Nghiên cứu chủng xạ khuẩn biển sinh hoạt chất kháng khuẩn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM PHẠM THU TRANG NGHIÊN CỨU CHỦNG XẠ KHUẨN BIỂN SINH HOẠT CHẤT KHÁNG KHUẨN LUẬN VĂN THẠC SĨ HÀ NỘI – 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM PHẠM THU TRANG NGHIÊN CỨU CHỦNG XẠ KHUẨN BIỂN SINH HOẠT CHẤT KHÁNG KHUẨN CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ SỐ: 60.42.02.01 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS NGUYỄN PHƯƠNG NHUỆ TS NGUYỄN VĂN GIANG HÀ NỘI – 2014 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu kết nghiên cứu luận văn trung thực chưa sử dụng công bố Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận văn cảm ơn thông tin trích dẫn rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày tháng năm 2014 Học viên Phạm Thu Trang Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page i LỜI CẢM ƠN Sau thời gian thực tập Phịng Cơng nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học, Viện hàn lâm Khoa học Cơng nghệ Việt Nam, để hồn thành luận văn tốt nghiệp này, cố gắng nỗ lực thân, nhận quan tâm giúp đỡ quý báu nhiều thầy cô, bè bạn Lời xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến TS Nguyễn Phương Nhuệ - Phó Trưởng phịng Cơng nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học, người dành nhiều thời gian, tâm huyết, tận tình giúp đỡ định hướng nghiên cứu cho tơi suốt q trình thực luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn quan tâm, bảo thầy giáo TS Nguyễn Văn Giang, người thầy tận tình giúp đỡ, động viên tơi suốt thời gian thực tập hồn thành luận văn Đồng thời tơi xin gửi lời cảm ơn đến NCS Phạm Thanh Huyền, KS Quách Ngọc Tùng giúp đỡ đóng góp ý kiến chân thành cho từ bước đầu thực luận văn Xin chân thành cảm ơn cán Phịng Cơng nghệ lên men cho phép tận tình bảo, giúp đỡ, tạo điều kiện cho suốt thời gian thực đề tài Xin cảm ơn Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ sinh học – Học viện Nông Nghiệp Việt Nam, Bộ môn Công nghệ Vi sinh tạo điều kiện cho tơi học tập hồn thành luận văn Cuối tơi xin gửi tới gia đình, bạn bè tập thể lớp CNSHB-K21 lời cảm ơn tình cảm chân thành động viên giúp đỡ quý báu mà người dành cho tơi để tơi hồn thành q trình thực tập thời gian vừa qua Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2014 Học viên Phạm Thu Trang Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page ii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt vi Danh mục bảng vii Danh mục hình ix Tóm tắt xi MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu Nội dung Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu xạ khuẩn 1.1.1 Vị trí phân loại 1.1.2 Đặc điểm sinh thái 1.1.3 Đặc điểm hình thái 1.1.4 Đặc điểm gen tính bất ổn định mặt di truyền 1.1.5 Phương pháp phân loại xạ khuẩn 1.2 Chất kháng sinh từ xạ khuẩn 10 1.2.1 Lược sử nghiên cứu chất kháng sinh nước 10 1.2.2 Đặc tính chung chất kháng sinh 11 1.2.3 Cơ chế tác động chất kháng sinh 12 1.2.4 Phân loại chất kháng sinh 12 1.2.5 Sự hình thành chất kháng sinh xạ khuẩn 13 1.2.6 Các chất kháng sinh có nguồn gốc từ xạ khuẩn biển 14 1.2.7 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp chất kháng sinh 16 1.2.8 Một số phương pháp tách chiết chất kháng sinh 18 1.2.9 Một số phương pháp sắc kí dùng phân tích chất kháng sinh 19 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page iii 1.2.10 Ứng dụng chất kháng sinh 21 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1 Vật liệu nghiên cứu 23 2.1.1 Chủng giống xạ khuẩn 23 2.1.2 Chủng giống VSV kiểm định 23 2.2 Hóa chất mơi trường nghiên cứu 23 2.2.1 Hóa chất 23 2.2.2 Mơi trường nghiên cứu 24 2.3 Phương pháp nghiên cứu 24 2.3.1 Nghiên cứu khả kháng VSV gây bệnh hai chủng XK 24 2.3.2 Nghiên cứu đặc điểm sinh học, phân loại hai chủng XK 24 2.3.3 Phân loại hai chủng XK phương pháp sinh học phân tử 27 2.3.4 Nghiên cứu điều kiện thu nhận chất kháng khuẩn từ hai chủng XK 2.3.5 tuyển chọn 29 Phân tích dịch chiết kháng khuẩn hai chủng XK 30 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 3.1 Đặc điểm sinh học hai chủng xạ khuẩn VD111 TB5.3 33 3.1.1 Đặc điểm hình thái 33 3.1.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 35 3.1.3 Kết phân loại hai chủng XK TB5.3 VD111 dựa vào đặc điểm sinh học 43 3.2 Phân loại hai chủng XK dựa trình tự gen 16S rDNA 44 3.3 Nghiên cứu điều kiện thu nhận chất kháng khuẩn từ hai chủng XK tuyển chọn 48 3.3.1 Ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy đến khả sinh chất kháng khuẩn 48 3.3.2 Động thái trình lên men 55 3.3.3 Lựa chọn dung môi chiết tách chất kháng khuẩn từ dịch lên men 57 3.4 Sơ phân tích dịch chiết kháng khuẩn hai chủng XK VD111 3.4.1 TB5.3 59 Đánh giá khả ức chế nồng độ vi khuẩn tối thiểu 59 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page iv 3.4.2 Sắc ký mỏng (TLC) 60 3.4.3 Sắc ký giấy 61 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 63 Kết luận 63 Kiến nghị 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO 65 PHỤ LỤC 69 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Tên viết tắt Tên đầy đủ XK Xạ khuẩn VSV Vi sinh vật CKS Chất kháng sinh DNA Deoxyribonucleic acid EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid SDS Sodium dodecyl sulfate CTAB Cetyltrimethyl ammonium bromide ISP International Streptomyces Project PCR Polymerase Chain Reaction RNA Ribonucleic acid 16S rDNA Gen 16S DNA ribosome CMC Carboxyl methyl cellulose sp Species MT Môi trường CFU Colony forming units VKK Vòng kháng khuẩn TLC Thin layer chromatography MBC Minimum bactericidal concentration TE Tris - EDTA rRNA Ribosomal ribonucleic acid NCBI National Center for Biotechnology Information G(+) Gram dương Å Ångström ATCC American Type Culture Collection MRSA Methicillin-resistant Staphylococcus aureus MRSE Methicillin-resistant Staphylococcus epidermidis Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page vi DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Trang 1.1 Phân loại kháng sinh theo nhóm hóa học 13 2.1 Cơ chất thuốc thử số enzyme ngoại bào 26 3.1 Đặc điểm nuôi cấy hai chủng XK môi trường ISP 34 3.2 Đặc điểm bào tử, cuống sinh bào tử hai chủng XK VD111, TB5.3 35 3.3 Khả sử dụng