Nghiên cứu thu nhân b glucan từ bã men bia ở quy mô phòng thí nghiệm

Viện Đại học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn sâu sắc em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ths Vũ Kim Thoa tận tình hướng dẫn, truyền thụ cho em kiến thức chuyên môn vô quý báu lịng nhiệt tình suốt q trình hồn thành khóa luận tốt nghiệp Em xin cảm ơn thầy cô giáo Khoa Công nghệ Sinh học – Viện Đại học Mở Hà Nội tận tình dạy dỗ em kiến thức đồng thời giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho chúng em học tập môi trường khoa học hoàn thiện Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè người bên cạnh động viên, khích lệ, giúp đỡ em suốt q trình học tập thời gian nghiên cứu Do thời gian khả thân cịn hạn chế, khóa luận em khơng tránh khỏi thiếu sót.Em mong nhận bảo thầy đóng góp ý kiến bạn để khóa luận em đầy đủ hồn chỉnh Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngàythángnăm 2016 Sinh viên Nguyễn Thị Hải Yến Nguyễn Thị Hải Yến Page i Khóa luận tốt nghiệp Viện Đại học Mở Hà Nội MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỞ ĐẦU PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung β-glucan 1.1.1 Nguồn nguyên liệu chứa β-glucan 1.1.2 Cấu trúc hóa học β - glucan 1.1.3 Cơ chế tác động β-glucan 1.2 Ứng dụng β-glucan 14 1.2.1 Ứng dụng công nghiệp thực phẩm 14 1.2.2 Ứng dụng β-glucan mỹ phẩm, y tế 15 1.2.3 Ứng dụng β-glucan nuôi trồng thủy sản 16 1.3 Tình hình nghiên cứu ngồi nước 16 1.3.1 Tình hình nghiên cứu β-glucan giới 16 1.3.2 Tình hình nghiên cứu β-glucan nước 18 PHẦN II.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1Vật liệu thiết bị 20 2.2 Phương pháp nghiên cứu 20 2.2.1 Quy trình tạo chế phẩm giàu β-glucan 20 2.2.2 Quy trình tạo chế phẩm giàu β-glucan 22 2.2.3 Phương pháp định lượng β – glucan 22 2.2.4 Phương pháp định lượng chế phẩm giàu β – glucan 23 PHẦN III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25 3.1Lựa chọn dung mơi trích ly β-glucan từ bã men bia 25 3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến q trình trích ly β-glucan từ bã men bia 26 3.2.1 Ảnh hưởng tỷ lệ dung môi DMSO bổ sung 26 3.2.2 Ảnh hưởng nhiệt độ đến q trình trích ly 29 3.2.3 Ảnh hưởng thời gian 31 3.2.4 Ảnh hưởng trình lắc, khuấy tới hiệu suất trích ly 34 4.3 Quy trình thu nhận β-glucan từ bã men bia quy mô thí nghiệm 35 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO 38 Nguyễn Thị Hải Yến Page ii Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Hải Yến DANH MỤC HÌNH VẼ, BẢNG Hình 1.1 Cấu trúc β-glucan Hình 1.2 Cấu trúc hóa học β-glucan Hình 1.3.β-glucan(cịn gọi lentinan) từ Lentinus edodes [Oba, 2009] Hình 1.4 Cấu tạo phân tử (1,3) – β-glucan ( A – curdlan; B – laminarin) Hình 1.5.Cơ chế hoạt động β-glucan hệ miễn dịch Hình 2.1 Quy trình thu nhận chế phẩm giàu β-glucan từ nấm men khô Naohito Ohno cộng (1999) 21 Hình 2.2 Đồ thị đường chuẩn β – glucan 23 Hình 3.1 Hàm lượng β – glucan dung môi khác 26 Hình 3.2 Ảnh hưởng thể tích dung mơi 28 Hình 3.3: Dịch ly tâm sau ủ với DMS Hình 3.3 : β-glucan tủa 4oC 29 Hình 3.4 : ảnh hưởng nhiệt độ tới hàm lượng β-glucan 30 Hình 3.5 : Hàm lượng β-glucantheo thời gian 33 Bảng 3.1 Kết hàm lượng β – glucan mẫu trích ly với lượng DMSO thay đổi 27 Bảng 3.2 Kết β – glucanthu trích ly nhiệt độ khác 30 Bảng 3: hàm lượng β-glucanthu theo thời gian 32 Bảng 3.4: ảnh hưởng trình khuấy tới hàm lượng β-glucan 34 Lớp 12 -02 Cơng nghệ Sinh học Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Hải Yến MỞ ĐẦU Thực tại, hàng năm giới từ nhà máy chế biến rượu bia, thực phẩm ủ chua… thải lượng bã khổng lồ.