Nghiên cứu công nghệ lên men sinh khối và thu hồi chủng lactococcus lactis subsp cremoris vnc53 có ứng dụng trong sản xuất phomat

Khoa Công nghệ Sinh Học Sv: Nguyễn Thị Thu LỜI CẢM ƠN Trước hết, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn La Anh – Chủ nhiệm Bộ môn Công nghệ Sinh học Vi sinh, Viện Cơng nghiệp Thực phẩm tận tình hướng dẫn giúp đỡ em suốt trình học tập, nghiên cứu hồn thiện khóa luận tốt nghiệp Em xin chân thành cảm Ban giám hiệu, Ban lãnh đạo, thầy giáo, cô giáo Viện Đại học Mở Hà Nội giảng dạy em suốt thời gian học tập trường tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ em hồn thành khóa luận Khóa luận bước đầu tập dượt nghiên cứu khoa học cố gắng tránh khỏi hạn chế, thiếu sót Em mong nhận ý kiến đóng góp thầy, giáo, bạn để khóa luận hồn thiện Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội,ngày 22 tháng 05 năm 2016 Người viết Nguyễn Thị Thu i Khoa Công nghệ Sinh Học Sv: Nguyễn Thị Thu LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng hướng dẫn khoa học PGS.TS Nguyễn La Anh Các nội dung nghiên cứu, kết đề tài trung thực chưa công bố hình thức trước Hà Nội,ngày 22 tháng 05 năm 2016 Người viết Nguyễn Thị Thu ii Khoa Công nghệ Sinh Học Sv: Nguyễn Thị Thu MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i  LỜI CAM ĐOAN ii  MỤC LỤC iii  DANH MỤC BẢNG BIỂU vi  DANH MỤC HÌNH ẢNH vii  CÁC TỪ VIẾT TẮT viii  MỞ ĐẦU 1  PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3  1.1.Giới thiệu chung phomat 3  1.2 Vi khuẩn lactic sản xuất phomat 4  - Quá trình chuyển hóa axit lactic 5  - Q trình chuyển hóa citrate 5  - Q trình phân giải lipit chuyển hóa axit béo 6  - Quá trình phân giải protein 6  1.2.1 Các nhóm vi khuẩn lactic khởi động sản xuất phomat 7  1.2.1.1 Các chủng vi khuẩn lactic ưa ấm 7  1.2.1.2 Các chủng vi khuẩn lactic ưa nhiệt 8  1.2.1.3 Các chủng khởi động “thủ công” 8  1.2.2 Lactococcus lactis subsp cremoris ứng dụng sản xuất phomat 9  1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình lên men tăng sinh khối 10  1.3.1 Ảnh hưởng môi trường tới khả sinh trưởng 10  1.3.2 Ảnh hưởng pH môi trường tới khả sinh trưởng 11  1.3.3 Ảnh hưởng nhiệt độ tới khả sinh trưởng 11  1.3.4 Ảnh hưởng tỉ lệ tiếp giống đến khả sinh trưởng 11  1.4 Các yếu tố ảnh hưởng tới tạo chế phẩm 12  1.4.1 Môi trường sấy 13  iii Khoa Công nghệ Sinh Học Sv: Nguyễn Thị Thu 1.4.1.1 Chất bảo vệ tế bào 13  1.4.2 Điều kiện sấy 15  1.4.2.1 Ảnh hưởng hàm ẩm 15  1.4.2.2 Ảnh hưởng nhiệt độ sấy 15  PHẦN THỨ HAI - NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 17  2.1 Nguyên liệu, hóa chất thiết bị 17  2.1.1 Chủng giống 17  2.1.2 Nguyên liệu hóa chất 17  2.1.3 Thiết bị 18  2.1.4 Môi trường 19  2.1.4.1 Môi trường giữ giống 19  2.1.4.2 Môi trường lên men 19  2.2 Phương pháp nghiên cứu 19  2.2.1 Phương pháp vi sinh 19  2.2.2 Xác định mật độ tế bào 20  2.2.2.1 Xác định mật độ tế bào phương pháp đo độ đục 20  2.2.3 Phương pháp xác định đường tổng 23  2.2.4 Phương pháp xác định protein phương pháp Lowry 24  PHẦN BA: KẾT QUẢ 26  3.1 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình lên men 26  