Tối ưu điều kiện sinh tổng hợp nattokinase theo phương pháp lên men chìm ở quy mô phòng thí nghiệm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI =======* & *====== PHẠM THỊ QUỲNH TỐI ƯU ĐIỀU KIỆN SINH TỔNG HỢP NATTOKINASE THEO PHƯƠNG PHÁP LÊN MEN CHÌM Ở QUY MƠ PHỊNG THÍ NGHIỆM LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Hà Nội - 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI =======* & *====== PHẠM THỊ QUỲNH TỐI ƯU ĐIỀU KIỆN SINH TỔNG HỢP NATTOKINASE THEO PHƯƠNG PHÁP LÊN MEN CHÌM Ở QUY MƠ PHỊNG THÍ NGHIỆM CHUN NGÀNH: CƠNG NGHỆ THỰC PHẨM LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS NGUYỄN LAN HƯƠNG Hà Nội - 2014 Luận văn thạc sĩ LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu khoa học mà thân tơi trực tiếp thực Tất số liệu kết thu trình bày khóa luận hoàn toàn khách quan trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Các tài liệu trích dẫn tác giả liệt kê đầy đủ, không chép tài liệu mà khơng có trích dẫn Hà Nội, ngày 26 tháng 08 năm 2014 Học viên Phạm Thị Quỳnh Phạm Thị Quỳnh i Luận văn thạc sĩ LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, ngồi cố gắng nỗ lực thân, tơi nhận ủng hộ, giúp đỡ tận tình thầy giáo, gia đình bạn bè Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Lan Hương - Viện Công nghệ sinh học & Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội tận tình bảo tơi suốt q trình thực luận văn tơi xin cảm ơn TS Phạm Tuấn Anh giúp đỡ tạo điều kiện cho tơi suốt thời gian thí nghiệm Phòng Kỹ thuật lên men, trung tâm Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học (TTCNSH), thuộc Viện Công nghệ Sinh học & Công nghệ Thực phẩm, trường Đại học Bách khoa Hà Nội cho phép tạo điều kiện thuận lợi cho học tập nghiên cứu phịng Tơi xin chân thành cảm ơn tới thầy cô giáo thuộc Viện Công nghệ sinh học & Công nghệ thực phẩm – Trường Đại học Bách khoa Hà Nội giảng dạy giúp đỡ tơi suốt q trình học tập thực luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè tạo điều kiện, quan tâm, động viên góp ý cho tơi suốt q trình học tập, nghiên cứu hồn thành luận văn Hà Nội, ngày 26 tháng 08 năm 2014 Học viên Phạm Thị Quỳnh Phạm Thị Quỳnh ii Luận văn thạc sĩ GIẢI THÍCH CHỮ VIẾT TẮT NK Nattokinase Enzym nattokinase pI Point isoelectric Điểm đẳng điện t-PA tissue Tiền tố kích thích plasminogen Plasminogen Activator FU Fibrin unit Tris - HCl Tris Đơn vị fibrin (hydroxymethyl) aminomethane TCA Trichloacetic acid Axít tricloaxêtic Fed–batch Fed–batch fermentation Lên men bổ sung chất Phạm Thị Quỳnh iii Luận văn thạc sĩ DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Số lượng tiêu thụ khơ đậu tương Việt Nam 13 Hình 1.2 Cấu trúc enzym nattokinase- - Hình 1.3 Cơ chế tác dụng nattokinase - Hình 1.4 Ảnh hưởng nguồn cacbon đến khả tổng hợp nattokinase - Hình 1.5 Ảnh hưởng nguồn cacbon đến khả tổng hợp nattokinas Hình 1.6 Ảnh hưởng nguồn nitơ đến khả tổng hợp nattokinase - 10 Hình 1.7 Ảnh hưởng nguồn nitơ đến khả tổng hợp nattokinase - 10 Hình 1.8 Ảnh hưởng tỉ lệ giống đến hoạt lực enzym 11 Hình 1.9 Ảnh hưởng pH đến khả tổng hợp nattokinase 12 Hình 1.10 Ảnh hưởng thời gian lên men đến hoạt lực nattokinase 12 Hình 1.11 Động học trình lên men fed-batch - 16 Hình 2.1 Hệ thống lên men 2L (Biostat B, Sartorius, Đức) 24 Hình 3.1 Ảnh hưởng