Ở Việt Nam, nấm men bia thu từ nhà máy bia lớn Ứơc tính trung bình 1000 lít bia thu 1,5 kg nấm men khô [Hồ Xưởng,1996].Năm 2005, sản lượng bia nước đạt 1,5 tỷ lít, tương ứng với 18 triệu sinh khối nấm men thải ra.Đến năm 2010, sản lượng bia nước đạt 2,5 tỷ lít lượng nấm men thải 30 triệu [Nguyễn Thị Hoàng Anh cs, 2008].Hầu hết sản phẩm lên men dùng để chế biến thức ăn cho động vật, làm phân cải tạo đất đươc dùng làm nguyên vật liệu rẻ tiền để sản xuất dịch chiết nấm men tự phân.Song tồn đọng 50-60% lượng chất rắn thô mà chủ yếu thành tế bào nấm men (trong β-glucan chiếm 50-60% trọng lượng khô thành tế bào nấm men)nguồn chất rắn bán làm thuôc bổ sung cho chăn nuôi với giá rẻ thải môi trường gây ô nhiễm Nhiều nước giới Hàn Quốc, Mỹ, Nhật Bản… có sản phẩm β-glucan sản xuất từ tế bào nấm men để sử dụng yếu tố kích thích miễn dịch tiềm ẩn tác động đáng kể đến việc bảo vệ vật chủ, tăng tính đề kháng vật chủ phần lớn loại bệnh nhiễm khuẩn, nấm, virut nhiều sinh vật kí sinh khác.Khơng vậy, nhà khoa học Nhật Bản sản xuất chế phẩm β-glucan yếu tố kích thích miễn dịch hiệu điều trị ung thư.Bên cạnh đó, β-glucan cịn chất chống xi hóa có tác dụng tái tạo da, làm mờ nếp nhăn nên sử dụng làm chất bổ sung để sản xuất mỹ phẩm Sản xuất chế phẩm giàu β-glucan từ bã men bia có ý nghĩa lớn lao việc giải phế thải cho nhà máy sản xuất bia, tạo sản phẩm có giá trị kinh tế cao, đồng thời cịn góp phầnbảo vệ mơi trường.Do đó, nhóm nghiên cứu tiến hành thực đề tài“Nghiên cứu thu nhận β-glucan từ bã men bia quy mơ phịng thí nghiệm ’’ Lớp 12 -02 Công nghệ Sinh học Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Hải Yến PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung β-glucan 1.1.1 Nguồn nguyên liệu chứa β-glucan Nguồn nguyên liệu tự nhiên để thu nhận β-glucan bao gồm vi khuẩn, nấm men, tảo, nấm lớn, đaị mạch yến mạch.Cấu trúc hóa học β-glucan phụ thuộc vào nguồn gốc nguyên liệu.(1,3), (1,6) β-glucan có vi khuẩn Alcalignes faecalis, tảo Euglena gracilis,…(1,3), (1,6) β-glucan có tảo Laminaria sp ,tảo nâu Eisenia bicyclis, nấm hương Lentnula ododes, nấm men Saccharomyces cerevisiae,… (1,3), (1,4) β-glucan thu nấm sò Pleurotus ostreatus, đại mạch , yến mạch số loại hạt khác [Hunter cs,2002].β-glucan yến mạch lúa mạch có khơng có hoạt tính.Nhưng β-glucan nước yến mạch có tác dụng làm giảm nguy bệnh tim.β-glucan tìm thấy nấm lớn có phân nhánh với phân tử glucoza tăng cường miễn dịch đến mức đó.Bên cạnh đó, βglucan chiết từ thành tế bào nấm men S cerevisiae phân nhánh mạnh có khả tăng hoạt tính miễn dịch mạnh tất loại βglucan [Chan cs, 2009].Β-glucan hợp chất đường liên phân tử tạo nên từ đơn phân tử D-glucose gắn với qua liên kết β-glycoside.Các β-glucan nhóm phân tử phân biệt dựa vào phân tử khối, độ hòa tan, độ nhớt cấu trúc không gian chiều Các nghiên cứu cho thấy dạng hợp chất khơng hịa tan (1,3/1,6) βglucan có hoạt tính sinh học cao dạng (1,3/1,4) β-glucan.Sự khác liên kết β-glucan cấu tạo hóa học chủ yếu độ hòa tan, phản ứng hoạt tính sinh học Lớp 12 -02 Cơng nghệ Sinh học Nguyễễn Thị Hải Yến Khóa luận tốt nghiệp 1.1.2 Cấu trúc hóa họcc β - glucan Hình 1.1 Cấu trúc β-glucan β-Glucan (beta-glucan) glucan) hợp h chất đường liên