3.1.1 Ảnh hưởng môi trường tới khả sinh trưởng 26  3.1.1.1 Lựa chọn thành phần đường môi trường cho lên men tăng sinh khối chủng VNC53 26  3.1.1.2 Lựa chọn thành phần đạm nồng độ đạm cho lên men tăng sinh khối chủng VNC53 28  3.1.2 Ảnh hưởng pH môi trường tới khả sinh trưởng 30  3.1.3 Ảnh hưởng nhiệt độ tới khả sinh trưởng 30  3.1.4 Ảnh hưởng tỉ lệ tiếp giống tới khả sinh trưởng 31  3.2 Động học trình lên men chủng Lactococcuslactis subsp cremoris VNC53 32  iv Khoa Công nghệ Sinh Học Sv: Nguyễn Thị Thu 3.3 Nghiên cứu lựa chọn chất bảo vệ màng tế bào 34  3.3.1 Lựa chọn chất bảo vệ màng tế bào chủng VNC53 34  3.3.2 Ảnh hưởng sốc nhiệt đến chủng VNC53 35  3.3.3 Ảnh hưởng sốc thẩm thấu đến chủng VNC53 36  KẾT QUẢ VÀ KIẾN NGHỊ 38  TÀI LIỆU THAM KHẢO 39  v Khoa Công nghệ Sinh Học Sv: Nguyễn Thị Thu DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1: Các hợp chất hương hình thành từ q trình chuyển hóa axit amin qua axit α – keto theo đường chuyển hóa transaminase………………….7 Bảng 1.2: Sự khác điều kiện sinh trưởng loài Lactococcus lactis ssp cremoris Lactococcus lactis ssp lactis ………………………………9 Bảng 1.3: Ứng dụng Lactococcus lactis ssp cremoris sản xuất phomat……………………………………………………………………….10 vi Khoa Công nghệ Sinh Học Sv: Nguyễn Thị Thu DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1: Các đường lên men hexose (glucose) vi khuẩn lactic Hình 2.1: Chủng Lactococcus lactis subsp cremoris VNC53………………17 Hình 3.1: Khảo sát nguồn đường chủng VNC53……………………………27 Hình 3.2: Nồng độ đường chủng VNC53………………………………… 27 Hình 3.3: Khảo sát nguồn đạm chủng VNC53 28 Hình 3.4: Nồng độ đạm chủng VNC53 29 Hình 3.5: Ảnh hưởng pH đến chủng VNC53………………………… 30 Hình 3.6: Ảnh hưởng nhiệt độ tới chủng VNC53………………………… 31 Hình 3.7: Ảnh hưởng tỷ lệ tiếp giống đến chủng VNC53……………… 32 Hình 3.8: Động học trình lên men chủng VNC53…………………… 33 Hình 3.9: Ảnh hưởng chất bảo vệ màng tế bào đến chủng VNC53……… 35 Hình 3.10: Ảnh hưởng nhiệt độ bảo quản tới chủng VNC53 .36 Hình 3.11: Ảnh hưởng thí nghiệm sốc thẩm thấu đến chủng VNC53 37 vii Khoa Công nghệ Sinh Học Sv: Nguyễn Thị Thu CÁC TỪ VIẾT TẮT BSA Bovine serum albumin ARN Axit ribonucleic CO2 Carbon dioxide FAA Free amino acid FAO Tổ chức Lương thực Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc CFU Colony Forming Unit LAB Lactic acid bacteria MRS de Man, Rogosa and Sharpe (Medium for LAB) OD Optical Density WHO Tổ chức Y tế Thế giới ATP Adenozin triphotphat viii Khoa Công nghệ Sinh Học Sv: Nguyễn Thị Thu MỞ ĐẦU Ngày nay, với đà tăng trưởng kinh tế, nhu cầu sản phẩm có giá trị dinh dưỡng cao từ nói chung, sản phẩm từ sữa nói riêng ngày cao Phomat sản phẩm trình lên men sữa, tiêu thụ rộng rãi giới Mặc dù mức tiêu thụ phomat nước ta chưa cao, tăng qua năm, đặc biệt thành phố lớn Trong sản xuất phomat, giống khởi động yếu tố quan trọng định chất lượng sản phẩm Các vi khuẩn lactic: Lactococcus lactis subsp cremoris, Lactococcus lactis subsp latis, loài thuộc chi Leuconostoc… giống khởi động thương mại hóa cho nhiều loại phomat: Cheddar, Gouda… Ở Việt Nam, nguồn giống nhập Do đó, nhu cầu nghiên cứu, tạo