nguồn đường khác hai chủng XK 36 3.4 Khả sử dụng nguồn nitơ khác hai chủng XK 37 3.5 Khả sinh trưởng hai chủng XK điều kiện nhiệt độ, pH, nồng độ NaCl khác 38 3.6 Hoạt tính enzym ngoại bào hai chủng XK VD111 TB5.3 40 3.7 Hoạt phổ kháng khuẩn hai chủng XK TB5.3 VD111 41 3.8 So sánh đặc điểm phân loại chủng VD111 với chủng chuẩn Streptomyces albogriseolus ISP 5003 chủng TB5.3 với chủng chuẩn Streptomyces viridodiastaticus ISP 5249 3.9 43 So sánh mức độ tương đồng chủng VD111 với chủng xạ khuẩn đăng kí GenBank 3.10 45 So sánh mức độ tương đồng chủng TB5.3 với chủng xạ khuẩn đăng kí GenBank 3.11 47 Khả sinh chất kháng khuẩn sinh khối hai chủng XK VD111 TB5.3 môi trường nhân giống khác 3.12 50 Ảnh hưởng hàm lượng nguồn dinh dưỡng tới khả sinh chất kháng khuẩn hai chủng XK VD111 TB5.3 3.13 51 Ảnh hưởng pH nhiệt độ lên khả sinh chất kháng khuẩn hai chủng XK VD111 TB5.3 3.14 53 Ảnh hưởng tỉ lệ tiếp giống thời gian nhân giống đến khả sinh chất kháng khuẩn hai chủng XK VD111 TB5.3 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 54 Page vii 3.15 Ảnh hưởng độ thơng khí lên khả sinh chất kháng khuẩn hai chủng XK VD111 TB5.3 3.16 55 Hoạt tính kháng khuẩn dịch chiết từ dịch lên men hai chủng XK TB5.3 VD111 loại dung môi Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 58 Page viii tính cao Để xác định dung mơi thích hợp cho việc tách chiết chất kháng khuẩn, dịch lên men hai chủng VD111 TB5.3 chiết loại dung mơi, xác định hoạt tính kháng khuẩn dịch chiết phương pháp đục lỗ Kết thể Bảng 3.16 Hình 3.15 Bảng 3.16 Hoạt tính kháng khuẩn dịch chiết từ dịch lên men hai chủng XK TB5.3 VD111 loại dung môi VKK (D-d, mm) Dung dịch (dung môi: dịch nuôi) VD111 TB5.3 n-Butanol (1:1) 18,7 ± 0,1 22,1 ± 0,1 2-Butanol (1:1) - 8,4 ± 0,1 n-Butyl acetate (1:1) - 19,7 ± 0,1 Ethyl - acetate (2:1) 22,4 ± 0,1 28,7 ± 0,1 Ethyl –acetate (1:1) 16,8 ± 0,1 21,5 ± 0,1 n-Butanol (2:1) 15,2 ± 0,1 21,2 ± 0,1 - - Acetol (1:1) VD111 TB5.3 Hình 3.15 Hoạt tính kháng khuẩn dịch chiết từ dịch lên men hai chủng XK TB5.3 VD111 Kết thu cho thấy khả hòa tan chất kháng khuẩn loại dung môi khác Với hai chủng nghiên cứu, dịch chiết ethyl acetate có hoạt lực mạnh nhất, vịng kháng khuẩn đạt 22,4 mm chủng VD111 28,7 mm chủng TB5.3, tương đương với hiệu suất chiết Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 58 khoảng 74,2% 78% Tiếp n - butanol với hiệu suất chiết khoảng 61 – 62 (%) hai chủng Chiết dịch lên men chủng TB5.3 hai dung mơi 2butanol n-butyl acetate có hiệu suất thấp hẳn hồn tồn khơng chiết chất kháng khuẩn từ dịch lên men chủng VD111 Từ kết cho thấy chất kháng khuẩn hai chủng VD111 TB5.3 nằm dịch ngoại bào chiết ethyl acetate Tuy hiệu suất chiết thu chưa cao song ethyl acetate coi dung môi hữu tương đối độc hại, dễ loại bỏ có độ bay cao dung môi dùng phổ biến nhiều ngành cơng nghiệp có cơng nghiệp thực phẩm (Dutia Pankaj, 2004) Vì sử dụng dung mơi an tồn cho người thực đồng thời thuận lợi trình tinh chất kháng sinh sau Ethyl acetate chọn làm dung môi tách chiết chất kháng khuẩn từ hai chủng XK biển nghiên cứu Kết phù hợp với nhiều