phân tử đư tạo nên từ đơn phân tử D-glucose glucose gắn g với qua liên kết β-glycoside glycoside.Các βGlucan nhóm phân tử t phân biệt dựa vào phân tử khối, kh độ hòa tan, độ nhớt cấuu trúc không gian chiều.Các chi hợp chất thường ng ttồn dạng phổ biếnn cellulose c thực vật, vỏ cám hạt ngũ cốc, c, thành tế t bào nấm men, nấm m vi khuẩn.Một khu số loại β-Glucan sử ddụng chất dinh dưỡng ngườii hợp chất tạo mịn chất sơ hịa ịa tan, nhiên llại bị biến đổii trong q trình đun sơi Nấm men nấm m y học h hấp phụ β-glucan cho khả nă thích nghi với trình đề kháng Các nghiên cứu cho thấy dạng hợpp ch chất khơng hịa tan (1,3/1,6) β-glucan glucan có ho hoạt tính sinh học cao dạng ng (1,3/1,4) β-glucan [1] Sự khác giữaa liên kết k β-glucan cấu tạo hóa học chủủ yếu độ hịa tan, phản ứng ng hoạt ho tính sinh học β-glucan mộtt biopolymer c 1,3-D-glucose(hoặcc 1,6 1,6-D-glucose) tìm thấyy vách tế t bào vi khuẩn, thực vật nấm.β-glucan glucan bao gồm g liênkếtt không phân nhánh c liên kết β-1,3 1,3 liên kkết β-1,4glucopyranose tạo o nên chuỗi chu polysaccharide, chứa khoảng ng 250 250 000 phân tử glucose Lớp 12 -02 Công nghệ Sinh học Nguyễễn Thị Hải Yến Khóa luận tốt nghiệp Hình 1.2 Cấu trúc hóa học β-glucan β-glucan từ nguồnn khác cấu c trúc khác β-glucan từ yến mạch ch Hàm lượng β-glucan glucan hhạt lúa mạch (3-11%) 11%) yyến mạch (37%).Một lượng nhỏ β-glucans glucans c tìm thấyy lúa (kho (khoảng 2%), lúa mì (khoảng ng 1%) lúa miến mi (0,2-0,5%) Trong trường hợpp yến y mạch, βglucans có mặt chủ yếuu lớp hạt, trong hạtt kúa m mạch, chất trải u toàn b ngũ cốc.Không giống ng nh cellulose không hịa tan, tồn phân tử glucose j nối đươc nối vớii bbởi liên kết βD-(1→4), β-glucans ans có nnội nhũ hạt ngũ cốc hỗnn hhợp β-D→4) glycosizit glucose chuỗii không phân nhánh liên kết k với β-(1→3) β-(1→ [Bednarski,2001] β -glucan glucan yến y mạch lúa mạch có hoặcc khơng có ho hoạt tính.Nhưng β-glucan glucan nước n yến mạch chịu trách nhiệm m cho mối m liên kết tế bào sản n phẩm ph yến mạch giảm nguy bệnh nh tim tim β -glucan từ nấm β-glucan từ nấm m gồm g loại: β-(1→3)/(1→6) 6) glucan, dạng d 4) glucan dạng hịa khơng hịa tan chiếm m kho khoảng 53-58% β-(1→3)/(1→4) tan chiếm khoảng 16-46% 46%.Β-glucan có mức độ phân nhánh trùng hhợp thấp Lớp 12 -02 Cơng nghệ Sinh học Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Hải Yến dạng hòa tan, β-glucan khơng hịa tan phân nhánh nhiều mạch dài hơn.Β-glucan thu từ nhiều loại nấm khác có kích thước phân tử khác nằm khoảng 2x101 -104Kda.Β-glucan có trọng lượng phân tử lớn 3.103 Kda có độ nhớt cao, trọng lượng phân tử khoảng Kda dạng gel [Zekovic cs, 2005] Có vài nấm dạng dược liệu, sử dụng thuốc cổ truyền châu Á như: Chinese Reishi (Ganoderma lucidum), Japanese Shiitake ( Lentinula edodes), Maitake (Trametes versicolor), Split Gill (Schizophyllim commune), Mulberry Yellow Polypore (Phellinus linteus) dạng nuôi trồng như: Hiratake (Pleurotus ostreatus, Oyster mushroom).Hàm lượng β-glucan Basidomycota thấp, khoảng 0.21-0 53 g/100g khơ.β-glucan biết tới cấu trúc hoạt tính sinh học với tên: lentinan từ Letunus edodes, schizophyllan (SPG) từ Schizophyllum commune, pleuran từPleurotus ostreatus pullulans (AP-FBG) từ Aureobasidium pullulan, scleroglucan (SGG) từ Sclerotium rolfsii, grifolan (GRN) từ Grifola frondosa, krestin (PSK- polysaccharide-K and PSP-polysaccharopeptde) từ Coriolus versicolor [Kony cs,2007;Standish cs,2008; Oba cs, 2009; Schmid cs,2010; Jong Suk Lee cs,2010] Hình 1.3.