nồng độ khơ đậu tương đến hoạt lực nattokinase - 25 Hình 3.2 Ảnh hưởng nồng độ glucose bổ sung đến hoạt lực nattokinase - 26 Hình 3.3 Ảnh hưởng nồng độ pepton bổ sung đến hoạt lực nattokinase 27 Hình 3.4 Ảnh hưởng pH ban đầu đến hoạt lực nattokinase - 27 Hình 3.5 Ảnh hưởng thời gian lên men đến hoạt lực nattokinase 28 Hình 3.6a: Ảnh hưởng yếu tố đến hoạt lực nattokinase 31 Hình 3.6b Bề mặt đáp ứng hoạt lực nattokinase mối quan hệ nồng độ glucose (A) nồng độ peptone (B) 31 Hình 3.6c Bề mặt đáp ứng hoạt lực nattokinase mối quan hệ nồng độ glucose (A) pH (C) 32 Hình 3.6d Bề mặt đáp ứng hoạt lực nattokinase mối quan hệ nồng độ pepton (B) pH (C) - 32 Hình 3.7 Diễn biến thơng số q trình lên men theo mẻ - 34 Hình 3.8 Hoạt lực nattokinase canh trường theo thời gian lên men 35 Hình 3.9 Hàm lượng đường khử canh trường theo thời gian lên men - 36 Hình 3.10 Hoạt lực nattokinase canh trường lên men fed-batch 37 Hình 3.11 Diễn biến thơng số q trình lên men fed-batch 38 Phạm Thị Quỳnh iv Luận văn thạc sĩ DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Thành phần hố học khơ đậu tương - 14 Bảng 2.1 Miền biến thiên yếu tố 23 Bảng 3.1 Giá trị mã hóa biến 28 Bảng 3.2 Ma trận thực nghiệm hoạt lực nattokinase canh trường 29 Bảng 3.3 Kết phân tích hồi quy - 30 Bảng 3.4 Một số điểm tối ưu xung quanh điểm trung tâm - 33 Phạm Thị Quỳnh v Luận văn thạc sĩ MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN - ii GIẢI THÍCH CHỮ VIẾT TẮT - iii DANH MỤC HÌNH iv DANH MỤC BẢNG - v MỤC LỤC vi MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN - 1.1 Enzym nattokinase - 1.1.1 Lịch sử 1.1.2 Tính chất 1.1.2.1 Cấu trúc - 1.1.2.2 Cơ chất Nattokinase 1.1.2.3 Q trình đơng máu hòa tan cục máu - 1.1.2.4 Cơ chế tác dụng nattokinase 1.2 Vi sinh vật tổng hợp nattokinase 1.3 Một số yếu tố ảnh hưởng đến trình lên men chìm sinh tổng hợp nattokinase 1.3.1 Ảnh hưởng nguồn cacbon - 1.3.2 Ảnh hưởng nguồn nitơ - 1.3.3 Ảnh hưởng tỷ lệ giống - 11 1.3.4 Ảnh hưởng pH ban đầu 11 1.3.5 Ảnh hưởng thời gian lên men - 12 1.4 Khô đậu tương - 12 1.5 Các phương pháp lên men sinh tổng hợp nattokinase 14 1.5.1 Phương pháp lên men bề mặt 14 1.5.2 Phương pháp lên men chìm 15 1.6 Kỹ thuật lên men có bổ sung chất (fed-batch) sinh tổng hợp nattokinase 15 1.7 Tình hình nghiên cứu sản xuất nattokinase nước - 17 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 20 2.1 Vật liệu, đối tượng nghiên cứu - 20 2.1.1 Vật liệu 20 Phạm Thị Quỳnh vi Luận văn thạc sĩ 2.1.2 Đối tượng nghiên cứu - 20 2.1.3 Hóa chất thiết bị 20 2.1.3.1 Các loại hóa chất dùng nghiên cứu - 20 2.1.3.2 Các thiết bị sử dụng 20 2.2 Phương pháp nghiên cứu - 20 2.2.1 Phương pháp vi sinh 20 2.2.2 Phương pháp hóa sinh 21 2.2.2.1 Phương pháp xác định hoạt lực nattokinase - 21 2.2.2.2 Phương pháp xác định hàm lượng đường khử 22 2.3 Nội dung nghiên cứu 22 2.3.1 Hoạt hóa giống - 22 2.3.2 Khảo sát số điều kiện lên men 22 2.3.3 Tối ưu hóa điều kiện lên men quy hoạch thực nghiệm 23 2.3.4 Lên men sinh tổng hợp nattokinase chủng B subtilis D thiết bị lên men quy mô PTN - 23 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN - 25 3.1 Khảo sát ảnh hưởng số yếu tố đến khả sinh tổng hợp nattokinase từ khô đậu tương - 25 3.1.1 Nồng độ khô đậu tương - 25 3.1.2 Nồng độ glucose bổ sung - 25 3.1.3 