Nghiên cứu thu nhận và tinh sạch enzyme cellobiose dehyrogenase từ loài nấm coprinellus aureogranulatus

ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đề tài: Nghiên cứu thu nhận tinh enzyme Cellobiose dehydrogenase từ loài nấm Coprinellus aureogranulatus Người hướng dẫn: TS Đỗ Hữu Nghị Sinh viên thực hiện: Tạ Đức Lâm Lớp 17 – 01 Mã sinh viên: 17A31010084 HÀ NỘI- 2021 ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP Đề tài: Nghiên cứu thu nhận tinh enzyme Cellobiose dehydrogenase từ loài nấm Coprinellus aureogranulatus Người hướng dẫn: TS Đỗ Hữu Nghị Sinh viên thực hiện: Tạ Đức Lâm Lớp 17 – 01 Mã sinh viên: 17A31010084 HÀ NỘI- 2021 Lời cảm ơn Để hoàn thành đề tài tốt nghiệp em anh chị, cô nhiều quan khác tạo điều kiện giúp đỡ Em xin phép bày tỏ lòng biết ơn đến anh chị, cô quan tạo điều kiện để em hoàn thành đề tài tốt nghiệp Thời gian thực tập làm đồ án vừa qua thời gian để em học hỏi, nghiên cứu so sánh ứng dụng kiến thức học giảng đường vào thí nghiệm trực tiếp nơi quan thực tập Em xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến cán phòng Sinh Học Thực Nghiệm, Viện Hóa học hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Các anh chị, phịng nhiệt tình dạy, ân cần theo sát, quan tâm để em hồn thành xong đề tài tốt nghiệp Đặc biệt em xin gửi lời cám ơn chân thành đến TS Đỗ Hữu Nghị thầy hướng dẫn em đồ án lần Cảm ơn thầy bảo, theo sát cung cấp cho em nhiều kiến thức bổ ích q trình thực tập làm đề tài tốt nghiệp Em xin gửi lời cám ơn đến cô cố vấn học tập tồn thể thầy cơng tác khoa Công nghệ sinh học, Trường Đại học Mở Hà Nội tạo điều kiện nơi thực tập hỗ trợ em bạn sinh viên khác khoa Với kinh nghiệm thời gian hạn chế sinh viên em, đồ án tránh khỏi thiếu sót, em mong nhận đóng góp, ý kiến nhận xét thầy để em có điều kiện bổ sung nâng cao kiến thức thân Khi nhận góp ý em bổ sung sửa đổi để đề tài em hoàn thiện MỤC LỤC Mở đầu I Lý chọn đề tài II Lịch sử nghiên cứu Chương 1: TỔNG QUAN 1.1 Sinh khối giàu lignocellulose từ nguồn phụ phẩm nông - lâm nghiệp Việt Nam 1.2 Giới thiệu nấm 1.3 Nấm phân giải Lignocellulose 13 1.4 Giới thiệu loài nấm Coprinellus aureogranulatus 14 1.5 Giới thiệu enzyme cellobiose dehydrogenase 16 1.6 Ứng dụng 24 Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.1 Đối tượng nghiên cứu, hóa chất thiết bị 27 2.2 Phương Pháp Nghiên cứu 29 Chương 3: Kết thảo luận 34 3.1 Kết lên men thu nhận enzyme 34 3.2 Kết tinh protein 34 3.3 Xác định độ tinh protein 39 3.4 Khảo sát điều kiện hoạt động tương thích 40 Kết Luận kiến nghị 42 Tải liệu Tham Khảo 44 Danh mục viết tắt Tên tiếng Anh Tên tiếng Việt CDH Cellobiose dehydrogenase Cellobiose dehydrogenase CYT Cytochrome domain of CDH Vùng cytochrome CDH DET Direct electron transfer Vận chuyển điện tử trực tiếp DCIP 2,6-Dichlorophenolindophenol 2,6Dichlorophenolindophenol DH DH domain of CDH Miền DH CDH FAD Flavin adenine dinucleotide Flavin adenine dinucleotide FPLC Fast protein liquid chromatography Sắc ký lỏng protein nhanh GDH Glucose dehydrogenase Glucose dehydrogenase GMC Glucose-methanol