β-glucan(cịn gọi lentinan) từ Lentinus edodes [Oba, 2009] Lớp 12 -02 Công nghệ Sinh học Nguyễễn Thị Hải Yến Khóa luận tốt nghiệp β-glucan từ vi khuẩn Polysaccharide từ t vi khuẩn sử dụng rộng ng rãi công nghiệp nghi thực phẩm chất ch phụ gia.Chúng thường gọii bacterial egzopolisaccharides cấu c tạo thành tế bào sảnn ph phẩm trình trao đổi chất củaa vi khu khuẩn: n: Cellulomonas flavigena ofKU strain, Bacillus curdlanolyticus and Bacillus kobensis, Bacillus and Micromonospora Agrobacterium spp TCC31749, Brady Bradyrhizobium, rhizobium, Rhizobium spp spp.Sarcina ventriculi Các sản phẩẩm từ vi khuẩn: n: xanthan, dextran,pullulan or gellan gellan.Cấu trúc β-glucan củaa vi khu khuẩn tương tự mannans, ng glucose thành phần cấu tạo bản.β glucan sản phẩm củaa trình lên men gọi curdlan laminarin Hình 1.4 Cấu tạoo phân tử t (1,3) – β-glucan ( A – curdlan; B – laminarin) Tính chất β-glucan glucan β-glucan glucan khơng hịa tan nước, n ethanol, aceton ưng lại l tan NaOH (CH3)2SO.Sự ự hòa tan giảm bậc cấuu trúc hóa học tác động chấất oxy hóa mạnh.β- glucan có nguồnn gốc g sinh học, thường tác động đến ự tăngcường đáp ứng miễn dịch tế bào từ loại kháng nguyên, nhiễm m trùng, ung bướu b 1.1.3 Cơ chế tác động ng ccủa β-glucan a) Cơ chế tăng cường ng hệ h miễn dịch Lớp 12 -02 Công nghệ Sinh học Nguyễễn Thị Hải Yến Khóa luận tốt nghiệp β-glucan có khả kích thích hệ miễn dịch chống lạii m mầm bệnh hiệu quả.Theo Theo Patchen, β β-glucan có khả tăng cường mạnh nh m mẽ trình sản xuất đại thựcc bào tăng t tính kháng không đặc hiệu củaa vvật chủ vi khuẩn, loại nấm m bệnh b nhiễm kí sinh trùng β-glucan kết hợp p với v thụ thể bên màng đạại thực bào tế bào bạch cầu u khác (bao gồm g tế bào thựcc bào ttự nhiên tế bào tạo độc tố ố thể).Với kết hợp đặc hiệuu gi thụ thể bề mặt đại thựcc bào vvới tác nhân lạ, β -glucan có tác dụng ng phát hi xâm nhập hoặcc bám vào c thểcủa nhân tố bất lợi cảnh nh báo cho c thể biết chế ch hoạt động β-glucan hệ miễễn dịch Hình 1.5.Cơ β-glucan kết hợp p rrất đặc hiệu với bạch cầuu gây ph phản ứng chuỗi dẫn đến việcc làm gia tăng t hoạt tính miễn dịch: - Sản xuất tếế bào bạch cầu từ tủy xương, bao gồm: m: đđại thực bào, bạch cầu u trung tính hồng h cầu - Huy động tế bào bbạch cầu máu có khả nhận diệnn “kẻ “k thù” di chuyển đến nơi có tácc nhân lạ l - Hoạt tính thựcc bào c bạch cầu tiêu diệt tế bào bên ngồi xâm nh nhập vào Lớp 12 -02 Cơng nghệ Sinh học Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Hải Yến µl sulfuric axit đặc), trộn thành phần ống nghiệm votex Sau đo độ hấp phụ quang dung dịch bước sóng 490 nm Đối chứng thay mẫu nước cất Phương trình tính toán hàm lượng β – glucan mẫudựa phương trình đồ thị chuẩn β – glucanđược viết sau: X =   × × (mg/ml) Trong đó: X: hàm lượng β – glucantrong mẫu cần xác định ∆Abs: giá trị thực độ hấp phụ quang mẫu bước sóng 490nm V : thể tích mẫu phản ứng D : hệ số pha loãng a, b hệ số phương trình đường chuẩn β – glucan Lớp 12 -02 Công nghệ Sinh học 24 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Hải Yến PHẦN III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1Lựa chọn dung mơi trích ly β-glucan từ bã men bia Bã men bia sau tự phân dung dịch NaOH 0,1N 5ml NaClO ủ qua đêm nhiệt độ 40 C Q trình tự phân kết thúc hồn tồn, loại bỏ phần dịch thu nhận phần tủa Phần