Nồng độ pepton bổ sung 26 3.1.4 pH ban đầu - 27 3.1.5 Thời gian lên men - 27 3.2 Tối ưu điều kiện lên men sinh tổng hợp nattokinase 28 3.3 Nghiên cứu kỹ thuật lên men phù hợp sinh tổng hợp nattokinase chủng B subtilis 33 3.3.1 Lên men theo mẻ 34 3.3.2 Lên men theo mẻ có bổ sung chất (fed-batch) - 36 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ - 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO - 41 Phạm Thị Quỳnh vii Luận văn thạc sĩ MỞ ĐẦU Đột quy hay gọi tai biến mạch máu não (TBMMN) tình trạng bệnh lý biểu triệu chứng thần kinh xảy đột ngột, lý đó, mạch máu não bị bít tắc lại, phía sau vùng bị bít tắc, tế bào thần kinh bị hủy hoại cách nhanh chóng, khoảng phút triệu tế bào [20, 41] Điều tương ứng với tổn thương cục hệ thần kinh trung ương rối loạn tuần hoàn não Hàng năm, giới có khoảng triệu người bị TBMMN, Việt Nam có khoảng 200.000 người mắc – nguyên nhân gây tàn phế hàng đầu cấp cứu thường gặp chuyên khoa thần kinh Tỉ lệ tử vong đột quỵ đứng hàng thứ sau tai biến tim mạch ung thư [40] Một bệnh nhân bị đột quỵ dù không tử vong bị tàn phế suốt đời trở thành gánh nặng cho gia đình xã hội Những dấu hiệu bệnh thường người biết đến chúng khó để nhận biết khơng có biểu biện rõ rệt Chính lẽ đó, việc ngăn ngừa phòng bệnh giúp người thân tránh gặp trường hợp hậu đáng tiếc Quá trình nghiên cứu, sản xuất loại thuốc thực phẩm chức có tác dụng phòng ngừa TBMMN tiến hành nhiều thập niên qua Nattokinase enzym sử dụng nhiều chế phẩm sinh học, loại thực phẩm chức phịng ngừa TBMMN Đây loại enzym có tính an tồn cao, tìm thấy lên men đậu tương, có tác dụng làm tan cục máu đông giúp ngăn ngừa bệnh TBMMN Nattokinase sinh tổng hợp vi khuẩn Bacillus subtilis lên men đậu tương – loại hình lên men có truyền thống lâu đời Đậu tương từ xa xưa biết đến thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao, giàu protein, lipid vitamin Từ đậu tương chế biến nhiều sản phẩm giàu dinh dưỡng có lợi cho sức khỏe Khơ đậu tương phụ phẩm trình ép đậu tương thu dầu thường sử dụng làm thức ăn gia súc, nhiên, với hàm lượng protein cao giá thành rẻ so với đậu tương, khô đậu tương phụ phẩm có triển vọng lên men sinh tổng hợp nattokinase Quá trình lên men sinh tổng hợp nattokinase từ B subtilis ngày Phạm Thị Quỳnh Luận văn thạc sĩ 3.3.1 Lên men theo mẻ Quá trình lên men thực thiết bị lên men 2L với thể tích mơi trường lít Các điều kiện sử dụng tối ưu quy mơ bình tam giác, nhiên có sử dụng cánh khuấy bơm nén khơng khí vào suốt trình lên men để trì hàm lượng oxy hòa tan đạt 30% Diễn biến trình lên men thể hình 3.7 80 60 60 40 40 20 20 10 15 20 25 30 35 6.5 0 7.5 pH 80 Axít HCl 2N (mL) 100 pO2 (%) 100 40 Thời gian (h) Hình 3.7 Diễn biến thơng số q trình lên men theo mẻ thiết bị lên men 2L Theo hình 3.7 cho thấy pH ln trì suốt q trình lên men 7,5, việc dung dịch HCl 2N tự động bơm vào thiết bị lên men sau 7h lên men Hàm lượng oxy hòa tan canh trường (pO2) giảm nhanh sau 5h lên men, hàm lượng oxy hịa tan canh trường ln thiết bị tự động tăng khuấy trộn từ 200 rpm đến 800 rpm khoảng thời gian lên men từ 5-18h Dựa vào biến động hàm lượng oxy hòa tan cho thấy, khoảng thời gian bắt đầu lên men chủng vi khuẩn sử dụng oxy cho phát triển sinh khối, sau 5h lên men lượng oxy cung cấp vào canh trường sử dụng hết Sau 18 lên