Nghiên cứu lên men sinh tổng hợp và thu nhận axit clavulanic từ xạ khuẩn streptomyces clavuligerus trên thiết bị 100 lít

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO NGUYỄN THỊ LINH TRƢỜNG ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGHIÊN CỨU LÊN MEN SINH TỔNG HỢP VÀ THU NHẬN AXIT CLAVULANIC TỪ XẠ KHUẨN STREPTOMYCES CLAVULIGERUS TRÊN THIẾT BỊ 100 LÍT HỌC VIÊN NGUYỄN THỊ LINH 2020-2022 HÀ NỘI - 2023 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI LUẬN VĂN THẠC SĨ CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGHIÊN CỨU LÊN MEN SINH TỔNG HỢP VÀ THU NHẬN AXIT CLAVULANIC TỪ XẠ KHUẨN STREPTOMYCES CLAVULIGERUS TRÊN THIẾT BỊ 100 LÍT HỌC VIÊN NGUYỄN THỊ LINH CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ NGÀNH: 8420201 NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS TẠ THỊ THU THỦY HÀ NỘI - 2023 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan Luận văn Thạc sĩ “Nghiên cứu lên men sinh tổng hợp thu nhận axit clavulanic từ xạ khuẩn Streptomyces clavuligerus thiết bị 100 lít” tiến hành công khai dựa cố gắng, nỗ lực Luận văn có giúp đỡ từ phía Viện Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm – Trường Đại học Mở Hà Nội hướng dẫn nhiệt tình PGS.TS Tạ Thị Thu Thủy Các số liệu kết nghiên cứu luận văn trung thực hồn tồn khơng chép sử dụng kết đề tài nghiên cứu tương tự Nếu phát chép từ kết nghiên cứu khác sai sót số liệu nghiên cứu, tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm trước nhà trường hội đồng Hà Nội, ngày 01 tháng 03 năm 2023 Học viên Nguyễn Thị Linh LỜI CẢM ƠN Sau thời gian tiến hành triển khai nghiên cứu, tơi hồn thành nội dung luận văn “Nghiên cứu lên men sinh tổng hợp thu nhận axit clavulanic từ xạ khuẩn Streptomyces clavuligerus thiết bị 100 lít” Luận văn hồn thành khơng công sức thân tác giả mà cịn có giúp đỡ, hỗ trợ tích cực nhiều cá nhân tập thể Trước hết, xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc đến PGS.TS Tạ Thị Thu Thủy, người trực tiếp hướng dẫn luận văn cho Cô dành nhiều thời gian, tâm sức cho luận văn thạc sỹ Những nhận xét q báu giúp tơi hồn thiện luận văn mặt nội dung lẫn hình thức Cơ quan tâm, động viên nhắc nhở kịp thời để tơi hồn thành luận văn thạc sỹ tiến độ Em xin gửi lời cảm ơn đến TS Nguyễn Thành Chung, ý kiến đóng góp quý báu quan tâm, động viên bảo tận tình thầy vừa giúp tơi có tin tưởng vào thân, vừa tạo động lực nhắc nhở tơi có trách nhiệm với đề tài mình, giúp tơi hồn chỉnh luận văn tốt Em xin gửi lời cảm ơn đến Viện Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm – Trường Đại học Mở Hà Nội tạo điều kiện thuận lợi, nhiệt tình giúp đỡ tơi q trình nghiên khoa học Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình, bạn bè, anh/chị lớp cao học 2020 – 2022 ln động viên, quan tâm, đồng hành em trình học tập thực luận văn Xin chân thành cảm ơn! MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 10 1.1 Xạ Khuẩn Streptomyces clavuligerus 10 1.2 Axit clavulanic 11 1.2.1 Cấu trúc hóa học 11 1.2.2 Cơ chế tác dụng