đươc ly tâm 5000 rpm 20 phút để loại bỏ hết phần nước Tiếp tục rửa tủa với nước cất ethanol làm khô với aceton (tự bay sấy nhẹ) Bổ sung dung môi khác (DMSO, ethanol, nước chloroform) vào hỗn hợp sau sấy Ủ hỗn hợp vào bể ổn nhiệt ủ 90oC giờ.Saukhi ủ, làm nguội ly tâm 5000 vòng/ 20 phút, thu dịch Bổ sung ethanol vào dịch sau ly tâm với tỷ lệ 1/4, ủ qua đêm 40C, ly tâm 5000 vòng/20 phút để thu kết tủaβ – glucan Xác định hàm lượng β – glucan mẫu trích ly dung môi khác Kết thể bảng… Dung môi OD/490 nm β – glucan (g/l) DMSO 0.842 30.34 Ethanol 0.341 11.33 Chloroform 0.389 13.15 Nước 0.401 13.61 Lớp 12 -02 Cơng nghệ Sinh học 25 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Hải Yến Hình 3.1 Hàm lượng β – glucan dung môi khác Kết cho thấy, dung môi khảo sát có khả trích ly β – glucan với hàm lượng khác Trong nước, cồn chloroform, hàm lượng β – glucanthu 30% so với trích ly dung môi DMSO Đối với dung môi nước, ethanol chloroform, hàm lượng β – glucanthu dao động từ 11-13 g/l Khi trích ly β – glucan dung môi DMSO hàm lượng β – glucan thu cao đạt 30.34 g/l, cao gấp lần so với dung môi khác khảo sát Kết phù hợp với nghiên cứu trước sử dụng Do vậy, thí nghiệm tiếp theo, đề tài lựa chọn dung môi khảo sát DMSO 3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến q trình trích ly β-glucan từ bã men bia 3.2.1 Ảnh hưởng tỷ lệ dung mơi DMSO bổ sung β – glucan trích ly số dung mơi thường dùng nước, ethanol Tuy nhiên, hàm lượng β – glucanthu trích ly dung dịch DMSO cao Tỷ lệ dung mơi bổ sung vào q trình trích ly hợp chất hữu có ảnh hưởng lớn đến hiệu suất trích ly Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ dung môi DMSO bổ sung vào Lớp 12 -02 Công nghệ Sinh học 26 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Hải Yến trình trích ly β – glucan Thể tích DMSO bổ sung (50, 100, 150, 200, 250 ml).Sau giữ ổn nhiệt 90oC 1h.Sau ủ, hỗn hợp đuợc làm nguội ly tâm 5000 rpm 20 phút, phần tủa loại bỏ.Dịch ly tâm bổ sung ethanol ủ qua đêm 4oC.Tiếp tục ly tâm 5000 rpm 20 phútthu kết tủa.Xác định hàm lượng β – glucanthu phương pháp đo độ hấp phụ quang bước sóng 490 nm Kết thể bảng … Bảng 3.1 Kết hàm lượng β – glucan mẫu trích ly với lượng DMSO thay đổi DMSO(ml) OD/490nm β-glucan (g/l) 25 0.456 15.7 50 834 30.04 75 1.023 37.21 100 1.025 37.28 125 1.028 37.4 150 1.025 37.28 Từ bảng số liệu biểu diễn qua đồ thị sau: Lớp 12 -02 Công nghệ Sinh học 27 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Hải Yến Hình 3.2 Ảnh hưởng thể tích dung mơi Từ bảng kết quả, thay đổi hàm lượng dung môi dimethyl sunfoxide (tách thành phần β-glucan từ vách tế bào nấm men), hiệu suất trích ly thay đổi theo Hàm lượng dung dịch DMSO tăng, hiệu suất trích ly tăng theo Khi bổ sung dung dịch DMSO với thể tích 25 ml, hàm lượng β-glucan thu thấp (15.7 g/l) Với hiệu suất trích ly thể tích 25 ml DMSO, hàm lượng β-glucan lại nguyên liệu nhiều Khi tăng gấp đôi lượng DMSO lên 50 ml, hàm lượng β-glucan tăng gần gấp đôi (30.04 g/l) Điều cho thấy, thể tích dung mơi trích ly q ít, khơng đủ để tách tồn lượng β-glucan có thành phần tế bào nấm men.Lượng DMSO đủ nhiều đảm bảo trích ly hàm lượng lớn β-glucan nguyên liệu Tiếp tục tăng thể tích dung môi lên 75 ml, hàm lượngβ-glucan thu tiếp tục tăng theo, đạt 37.21 g/l, tăng g/l so với thể tích 50 ml Với tốc độ tăng thấy thể tích dung mơi tận thu β-glucan nguyên liệu Từ thể tích 75 ml, dù có tăng thể