men chủng vi khuẩn phát triển chậm lại, hàm lượng pO2 canh trường dễ dàng khống chế 30% thiết bị lên men Sau 34h lên men hàm lượng oxy hòa tan canh trường cịn có xu hướng tăng lên 40% Hoạt lực nattokinase canh trường theo thời gian lên men thể hình sau Phạm Thị Quỳnh 34 Luận văn thạc sĩ Hoạt lực nattokinase (FU/ml) 120 100 80 60 40 20 12 18 24 30 36 Thời gian lên men (giờ) Hình 3.8 Hoạt lực nattokinase canh trường theo thời gian lên men Trước lên men hoạt lực nattokinase chưa có (số liệu khơng đưa vào), hoạt lực đạt 40 FU/m, hoạt lực tăng nhanh từ đến 12 lên men, sau tiếp tục tăng chậm dần sau 18 lên men đạt cực đại sau 24 lên men với hoạt lực nattokinase 112,17 FU/ml Các lên men dù chủng có phát triển mạnh (thể qua lượng axít bổ sung liên tục vào bình lên men để đưa pH canh trường pH 7,5 hàm lượng oxy hòa tan trở 0) hoạt lực nattokinase giảm nhẹ sau 24 lên men Như thấy lên men theo mẻ thiết bị lên men 2L hoạt lực nattokinase canh trường cao so với lên men bình tam giác 1,4 lần, điều cho thấy việc trì pH 7,5 hàm lượng oxy hòa tan canh trường lên men 30% suốt trình lên men yếu tố làm tăng hoạt lực nattokinase thu nhận Hàm lượng đường khử canh trường theo thời gian lên men xác định hình 3.9 Phạm Thị Quỳnh 35 Luận văn thạc sĩ Hàm lượng đường khử (g/L) 16 14 12 10 0 12 18 24 30 Thời gian lên men (h) Hình 3.9 Hàm lượng đường khử canh trường theo thời gian lên men Theo kết hình 3.9 cho thấy, hàm lượng đường khử giảm nhanh 6h đầu trình lên men (từ 14,94 xuống 5,24 g/L), tiếp tục giảm chậm sau 6h không đổi từ 12- 24h lên men (2,17- 1,99 g/L), sau 30h lên men hàm lượng đường khử giảm đáng kể cịn 0,84 g/L Như thấy 12h đầu giai đoạn vi khuẩn phát triển sinh khối mạnh mẽ, từ 12-24h lên men giai đoạn chủng vi khuẩn sinh tổng hợp enzym, đến 30h lên men hàm lượng đường khử giảm đáng kể nguyên nhân làm cho hoạt lực nattokinase giảm so với hoạt lực nattokinase sau 24h lên men Từ kết hoạt lực nattokinase hàm lượng đường khử canh trường cho thấy nên trì hàm lượng đường canh trường nồng độ định chủng vi khuẩn tiếp tục tăng sinh khối kéo dài thời gian sinh tổng hợp nattokinase Vì chúng tơi sử dụng kỹ thuật lên men fed-batch với việc trì pH lên men 7,5 dung dịch đường glucose (15%) 3.3.2 Lên men theo mẻ có bổ sung chất (fed-batch) Đã tiến hành lên men fed-batch thiết bị lên men 2L, diễn biến trình lên men cho kết tương tự lên men theo mẻ (hình 3.7), nhiên lượng dịch đường bổ sung vào thiết bị lên men gấp khoảng 7,5 lần so với sử dụng axít để trì pH 7,5 (xem hình – phụ lục) Hoạt lực nattokinase dịch canh trường theo thời gian lên men biểu diễn hình 3.10 Phạm Thị Quỳnh 36 Luận văn thạc sĩ Hoạt lực nattokinase (FU/ml) 500 450 Lít 400 Lít 350 300 250 200 150 100 50 12 16 20 24 28 30 32 34 36 Thời gian lên men (giờ) Hình 3.10 Hoạt lực nattokinase canh trường lên men fed-batch theo thời gian lên men Kết hình 3.10 cho thấy hoạt lực nattokinase canh trường lên men tăng từ thứ đến thứ 24, sau tăng mạnh đạt cực đại sau 30 lên men Như thấy tiến hành bổ sung glucose vào trình lên men, hoạt lực nattokinase tăng mạnh, đồng thời thời gian đạt cực đại kéo dài so với lên men theo mẻ (từ 24 lên 30 giờ), hoạt lưc nattokinase đạt cực đại cao gấp 3,8 lần so với hoạt lực nattokinase lên men theo mẻ Sau 30 lên men hoạt lực nattokinase