choline Glucose-methanol choline IET Interdomain electron transfer Vận chuyển điện tử nội phân tử LPMO Lytic polysaccharide monooxygenase Lytic polysaccharide monooxygenase MET Mediated electron transfer Vận chuyển điện tử qua trung gian MWCO Molecular weight cut off Siêu lọc theo khối lượng phân tử NADP Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate ITS internal transcribed spacer Trình tự Nu vùng nhân OD Optical density Mật độ quang học Tên viết tắt Danh mục hình ảnh, đồ thị Hình 1.1: Cấu tạo lignocellulose Hình 1.2: Mặt cắt vi sợi lignocellulose Hình 1.3: Nấm Coprinellus disseminatus lồi nấm thuộc chi Coprinellus thuộc ngành Bacidiomycota Hình1.4: Nấm Sarcoscypha coccsinea lồi nấm thuộc ngành Ascomycota Hình 1.5: Các dạng hình thái lồi nấm Coprinellus aureogranulatus Hình 1.6: Hình ảnh lồi nấm Coprinellus aureogranulatus tự nhiên Hình 1.7: Cấu trúc in vivo CDH CDH lấy electron cellobiose chuyển sang trung tâm đồng LPMO để kích hoạt phân tử oxi, phân cắt cellulose Hình 1.8: Sự phân bố xuất gene lpmo cdh genome nấm Hình1.9: Phân loại CDH Hình1.10: Cấu trúc PcCDH Hình 1.11: Cơ chế xúc tác CDH mối liên hệ với LPMO Hình 1.12: Dịch chuyển điện tử CDH từ chất sang số chất nhận điện tử Hình 2.1: Hệ sắc ký protein nhanh ÄKTA pure 150M, GE Healthcare Biosciences phịng Sinh học thực nghiệm (Viện hóa học hợp chất thiên nhiên) sử dụng đề tài Hình 3.1: Đồ thị chạy cột DEAE - sepharose, nồng độ protein xác định độ hấp thụ quang học bước sóng 280nm Hình 3.2: Đồ thị chạy cột Q - sepharose, nồng độ protein xác định độ hấp thụ quang học bước sóng 280nm Hình 3.3: Kết điện di SDS-PAGE (trái) điện di pI (phải) CauCDH sau tinh dòng thứ protein marker dòng Hình 3.4: So sánh hoạt tính CauCDH điều kiện nhiệt độ khác Hình 3.5: So sánh hoạt tính CauCDH dung dịch đệm có giá trị pH khác Danh mục bảng Bảng 1: Lịch sử nghiên cứu enzyme CDH Bảng 2: Sinh khối lignocellulose từ phế phẩm nông - lâm nghiệp Việt Nam Bảng 3: Thiết bị sử dụng hãng sản xuất Bảng 4: Tổng hợp kết tinh enzyme CauCDH Mở đầu I Lý chọn đề tài Sinh vật phân hủy lignocellulose đóng vai trị quan trọng việc trì vịng tuần hồn carbon nhờ khả chuyển hóa vật liệu có thành phần lignocellulose hệ thống enzyme thủy phân oxi hóa, chúng có vai trị việc phá vỡ cấu trúc phức tạp lignocellulose [31] Trong nhóm vi sinh vật sản sinh enzyme phân giải lignocellulose, nấm nhóm nghiên cứu nhiều Các loại nấm khác có khả sinh enzyme phân giải lignocellulose khác nhau.Trong loại nấm mục nấm mục nâu nấm mục trắng phổ biến Việt Nam Việt Nam nước có đa dạng sinh học cao giới với giới Trong có hàng ngàn lồi nấm khác Nấm mục có vai trị quan trọng việc phân giải cellulose, nhờ có khả sinh loại enzyme ngoại bào (cellulase, lignin peroxidase, mangan peroxidase, laccase, cellobiose dehydrogenase, …) Tuy nhiên, nước cơng trình khoa học nghiên cứu đặc tính cellobiose dehydrogenase, đặc biệt khả sinh enzyme cellobiose dehydrogenase từ nấm lớn Việt Nam Từ sở khoa học thực tiễn làm động lực cho em chọn đề tài: “Nghiên cứu thu nhận tinh enzyme cellobiose