tích dung mơi DMSO lên 100, 150… hàm lượng β-glucan trích ly khơng thay đổi Do để bảo đảm tính hiệu tính kinh tế, đề tài lựa chọn thể tích dung dịch Lớp 12 -02 Công nghệ Sinh học 28 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Hải Yến DMSO bổ sung q trình trích ly β-glucan từ bã men bia 75ml dung môi DMSO cho 300 gam bã men bia nguyên liệu Hình 3.3: Dịch ly tâm sau ủ với DMS Hình 3.3 : β-glucan tủa 4oC 3.2.2 Ảnh hưởng nhiệt độ đến trình trích ly Nhiệt độ yếu tố quan trọng q trình trích lythu nhận β-glucan từ bã men bia.Để xác định nhiệt độ thích hợp cho q trình trích ly, tiến hành thực hiệnthí nghiệm sau: tự phân bã men bia dung dịch NaOH 0,1N 5ml NaClO, ủ qua đêm nhiệt độ 40 C Q trình tự phân kết thúc hồn tồn, loại bỏ phần dịch thu nhận phần tủa Ly tâm phần tủa tốc độ 5000 rpm 20 phút để loại bỏ hết phần nước Tiếp tục rửa tủa với nước cất ethanol làm khô với aceton (tự bay sấy nhẹ) Bổ sung dung môi DMSO vào hỗn hợp sau sấy, ủ bể ổn nhiệt mốc nhiệt độ khác (60, 70, 80, 90, 100oC) 1h Saukhi ủ, làm nguội ly tâm 5000 vòng/ 20 phút, thu dịch Bổ sung ethanol vào dịch sau ly tâm với tỷ lệ 1/4, ủ qua đêm 40C, ly tâm 5000 vòng/20 phút để thu kết tủaβ – glucan Xác định hàm lượng β – glucan mẫu trích ly nhiệt độ khác Kết thể bảng… Lớp 12 -02 Công nghệ Sinh học 29 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Hải Yến Bảng 3.2 Kết β – glucanthu trích ly nhiệt độ khác Nhiệt độ(oC) OD/490nm β-glucan (g/l) 60 593 20.89 70 610 21.54 80 716 25.56 90 880 31.78 100 841 30.27 Từ bảng số liệu trên, biểu diễn qua đồ thị sau: Hình 3.4 : ảnh hưởng nhiệt độ tới hàm lượng β-glucan Nhiệt độ có ảnh hưởng lớn đến hiệu trích ly β – glucan từ bã men bia Khảo sát yếu tố nhiệt độ có ý nghĩa quan trọng đặc biệt sản xuất quy mô lớn Nhiệt độ thấp, dễ điều khiển sản xuất, tiết kiệm chi phí hiệu suất trích ly thấp, hàm lượng β – glucan, khơng tận dụng hết nguyên liệu Nhiệt độ trích ly cao, gây tốn chi phí lượng, đem Lớp 12 -02 Cơng nghệ Sinh học 30 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Hải Yến lại hiệu suất trích ly cao, hàm lượng β – glucan lớn, tận thu nguồn nguyên liệu Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ tìm điều kiện thích hợp cho q trình trích ly, hiệu suất thu nhận β – glucan lớn Đảm bảo chi phí sản xuất tiết kiệm Kết từ đồ thị cho thấy, tăng nhiệt độ nhiệt độ từ 60 đến 100oC hàm lượng β-glucan tăng dần; nhiệt độ cao, hàm lượng β – glucan thu lớn Ở nhiệt độ 60oC, mốc nhiệt độ 90oC, hàm lượng β – glucanthu cao 31.78 g/l đạt giá trị cao 90oC 100oC.Do nhiêt độ thích hợp nên chọn 90oC 3.2.3 Ảnh hưởng thời gian Trong thí nghiệm trên, q trình trích ly β-glucan dung môi DMSO thực 60 phút Hàm lượng β-glucan thu thay đổi tùy thuộc vào thể tích dung mơi trích ly, nhiệt độ q trình trích ly Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng thời gian trích ly đến hiệu suất q trình Về mặt lý thuyết, thời gian trích ly dài, hiệu suất thu nhận β-glucan cao Tuy nhiên, hàm lượng β-glucan nguyên liệu giới hạn, đến mức độ β-glucan ngun liệu khơng cịn, tiếp tục trích ly nhiệt độ cao, hàm lượng β-glucan khơng khơng tăng mà bị hao hụt môt số biến đổi không mong muôn Nhằm xác định khoảng thời gian để quy trình thu nhận β-glucan đạt hiệu cao nhất, tiến hành khảo sát q trình trích ly β-glucan khoảng thời gian từ 30-120 phút thời điểm: 30 phút, 45 phút, 60 phút, 75 phút, 90 phút.Bã men bia sau tự phân