canh trường lại có xu hướng giảm Để khẳng định khả nâng cao hoạt lực nattokinase canh trường sử dụng kỹ thuật lên men có bổ sung chất, chúng tơi tiếp tục tăng quy mơ lên men từ lít (trong thiết bị lên men 2L) lên quy mơ lít (trong thiết bị lên men 10 L) Diễn biến thơng số q trình lên men fed – batch thiết bị lên men 10 L thể hình sau Phạm Thị Quỳnh 37 Luận văn thạc sĩ 2304 60 1728 40 1152 20 576 7.5 pH 80 Dung dich glucose bo sung (mL) 2880 pO2 (%) 100 6.5 0 10 15 20 25 30 35 40 45 Thời gian (h) Hình 3.11 Diễn biến thơng số trình lên men fed-batch thiết bị lên men 10L Hình 3.11 cho ta thấy, đầu trình lên men tiến hành lên men theo mẻ, thứ 5, pH canh trường giảm xuống pH 7, bơm tự động bật đưa dung dịch glucose vào thiết bị lên men để trì ổn định pH 7,5 Do lượng đường glucose bổ sung nên chủng vi khuẩn phát triển mạnh, pO2 ln trì mức sau 20 lên men, sau chủng vi khuẩn phát triển chậm lại, thể hàm lượng oxy hịa tan tăng lên 5-15%, trí có lúc tăng đến 40% sau 33 lên men Lượng glucose bổ sung vào thể tích dịch canh trường lên men tương tự lên men fed-batch quy mô 2L, nhiên thời gian bổ sung chất sớm so với lên men quy mô 2L Bước đầu thấy chủng vi khuẩn phát triển tốt quy mơ lít /mẻ Hoạt lực nattokinase canh trường theo thời gian lên men thể hình 3.10 Như vậy, tăng quy mơ lên men từ lít tới lít, hoạt lực nattokinase canh trường theo thời gian lên men khác tương đồng Ở quy mơ lít/mẻ, hoạt lực nattokinase đạt cực đại sau 30 lên men 431±8,5FU/ml Kết nghiên cứu với với hàm lượng bột khô đậu tương 15%, glucose 1,5%, peptone 1,5% q trình lên men có bổ sung chất (glucose 15%) cho hoạt lực nattokinase cao gấp 3,8 lần so với hoạt lực nattokinase thu Phạm Thị Quỳnh 38 Luận văn thạc sĩ lên men theo mẻ Vì kỹ thuật lên men có bổ sung chất để trì pH 7,5 kỹ thuật phù hợp cho lên men sinh tổng hợp nattokinase chủng B subtilis D Trong nghiên cứu Cho cộng (2010) sử dụng kỹ thuật lên men có bổ sung chất để ổn định pH 7,0, môi trường khô đậu tương chủng B subtilus, hoạt lực nattokinase thu tăng 2,1 lần so với lên men theo mẻ [12] Kwon cộng (2011) sử dụng lên men có bổ sung chất glucose pepton đồng thời đưa vào canh trường lên men với tỉ lệ thay đổi từ 0,2 đến g glucose/g pepton Tác giả nhận thấy tỉ lệ 0,33 glucose pepton cung cấp vào canh trường lên men để trì pH 7,0 hoạt lực nattokinase thu tăng 4,3 lần so với hoạt lực lên men theo mẻ [19] Năm 2012, Unrean cộng sử dụng phương pháp bổ sung chất để lên men chủng B subtilis K-C3, glycerol đưa vào môi trường theo hàm số mũ, hoạt lực nattokinase thu tăng 20 lần so với trình lên men theo mẻ [39] Phạm Thị Quỳnh 39 Luận văn thạc sĩ KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Khơ đậu tương hồn tồn sử dụng làm ngun liệu cho lên men chìm sinh tổng hợp nattokinase chủng Bacillus subtilis D Đã khảo sát ảnh hưởng số yếu tố đến khả sinh tổng hợp nattokinase là: hàm lượng khô đậu, glucose bổ sung, peptone bổ sung, pH ban đầu thời gian lên men Đã tối ưu điều kiện lên men quy hoạch thực nghiệm cho thấy quy mơ bình tam giác (50 ml canh trường/ thể tích bình 250 ml), hàm lượng khơ đậu sử dụng 15%, glucose bổ sung 1,5%, pepton bổ sung 1,5% pH ban đầu 7,5 hoạt lực nattokinase canh trường đạt cực đại 79,55 FU/ml Đã lên men theo mẻ thiết bị lên men 2L với điều kiện tối ưu