nghiên cứu trước chiết suất chất kháng sinh từ xạ khuẩn biển (Sirisha cộng sự, 2013; Valli cộng sự, 2012; Sandeep Menaka, 2014) 3.4 Sơ phân tích dịch chiết kháng khuẩn hai chủng XK VD111 TB5.3 3.4.1 Đánh giá khả ức chế nồng độ vi khuẩn tối thiểu Để đánh giá khả ức chế nồng độ vi khuẩn tối thiểu hai chủng XK nghiên cứu, sử dụng phương pháp MBC (Determination of minimum bactericidal concentration) Kết cho thấy hai chủng VD111 TB5.3 kháng vi khuẩn gây bệnh mật độ tế bào khác Đặc biệt chủng TB5.3, mật độ vi khuẩn đạt đến 105 CFU/ml, dịch chiết chủng ức chế vi khuẩn kiểm định, thể kháng yếu với MRSA Dịch chiết từ chủng TB5.3 khả kháng mạnh với B subtilis ATCC 6633, S typhimurium ATCC 14028, E coli ATCC 25922 K pneumoniae ATCC 13883 nồng độ vi khuẩn đạt 106 CFU/ml Khi nồng độ VSV đạt ngưỡng 107 CFU/ml, dịch chiết cịn khả kháng hồn toàn với B subtilis ATCC 6633 thể kháng yếu với vi khuẩn khác Đối với chủng VD111, dịch chiết chủng kháng lại vi sinh vật Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 59 kiểm định nồng độ VSV đạt đến 104 CFU/ml khả ức chế S typhimurium ATCC 14028 Khả kháng mạnh với B subtilis ATCC 6633 Khi nồng độ VSV đạt 105 CFU/ml, dịch chiết kháng yếu VSV kiểm định, nồng độ VSV đạt ngưỡng 106 CFU/ml lớn hơn, dịch chiết khơng cịn khả kháng Kết thể Hình 3.16 107 106 105 104 103 107 106 105 104 103 107 106 105 104 103 107 106 105 104 103 TB5.3 VD111 ĐC1:LB ĐC2:LB+ Ethyl acetat Hình 3.16 Đánh giá khả ức chế vi khuẩn tối thiểu dịch chiết kháng khuẩn từ hai chủng XK TB5.3 VD111 (Ghi chú: 1: B subtilis ATCC 6633, 2: S typhimurium ATCC 14028, 3: E coli ATCC 25922, 4: MRSA, 5: S lutea M5, 6: K pneumoniae ATCC 13883, 7: B cereus ATCC 11778, 8: MRSE) 3.4.2 Sắc ký mỏng (TLC) Chất chiết từ dịch lên men hai chủng XK VD111 TB5.3 sau loại bỏ dung môi nhờ chân khơng phân tích định tính phương pháp sắc ký mỏng sử dụng hệ dung môi: Isopropanol : Acetone (3 : 1) Kết thể Hình 3.17 cho thấy phổ băng thu có khác hai chủng Khi màu tia cực tím, phổ thu từ chủng VD111 gồm chấm tròn (Rf1 = 0.78) băng (Rf2 = 0.85) Đồng thời thu phổ TLC gồm băng (Rf1 = 0.90) vệt tím đậm (Rf2 = 0.92) từ chủng TB5.3 Khi màu xông I ốt thu kết tương tự quan sát thấy xuất băng tương ứng với mẫu từ chủng Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nơng nghiệp Page 60 Hình 3.17 Phổ TLC chất chiết từ dịch ngoại bào hai chủng vi khuẩn VD111 TB5.3 a/Hiện màu tia cực tím b/ Hiện màu I ốt (Ghi chú: 1: TB5.3; 2: VD111) Như vậy, phân tích TLC thu hệ số Rf hợp chất chiết từ hai chủng XK nghiên cứu, yếu tố quan trọng để phân nhóm cho chất kháng sinh thu Tuy nhiên, để phân loại hợp chất thu cần phải có nghiên cứu sâu 3.4.3 Sắc ký giấy Đây phương pháp định tính để xác định hoạt tính kháng khuẩn dịch chiết thu Cách tiến hành tương tự sắc ký mỏng, sau kết thúc trình chạy sắc ký, đặt giấy sắc ký lên bề mặt môi trường thạch cấy B subtilis ATCC 6633 vi sinh vật kiểm định, để 2-4 nhiệt độ 4oC cho chất kháng khuẩn khuếch tán vào mơi trường thạch, tiếp ni 28 – 30oC đọc kết sau 12 Quan sát vị trí có vịng vơ khuẩn thu kết sau: với hai chủng XK nghiên