dehydrogenase từ loài nấm Coprinellus aureogranulatus” II Lịch sử nghiên cứu Cellobiose dehydrogenase (CDH) nghiên cứu từ năm 1974 Westermark Eriksson phát hai loài nấm mục trắng Trametes versicolor Phanerochaete chrysosporium[31] Dưới bảng thông kê khám phá quan trọng enzyme CDH từ lúc phát đến Năm Sự kiện 1974 Lần đầu phát CDH nấm mục trắng (T versicolor & P 31 chrysosporium) 1980 Lần đầu phát CDH nấm mục nâu (Monilia sp.) 33 1991 Quan sát phân tách protein miền CDH 34 1992 Sự tạo thành Fe2+ H2O2 35 1992 Ứng dụng CDH cảm biến sinh học MET cellobiose dựa 36 polymer oxy hoá khử 1996 Ứng dụng tượng dịch chuyển điện tử trực tiếp CDH làm 37 điện cực than chì 2000 Giải mã cấu trúc miền CYT 12 2002 Giải mã cấu trúc miền DH 13 2002 Tiềm oxy hoá khử cofactor DH CYT tỷ lệ IET 38 xác định 2006 CDH sử dụng làm nguyên tố sinh học cho biosensor lactose 39 hệ 2004 Phân loại CDH theo gene thành loại I, II, III 2008 Sử dụng CDH làm anode pin nhiên liệu sinh học glucose/O2 28 2011 Sử dụng CDH làm nguyên tố sinh học biosensor glucose 40 hệ 2011 Phát LPMO chất nhận điện tử tự nhiên CDH 41 2016 Ứng dụng CDH biosensor 42 2016 Khảo sát chế tương tác CDH LPMO 43 2018 Sử dụng CDH làm anode biosupercapacitor (siêu tụ điện) 41 2019 Thêm nhóm IV vào nhóm phân loại CDH 16 TLTK Bảng 1: Lịch sử nghiên cứu enzyme CDH 18 3.3 Xác định độ tinh protein Hình 3.3: Kết điện di SDS-PAGE (trái) điện di pI (phải) CauCDH sau tinh dòng thứ protein marker dòng Độ tinh khiết C aureogranulatus CDH (CauCDH) sau bước cuối cột HiTrap Q đánh giá phân tích điện di gel polyacrylamide 12% SDS, cho thấy dải band rõ ràng với khối lượng phân tử 109 kDa (Hình 3.3) CauCDH tinh khiết thể giá trị pI pH acid yếu 5.4 xuất dạng dải protein đồng gel IEF sau nhuộm Colliodal blue Kết tinh CauCDH tóm tắt bảng 39 3.4 Khảo sát điều kiện hoạt động tương thích 3.4.1 Điều kiện nhiệt độ Hình 3.4: So sánh hoạt tính CauCDH điều kiện nhiệt độ khác Trong nhiệt độ khảo sát từ 30 đến 70ºC dựa vào kết ta thấy rằng: Từ nhiệt độ 30 đến 50ºC ta thấy tăng nhiệt độ lên hoạt tính CauCDH tăng theo qua mức 50ºC ta tăng nhiệt độ hoạt tính CauCDH ngày giảm Nhìn vào biểu đồ ta thấy hoạt tính CauCDH mạnh nhiệt độ từ 45-55ºC 40 3.4.2 Khảo sát điều kiện pH Hình 3.5: So sánh hoạt tính CauCDH dung dịch đệm có giá trị pH khác Trong pH khảo sát từ đến dựa vào kết ta thấy: Ở pH từ đến 5,5 hoạt tính CauCDH tăng ta tăng pH lên Từ pH 5,5 đến ta tăng pH hoạt tính CauCDH giảm, pH thích hợp để hoạt tính CDH mạnh thể pH 5,5 Kết tối ưu điều kiện hoạt động tương đối phù hợp với nghiên cứu enzyme CDH khác công bố 41 Kết Luận Kiến nghị Kết Luận Từ kết nghiên cứu, rút số kết luận sau: Sau quy trình tinh gồm bước thu enzyme cellobiose dehydrogenase từ loài nấm Coprinellus aureogranulatus(CauCDH), thể băng gel điện di SDS-PAGE điện di IEF với trọng lượng phân tử MW = 109kDa pI = 5,4 Sau quy trình tinh này, hàm lượng CauCDH cịn lại đạt 22.7% tinh 41.9 lần từ dịch lọc nuôi cấy thô với hoạt độ riêng 28,86 U/mg (tổng 411,8 U) Sau quy trình khảo sát nhiệt độ thích hợp với enzyme cho thấy nhiệt