Axit clavulanic 12 1.2.3 Con đường sinh tổng hợp Axit clavulanic 12 1.3 Tổng quan kháng sinh β-lactam 13 1.3.1 Đặc điểm chung kháng sinh vòng β-lactam 13 1.3.2 Axit clavulanic phối hợp với kháng sinh 14 1.4 Các yếu tố điều kiện lên men có ảnh hưởng đến khả sinh hoạt chất sinh học xạ khuẩn quy mô pilot 14 1.4.1 Ảnh hưởng tốc độ khuấy số oxy hòa tan 15 1.4.2 Ảnh hưởng tỷ lệ tiếp giống tuổi giống đến khả sinh kháng sinh 15 1.4.3 Ảnh hưởng thời gian ni đến q trình tạo sản phẩm 16 1.5 Ảnh hưởng dinh dưỡng đến khả tổng hợp hoạt chất sinh học 16 1.5.1 Ảnh hưởng nguồn cacbon 16 1.5.2 Ảnh hưởng Nitơ đến trình lên men vi sinh vật 17 1.6 Các nghiên cứu nước 17 CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 Vật liệu nghiên cứu 19 2.2 Hóa chất thiết bị 19 2.2.1 Hóa chất 19 2.2.2 Thiết bị 20 2.3 Phương pháp nghiên cứu 22 2.3.1 Phương pháp xác định khối lượng tế bào 22 2.3.2 Phương pháp xác định khả sinh trưởng sinh axit 23 2.3.3 Phương pháp xác định hoạt tính Axit clavulanic 23 2.3.4 Phương pháp lên men S clavuligerus 24 2.3.5 Phương pháp xác định hàm lượng Axit clavulanic 26 2.3.6 Phương pháp thu nhận Axit clavulanic 27 CHƢƠNG III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 21 3.1 Khả hỗ trợ tăng hoạt tính kháng sinh từ tương tác với Axit clavulanic 28 3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến q trình ni chủng xạ khuẩn Streptomyces clavuligerus thiết bị lên men 100 lít 29 3.2.1 Ảnh hưởng tốc độ khuấy, lưu lượng khí, thời gian 29 3.2.2 Ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng 32 3.2.3 Ảnh hưởng pH 35 3.3 Thu nhận tinh Axit clavulanic từ chủng xạ khuẩn Streptomyces clavuligerus 36 3.3.1 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình thu nhận 36 3.3.2 Phân tích sản phẩm sắc ký mỏng (TLC) CA 37 3.3.3 Phân tích sản phẩm CA HPLC 38 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO 44 DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT S clavuligerus Streptomyces clavuligerus CA Axit clavulanic D Đường kính trung bình vịng vơ khuẩn tính theo mi-li-mét Gram (+) Gram dương Gram (-) Gram âm h Giờ LB Luria Bertani TLC Sắc ký mỏng Amox Amoxicillin Amp Ampicillin E.coli JM109 Escherichia coli JM109 VSV Vi sinh vật HPLC Sắc ký lỏng hiệu cao GPKD Giải phóng kéo dài GPN Giải phóng nhanh MNND N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidin MT Mơi trường DANH MỤC HÌNH Hình Xạ khuẩn S clavuligerus tự nhiên đĩa thạch S.clavuligerus soi kính hiển vi 100X 10 Hình Công thức phân tử Axit clavulanic 11 Hình Con đường sinh tổng hợp Axit clavulanic 12 Hình Thiết bị lên men 100 lít Viện Công nghệ sinh học 22 Công nghệ thực phẩm – Trường Đại học Mở Hà Nội 22 Hình Đường chuẩn Axit clavulanic 27 Hình Vịng kháng khuẩn S clavuligerus tốc độ khuấy khác .30 Hình Vòng kháng khuẩn S clavuligerus hàm lượng glucose khác nhau: 33 Hình Sắc ký đồ mẫu phân tích CA thơ 37 Hình 9a Hình ảnh pick CA chất chuẩn 38 Hình 9b Hình ảnh pick CA thu từ thí nghiệm 39 DANH MỤC BẢNG Bảng Dụng cụ, thiết bị dùng đề tài 20 