cứu thu vòng kháng vi sinh vật kiểm định nằm tập trung phía giấy sắc ký, vùng kháng chủng VD111 có Rf = 0.83 chủng TB5.3 có Rf = 0.90, ngồi không thu vùng kháng khác Kết thể Hình 3.18 Học viện Nơng nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 61 VD111 TB5.3 Hình 3.18 Phân tích dịch chiết hai chủng XK VD111 TB5.3 sắc ký giấy Kết thu cho thấy hệ số Rf chất chiết từ dịch lên men hai chủng XK chạy TLC tương đồng với chạy sắc ký giấy Do vậy, vùng kháng khuẩn thu môi trường cấy vi sinh vật kiểm định sử dụng phương pháp sắc ký giấy chứng minh diện chất kháng khuẩn mẫu nghiên cứu Kỹ thuật sắc ký mỏng kết hợp với sắc ký giấy thực nhiều nhà nghiên cứu trình nghiên cứu thuốc kháng sinh Considinet cộng (1965) sử dụng kỹ thuật để xác định vị trí điểm hoạt động TLC Awais cộng (2007) sử dụng kỹ thuật để kiểm tra hiệu lực điểm kháng sinh TLC Peneka Moncheva cộng (2002); Muhammad Awais cộng (2007); Xue-Chang Wu (2007) đưa báo cáo quan trọng áp dụng phương pháp TLC nghiên cứu chất kháng sinh Đây hai phương pháp định tính đơn giản, dễ thực hiện, thường áp dụng nghiên cứu chất kháng sinh Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 62 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Hai chủng XK VD111 TB5.3 sinh trưởng tốt nhiệt độ 37oC, pH 7-8, sinh trưởng tốt nồng độ muối 5-8%, có khả đồng hóa đa số nguồn cacbon khác thích hợp phát triển mơi trường có chứa nguồn nitơ hữu cao nấm men, peptone, bột đậu tương Hai chủng XK nghiên cứu có khả sinh hầu hết enzyme ngoại bào như: amylase, protease, cellulase, chitosanase, xylanase có phổ kháng khuẩn rộng, có khả ức chế vi khuẩn Gram âm, Gram dương, nấm men Mơi trường lên men thích hợp chủng XK VD111và TB5.3 tương ứng A4H M1ASW Điều kiện lên men thích hợp chung cho hai chủng XK sinh tổng hợp chất kháng khuẩn là: pH – 7, nhiệt độ 300C, tỉ lệ tiếp giống 5%, thời gian nhân giống 36-48 giờ, thể tích dịch lên men chiếm 15-20% thể tích bình Ở điều kiện tối ưu thời gian thu hồi chất kháng khuẩn chủng VD111 sau 60h lên men, chủng VD111 có hoạt tính kháng khuẩn lớn nhất, đường kính vịng kháng B subtilis ATCC 6633 đạt 30,2 mm Chủng TB5.3 có thời gian thu hồi 96 lên men tương ứng với vòng kháng khuẩn ức chế chủng B subtilis ATCC 6633 36,8 mm Dung mơi thích hợp dùng chiết tách chất kháng khuẩn từ dịch lên men hai chủng XK VD111 TB5.3 ethyl acetat với tỷ lệ dung môi : dịch nuôi Dịch chiết thu từ dịch lên men hai chủng XK biển thể tính kháng mạnh với nhiều nhóm VSV kiểm định khác đồng thời hợp chất dịch chiết có hệ số Rf chạy sắc ký TLC so với chạy sắc ký giấy cho thấy hợp chất tách chạy sắc ký TLC chất có hoạt tính kháng khuẩn Dựa đặc điểm sinh học kết giải trình tự gen 16S rDNA hai chủng XK VD111 TB5.3, tạm thời đặt tên hai chủng XK tương ứng Streptomyces albogriseolus VD111 Streptomyces viridodiastaticus TB5.3 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 63 Kiến nghị Hai chủng XK VD111 TB5.3 hai chủng có hoạt tính kháng sinh mạnh, hoạt phổ rộng Vì cần tiếp tục nghiên cứu nội dung sau: Tối ưu thành phần môi trường điều kiện lên men để thu nhận lượng chất