dung dịch NaOH 0,1N 5ml NaClO ủ qua đêm nhiệt độ 40 C Q trình tự phân kết thúc hồn tồn, loại bỏ phần dịch thu nhận phần tủa Phần đươc ly tâm 5000 rpm 20 phút để loại bỏ hết phần nước Tiếp tục rửa tủa với nước cất ethanol làm khô với aceton (tự bay sấy nhẹ) Bổ sung dung môi khác (DMSO, ethanol, nước chloroform) vào hỗn hợp sau sấy Ủ Lớp 12 -02 Công nghệ Sinh học 31 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Hải Yến hỗn hợp vào bể ổn nhiệt ủ 90oC thời gian khác nhau.Saukhi ủ, làm nguội ly tâm 5000 vòng/ 20 phút, thu dịch Bổ sung ethanol vào dịch sau ly tâm với tỷ lệ 1/4, ủ qua đêm 40C, ly tâm 5000 vòng/20 phút để thu kết tủaβ – glucan Kết thúc trình, xác định hàm lượng β – glucantrích ly mốc thời gian khác phương pháp đo bước sóng 490nm thu kết sau: Bảng 3: hàm lượng β-glucanthu theo thời gian Thời gian (phút) OD/490nm β-glucan (g/l) 15 0.303 9.89 30 375 12.62 45 507 17.63 60 842 30.34 75 0.967 35.08 90 931 33.72 105 912 33.00 Lớp 12 -02 Công nghệ Sinh học 32 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Hải Yến Hình 3.5 : Hàm lượng β-glucantheo thời gian Kết cho thấy, khoảng thời gian từ – 75 phút, thời gian dài, hàm lượng β-glucanthu tăng Trong vòng 15 phút đầu, hàm lượng β-glucan thu thấp, đạt 9.89 g/l Khi thời gian trích ly tăng 75 phút, hàm lượng β-glucan thu cao nhất, gấp lần so với thời gian 15 phút Sau 75 phút, hàm lượng β-glucanthu khơng tăng, chí cịn có xu hướng giảm đến thời gian 90, 105 phút Điều lý giải trình trích ly β-glucan diễn nhiệt độ cao 90oC, ngun liệu khơng cịn β-glucan dù thời gian trích ly kéo dài hàm lượng β-glucan khơng thể tăng thêm Trong đó, nhiệt độ nguyên nhân vài biết đổi làm phân hủy chuyển hóa β-glucan thu nhận, làm giảm hàm lượng β-glucan thu Do vậy, cần lựa chọn thời gian trích ly phù hợp Và nhóm nghiên cứu kết luận thời gian thích hợp cho q trình trích ly 75 phút Lớp 12 -02 Cơng nghệ Sinh học 33 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Hải Yến 3.2.4 Ảnh hưởng q trình lắc, khuấy tới hiệu suất trích ly Trong q trình tách chiết β-glucan dung mơi, việc ngun liệu tiếp xúc hồn tồn với dung mơi ảnh hưởng đến hiệu suất trích ly Khi nguyên liệu ngâm dung môi, đồng thời lắc làm cho tế bào nấm men tiếp xúc với dung môi nhiều hơn, khả tách chiết cao Nhằm xác định xem q trình lắc có ảnh hưởng tới hàm lượng β-glucan thu nhận hay khơng, tiến hành làm thí nghiệm hai điều kiện: q trình trích ly có lắc, khuấy trộn; trích ly dạng tĩnh nghĩa không lắc khuấy suốt trình Bã men bia sau tự phân dung dịch NaOH 0,1N 5ml NaClO ủ qua đêm nhiệt độ 40 C Quá trình tự phân kết thúc hoàn toàn, loại bỏ phần dịch thu nhận phần tủa Phần đươc ly tâm 5000 rpm 20 phút để loại bỏ hết phần nước Tiếp tục rửa tủa với nước cất ethanol làm khô với aceton (tự bay sấy nhẹ) Bổ sung dung môi khác (DMSO, ethanol, nước chloroform) vào hỗn hợp sau sấy Ủ hỗn hợp 90oC thời gian 1h, trình ủ có khuấy khơng khuấy.Saukhi ủ, làm nguội ly tâm 5000 vòng/ 20 phút, thu dịch Bổ sung ethanol vào dịch sau ly tâm với tỷ lệ 1/4, ủ qua đêm 40C, ly tâm 5000 vòng/20 phút để thu kết tủaβ – glucan Kết thúc q trình, xác định hàm lượng β – glucan trích ly điều kiện khác phương pháp đo độ hấp thụ quang bước 490nm Bảng 3.4: ảnh hưởng trình khuấy tới hàm lượng β-glucan Điều kiện OD/490nm β-glucan (g/l) Lắc 840 04 Không lắc 842 05 Lớp 12 -02 Công nghệ Sinh học 34 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Hải