giống khởi động để chủ động nguồn cung, giảm giá thành sản phẩm cần thiết Các nghiên cứu tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic phù hợp cho lên men phomat tiến nghiên cứu Bộ môn Công nghệ sinh học vi sinh, Viện Cơng nghiệp thực phẩm (thuộc chương trình KC07) Chủng Lactococcus lactis subsp cremoris VNC53 tuyển chọn chủng khởi phù hợp cho lên men phomat Do đề tài nghiên cứu em thuộc lĩnh vực nghiên cứu công nghệ sản xuất giống khởi động, với tiêu đề “ Nghiên cứu công nghệ lên men sinh khối thu hồi chủng Lactococcus lactis subsp cremoris VNC53 có ứng dụng sản xuất phomat” Mục tiêu nghiên cứu: Xác định điều kiện thích hợp để lên men bảo quản sinh khối từ chủng Lactococcus lactis subsp cremoris Page 1  Khoa Công nghệ Sinh Học Sv: Nguyễn Thị Thu VNC53 với mật độ tỷ lệ sống sót cao nhất, nhằm tạo giống khởi động phù hợp cho sản xuất phomat Nội dung nghiên cứu: - Nghiên cứu điều kiện tối ưu để lên men chủng Lactococcus lactis subsp cremoris VNC53: xác định thời gian, môi trường, nhiệt độ, pH tỷ lệ tiếp giống thích hợp để lên men thu sinh khối - Nghiên cứu phương pháp bảo vệ tế bào chủng Lactococcus lactis subsp cremoris VNC53 Page 2  K Khoa Côngg nghệ Sinnh Học Svv: Nguyễn n Thị Thuu Ảnh hưởng h nguồn caccbon đến s sinh trư ưởng chủngg VNC53 Log (CFU/ml) 9.10 9.05 9.00 8.95 8.90 8.85 8.80 Glucose Lactose Fructose Galactosse Ngguồn cacbon Hình 3.1: Khảoo sát nguồ ồn đường chủng c VN NC53 ™ Lựa chọn nồn ng độ đườ ờng Sau khhi lựa chọn nguồn đường đ lactose, l tiếếp tục khảảo sát lựaa chhọn hàm lượng l đườ ờng lactosse thích hợp cho lêên men C Các nồng độ đ lactosee khhảo sát: 100; 15; 20; 25; 30 g/ll Kết thể Hình 3.22 y Ảnh hưởng củ hàm lượ ợng lactosee đến siinh trưở ởng ch hủng VNC C53 Log (CFU/ml) 9.20 9.15 9.10 9.05 9.00 8.95 8.90 10gg/L 15gg/L 20g/L 25 5g/L 30 0g/L H Hàm lượng lacctose (g/L) Hìình 3.2: Nồng N độ đư ường chủnng VNC533 Kết quuả Hình 3.2cho thấyy dải nồ ồng độ lacctose từ 100g/l – 20g//L mật độộ tếế bào tăng chậm từ 1,23x109 CFU/ml C đến đ 1,32x1109 CFU/m ml đạt giá g trị caoo Page 27 7  K Khoa Côngg nghệ Sinnh Học Svv: Nguyễn n Thị Thuu nhhất nồngg độ 25g/L L với mậtt độ tế bào o đạt 1,43×109 CFU U/ml.Tuy nhiên, n khii tăăng dần đếến nồng độ đ 30g/l thhì mật độ tế bào nàày giảm xuống cịn 1,02×109 C CFU/ml Dựa trrên kết mật độ tế t bào thu u được, lựaa chọn nồng độ đườ ờng 25 g/ll đểể tiếp tục khảo k sát cho c thí nghhiệm sau 1.1.2 Lựaa chọn thàành phần đạm nồng n độ đạạm cho lêên men tăn ng sinh kh hối chủngg VNC53 ™ Lựa chọn ngu uồn đạm Mỗi m chủng vi khuẩn lactic kháác đềều có nhu cầu khác k nhauu vềề nguồn đạm, đ nguồnn đường Chính vìì vậy, dựaa mơi trường MRS M – môii trrường chuung cho cáác chủng lactic l để chọn c nguồồn đạm thhích hợp cho c chủngg V VNC53 phát triển Khảo K sát nguồn n đạm m bao gồm m: sữa gầyy, peptone, cao nấm m m với nồồng độ đạm men m đồngg Tỉ lệ tiếp giốống 4%, llên men 30oC sauu 9hh, tiến hànnh phân tíích mật độộ tế bào t dịchh lên men phư ương phápp đếếm khuẩn lạc Kết q thể hiệện Hình 3.3: Ảnh hưở ởng ngguồn đạm đến sin nh trưởngg chủng C53 VNC Log (CFU/ml) 