Bảng Kết sau thử hoạt tính .25 Bảng Thử nồng độ kháng sinh kháng khuẩn 28 Bảng Kết hợp Axit clavulanic với kháng sinh amoxicilin 28 Bảng Khảo sát ảnh hưởng tốc độ khuấy đến khả sinh trưởng sinh axit 29 Bảng Ảnh hưởng tốc độ khuấy đến khả sinh axit với thể tích 100 lít 30 Bảng Tổng hợp thông số lên men với điều kiện cấp khí khác 31 (0,7 1,0 lít khí/lít mơi trường/phút) 31 Bảng Khảo sát ảnh hưởng thời gian lên men 32 Bảng Ảnh hưởng hàm lượng glucose đến khả sinh trưởng sinh tổng hợp axit xạ khuẩn S clavuligerus .33 Bảng 10 Ảnh hưởng hàm lượng pepton đến khả sinh trưởng sinh tổng hợp axit S clavuligerus 34 Bảng 11 Ảnh hưởng hàm lượng MgCl2 đến khả sinh trưởng sinh tổng hợp axit S clavuligerus 35 Bảng 12 Ảnh hưởng pH đến khả sinh trưởng sinh tổng hợp axit 35 S clavuligerus 35 Bảng 13 Ảnh hưởng dung môi đến khả sinh trưởng sinh tổng hợp axit S clavuligerus 36 Bảng 14 Ảnh hưởng thời gian lắc phân pha đến khả sinh trưởng sinh tổng hợp axit chủng S clavuligerus 37 Bảng 15 Quy trình lên men sinh tổng hợp CA quy mơ 100 lít/mẻ 40 MỞ ĐẦU Trong sống đại ngày nay, công nghệ sinh học ngày phát triển có ý nghĩa lớn đời sống người Nhận thức điều đó, quốc gia giới ln ưu tiên đầu tư cho nghiên cứu, kế hoạch ngành cơng nghệ sinh học mang tính thực tế có tính ứng dụng cao Giờ cơng nghệ sinh học dần xem cánh tay đắc lực nhằm đưa lĩnh vực nông nghiệp, sức khỏe, khoa học thực phẩm bảo vệ môi trường lên tầm cao Trong số đó, khơng thể khơng nhắc tới kháng sinh – phần quan trọng mảng nghiên cứu sinh học, y dược Kháng sinh chế phẩm sinh học sản xuất nhằm tiêu diệt vi sinh vật gây bệnh cải thiện đời sống người, động vật thực vật Tuy vậy, tình trạng kháng kháng sinh mức báo động vấn đề đáng lo ngại người Đây vấn đề mang tính tồn cầu đặc biệt trội nước phát triển với gánh nặng bệnh nhiễm khuẩn nhiều chi phí cho việc thay kháng sinh cũ kháng sinh Tổ chức Y tế giới ( WHO ) khuyến cáo năm có hàng triệu người chết kháng thuốc, 1,4 triệu trẻ em hàng trăm tỷ USD cho kháng thuốc Việt Nam nằm danh sách nước có tỷ lệ kháng thuốc kháng sinh cao giới Trong đó, xuất vi khuẩn kháng đa thuốc, mức độ kháng ngày gia tăng Bởi vậy, người phải hướng đến tìm loại chế phẩm để phối hợp làm tăng hoạt lực kháng sinh giúp ngăn chặn tình trạng kháng kháng sinh Chủng xạ khuẩn Streptomyces clavuligerus có khả sinh axit clavulanic ngăn chặn phần tính kháng thuốc số chủng vi sinh vật có khả sinh enzyme β-lactamase Axit clavulanic chất có chứa vịng β-lactam cấu trúc có khả ức chế β-lactamase Mặc dù khơng có tác dụng kháng sinh, kết hợp với kháng sinh nhóm β-lactam, có khả ức chế hoạt động enzyme β-lactamase tăng phổ kháng khuẩn kháng sinh 84 1,6 18,45 127,5 5,9 19,65 63,8 96 1,5 17,51 121,4 5,3 18,27 54,4 c Ảnh hưởng thời gian lên men thể tích 100 lít dịch lên men Bảng Khảo sát ảnh hƣởng thời gian lên men Giờ lên men Sinh khối ƣớt (g/l) Sinh CA (mg/l) 0,69 12 2,12 24 3,54 30 5,8 42 10,97 5,6 48 15,61 55,6 60 19,14 85,5 72 19,07 119,2 84 19,05 129,04 96 19,01 109,04 Kháng sinh hợp chất