Yến Qua theo dõi ta thấy hàm luợng β-glucan không thay đổi hai điều kiện trích ly (có khuấy khơng khuaayts).Vì để trình thu nhận dễ dàng đảm bảo đạt hàm lượng β-glucan tối ưu nhất,lựa chọn điều kiện khơng lắc khuấy trộn q trình trích ly β-glucan dung mơi 4.3 Quy trình thu nhận β-glucan từ bã men bia quy mơ thí nghiệm Với khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến q trình trích ly β-glucan từ bã men bia thực mục 4.2, nhóm nghiên cứu đề xuất quy trình thu nhận β-glucan từ bã men bia quy mơ thí nghiệm Quy trình thu nhận β-glucan từ bã men bia dung môi quy mô phịng thí nghiệm: Bã men bia (300g) Tạo dịch huyền phù với 70ml NaOH 0,1N Thêm 5ml dung dịch NaClO Ủ qua đêm 40C Ly tâm 5000 vòng/15 phút (hoặc thẩm tích) Hỗn hợp tế bào oxi hóa - Dịch huyền phù rửa với nước cất Làm khơ với ethanol acetone NaClO – oxi hóa tế bào Ngưng kết DMSO Xử lý 900C/75 phút Ly tâm 5000 vòng /20 phút - Dịch chiết - Ly tâm 5000 vòng/ 20 phút Dịch chiết với DMSO Chế phẩm β-glucan Lớp 12 -02 Công nghệ Sinh học - 35 Thêm thể tích ethanol ủ qua đêm 40C Làm khơ với ethanol aceton Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Hải Yến Thuyết minh quy trình: - Cân 100g bã men bia tươi cho vào cốc thủy tinh Thêm 70ml dung dịch NaOH 0,1N 5ml NaClO vào cốc Sau khuấy hỗn hợp để trình tự phân xảy dễ dàng hơn.Ủ qua đêm nhiệt độ khoảng 40 C Sau q trình tự phân hồn thành, loại bỏ phần dịch thu nhận phần tủa Phần đươc ly tâm 5000 vòng/20 phút để loại bỏ hết phần nước - Phần tủa rửa với nước cất ethanol (tiến hành lặp lại lần) Phần chất rắn tiếp tục làm khô với aceton (tự bay sấy nhẹ) Hỗn hợp sau sấy khô nghiền nhỏ - Thêm dung dịch 75 ml dung dịch DMSO vào khuấy dể phản ứng xảy dễ dàng Cho hỗn hợp vào bể ổn nhiệt ủ 90oC 75 phút.Saukhi ủ xong, hỗn hợp làm nguội ly tâm 5000 vòng/ 20 phút.Sau ly tâm, phần tủa loại bỏ.Dịch ly tâm thu lại cốc khác - Thêm lần thể tích dung dịch ethanol vào cốc chứa dịch ly tâm ủ qua đêm 40C Sau ly tâm 5000 vịng/20 phút để thu kết tủa - Rửa làm khô tủa với acetonthuβ-glucan thô - Hàm lượng β-glucan thu đạt 40.24 g/l Với kết này, hiệu suất thu hồi β-glucan 4.02% Lớp 12 -02 Công nghệ Sinh học 36 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Hải Yến KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận Sau q trình thí nghiệm, đề tài đạt đươc số kết sau: Đã khảo sát số dung mơi có khả trích ly hợp chất hữu lựa chọn dung môi phù hợp để tách chiết β-glucan từ bã men bia dung dịch Dimethyl sulfoxide (DMSO) Đã khảo sát ảnh hưởng số yếu tố đến q trình trích ly β-glucan từ bã men bia: - Nhiệt độ thích hợp cho q trình trích ly: 90oC - Thê tích dung mơi DMSO: 75 ml dung môi cho 100 gam bã men bia - Thời gian trích ly: 75 phút - Q trình tách chiết β-glucan không cần lắc khuấy Đề xuất quy trình thu nhận β-glucan từ bã men bia quy mơ thí nghiệm Với quy trình này, hiệu suất thu nhận β-glucan 4.02% Đề nghị Do thời gian thực luận văn cịn có hạn nên số nội dung tơi chưa hồn thiện được.Nếu có điều kiện tiếp tục, nhóm nghiên cứu đề xuất: hồn thiện thêm số nội dung sau: - Tiếp tục nghiên cứu hồn thiện quy trình thu nhận chế phẩm giàu β-glucan từ bã men bia hay từ nguồn nguyên liệu khác nhau.Đưa phương pháp định tính định lượng tinh chế phẩm giàu β-glucan - Phân tích chất lượng sản phẩm, độ an toàn vi sinh vật, phân tích độc tính cấp chế phẩm giàu β-glucan từ bã nấm men bia Lớp 12 -02 Công nghệ Sinh học 37