đồng thời trì pH lên men 7,5 hàm lượng oxy hòa tan (pO2) 30% Hoạt lực nattokinase canh trường đạt cực đại 112 ±2,4FU/ml sau 24 h lên men Khi thực lên men có bổ sung chất sử dụng glucose 15% cấp vào thiết bị lên men theo phương pháp lên men ổn định pH 7,5 cho hoạt lực nattokinase cao gấp 3,8 lần so với lên men theo mẻ Kỹ thuật lên men có bổ sung chất kỹ thuật phù hợp cho lên men sinh tổng hợp nattokinase chủng B subtilis D Kiến nghị Tiếp tục hoàn thiện công nghệ lên men sinh tổng hợp nattokinase quy mô pilot Phạm Thị Quỳnh 40 Luận văn thạc sĩ TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Đặng Thu Hương (2006), Nghiên cứu đặc điểm enzyme fibrinase sinh chủng Bacillus subtilis NT5 quy trình thu hồi Luận văn thạc sĩ khoa học; Trường đại học Bách Khoa Hà Nội Nguyễn Lan Hương, Hà Thị Phương, Phạm Quốc Luân (2011) Phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn sinh tổng hợp enzym nattokinase từ số thực phẩm đậu tương lên men Tạp chí khoa học & công nghệ trường đại học kỹ thuật, 81, 175-179 Nguyen Thi Hong Ngan, Nguyen Lan Huong (2011) Factors affecting on nattokinase production by isolates from fermented soybean products Tạp chí Khoa học Cơng nghệ, 49 (1A) Nguyễn Lan Hương, Phạm Tuấn Anh, Lã Thị Quỳnh Như, Dương Văn Hà, Tô Kim Anh (2013) Nâng cao khả sinh tổng hợp nattokinase chủng Bacillus subtilis phương pháp lên men fed-batch Tạp chí khoa học công nghệ trường đại học kỹ thuật 92: 147-151 Nguyễn Lan Hương (2014) Hoàn thiện quy trình sản xuất chế phẩm nattokinase làm nguyên liệu cho sản xuất thuốc thực phẩm chức Báo cáo tổng kêt dự án sản xuất thử nghiệm cấp Bộ Giáo dục Đào tạo Lê Thị Bích Phương, Võ Thị Hạnh, Trần Thạnh Phong, Lê Tấn Hưng, Trương Thị Hồng Vân, Lê Thị Hương (2012) Phân lập tuyển chọn số chủng Bacillus sinh tổng hợp Nattokinase Tạp chí sinh học 34(3se), 99 - 104 Tài liệu tiếng Anh Al-Juamily E F., Al-Zaidy B H (2012), Optimizitation conditions of production fibrinolytic enzym from Bacillus lichniformis B4 local isolate British Journal of Pharmacology and Toxicology, 3(6), 289 - 295 Banaszkiewicz T (2011), Soybean and nutrition Siedlce University, Natural Faculty, Poland, 1, Phạm Thị Quỳnh 41 Luận văn thạc sĩ Chang C.T., Wang P.M., Hung Y.F., Chung Y.C., (2012), Purification and biochemical properties of a fibrinolytic enzyme from Bacillus subtilis-fermented red bean Food Chemistry, 133, 1611 - 1617 10 Chen P T , Chiang C J., Chao Y P., (2007), Medium optimization for the production of recombinant nattokinase by Bacillus subtilis using response surface methodology Biotechnol Prog., 23(6):1327-1332 11 Chen P.T., Chao Y P, (2006), Enhanced production of recombinant nattokinase in Bacillus subtilis by the elimination of limiting factors Biotechnol Lett, 28(19):1595-1600 12 Cho Y H., Song J Y., Kim K M., Kim M K., Lee I Y., Kim S B., Kim H S., Han N S., Lee B H., Kim B S., Production of nattokinase by batch and fedbatch culture of Bacillus subtilis N Biotechnol 2010, 27(4):341-346 13 Collen D., Lijnen H.R (1991), Basic and clinical aspects of fibrinolysis and thrombosis Blood, 78, 3114 - 3124 14 Deepak V., Kalishwaralal K., Ramkumarpandian S., Babu S.V., Senthilkumar S R , Sangiliyandi G., (2008), Optimization of media composition for Nattokinase production by