sinh học độc kéo dài thời gian nuôi cấy làm giảm mạnh hiệu suất sinh kháng sinh, chí gây chết tế bào xạ khuẩn Vì xác định thời gian thích hợp để thu nhận kháng sinh việc cần thiết để thu nhận tối đa lượng kháng sinh với thời điểm từ 60 nuôi cấy đạt cao thời điểm 72 nuôi (Gramajo cs., 1993) Kết thí nghiệm cho thấy thời gian nuôi 84 chủng đạt tốc độ sinh trưởng với sinh khối tế bào (19,05 g/l) tạo kháng sinh đạt hiệu cao (129,04 mg/l) Tuy nhiên sau 84 hàm lượng axit giảm nhanh dạng tự Axit clavulanic bền dễ biến tính hoạt tính sau 78 mơi trường thường Vì cần phải xác định xác thời gian tạo Axit clavulanic hiệu để thu hồi sản phầm 3.2.2 Ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng a Ảnh hưởng hàm lượng glucose 32 Tiến hành khảo sát hàm lượng glucose với nồng độ khác để xem khả ảnh hưởng đường đến khả sinh trưởng chủng S clavuligerus thiết bị 100 lít khả sinh axit Cụ thể lượng glucose 14, 16, 18, 20 22 g/l môi trường nuôi cấy đến khả sinh tổng hợp axit, kết xác định phương pháp đo vịng vơ khuẩn sau 72 nuôi cấy với VSV kiểm định E coli JM109 amoxicillin Bảng Ảnh hƣởng hàm lƣợng glucose đến khả sinh trƣởng sinh tổng hợp axit xạ khuẩn S clavuligerus Hàm lượng Trọng lượng Khả tăng hoạt Lượng CA glucose (g/l) ướt (g/l) tính axit D (mm) (mg/l) 14 50,56 5,0 98,5 16 51,34 7,0 101,4 18 54,28 15,0 115,3 20 55,86 19,2 128,7 22 55,91 19,5 128,6 Hình Vịng kháng khuẩn S clavuligerus hàm lƣợng glucose khác nhau: Vòng 1: 16 g/l - 0,7cm; Vòng 2: 18 g/l - 1,2 cm; Vòng 3: 22 g/l - 1,95 cm; Vòng 4: 14 g/l - 0,5 cm; Vòng 5: 20 g/l - 1,92 cm 33 Qua kết cho thấy xạ khuẩn S clavuligerus tự nhiên nuôi môi trường giàu khống có hàm lượng glucose 20 – 22 g/l tạo hàm lượng axit nhiều mơi trường giàu khống có hàm lượng glucose khác làm lượng axit tạo Như vậy, hàm lượng cacbonhydrat cao hay thấp ảnh hưởng lớn đến khả sinh axit xạ khuẩn S clavuligerus tự nhiên: hàm lượng cacbonhydrat q thấp khơng đủ dinh dưỡng cho phát triển cịn hàm lượng cacbonhydrat q cao lại ức chế tổng hợp axit chủng b Ảnh hưởng hàm lượng pepton Tiến hành khảo sát hàm lượng pepton với nồng độ khác để xem khả ảnh hưởng đến việc lên men S clavuligerus thiết bị 100 lít, với hàm lượng đường 20 g/l, tốc độ khuấy 200 v/p, thời gian lên men 84 Các mức pepton bổ sung vào dịch môi trường lên men là: 2,5, 3,0; 3,5; 4,0; 4,5 g/l Bảng 10 Ảnh hƣởng hàm lƣợng pepton đến khả sinh trƣởng sinh tổng hợp axit S clavuligerus Hàm lượng pepton Trọng lượng ướt (g/l) 2,5 Hàm lượng CA (g/l) (mg/l) 15,2 98,5 3,0 16,4 101,4 3,5 18,0 115,3 4,0 20,8 129,5 4,5 20,9 129,6 Kết nghiên cứu cho thấy với hàm lượng pepton 4g/l lượng axit đạt cao cho dù tăng thêm lượng pepton hiệu suất không tăng nhiều Vì nhóm lựa chọn 4,0 g/l hàm lượng thích hợp c Nguồn khống: MgCl2 Tiến hành khảo sát hàm lượng MgCl2 với nồng độ khác để xem khả ảnh hưởng đến việc lên men S clavuligerus thiết bị 100 lít Cụ thể là: 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5 g/l 34 Bảng 11 Ảnh hƣởng hàm lƣợng MgCl2 đến khả sinh trƣởng sinh tổng