bột giấy ngành sử dụng nhiều vốn, tài ngun có nhiều tác động xấu đến mơi trường Trong lộ trình phát triển ngành giấy, Việt Nam đặt mục tiêu đạt 600.000 bột giấy vào năm 2010 1.800.000 vào năm 2020, nghĩa cần có gia tăng sản xuất gấp 2-3 lần Điều đồng nghĩa với việc gia tăng nguy gây ô nhiễm môi trường trầm trọng phát triển sản xuất không kèm với việc áp dụng công nghệ thân thiện với môi trường tăng cường giám sát việc xử lý chất thải nhà máy Vì để giảm thiểu nhiễm mơi trường từ trình sản xuất giấy thiết cần phải giảm lượng hóa chất đầu vào Có số giải pháp để giảm lượng hóa chất ảnh hưởng đến mơi trường hầu hết địi hỏi chi phí tốn Sử dụng enzyme vào trình xử lý bột thô giải pháp thân thiện với môi trường quan tâm ngành giấy Việc sử dụng enzyme ngành công nghiệp giấy bột giấy phát triển nhanh chóng kể từ năm 1980 Sản xuất giấy ngành công nghiệp tiêu thụ nhiều lượng, lượng nghiền chiếm phần chi phí lớn giá thành sản phẩm Việc xử lý bột giấy enzyme trước nghiền giúp nhà máy giảm lượng yêu cầu cho trình nghiền tiết kiệm lượng tiêu thụ Các enzyme sử dụng trợ nghiền cellulase, xylanase Với chức enzyme chủ yếu thủy phân xơ sợi nhỏ, phá hủy làm đứt xơ sợi dài Bằng cách thủy phân xơ sợi, enzyme tăng cường độ thoát nước cho huyền phù bột, tiết kiệm lượng trợ nghiền từ 6-30% tăng tốc độ máy xeo [3] Để tiết kiệm chi phí giảm thiểu nhiễm mơi trường từ q trình sản xuất, việc đẩy mạnh SV:Cấn Thị Dung K24-CNSH Khóa luận tốt nghiệp Khoa: Cơng nghệ Sinh học nghiên cứu nhằm tìm giải pháp thân thiện từ enzyme sinh học cần quan tâm nhiều Để đáp ứng yêu cầu sản xuất ứng dụng vào thực tiễn việc nghiên cứu enzyme sử dụng trợ nghiền việc làm cần thiết Do đó, tơi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu thu nhận enzyme xylanase CMCase từ xạ khuẩn ứng dụng trợ nghiền bột giấy” Mục tiêu nghiên cứu: Nghiên cứu thu nhận enzyme xylanase/CMCase từ chủng xạ khuẩn bước đầu đánh giá khả ứng dụng enzyme thu nhận từ chủng xạ khuẩn tiềm trợ nghiền bột giấy Nội dung nghiên cứu: - Nghiên cứu đặc điểm sinh học định danh chủng tuyển chọn - Nghiên cứu số điều kiện (môi trường, nhiệt độ, pH, thời gian) thích hợp sinh tổng hợp xylanase CMCase chủng xạ khuẩn tuyển chọn - Nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động enzyme xylanase/CMCase - Bước đầu đánh giá tiềm ứng dụng enzyme thu nhận trợ nghiền bột giấy SV:Cấn Thị Dung K24-CNSH Khóa luận tốt nghiệp Khoa: Cơng nghệ Sinh học PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Xạ khuẩn sinh tổng hợp enzyme xylanase và CMCase 1.1.1 Xạ khuẩn Theo hệ thống phân loại nay, xạ khuẩn thuộc giới Prokayote giới phân loại Xạ khuẩn có mặt chủ yếu đất, nước, ao hồ, bùn chất hữu khác, có thực vật, chí chất mà vi khuẩn nấm mốc không phát triển Xạ khuẩn trước xếp vào nhóm vi khuẩn Gram (+) có dạng sợi nấm Chúng vi sinh vật hiếu khí có mặt khắp nơi tự nhiên ADN xạ khuẩn giàu G C (chiếm 57 - 75%) [22] Tùy theo môi trường phát triển mà chúng xếp vào nhóm vi sinh vật ưa ấm hay ưa nhiệt Hầu hết loài xạ khuẩn thường phát triển nhiệt độ 25 – 37oC Một số chủng xạ khuẩn phát triển tốt khoảng