độ lý tưởng từ 45 – 55 ºC hoạt tính enzyme nhiệt độ cao Khảo sát hoạt tính enzyme với dải pH từ đến cho thấy pH 5,5 hoạt tính CauCDH cao Khi so sánh kết nghiên cứu với kết số nhóm nghiên cứu khác cơng bố trước đó, nhận thấy có số điểm khác biệt đặc tính enzyme điều kiện tối ưu enzyme Điều dễ hiểu đặc tính enzyme phụ thuộc vào nhiều yếu tố, nguồn nấm phân lập địa phương phân lập Các loại nấm phân lập từ quốc gia khác nhau, có khí hậu khác nhau, vùng có đặc tính dinh dưỡng khác nhau, hay chí thân khác có đặc tính khác 42 Kiến nghị: Từ kết nghiên cứu, chúng tơi có số kiến nghị: Kết nghiên cứu thu cellobiose dehydrogenase tinh từ Coprinellus aureogranulatus, nghiên cứu xác định đặc tính xúc tác đặc hiệu chất enzyme Nghiên cứu ứng dụng enzyme xúc tác chuyển hóa sinh khối lignocellulose 43 Tải liệu Tham Khảo Lê Mai Hương, Trần Thị Hồng Hà, Đỗ Hữu Nghị (2019), Một số kết nghiên cứu định hướng ứng dụng chất có hoạt tính sinh học từ nấm lớn Việt Nam, NXB Khoa học tự nhiên Cơng nghệ Vũ Đình Giáp, Thái Thị Mỹ Hiệp, Đỗ Hữu Nghị (2020), Nghiên cứu khả sinh tổng hợp celobiose dehydrogenase từ số lồi nấm phân lập rừng mưa phía Bắc Việt Nam, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 18(1): 135-145 Stefan Scheiblbrandner, dehydrogenase: Roland Bioelectrochemical Ludwig (2020), insights and Cellobiose applications, Bioelectrochemistry Christin Fischer, Annett Krause and Thomas Kleinschmidt (2014), Optimization of production, purification and lyophilisation of cellobiose dehydrogenase by Sclerotium rolfsii, BMC Biotechnology 2014, 14:97 Barry B Hunter, J.V Hoyes and H.L Barnett (1974), The additions of aureomycin and chloramphenicol to various fungal media to prevent bacterial contamination, Penn State University Press (Schmidhalter, D.R., Canevascini, G., 1993 Isolation and characterization of the cellobiose dehydrogenase from the brown rot fungus Coneophora puteana (Schum ex Fr.) Karst Arch Biochem Biophys 300 (2), 559–563 44 Pérez-Torrado R, et al (2002), Wine yeast strains engineered for glycogen overproduction display enhanced viability under glucose deprivation conditions Appl Environ Microbiol 68(7):3339-44 G Wojtczak et Al (1987), A comparison of the thermostability of cellulases from various thermophilic fungi, Applied Microbiology and Biotechnology volume 27, pages82–87 Lizbeth Laureano-Perez (2005), Understanding factors that limit enzymatic hydrolysis of biomass, Applied Biochemistry and Biotechnology volume 124, pages1081–1099(2005) 10 Uljé CB, Aptroot A, van Iperen A (1998), “A new Coprinus from Papua New Guinea sporulating in pure culture” Persoonia 16 (4): 549–51 11 S.M Kremer, P.M Wood (1992), Production of Fenton’s reagent by cellobiose oxidase from cellulolytic cultures of Phanerochaete chrysosporium, Eur J Biochem 208 12 B.M Hallberg, T Bergfors, K Bäckbro, G Pettersson, G Henriksson, C Divne (2000), A new scaffold for binding haem in the cytochrome domain of the extracellular flavocytochrome cellobiose dehydrogenase, Structure 8, 79–88 13 B Martin Hallberg, G