30 20 10 00 90 Skim milk m Pepto one Yeast Extract E MR RS Ng guồn đạm Hìn nh3.3: Ngguồn đườn ng chủủng VNC553 Kết quuả Hìình 3.3 chho thấy ch hủng VNC C53 phát ttriển trênn m trườngg có nguồnn đạm sữa mơi s gầy đạt 1,35×109 CFU/m ml mật độ tế bàoo Page 28 8  K Khoa Côngg nghệ Sinnh Học Svv: Nguyễn n Thị Thuu nàày thay đổổi khác nhhau từ ừng mơi trrường có nguồn đạm m khác nh hau tốtt nhhất mơi m trường có nguồnn đạm caao nấm men đạt 1,884×109 CF FU/ml Dựa vào v kết quuả mật độộ tế bào sau s lên men, m lựa chhọn mơi trường t cóó ngguồn đạm m cao nấấm men làà môi trườ ờng lên meen cho chủủng VNC5 53 tiếpp tụục khảo sáát ảnh hưở ởng cácc nồng độ ộ khác nhaau nguuồn đạm ™ Lựa chọn nồn ng độ đạm m Sau khhi lựa chọọn nguồn n đạm m cao nấm n men, tiến hành h khảo sátt hààm lượng đạm thíchh hợp choo chủng VNC53 V pháát triển, vớ ới nồn ng độ saau: 5; 7; 9; 10; 12; 15; 18 g/l Ảnh hưở ởng hààm lượng đạm đ tới ự sinh trưở ởng VNC C53 Log (CFU/ml) 9.20 9.15 9.10 9.05 9.00 8.95 5g/ll 7g/l 9g/l 10g/l 12g//l 15g/l 18g/l Hàm lượng đạm đ mơơi trường (g/L L) H Hình 3.4: Nồng N độ đạm đ chủngg VNC53 Biểu đồ đ Hình 3.4 cho thhấy với hààm lượngg đạm 5g//L g//l chưaa thhích hợp cho c sinh trưởng c chủng g VNC53, mật độ tếế bào đạt tươngg ứnng 1,122x109 CFU U/ ml 1,18x109 CFU/ ml Mật độ ttế bào cao o đạtt 1,,45x 109 (CFU/ml) tăng lượng đạm m lên 9g/l Tuy nhiênn, tăng g nồng độộ đạạm đến 188g/l mật m độ tế bào b giảm dần d đạt 1,15x109 (CFU/m ml) nồngg độộ 18g/L Do đó, lự ựa chọn nồng n độ đạm đ 9g/l để đ khảo ssát tiếp ch ho thíí ngghiệm tiếpp theo Page 29 9  K Khoa Cơngg nghệ Sinnh Học Svv: Nguyễn n Thị Thuu 1.2 Ảnh hưởng h củ pH môii trường tới t khả năăng sinh ttrưởng pH yếu tố khôông nhỏ ảnh ả hưởng g tới trrình sinh trrưởng củaa vi khuẩnn laactic Mỗi lồi t sốống thích hợp h mộtt pH đđó, tiến hànhh khhảo sát ảnnh hưởng pH môi m trường g tới khả sinhh trưởng c chủngg V VNC53 c dải pH H: 5,0; 5,5; 6; 6,5; 7,0; 7,5 8,0 Kết qquả thể hiệện Hìnhh đâây: Ảnh hưởng h pH đến ự sinh trưở ởng ch hủng VNC C53 9.25 9.10 g Log(CFU/ml) 8.95 8.80 8.65 8.50 8.35 8.20 5.0 5.55 6.0 6.5 7.5 8.0 h củaa pH đến chủng c VN NC53 Hình 3.5: Ảnh hưởng Kết quuả phân tíích cho thấấy chủng VNC53 sống tốt troong mơi trường t pH H ường có pH H 7,0, chủ ủng VNC553 sinh trư ưởng mạnh h vớii trrung tính Ở mơi trư m độ tế bào mật b đạt 1,337x109 CF FU/ml thấp t pH 5,0 (3,77x108CFU/ml) K pH môôi trường tăng Khi t tới từ 7,5 đến 8,0 mật độ tế bàào giảm dần, d tươngg ứnng đạt 1,220x109CF FU/ml 1,12x109 CFU/ml Như vậy, lựa chọn n pH môii trrường pH H 7,0 để lên l men tăăng sinh kh hối chủngg VNC53 1.3 Ảnh hưởng h củ nhiệt độ tới khả sinh h trưởng Nhiệt độ l tronng yếu tố vôô quaan trọng ảnh ả hưởngg khhông nhỏ đến trrình lên men m chủng g VNC53.V Vì sauu tố ối ưu đượcc Page 30 0  K Khoa Côngg nghệ Sinnh Học Svv: Nguyễn n Thị Thuu cáác điều kiệện thànnh phần diinh dưỡng g môôi trường, tiếp tục kh hảo sát vềề ự ảnh hưở ởng nhhiệt độ lênn men tới chủng c VN NC53 Khảảo sát n nhiệtt độộ 25, 28, 30, 32, 35oC Thời gian g lên men m 9h, tiếếp giống 4% Log (CFU/ml) Ảnh hưởng h củaa