Bacillus subtilis using response surface methodology Bioresour Technol, 99(17):8170-8174 15 Fujita M., Hong K., Ito Y., Fujii R., Kariya K., Nishimuro S., (1995), Thrombolytic effect of nattokinase on a chemically induced thrombosis model in rat Bio Pharm Bull, 10, 1387 - 1391 16 Hahn B.S., Cho S.J., Wu I.M., Chang K.H., Beak Y.C., Halkier T., (1991), Mechanisms in blood coagulation, fibrinolysis and the complement system Cambridge university press, 13, 978 - 980 17 Kim W., Choi K., Park H., Choi J., Lee Y., (1996), Purification and characterization of a fibrinolytic enzyme produced from Bacillus sp strain CK 11-4 screened from Chungkook-Jang Applied and Environmental, Microbiology, 62, 2482 - 2488 18 Ku T.W., Tsai R.L., Pan T.M., (2009), A simple and cost-saving approach to optimize the production of subtilisin NAT by submerged cultivation of Bacillus subtilis natto J Agric Food Chem, 57(1), 292 - 298 Phạm Thị Quỳnh 42 Luận văn thạc sĩ 19 Kwon E.Y., Kim K.M., Kim M.K., Lee I.Y., Kim B.S., (2011), Production of nattokinase by high cell density fed-batch culture of Bacillus subtilis Bioprocess and Biosystems Engineering, 34(7), 789 - 793 20 Lawrence R., Wechsler M.D (2004), Stem cell transplantation for stroke Cleveland clinic journal of medicine, 71(1), 40 - 41 21 Li H L., Jun L., Feng Z.U., Zhi Y.W., (2011), Optimization of Liquid Fermentation Conditions of Nattokinase Chemistry & Bioengineering, 01 22 Liu J.G., Xing J.M., Ma Z., Liu H., (2005), Optimization of nutritional conditions for nattokinase production by Bacillus natto NLSSE using statistical experimental methods Process biochemistry, 40, 2757 - 2762 23 Liu J.G., Xing J.M., Shen R., Yang C.L., Liu H.Z., (2004), Reverse micelles extraction of nattokinase from fermentation broth Biochemical Engineering Journal 21, 273 - 278 24 Long L.U et al (2011), Studies on Conditions for Solid and Liquid Fermentation of Natto Journal of Anhui Agricultural Sciences, 26 25 Manhajan P M., Gokhale S V., Lele S S., Production of Nattokinase using Bacillus natto NRRL 3666: media optimization, sacle up kinetic modling Food Sci Biotechnol 2010, 19(6):1593-1603 26 Meruvu H., Vangalapati M (2011), Nattokinase: A Review on Fibrionlytic Enzyme Internationl Journal of Chemical, Environmental and Pharmaceutical Research, 2(1), 61 - 66 27 Mine Y., Wong A.H.K., Jiang B., (2005), Fibrinolytic enzymes in Asian traditional fermented foods Food research international, 38, 243 - 250 28 Patrick P.S., Antonios G.M (2010), Fibrin glue as a drug delivery system Journal of Controlled Release, 148, 49 - 55 29 Peng Y., Huang Q., Zhang R., (2003), Purification and characterization of a fibrinolytic enzyme produced by Bacillus amiloliquefaciens DC-4 screened from douche, a traditional Chinese soybean food Chomparative biochemistry and physiology part, 134, 45 - 52 30 Peng, Y., X Yang, and Y Zhang, (2005), Microbial fibrinolytic enzim: an overview of source, production, properties, and thrombolytic in vivo, Microbiol Phạm Thị Quỳnh 43 Luận văn thạc sĩ Biotechnol, 69, 126 – 132 31 Samruan W., Oonsivilai A., Onsivilai R., (2012), Soybean and fermented soybean extract antioxidant activities World academy of science, engineering and technology, 72, 1135 - 1138 32 Saxena R., Singh