nhiệt độ 45 - 50oC, xem nhóm vi sinh vật ưa nhiệt Xạ khuẩn thường phát triển tốt mơi trường trung tính kiềm ngừng phát triển phát triển chậm môi trường acid kiểm Các chủng xạ khuẩn phát triển mơi trường có nồng độ muối – 5%, nồng độ muối cao chúng bị ức chế Xạ khuẩn thuộc nhóm vi sinh vật dị dưỡng, với hệ enzym phong phú như: amylase, xylanse, cellulase, protease, kitinase,… giúp chúng sử dụng nguồn cacbon khó phân hủy (tinh bột, loại đường hợp chất) Nitơ xem nguồn dinh dưỡng thiết yếu xạ khuẩn Nguồn nitơ vô thường dạng nitrate, muối amon,… nitơ hữu thường pepton, cao ngơ, cao nấm men… Xạ khuẩn nhóm vi khuẩn đặc biệt Chúng có khuẩn lạc khơ đa số có dạng hình phóng xạ lại có dạng sợi phân nhánh nấm Xạ khuẩn có cấu trúc nhân nguyên thuỷ vi khuẩn khác, chiều ngang sợi nhỏ vi khuẩn Trên môi trường thạch rắn đa số xạ khuẩn có hai loại SV:Cấn Thị Dung K24-CNSH Khóa luận tốt nghiệp Khoa: Cơng nghệ Sinh học Xạ khuẩn tuyển chọn nuôi môi trường lên men Noura (g/l) [25] Cơ chất bổ sung thêm vào 2% lần lượt: lõi ngô, CMC, bột gỗ, Wheat bran Sau ngày ly tâm thu dịch enzyme thơ kiểm tra a b Hình 10 Ảnh hưởng chất đến khả sinh tổng hợp xylanase (a) CMCase (b) chủng CXVC1-28 Trên mơi trường Noura có bổ sung nguồn chất khác làm tăng khả sinh tổng hợp xylanase CMCase chủng CXVC1-28 Hoạt tính xylanase đạt cao bổ sung lõi ngô vào môi trường, hoạt độ đạt 7,53 U/ml Hoạt tính CMCase sinh cao bổ sung 2% chất CMC với hoạt độ enzyme đạt 5,85 U/ml Khi lên men chủng S mexicanus CXVC1-28 môi trường có bổ sung 2% lõi ngơ khả sinh tổng hợp CMCase đạt 4,96 U/ml Thông qua kết thu nhận được, lựa chọn mơi trường Noura có bổ sung 2% lõi ngô làm chất cảm ứng cho trình lên men thu xylanase CMCase từ xạ khuẩn CXVC 1-28 Trong nghiên cứu El-Naggar cộng (2014), xylan, sucrose, tinh bột, inulin, bột yến mạch cellobiose khơng có tác dụng kích thích sản xuất endoglucanase từ xạ khuẩn S albogawnolus Trong đó, bã mía, bột cellulose, rơm bụi, cám lúa mì trấu lại làm tăng khả sinh tổng hợp enzyme so với chất CMC Endoglucanase đạt cao (41,54 U/mL) mơi trường có bã mía thấp (14,07 U/mL) mơi trường có sucrose Trong nghiên cứu đó, xạ khuẩn nghiên cứu sinh tổng hợp endoglucanase cao mơi trường có chứa pepton [13] Với chủng Streptomyces sp SV:Cấn Thị Dung 35 K24-CNSH Khóa luận tốt nghiệp Khoa: Công nghệ Sinh học BRC1 BRC2, tinh bột maltose làm ức chế sản xuất endoglucanase Trong glucose cellobiose lại tốt cho sản xuất enzyme [9] Như vậy, chất quan trọng việc sinh tổng hợp enzyme từ chủng xạ khuẩn chủng lại yêu cầu nguồn chất môi trường khác Khi khảo sát chất cho trình sinh tổng hợp xylanase CMCase từ vi sinh vật Hoạt tính enzyme thường đạt cao môi trường bổ sung lõi ngô 2% 3.2.2 Ảnh hưởng điều kiện pH, nhiệt độ thời gian môi trường đến khả sinh tổng hợp enzyme xylanase CMCase Khảo sát nhiệt độ lên men thích hợp Chủng CXVC1-28 khảo sát khả sinh trưởng khả sinh tổng hợp enzyme nhiệt độ: nhiệt độ 25oC, 37oC, 45oC, 50oC mơi trường Noura có bổ sung 2% lõi ngô Sau ngày nuôi cấy, tiến hành kiểm tra hoạt độ xylanase, CMCase sinh mơi trường Hình 11 