Henriksson, G Pettersson, C Divne (2002), Crystal structure of the flavoprotein domain of the extracellular flavocytochrome cellobiose dehydrogenase, J Mol Biol 315, 421–43 45 14 Roland Ludwig, Roberto Ortiz, Christopher Schulz, Wolfgang Harreither, Christoph Sygmund, Lo Gorton (2013), Cellobiose dehydrogenase modified electrodes: advances by materials science and biochemical engineering, Anal Bioanal Chem 15 L Sützl, C.V.F.P Laurent, A.T Abrera, G Schütz, R Ludwig, D Haltrich (2018), Multiplicity of enzymatic functions in the CAZy AA3 family, Appl Microbiol Biotechnol 102, 2477–2492 16 L Sützl, G Foley, E Gillam, M Bodén, D Haltrich (2019), The GMC superfamily of oxidoreductases revisited: analysis and evolution of 17 fungal GMC oxidoreductases, Biotechnol Biofuels 12, 118 M Zámocký, R Ludwig, C Peterbauer, B.M Hallberg, C Divne, P Nicholls, D.Haltrich (2006), Cellobiose dehydrogenase – a flavocytochrome from wood-degrading, Phytopathogenic and saprotropic fungi, Curr Protein Pept Sci 7, 255–280 18 M Zámocký, M Hallberg, R Ludwig, C Divne, D Haltrich (2004), Ancestral gene fusion in cellobiose dehydrogenases reflects a specific evolution of GMC oxidoreductases in fungi, Gene 338, 1–14 19 Sanchita Banerjeea, Ankit Royb, M S Madhusudhanb, Hridoy R Bairagyaa, Amit Roya (2019), Structural insights of a cellobiose dehydrogenase enzyme from the basidiomycetes fungus Termitomyces clypeatus 20 D Kracher, S Scheiblbrandner, A.K.G Felice, E Breslmayr, M Preims, K Ludwicka, D Haltrich, V.G.H Eijsink, R Ludwig (2016), Extracellular electron transfer systems fuel cellulose oxidative degradation, Science 352, 1098–110 46 21 B.M Hallberg, G Henriksson, G Pettersson, A Vasella, C Divne (2003), Mechanism of the reductive half-reaction in cellobiose dehydrogenase, J Biol Chem 278, 7160–7166 22 T.-C Tan, D Kracher, R Gandini, C Sygmund, R Kittl, D Haltrich, B.M Hällberg, R.Ludwig, C Divne (2015), Structural basis for cellobiose dehydrogenase action during oxidative cellulose degradation, Nat Commun 23 K Igarashi, I Momohara, T Nishini, M Samejima (2002), Kinetics of inter-domain electron transfer in flavocytochrome cellobiose dehydrogenase from the white-rot fungus Phanerochaete chrysosporium, Biochem J 365, 521–526 24 M Elmgren, S.-E Lindquist, G Henriksson (1992), Cellobiose oxidase crosslinked in a redox polymer matrix at an electrode surface—a new biosensor, J Electroanal Chem 341, 257–273 25 Maria Silvia Bertran, Bruce E.Dale (1986), Determination of cellulose a ccessibility by differential scanning calorimetry 26 Michael E Himmel (2007), Biomass Recalcitrance: Engineering Plants and Enzymes for Biofuels Production, Science 315, 804-807 27 A.T Yahiro, S.M Lee, D.O Kimble (1964), Bioelectrochemistry: I.Enzyme utilizing bio-fuel cell studies, Biochim Biophys Acta BBA Spec Sect Biophys Subj 88, 375–383 28 V Coman, C Vaz-Domínguez, R Ludwig, W Harreither, D Haltrich, A.L De Lacey, T.Ruzgas, L Gorton, S Shleev (2008), A 47 membrane-, mediator-, cofactor-less glucose/oxygen biofuel cell, Phys