nhiệt độ đến sin nh trưởng V chủng VNC53 9.40 9.20 9.00 8.80 8.60 8.40 8.20 8.00 25 oC 28 oC 30 oC 32 oC 35 oC Nhiệệt độ lên men,, oC Hình 3.6: Ảnh hưởng h nhiiệt độ tới chủng c VN NC53 đ Hình cho thấấy, chủng VNC53 V siinh trưởngg thích hợp p dải 255 Biểu đồ – 30oC, troong đó, mật m độ tế bào b dịch lên men m cao nnhất 28oC, đạtt 1,,68x 109CFU/ml C K nhiệt độ Khi đ tăng cao 32 – 35oC lại trở thành yếu tố ứcc chhế tăngg trưởng c chủngg VNC53,, 35oC mật m độ tế bào c 2,95xx 1008(CFU/m ml) Như v nhiệt độ đ tối ưu để chủng c VN NC53 sinh trưởng làà 288oC 1.4 Ảnh hưởng h củ tỉ lệ tiếp p giống tớ ới khả năn ng sinh trrưởng Lựa chhọn tỷ lệ tiếp giống thích hợp p m yếu u tố quyếtt địịnh đến hiệu h suất c q trrình lên men m Lượnng giống qq chúng sử dụụng khơngg hết lượnng dinh dư ưỡng g môi trườ ờng dẫn đến thành phần p dinhh dư ưỡng tronng môi trư ường dư thhừa g lượng giiống lớn xảảy cạnhh trranh dinh dưỡng troong trình t lên men m sinhh độc tố, t haii Page 31  K Khoa Côngg nghệ Sinnh Học Svv: Nguyễn n Thị Thuu trrường hợpp cho c kết quuả mật độ tế bào khhông cao Tiến hành h khảo sátt tỷỷ lệ tiếp giiống: 2%, 4%, 6%, 8% 10% % Kết quuả thểể Hình H 3.7 dư ưới đây: Ảnh hưởng h củaa tỷ lệ tiếp giống đến n chủng VN NC53 9.14 Log(CFU/ml) 9.09 9.04 8.99 8.94 8.89 2           4               6              8              10 Tỷ lệ tiếp giống (% t ) H Hình 3.7: Ảnh hưởnng tỷ lệ tiếếp giống đến đ chủngg VNC53 Từ kếết thuu được, vớ ới tỉ lệ tiiếp giống 2% mật độ tế bàào đạtt 1,,09x109 CFU/ml C vàà mật độ đạt đ cực đạại tỷ lệ tiếp giốngg 4% (1,35x 109 C CFU/ml) M độ tế bào giảm Mật m dần ta tăng dầần tỷ lệ tiếếp giống lên, l 6% % m độ tế bào mật b 1,229x 109 (C CFU/ml) cịn c 10% % mậtt độ tế bào cònn 1,,20x 109 (C CFU/ml) Lựa chọnn tỷ lệ tiếp giống 4% % để lên m men Động học h trrình lên men m ng Lactocooccuslactiis subsp cremoris c V VNC53 Động học trình t lên men m qu uá trình biến đổi, sinh trưởn ng phátt trriển vii sinh vật t suốtt trình h lên men Quá trìnhh bắt đầu đ từ khii giiống đượcc bổ sungg vào môi trường lêên men chho đến khhi chúng phát p triểnn m mạnh mẽ Việc V tiến hành h kiểm m tra động g học trình t lên m men nhằm m xác địnhh Page 32  Khoa Công nghệ Sinh Học Sv: Nguyễn Thị Thu phát triển chủng giống giai đoạn, thời điểm Từ có lựa chọn định hướng tuỳ vào mục đích thí nghiệm Trong thí nghiệm này, tiến hành kiểm tra động học trình lên men chủng VNC53 tối ưu hóa điều kiện: Hàm lượng đường 25g/l lactose;đạm g/L cao nấm men; tỷ lệ tiếp giống 4%; nhiệt độ lên men 28oC Khảo sát thời gian lên men từ – 24h.Ở thời điểm thực lấy mẫu để xác định mật độ tế bào cách đếm khuẩn lạc môi trường MRS agar, đo pH, xác định giá trị đường sót đạm sót Dong hoc qua trinh len men chung VNC53 9.4 13.0 7.5 9.2 30000 7.0 12.5 25000 9.0 6.0 8.4 5.5 20000 pH 11.5 8.6 15000 8.2 Duong sot, mg/L 8.8 12.0 Log (CFU) Dam sot, g/L 6.5 5.0 11.0 8.0 10.5 4.5 7.8 7.6 10000 4.0 10 15 20 25 30 Time (h) Log (CFU) pH Duong sot, mg/L Dam sot, g/L Hình 3.8: Động học trình lên men chủng VNC53 Kết hình 3.8 cho thấy, mật độ tế bào dịch lên men tăng mạnh đầu từ 5,29x107 