hợp axit S clavuligerus Hàm lượng MgCl2 Trọng lượng ướt (g/l) Hàm lượng CA (mg/l) 0,5 14,39 97,6 1,0 15,4 105,7 1,5 17,50 118,3 2,0 20.89 128,5 2,5 20,95 128,7 (g/l) Kết nghiên cứu cho thấy với hàm lượng MgCl2 2,0 g/l lượng Axit clavulanic thu 128,5 mg/l Tiến hành tăng thêm lượng MgCl2 hiệu suất không cao nhiều Vì lựa chọn 2,0 g/l hàm lượng MgCl2 thích hợp 3.2.3 Ảnh hưởng pH Chúng tiếp tục khảo sát ảnh hưởng pH đến trình lên men S clavuligerus thiết bị 100 lít Cụ thể 6; 6,5; 7; 7,5; Bảng 12 Ảnh hƣởng pH đến khả sinh trƣởng sinh tổng hợp axit S clavuligerus pH Trọng lượng ướt (g/l) Hàm lượng CA (mg/l) 15,12 98,9 6,5 18,12 130,7 18,5 130,1 7,5 20.5 128.3 20,8 127,8 Khảo sát pH từ đến 8, trọng lượng ướt thu từ 15,12 đến 20,8 g/l hàm lượng CA 98,9 đến 127,8 mg/l 35 Kết cho thấy pH=6,5 hàm lượng CA đạt cao nhất, cụ thể 130,7 mg/l Do lựa chọn pH=6,5 để tiến hành nghiên cứu môi trường nuôi cấy xạ khuẩn 3.3 Thu nhận tinh Axit clavulanic từ chủng xạ khuẩn Streptomyces clavuligerus 3.3.1 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình thu nhận a Lựa chọn dung môi Tiến hành khảo sát loại dung môi khác để xem khả ảnh hưởng đến việc lên men S clavuligerus thiết bị 100 lít Cụ thể là: etyl acetat, n-butanol, n-hexan, chloroform Bảng 13 Ảnh hƣởng dung môi đến khả sinh trƣởng sinh tổng hợp axit S clavuligerus Dung môi Lượng axit thu quan sát qua Ghi mỏng etyl acetat CA có vệt đậm rõ ++ n-butanol CA có vệt + CA có vệt mờ + CA không xuất - n-hexan chloroform Ghi chú: (+) : Dương (-) : Âm Kết cho thấy với dung mơi etyl acetat vệt CA thu quan sát qua mỏng đậm rõ nét Với dung mơi Chloroform khơng thấy CA xuất b Thời gian lắc phân pha Tiến hành khảo sát thời gian lắc phân pha để xem khả ảnh hưởng đến việc lên men S clavuligerus thiết bị 100 lít Cụ thể là: 30 phút, 60 phút, 120 phút, 150 phút 36 Bảng 14 Ảnh hƣởng thời gian lắc phân pha đến khả sinh trƣởng sinh tổng hợp axit chủng S clavuligerus Thời gian lắc phân pha Lượng axit thu quan sát qua Ghi mỏng 30 phút CA khơng xuất - 60 phút CA có vệt + 120 phút CA có vệt đậm rõ ++ 150 phút CA có vệt + Kết cho thấy với thời gian lắc phân pha 120 phút vệt CA thu quan sát qua mỏng đậm rõ nét Với thời gian lắc phân pha 30 phút khơng thấy CA xuất 3.3.2 Phân tích sản phẩm sắc ký mỏng (TLC) CA Sử dụng 6µl CA thơ chủng xạ khuẩn sau đột biến đem chạy sắc ký TLC với hệ dung môi n-butanol: acid acetic: H2O = 12:3:5 ta thu kết hình 8: Hình Sắc ký đồ mẫu phân tích CA thơ A, B: CA thơ C: CA chuẩn 37 Qua phân tích TLC, mẫu A B mẫu phân tích sản phẩm sau thu nhận axit với L2 = 6cm; L1= 2,76cm  Rf= L1/L2 = 2,76/6 = 0,46 Nhận thấy vị trí Rf =0,46 phù hợp với kích thước chuẩn CA Điều chứng minh nhóm nghiên cứu tách chiết thành cơng CA từ chủng xạ khuẩn 3.3.3 Phân tích sản phẩm CA HPLC Sản phẩm Axit clavulanic phân tích dựa sắc kí hiệu cao, qua phân tích số liệu sắc kí đồ cho thấy pick CA, chất chuẩn xuất với thời gian lưu 5,8 phút sắc kí đồ (hình 9a) Tương tự vậy, pick CA xuât trùng với thời gian lưu chất chuẩn (hình 