R (2010), Statistical optimization of conditions for protease production from Bacillus sp Acta Biologica szegediensis, 54(2), 135 - 141 33 Sumi H., Hamada H., Nakanishi K., Hiratani H., (1990), Enhancement of the fibrinolytic activity in plasma by oral administration of nttokinase Acta Haematl, 3, 139 - 143 34 Swick R.A (2002), Soybean meal quality The Advocate, 48 35 Wang C., Du M., Zheng D., Kong F., Zu G., (2009), Purification and Characterization of Nattokinase from Bacillus subtilis Natto B-12 Journal of agricultural and food chemistry article, 57, 9722 - 9729 36 Wang J K., Chiu H H., Hsieh C S., (2009), Optimization of the medium components by statistical experimental methods to enhace nattokinase activity Food in J health Sci 1(1), 21 - 27 37 Wang S.L., Wu Y.Y., Liang T.W., (2011), Purification and biochemical characterization of a nattokinase by conversion of shrimp shell with Bacillus subtilis TKU007 N Biotechnol, 28(2), 196 - 202 38 Zhou F Z., Jia Y L., Chen G C., Xie B E., Wang H.Y., (2008), Study on strains selection and liquid fermentation conditions of fibrinolytic enzyme Henan Science, 39 Unrean P., Nguyen H A N., Visessanguan W., and P Kitsubun, (2012), Improvement of nattokinase production by Bacillus subtilis K-C3 using an exponential feeding fed-batch strategy KKU Res J., 17(5), 769-777 Tài liệu internet 40 World Health Organization (2012), Steps stroke manual http://www.who.int/ncd_surveillance/en/steps_stroke_manual_v1.2.pdf, 1(2) 41 www.stroke.org (2010), Stroke 101 fact sheet 42 http://www.vietrade.gov.vn/nong-sn-khac/4289-nganh-hang-kho-du-u-tng-vitnam-2014-va-d-bao.html Phạm Thị Quỳnh 44 Luận văn thạc sĩ Phạm Thị Quỳnh 45 Luận văn thạc sĩ PHỤ LỤC Bảng Giá trị OD dung dịch tyzosine nồng độ khác Nồng độ tyzosine (µg/ml) Giá trị OD670nm 0,030 0,057 0,069 0,086 0,107 0,123 0,140 0,171 0,181 10 0,193 Hình Đồ thị đường chuần nồng độ tyrosine y = Giá trị độ hấp thụ ánh sáng bước 275 nm x = nồng độ tyrosine Phạm Thị Quỳnh 46 Luận văn thạc sĩ Bảng Thành phần hỗn hợp phản ứng DNS Nồng độ Thể tích Thể tích Thể tích glucose glucose nước (ml) DNS (µl) (mg/L) g/L (ml) 0,2 100 900 600 0.324 0,4 200 800 600 0.504 0,6 300 700 600 0.704 0,8 400 600 600 0.902 1,0 500 500 600 1.117 1,2 600 400 600 1.373 1,4 700 300 600 1.549 1,6 800 200 600 1.859 Phạm Thị Quỳnh 47 A540 Luận văn thạc sĩ Hình Đồ thị đường chuần nồng độ glucose y = Giá trị độ hấp thụ ánh sáng bước sóng 540 nm x = nồng độ glucose 360 60 270 40 180 20 90 0 10 15 20 25 30 35 40 Hình Sự biến thiên thơng số q trình lên men fed-batch Phạm Thị Quỳnh 48 6.5 Thời gian (h) thiết bị lên men 2L 7.5 pH 80 Axít HCl 2N (mL) 450 pO2 (%) 100 ... gian lên men thích hợp sinh tổng hợp nattokinase 48h 3.2 Tối ưu điều kiện lên men sinh tổng hợp nattokinase Để lựa chọn điều kiện tối ưu cho lên men sinh tổng hợp nattokinase quy mơ phịng thí nghiệm, ... Khảo sát ảnh hưởng số yếu tố đến khả sinh tổng hợp nattokinase từ khô đậu tương Tối ưu điều kiện lên men chìm quy mơ phịng thí nghiệm Lựa chọn kỹ thuật lên men phù hợp sinh tổng hợp nattokinase. .. Các phương pháp lên men sinh tổng hợp nattokinase Để thu nhận nattokinase, người ta thường sử dụng hai phương pháp lên men lên men bề mặt lên men chìm, phương pháp có ưu, nhược điểm khác 1.5.1 Phương