tới 7,28x108 CFU/ml Đây giai đoạn pH môi trường giảm nhanh từ 7,0 xuống 5,18 Ở giai đoạn – 10h, mật độ tế bào tăng chậm đạt tối đa thời điểm 10h với mật độ 1,87x109( CFU/ml) Sau 10h lên men, pH giảm xuống 4,55 Đây giai đoạn lượng lactose sử dụng nhiều (10,188 g/L) Page 33  Khoa Công nghệ Sinh Học Sv: Nguyễn Thị Thu Ở giai đoạn sau từ 11 – 24h giai đoạn ổn định, mật độ tế bào có giảm, dao động giá trị 1,5x109 CFU/ml Kết phù hợp với việc sử dụng không đáng kể lượng lactose giai đoạn (sử dụng 3,05 g/L lactose 14h) Kết thúc trình động học, lựa chọn thời điểm kết thúc lên men 10h 3.3 Nghiên cứu lựa chọn chất bảo vệ màng tế bào Sau nghiên cứu điều kiện sinh trưởng tối ưu cho chủng VNC53, nghiên cứu tiếp theo: lựa chọn chất bảo vệ màng tế bào, phương pháp tạo chế phẩm, cần tiến hành để tạo sản phẩm giống khởi động có mật độ tế bào sống cao 3.3.1 Lựa chọn chất bảo vệ màng tế bào chủng VNC53 Quá trình sấy thường làm chết tế bào tế bào vi sinh vật phải chịu thay đổi điều kiện môi trường bên ngồi hay cịn gọi sốc (nhiệt độ, độ ẩm, áp suất ưu trương) Một nguyên nhân gây chết tế bào hư hỏng xảy màng tế bào vi khuẩn Do đó, chọn lựa chất bảo vệ màng tế bào cần thiết để tăng tỷ lệ sống tế bào Trong nghiên cứu này, loại đường: sucrose; đường không khử: trehalose; đường rượu: mannitol, sorbitol glycerol; axit amin: sodium glutamate sử dụng để khảo sát khả bảo vệ màng tế bào chủng VNC53 Sinh khối chủng VNC53, bổ sung vào dung dịch bảo vệ nồng độ 3% Theo dõi tỷ lệ sống tế bào sau 30oC Kết Hình thể tỷ lệ sống chủng VNC53 dung dịch bảo vệ sau 3h Page 34  K Khoa Côngg nghệ Sinnh Học Svv: Nguyễn n Thị Thuu Ảnh hưởng ch hất bảo vệ màng tế bào b tới chủ ủng C53 VNC 100 80 60 40 20 Sucrosee 3% Trehalose 3% Sodium glutamate 3% Mannitol 3% S Sorbitol 3% Glyycerol 3% Hình h 3.9: Ảnhh hưởng chhất bảo vệệ màng tế bào b đến chhủng VNC C53 Biểu đồ đ hình 3.9 cho thấyy, sucrosee có tác độộng tích cự ực tớ ới màng tếế bàào chủng VNC53,vvới tỷ lệ tế t bào sốn ng dung d dịchh sau 3h caoo nhhất, đạt 922,45% Trrong loạại đường rượu glycerol g ccó khả năn ng bảo vệệ m màng tế bàào chủng VNC53 V tốt cả, với v tỷlệ tếế bào sốngg sau 3h làà 84,65%,, soo với mannnitol (36%) sorrbitol (56 6,6%) Soddium gluttamate trehalosee cũũng có tácc dụng bảảo vệ tế bào tốt, tro ong đầu, mật độ tế bào o khhơng đổi, đến 3h thhì tỷ lệ tế bào b sống giảm g xuốnng, tương ứ ứng 80,08% vàà 700,97% 3.2 Ảnh hưởng h sốc nhiệt đếến chủng VNC53 Tiến hành h kiểm m tra khả n thích h ứng với nhiệt độ chủng VNC53 đểể từ lự ựa chọn phương p p pháp tạo chế c phẩm m phù hợpp Sinh kh hối chủngg V VNC53 đư ược bảo quuản dung dịch: sucroose 3%; hỗỗn hợp su ucrose 3% % vàà glyceroll 0,3%, đư ược khảo sát dải nhiệt n độ: 4, 30, 42,, 50oC Kiiểm tra ự sốống sót củủa tế bào sau s giờ, phư ương phápp đếm khuuẩn lạc Kếết thểể hiiện hình h đây: Page 35  K Khoa Côngg nghệ Sinnh Học Svv: Nguyễn n Thị Thuu Kh thíích ứng vớ ới nhiệt độộ ng VNC C53 100.0 Sucrosee 3% Tỷ lệ sống, % 80.0 Sucrosee 3%+ glycero ol  0.3% 60.0 40.0 20.0 0.0 oC/1h 30 oC/1h 42oC/1h 50oC/11h hời gian (h) Nhiệệt độ (oC)/ Th Hìình 3.10: Ảnh hưởnng nhiệt độ bảo quảản tới chủnng VNC53 Biểu đồ đ hình 3.10 cho thhấy chủng VNC53 thhích ứng tốt với dảải nhiệt độộ – 42oC, số lượng tếế bào khôn ng đổi sau 1h (tỷ lệ ttế bào sốn ng 100%) Tuy nhiên, 50oC, tếế bào chủng VNC53 bị chết, tỷ lệ sốngg 0% Đây Đ cănn ứ quan trọọng để thiếết lập thông t số cho c trìình sấy tạoo chế phẩm m 3.3 Ảnh hưởng h sốc thẩm th hấu đến ch hủng VNC C53 Sấy đông khô l trìnnh thăng hoa nước cáchh từ từ Ngược N lại,, trrong phươ ơng pháp sấy s chân không, sin nh khối thhường phải trộn vớ ới vật liệuu sấấy chấtt rắn, nênn tế bào phải p chịu giảm đột đ ngột độ ẩm m môii trrường bênn (từ 80 – 90% % xuống độ ẩm củủa hỗn hợpp vật liệu u sấy 20 – 400%) Ngoài ra, nhiệệt độ sấy cao c gây g thoát t nướcc khỏi tế bào b vậtt liệu sấy nhhanh Do vậy, đánhh giá khả chịịu sốc thẩẩm thấu c chủngg V VNC53 cần thiếtt Khảo sát s ảnh hư ưởng củaa sốc thẩm m thấu đếến tế bàoo V VNC53 dung dịch: d glyccerol 40% glycerrol 85% K Kết kh hảo sát thểể hiiện hình h đây: Page 36 6  K Khoa Côngg nghệ Sinnh Học Svv: Nguyễn n Thị Thuu Ảnh hưởn ng shoock thẩm t  thấu đến chủng VNC53 V Tỷ lệ sống, % 100.0 NaCl 0,8 85% 80.0 Glycerol 40% 60.0 Glycerol 85% 40.0 20.0 0.0 4 oC/ 1h 30 oC/1h 42 oC/1h 50 oC/1h độ (oC) / Thờ ời gian (h) Nhiệt đ Hìn nh 3.11: Ảnh Ả hưởngg shock thẩm thấấu đến chủủng VNC53 Dung dịch glyccerol 85% %, gây thoát nước từ ttế bào ch hất mơii trrường bênn ngồi nhhanh so với du ung dịch glycerol 440% Kết hìnhh 11 cho thhấy, tỷ lệ tế bào sốống dung dịch glycerol 85% tất t cácc nhhiệt độ thấp Ngược N lạii, du ung dịch glycerol g 400%, tế bào o khhông bị chết (tỷ lệ sống từ 95 – 100% %) ngoại trừ 50oC C Như vậậy, chủngg V VNC53 chỉỉ chịu đượ ợc khả nănng nư ước khỏi tếế bào mộtt cách từ từ Căn ứ vàào kết quảả thí nghiệm n sốcc nhiệt, số ốc thẩm thhấu thấy, phư ương phápp sấấy đơng khhơ thích hợp h cho viiệc tạo chế phẩm giiống khởi động VN NC53 Tuyy nhhiên, thông t số v điều kiiện sấy nh hư: thời giian, nhiệt độ, độ ẩm m cần phảii cóó nghiên n cứuu tiếp theoo Page 37 7  Khoa Công nghệ Sinh Học Sv: Nguyễn Thị Thu KẾT QUẢ VÀ KIẾN NGHỊ ™ Lựa chọn mơi trường thích hợp cho chủng phát triển, mơi trường thích hợp mơi trường MRS có nguồn đạm cao nấm men với hàm lượng 9g/l; nguồn đường lactose với hàm lượng đường 25g/l ™ Điều kiện ni cấy thích hợp để tăng sinh khối - Nhiệt độ: 280C - pH 7,0 - Tỷ lệ tiếp giống 4% - Thời gian lên men 10 - Lựa chọn chất bảo vệ màng tế bào cho chủng VNC53 + chất bảo vệ màng tế bào tốt sucrose + nhiệt độ thu hồi để thu hồi từ đến 42oC ™ Kiến nghị Sau tối ưu điều kiện lên men tăng sinh khối, tiếp tục nghiên cứu điều kiện tạo chế phẩm để có tế bào có tỷ lệ sống cao Page 38  Khoa Công nghệ Sinh Học Sv: Nguyễn Thị Thu TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt Đinh Huy Sơn (2014), Nghiên cứu tuyển chọn chủng giống khởi động cho lên men phomat, Luận văn thạc sĩ Lê Thị Liên Thanh, Lê Văn Hồng (2002), Cơng nghệ chế biến sữa sản phẩm từ sữa, Nhà xuất Khoa học kỹ thuật, Hà Nội Tài liệu tiếng anh Abadias, M., Benabarre, A., Teixido, N., Usall, J., & Vin˜as, I (2001a) Effect of