9b) Hình 9a Hình ảnh pick CA chất chuẩn 38 Hình 9b Hình ảnh pick CA thu đƣợc từ thí nghiệm 39 QUY TRÌNH LÊN MEN TỔNG HỢP CA QUY MƠ 100 LÍT/MẺ S clavuligerus Nhân giống cấp Khử trùng mơi trường nhiệt độ 1210C, 30 phút Khử trùng môi trường nhiệt độ 1210C, 30 phút (Môi trường R2YE, 28oC, lắc 200 vòng/phút , 72 giờ) Nhân giống cấp (Mơi trường R2YE, 28oC, khuấy 200 v/p, khí 1.0 lít/lít/phút, 72 giờ) Lên men (Mơi trường AMP, 28oC, 84 giờ, khuấy 200 v/p, cấp khí 0,7 lít/lít/phút) Ly tâm thu dịch lên men (17.000 v/p; 10 lít/giờ) Bảo quản dịch lên men (-20oC) Chiết kháng CA thô Chloroform: Etyl acetat (9:1) Axit CA thơ Bảng 15 Quy trình lên men sinh tổng hợp CA quy mơ 100 lít/mẻ 40 Loại sinh khối THUYẾT MINH QUY TRÌNH Chủng xạ khuẩn Streptomyces clavulizerus - Chủng giống tự nhiên Viện CNSH CNTP– Đại học Mở Hà nội - Thành phần môi trường giữ giống ISP2 rắn gồm có (g/l): Cao nấm men: g; Cao malt: 10g; Agar: 20g; Glucose 4g - Thành phần môi trường nhân giống R2YE (g/l): Glucose: 25g; Cao nấm men 4g; NaCl: 2g; HEPES sodium salt: 15g; MgSO4 : 0.1g; Dung dịch khoáng vi lượng: 10ml - Thành phần dung dịch khoáng vi lượng (mg/l): ZnCl2: 40, FeCl3.6H2O: 200; CuCl2.2H2O: 10; MnCl2.4H2O: 10, Na2B4O7.10H2O: 10; (NH4)6Mo7O2.4H2O: 10 - Thành phần môi trường tạo axit AMP (Production media) (g/l): Glucose :45; Maltose: 15; Cao nấm men: 8; Cao malt: 25; NaCl: 2; MOPS sodium salt: 15; MgSO4 : 0.1; Dung dịch khoáng vi lượng: 10 ml Nhân giống cấp Chủng giống cấy ria đĩa thạch ISP2 lấy ml chủng giống điều kiện bảo quản -800C cấy mơi trường R2YE dịch lỏng, thể tích lên men 50 ml – 100 ml, nuôi điều kiện 280C, tốc độ lắc 200 vịng/phút Q trình lên men thực 72 giờ, kiểm tra phát triển tế bào đạt pha sinh trưởng chuyển sang trình nhân giống cấp thiết bị lên men dung tích lít Nhân giống cấp Mơi trường R2YE dịch lỏng, thể tích 10 lít, khử trùng bình lên men tự động 1210C, 30 phút Tiếp giống cấp với tỷ lệ 4% Ni cấy 28oC, khuấy 200 vịng/phút, sục khí 0.7 lít/lít/phút, 64 Lên men Lên men theo mẻ: Lên men thiết bị dung tích 250 lít với 100 lít mơi trường lên men AMP (hay môi trường tạo axit), pH =6,5 khử trùng thiết bị 1210C, 30 phút Tỷ lệ tiếp giống 4% (10 lít) Ni 28oC, tốc độ khuấy 200 vịng/phút, sục khí lít/lít mơi trường/phút Thời gian lên men 84giờ; 41 Ly tâm thu dịch lên men Sau trình lên men hoàn thành với thời gian lên men đạt 84 giờ, tồn dịch ni có chứa axit thu hồi Để loại bỏ xác tế bào dich nuôi lọc thiết bị lọc liên tục với công suất 50 lít/giờ Bảo quản dịch lên men Dịch lên men sau ly tâm bảo quản can nhựa điều kiện -200C để tránh phân giải CA Chiết Axit CA thô Dung môi tách chiết CA ethylacetate Phần sinh khối sau ly tâm đem chuẩn pH = HCl 3M Hệ dung môi trộn với dịch nuôi với tỷ lệ v/v 50:50, hỗn hợp lắc bình lắc (funel flask) thời gian Hỗn hợp dung môi : dich nuôi sau lắc để phân pha tự nhiên ly tâm để tách pha với tốc độ 4000 vịng/phút thời gian 10 phút Phần dung mơi thu sau quay chân khơng để đuổi dung mơi, phần chất hỗn hợp có màu hồng cam cịn lại