kháng khuẩn tích lũy cao khoảng thời gian ngắn Hoàn thiện quy trình tách chiết chất kháng khuẩn nhằm đạt hiệu suất chiết cao Nghiên cứu tinh chất có hoạt tính kháng khuẩn Nghiên cứu cấu trúc hóa học chất có hoạt tính sau tinh Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Ngơ Đình Quang Bính (2005) Vi sinh vật học cơng nghiệp Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật, Trung tâm Khoa học tự nhiên Công nghệ quốc gia, Hà Nội, Tr 53 - 71 Nguyễn Văn Cách (2004) Công nghệ lên men chất kháng sinh, Nhà xuất Khoa học Kĩ thuật Hà Nội Nguyễn Văn Cách, Lê Văn Nhương (2009) Cơ sở công nghệ sinh học, tập Nhà xuất Giáo dục Việt Nam Nguyễn Thành Đạt (2000) Sinh học vi sinh vật Nhà xuất Giáo dục Nguyễn Thành Đạt (2007) Cơ sở sinh học vi sinh vật, tập Nhà xuất Đại học sư phạm Nguyễn Lân Dũng (dịch, 1983) Thực tập vi sinh vật học Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Tr 73 – 81 Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2002), Vi sinh vật học Nhà xuất Giáo Dục, Hà Nội Tr 39 - 41 Nguyễn Lân Dũng, Đào Xuân Mượu, Nguyễn Phùng Tiến, Đặng Đức Trạch, Phạm Văn Ty (1972) Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, tập Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật Hà Nội Nguyễn Lân Dũng, Phạm Thị Trân Châu (1978) Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, tập III Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội 10 Nguyễn Lân Dũng, Phạm Văn Ty, Nguyễn Đình Quyến (1977) Vi sinh vật học, tập Nhà xuất Đại học Trung học chuyên nghiệp, Hà Nội 11 Bùi Thị Hà (2008) Nghiên cứu xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh chè Thái Nguyên Luận văn thạc sĩ Sinh học, Thái Nguyên 12 Bùi Thị Việt Hà (2006).Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh thực vật Việt Nam Luận án tiến sĩ sinh học, Hà Nội 13 Nguyễn Bá Hiên, Hoàng Hải, Nguyễn Xuân Thành (2006) Giáo trình vi sinh vật học cơng nghiệp Nhà xuất Giáo dục 14 Lê Gia Hy (1994) Nghiên cứu xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh đạo ôn thối cổ rễ phân lập Việt Nam Luận án Phó tiến sĩ Sinh học, Hà Nội 15 Nguyễn Khang (2005) Kháng sinh học ứng dụng Nhà xuất Y học, Hà Nội, Tr 21 16 Lương Đức Phẩm (1998) Công nghệ vi sinh vật Nhà xuất Xây dựng, Hà Nội Tr 47-49 17 Nguyễn Văn Ri (2009) Các phương pháp tách, khoa Hoá Trường ĐHKHTN ĐHQG Hà Nội 18 Nguyễn Xuân Thành, Nguyễn Thị Hiền (2003) Giáo trình vi sinh vật học nông nghiệp Nhà xuất Đại học Sư phạm 19 Trần Thị Cẩm Vân, Giáo trình vi sinh vật học môi trường, Nxb ĐHQG Hà Nội, 2001 20 Đào Hữu Vinh, Nguyễn Xuân Dũng, Trần Thị Mĩ Linh, Phạm Hùng Việt (1985) Các phương pháp sắc ký , Nhà xuất Khoa học kỹ thuật Hà Nội Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 65 Tài liệu tiếng Anh 21 Adhikari T B (1993) Identification of biovars and races of Pseudomonas solanacearum and source of resistance in tomato in Nepa Plant disease, vol 77, 905 - 907 22 Agrios G N (1997) Plant Pathology, 4th Edition Academic Press San Diego, USA 23 Arwa A.Ahmed (2007) Production of antimicrobial agent by Streptomyces Violachromogen.Saudi J of Biological