freeze-drying and protectants on viability of the biocontrol yeast Candida sake International Journal of Food Microbiology,65,173–182 Burcu OKUKLU (2005), Investigation of chromosomal and plasmid DNA profiles of Lactococcus lactis ssp lactis, Izmir Institute of Technology, Turkey Crowe, L.M., Reid, D.S., & Crowe, J.H (1996) Is trehalose special for preserving dry biomaterials Biophysical Journal, 71, pp 2087-2093 Cisem BULUT (2003), Isolation and molecular characterization of lactic acid bacteria from cheese, Izmir Institute of Technology, Turkey Cogan T M., Barbosa M., Beuvier e., Branchi-Salvodari B., Cocconcelli P.S., FernandesbI., Gomez J., Gomez R., Kalantzopoulos G., Ledda A., Medina M., Rea M C: and Rodriguez E (1997), “Characterization of the lactic acid bacteria in artisanal dairy products”, International of Dairy Research, 64, pp 409 – 421 Castro, H P., Teixeira, P M., & Kirby, R (1996) Changes in the membrane of Lactobacillus bulgaricus during storage following freezedrying Biotechnology Letters, 18, 99–104]; Page 39  Khoa Công nghệ Sinh Học Sv: Nguyễn Thị Thu Carvalho, A S., Silva, J., Ho, P., Teixeira, P., Malcata, F X., & Gibbs, P (2003c) Protective effect of sorbitol and monosodium glutamate during storage of freeze-dried lactic acid bacteria Le Lait, 83, 203–210 10 Fatma A M Hassan, Mona A M Abd El – Gawad, A K Enab (2013), “Flavour Compounds in Cheese (Review)”, Research on Precision Instrument and Machinery, 2, pp 15 – 29 11 W.H Holzapfel and B.J.B Wood ( 1995), The Genera of Lactic Acid Bacteria 12 Ivano De Noni, Richard J FitzGerald, Hannu J T Korhonen, Yves Le Roux, Chris T Livesey, Inga Thorsdottir, Daniel Tomé, Renger Witkamp (2009), Review of the potential health impact of βcasomorphins and related peptides, EFSA Scientific Report, 231, pp 1107 13 Juliano De Dea Lindner (2008), Traditional and innovative approaches to evaluate microbial contribution in long ripened fermented foods: the case of Parmigiano Reggiano cheese, University of Parma, italia 14 Patrick F.Fox, Paul L.H.McSweeney, Timothy M.Cogan and Timothy P.Guinee (2004), Cheese Chemistry, Physics and Microbiology Volume 15 Pieter Walstra, Jan T M Wouters, Tom J Geurts (2006), Dairy Science and Technology Second Edition, Taylor & Francis Group, USA 16 Paul L.H.McSweeney (2000), “Biochemical pathways for the production of flavour compounds in cheeses during ripening: Areview”, INRA, EDP Sciences, lait 80, pp 293 – 324 17 Paul L.H McSweeney (2004), “Biochemistry of cheese ripening”, International Journal of Dairy Technology, 57, pp 127 – 144 18 Quintans N G., Blancato V., Repizo G., Magni C and Paloma López P (2008), “Molecular aspects of lactic acid bacteria for traditional and new Page 40  Khoa Công nghệ Sinh Học Sv: Nguyễn Thị Thu application”, Applied Microbiology and Biotechnology, 51, pp 422 – 430 19 Selmer-Olsen, E., Birkeland, S.-E., & S^rhaug, T (1999) Effect of protective solutes on leakage from and survival of immobilized Lactobacillus subjected to drying, storage and rehydration Journal of Applied Microbiology, 87, 429–437 Page 41