bình quay hịa tan methanol Axit thơ sau quay hồ tan methanol bảo quản -20°C 42 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận: Điều kiện thích hợp cho lên men xạ khuẩn S Clavuligerus thiết bị 100 lít: Tốc độ khuấy 200 vịng/phút; tốc độ cấp khí 0,7 lít khí/lít mơi trường/phút, pH ban đầu 6,5; nhiệt độ lên men 280C, thời gian lên men 84 Đã nghiên cứu lựa chọn thành phần dinh dưỡng, điều kiện xây dựng quy trình lên men xạ khuẩn S clavuligerus với thiết bị lên men 100 lít đó: Mơi trường AMP có hàm lượng chất dinh dưỡng gồm: Glucose 20 g/l; pepton g/l; khoáng MgCl2 g/l Đã xây dựng quy trình lên men thu nhận Axit clavulanic từ dịch lên men quy mơ 100 lít/mẻ Kiến nghị: Tiếp tục nghiên cứu phát triển qui mơ lên men 500 lít để ứng dụng sản xuất tạo sản phẩm 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO Aharonowitz Y, Demain A (1 August 1978) Carbon Catabolite Regulation of Cephalosporin Production in Streptomyces clavuligerus Antimicrob Agents Chemother Abramic M, Lescic I, Korica T, Vitale L, Saenger W, Pigac J Purification and properties of extracellular lipase from Streptomyces rimosus Enzyme Microb Technol Aires-Barros MR, Taipa MA, Cabral JMS Isolation and purification of lipases In: Woolley P, Petersen SB, editors Lipases - Their structure, biochemistry and application Cambridge, UK: Cambridge University Press Ausubel FM 5th edn Wiley; New York 2002 Short protocols in molecular biology: a compendium of methods from Current protocols in molecular biology Baggaley KH, Brown AG, Schofield CJ Chemistry and biosynthesis of clavulanic acid and others clavams Nat Prod Rep Baggaley K, Brown A, Schofield C (1997) Chemistry and biosynthesis of clavulanic acid and other clavams Nat Prod Rep Doran J, Leskiw B, Aippersbach S, Jensen S (1990) Isolation and characterization of a beta-lactamase-inhibitory protein from Streptomyces clavuligerus and cloning and analysis of the corresponding gene J Bacteriol Finlay cộng sự, (2003)Characterization of sugar uptake in wild-type Streptomyces clavuligerus, which is impaired in glucose uptake, and in a glucoseutilizing mutant J Bacteriol Higgens CE, Kastner RE (1971) Streptomyces clavuligerus sp nov., a betalactam antibiotic producer International Journal of Systematic Bacteriology 10 Jump up Kirk S (2000) “ The physiology of clavulanic acid production by Steptomyces clavuligerus(PhD thesis)” University of Surrey,UK 11 Jump up Nabais AMA, Dafonseca MMR (1995) “The Effect of Solid Medium Composition on Grrowth anh Sporulation of Streptomyces-ClavuligerusSpore Viability During Storage at + – Degrees – C” Biotechnology Techniques 9(5):361-4 Doi: 10.1007/BF00638871 44 12 Kirk S (2000) The physiology of clavulanic acid production by Streptomyces clavuligerus (PhD thesis) University of Surrey, UK 13 Tahlan K, Anders C, Jensen S (2004) The Paralogous Pairs of Genes Involved in Clavulanic Acid and Clavam Metabolite Biosynthesis Are Differently Regulated in Streptomyces clavuligerus J Bacteriol 