Sciences 14: 7-16 24 Ashadevi N.K (2005) Isolation and identification of marine actinomycetes and their potential in antimicrobial activity Pakistan J Biological Sciences 9(3): 470-472 25 Aslan B (1999) Studies on isolation, characterization and antibiotic production of Streptomyces species PhD thesis, Cukurova University, Institute of Science, Adana 26 Awais M., Shah A., Hammed A and Hasan F (2007) Isolation,Identification and optimization of bacitracin produced by Bacillus sp Pak J.Bot 39: 1303 – 1312 27 B Sirisha, R Haritha, YSYV Jagan Mohan, K Siva Kumar and T Ramana (2013) Bioactive compounds from marine actinomycetes isolated from the sediments of bay of bengal International journal of pharmaceutical, chemical and biological sciences 3(2), 257-264 28 Beovic B (2006) The issue of antimicrobial resistance in human medicine International Journal of Food Microbiology 112, 3, 280-287 29 Bérdy J (2005) Bioactive microbial metabolites: A personal view J Antibiot (Tokyo), 58:1–26 30 Carlos Olano, Carmen Méndez, José A Salas (2009) Antitumor compounds from Marine Actinomycetes Marine Drugs, 7, 210-248 31 Crandall LW, Hamil RL (1986) Antibiotics produced by Streptomyces: major structural classes In: Queener SW, Day LE (eds), The bacteria, Vol 9, Academic Press, Orlando, Fla, 355-401 32 D Kealey, P J Haines (2002) Analytical Chemistry, printed in the united States of America 33 Dancer SJ (2004) How antibiotics can make us sick: the less obvious adverse effects of antimicrobial chemotherapy The Lancet Infectious Diseases 4, 611-619 34 Daniel C Harris (2007) Quantitative Chemical Analysis, printed in the united States of America 35 Dhanasekaran D., Thajuddin N., Panneerselvam A (2012) Applications of Actinobacterial Fungicides in Agriculture and Medicine Fungicides for Plant and Animal Diseases, 1-27 36 Filedler, H.P , Bruntnerc , Bull, A.T ,Word, A.C , Goodfellow, M , Potterat, O , Puder, C and Mihm, G (2005) Marine actinomycetes as a source of novel secondary metabolites Antonie Van leeuwenhoek 87: 37-42 37 Furimai, K.Saitoh, M.Kakushima, S.Yamamuto, K.Suzuki, C.Ikeda, S Kobaru, M.Hatori and T.Oki (1993) BS -181184, A new pradimic ins deverative, J Antibiotics, N046 (2), 265 - 274 38 Gunasekaran Mohanraj and Thangavel Sekar (2013) Isolation and screening of actinomycetes from marine sediments for their potential to produce antimicrobials Int J LifeSc Bt & Pharm Res Vol 2, No 39 Henrik Hasman (2011) Antibiotics: mode of action and mechanisms of resistance Technical university of Denmark 40 Hopwood D.A and MJ Merrick (1997) Gentics of antibiotic production, J.Bacteriol, Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 66 596 - 636 41 Hotam S Chaudhary, Jayprakash Yadav, Anju R Shrivastava, Smriti Singh, Anil K Singh, and Natrajan Gopalan (2013) Antibacterial activity of actinomycetes isolated from different soil samples of Sheopur (A city of central India) J Adv Pharm Technol Res, 4(2): 118–123 42 Isoken Nekpen Henrietta Ogunmwonyi (2010) Assessment of antibiotic production by some marine Streptomyces