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả sinh trưởng chủng xạ khuẩn CXVC1-28 Bảng Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả sinh tổng hợp xylanase CMCase chủng CXVC1-28 Ảnh hưởng nhiệt độ Nhiệt độ (C) 25 37 45 50 Xylanase (U/ml) 2,19±0,30 9,16±0,29 13,75±0,26 1,29±0,04 CMCace (U/ml) 0,23±0,07 3,24± 0,37 3,57±0,29 2,03±0,16 SV:Cấn Thị Dung 36 K24-CNSH Khóa luận tốt nghiệp Khoa: Cơng nghệ Sinh học Ở nhiệt độ 25oC, 37oC 45oC, 50oC xạ khuẩn CXCV1-28 sinh tổng hợp xylanase CMCase Khi nhiệt độ tăng khoảng 25 đến 45oC khả sinh tổng hợp enzyme chủng tăng lên Chủng CXVC1-28 sinh tổng hợp enzyme tốt nuôi cấy 45oC với hoạt độ enzyme xylanase đạt khoảng 13,75 U/ml CMCase đạt khoảng 3,57U/ml Ở nhiệt độ nuôi 25oC, 37oC 50oC khả sinh tổng hợp xylanase CMCase chủng giảm Kết kiểm tra hoạt độ enzyme phù hợp với khả phát triển chủng Lựa chọn pH mơi trường lên men thích hợp Độ pH môi trường yếu tố định đến khả sinh trưởng sinh tổng hợp enzyme phân hủy Ở ngưỡng pH thích hợp thúc đầy q trình sinh trưởng kích thích khả sinh tổng hợp enzyme, ngưỡng pH chủng phát triển yếu chết Mỗi lồi vi sinh vật khác có ngưỡng pH thích hợp, đó, việc khảo sát tối ưu điều kiện pH cần thiết Khảo sát ảnh hưởng pH đến khả sinh trưởng sinh tổng hợp enzyme xạ khuẩn S mexicanus CXVC1-28 tiến hành mơi trường Noura lỏng có bổ sung chất lõi ngô 2% 45 oC, tốc độ lắc 200 vịng/phút Độ pH mơi trường thay đổi từ 5÷9 Sau ngày ni cấy, kiểm tra hoạt tính CMCase xylanase có dịch lên men Kết thể Bảng 3.7 Hình 3.12 Ảnh hưởng pH môi trường đến khả phát triển chủng CXVC1-28 SV:Cấn Thị Dung 37 K24-CNSH Khóa luận tốt nghiệp Khoa: Công nghệ Sinh học Bảng 3.7 Ảnh hưởng pH đến khả sinh tổng hợp xylanase CMCase chủng CXVC1-28 Ảnh hưởng pH môi trường pH môi trường Xylanase 15,24±1,60 (U/ml) CMCase 4,24±0,43 (U/ml) 22,59±0,80 7,12±1,18 5,33±0,14 3,55±0,02 3,88±0,42 0,128±0,01 0 Hầu hết mức pH môi trường từ ÷ chủng S mexicanus CXVC1-28 có khả sinh tổng hợp xylanase, enzyme CMCase sinh tổng hợp pH từ ÷ Độ pH mơi trường thích hợp cho sinh tổng hợp CMCase xylanase chủng xạ khuẩn S mexicanus CXVC1-28 đạt cao môi trường pH với hoạt độ đạt 5,33 22,59 U/ml Ở môi trường pH 7÷9 chủng sinh tổng hợp xylanase kém, hoạt độ giảm dần đến pH 9, hoạt độ 0,128 U/ml Chủng CXVC1-28 sinh tổng hợp enzyme CMCase khoảng pH từ 5÷7 Chủng có khả sinh tổng hợp CMCase tốt pH 6, hoạt độ đạt 5,33U/ml Do đó, mơi trường có pH6 thích hợp cho sinh tổng hợp xylanase CMCase Khảo sát thời gian thu hồi xylanase CMCase Xạ khuẩn CXVC1-28 tiến hành ni cấy mơi trường thích hợp Định kỳ 24 lấy mẫu lần xác định hoạt độ hai enzyme khảo sát Kết thể Bảng 3.8 Bảng Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến khả sinh tổng hợp xylanase CMCase chủng CXVC1-28 Enzym khảo sát Thời gian (giờ) 24 48 72 96 120 144 168 Xylanase 0,56±0,0 5,27±0,4 14,05±1, 26,65±3, 22,01±1,8 7,83±0, 5,43±0,3 (U/ml) 23 11 31 CMCase 0 1,37 1,42 1,48 5,83 7,63 (U/ml) SV:Cấn Thị Dung 38 K24-CNSH Khóa luận tốt nghiệp Khoa: Cơng nghệ Sinh học Ở thời điểm 24 – 48 chủng CXVC1-28 có khả sinh tổng hợp xylanase, nhiên, hoạt độ đạt không cao (