14 PGS-TS Nguyễn Ngọc Chiến, “Nghiên cứu bào chế viên nén hai lớp amoxicillin kali clavulanat giải phóng kéo dài”, ĐH Y Dược Hà Nội, năm 2014 15 Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2002), “Vi sinh vật học”, Nhà xuất Giáo Dục, Hà Nội 16 Nguyễn Khang 7-20, 2005 “Kháng sinh học ứng dụng”, Nhà xuất y học Hà Nội 17 Biền Văn Minh (2000), “Nghiên cứu khả sinh chất kháng sinh số chủng xạ khuẩn phân lập từ đất Bình Trị Thiên”, Luận án tiến sĩ sinh học, Hà Nội 18 TS Lê Quan Nghiệm, “Nghiên cứu định lượng amoxicillin acid clavulanic huyết người phương pháp HPLC” , năm 2005 19 Cao Văn Thu, Bài giảng kháng sinh Vitamin, Bộ môn Công nghiệp Dược, Đại học Dược Hà Nội, 2000 20 Chen HC., Wilde F., (1991) The Effect of Dissolved Oxygen and Aeration Rate on Antibiotic Production of Streptomyces fradiae Biotechnol and Bioeng 37: 591-595 21 Hamdy AA, El-Refai AF, Sallam LAR, Osman ME, Om Kalthoum HK, and Mohamed MA, (2011) Seed stage manipulation as a tool for improving Rapamycin production by Streptomyces hygroscopicus ATCC 29253 Aust J Basic and App Sciences 5(2): 1-7 22 Martins CS and Souto-Maior AM (2003) Anthracycline production by Streptomyces capoamus in batch fermentation Brazilian archives of biology and technology 46(3): 483-48 45 23 Martins RA, Guimarães LM, Pamboukian CR, Tonso A, Facciotti MCR, and Schmidell W, (2004) The effect of dissolved oxygen concentration control on cell growth and antibiotic retamycin production in Streptomyces olindensis So 20 fermentation Brazi Jour Chemical Engineering 21(2): 185 – 192 24 Mukhtar H, Ija S, Haq IU (2012) Production of antibiotic by Streptomyces capoamus Pak J Bot., 44(1): 445-452 25 Natalie L., Sharee, Otten, Yukiko D., Leonid F., Xiao C L., Toshio T., Augusto I S., Silvia F., Francesca T., Anna L.C., Richard Hutchinson (1999) Doxorubicin Overproduction in Streptomyces peucetius: Cloning and Characterization of the dnrU Ketoreductase and dnrV Genes and the doxA Cytochrome P-450 Hydroxylase Gene Journal of bacteriology p 305–318 vol 181, 26 Pradeep S., Mishar P., Kundu S., (2006) Process Stratergy for Cephalosporin C fermentation J Scient and Ind Research 65: 559 – 602 27 Silva IR., Martins M K., Carvalho CM., Azevedo JL., and Procópio RE Lima, (2012) The effect of varying culture conditions on the production of nntibiotics by Streptomyces spp isolated from the Amazonian soil Ferment Technol 2012, 1:3 28 Song Q., Huang Y & Yang H., (2012) Optimization of fermentation conditions for antibiotic production by Actinomycetes YJ1 strain against Sclerotinia sclerotiorum Journal of Agricultural Science (7); 2012 29 Suphantharika M., Ison A P., Lilly M D., and Buckland B C., (1994) The influence of dissolved oxygen tension on the synthesis of the antibiotic difficidin by Bacillus subtilis Communication to the Editor 30 Wang YH., Zhang S., (2007) Influence of agitation and aeration on growth and antibiotic production of Xenorhabdus nematophila World J Microbial Biotechnol, 23: 221-227 46