Chem Chem Phys 10, 6093 29 R.F.H Dekker (1988), Cellobiose dehydrogenase produced by Monilia sp, Methods Enzymol 160, 454–463 30 G Henriksson, G Pettersson, G Johansson, A Ruiz, E Uzcategui (1991), Cellobiose oxidase from Phanerochaete chrysosporium can be cleaved by papain into two domains, Eur J Biochem 196, 101–106 31 U Westermark, K Eriksson (1974), Cellobiose-quinone oxidoreductase, a new wood-degrading enzyme from white-rot fungi, Acta Chem Scand Ser B Org Chem., Biochem B 28, 209–214, https://doi.org/10.3891/acta.chem.scand.28b-0209 32 Palonen H (2004) Role of lignin in the enzymatic hydrolysis of lignocellulose VTT Biotechnology 33 R.F.H Dekker (1988), Cellobiose dehydrogenase produced by Monilia sp, Methods Enzymol 160, 454–463 34 G Henriksson, G Pettersson, G Johansson, A Ruiz, E Uzcategui (1991), Cellobiose oxidase from Phanerochaete chrysosporium can be cleaved by papain into two domains, Eur J Biochem 196, 101–106 35 S.M Kremer, P.M Wood (1992), Production of Fenton’s reagent by cellobiose oxidase from cellulolytic cultures of Phanerochaete chrysosporium, Eur J Biochem 208 36 M Elmgren, S.-E Lindquist, G Henriksson (1992), Cellobiose oxidase crosslinked in a redox polymer matrix at an electrode surface—a new biosensor, J Electroanal Chem 341, 257–273 48 37 T Larsson, M Elmgren, S.-E Lindquist, M Tessema, L Gorton, G Henriksson (1996), Electron transfer between cellobiose dehydrogenase and graphite electrodes, Anal.Chim Acta 331, 207– 215 38 K Igarashi, I Momohara, T Nishini, M Samejima (2002), Kinetics of inter-domain electron transfer in flavocytochrome cellobiose dehydrogenase from the white-rot fungus Phanerochaete chrysosporium, Biochem J 365, 521–526 39 L Stoica, R Ludwig, D Haltrich, L Gorton (2006), Third-generation biosensor for lactose based on newly discovered cellobiose dehydrogenase, Anal Chem 78, 393–398 40 F Tasca, M.N Zafar, W Harreither, G Nöll, R Ludwig, L Gorton (2011), A third generation glucose biosensor based on cellobiose dehydrogenase from Corynascus thermophilus and single-walled carbon nanotubes, Analyst 136, 2033–2036 41 T Bobrowski, E González Arribas, R Ludwig, M.D Toscano, S Shleev, W.Schuhmann (2018), Rechargeable, flexible and mediatorfree biosupercapacitor based on transparent ITO nanoparticle modified electrodes acting in μM glucose containing buffers, Biosens Bioelectron 101, 84–89 42 A Cipri, C Schulz, R Ludwig, L Gorton, M del Valle (2016), A novel bioelectronic tongue using different cellobiose dehydrogenases to resolve mixtures of various sugars and interfering analytes, Biosens Bioelectron 79, 515–521 49 43 D Kracher, S Scheiblbrandner, A.K.G Felice, E Breslmayr, M Preims, K Ludwicka, D Haltrich, V.G.H Eijsink, R Ludwig (2016), Extracellular electron transfer systems fuel cellulose oxidative degradation, Science 352, 1098–1101 44 Phẩm, Phan Thị, Đoàn Thị Lê Thị Thu Hương, and Tuyết Lê "sự chuyển đổi sinh khối lignocellulose: từ phế thải đến nguyên liệu tiềm cho sản xuất ethanol sinh học hệ thứ hai việt nam." 50 51 52 53