isolated from the Nahoon beach Department of biochemistry and microbiology faculty of science and agriculture, University of for Hare, Alice, South Africa 43 Istianto Y., Raden Setyo Adji Koesoemowidodo, Harmoko Saputra, Yoshio W.A.T Anabe, Hardaning Pranamuda, Andbambang Marwoto (2012) Application of Phenol Pretreatment for the Isolation of Rare Actinomycetesfrom Indonesian Soil Microbiology Indonesia, Vol 6, 42-47 44 James R Doroghazi and William W Metcalf (2013) Comparative genomics of actinomycetes with a focus on natural product biosynthetic gens BMC Genomics, Vol.14, 611 45 Kin S Lam (2006) Discovery of novel metabolites from marine actinomycetes Current Opinion in Microbiology, 245-251 46 Luzhetska M, Härle J, Bechthold A (2010) Combinatorial and synthetic biosynthesis in actinomycetes Fortschr Chem Org Naturst 47 Markus Nett, Haruo Ikeda, and Bradley S Moore (2011) Genomic basis for natural product biosynthetic diversity in the actinomycetes Nat Prod Rep Author manuscript; available in PMC 48 Michael A Kohanski, Daniel J Dwyer, James J Collins (2010) How antibiotics kill bacteria: from targets to network Nat Rev Microbiol: 8(6): 423 - 435 49 Mitra A, Santra S.C, Mukherjee J (2008) Distribution of Actinomycetes, their antagonistic behavior and physico-chemical characteristics of worlds largest tidal mangrove forest Appl Microbiol Biotechnol., Vol 80, 685-695 50 Nduka O (2007) Modern Industrial Microbiology and Biotechnology Science, Enfield, USA, 429 – 453 51 Ozgur Ceylan, Gulten Okmen, Aysel Ugur (2008) Isolation of soil Streptomyces as source antibiotics active against antibiotic-resistant bacteria EurAsian Journal of BioSciences, 2, 73-82 52 Pandey.B., Prakash Ghimire and Agrawal V (2004) Studies on the antibacterial activity of the actinomycetes isolated from Khumbu Region of Nepal A paper presented in international Conference on the ‘Great Himalayas’ Climate, Health, Ecology, Management and Conservation, Kathmandu 53 Paul R Jensen, Tracy J Mincer, Philip G Williams, William Fenical (2005) Marine actinomycete diversity and natural product discovery Antonie van Leeuwenhoek, 43-48 54 Paul Singleton, Diana (1999) Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, second edi, Sainburg, John Willey & Son 55 R.M Gulve and A.M Deshmukh (2012) Antimicrobial activity of the marine actinomycetes International Multidisciplinary Research Journal, 2(3):16-22 56 Rabe P, Citron CA, Dickschat JS (2013) Volatile terpenes from actinomycetes: a biosynthetic study correlating chemical analyses to genome data Chembiochem., Vol 14(17):2345-54 57 Rahman MA, Islam MZ, Islam MA (2011) Antibacterial activities of Actinomycete Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 67 isolates collected from soils of Rajshahi, Bangladesh Biotechnol Res Int : 857925 58 Saadoun I, Hameed KM, Moussauui A (1999) Characterization and analysis of antibiotic activity of some aquatic actinomycetes Microbios, 99:173–9 59 Sandeep Rana and Menaka Devi Salam (2014) Antimicrobial Potential of Actinomycetes Isolated from Soil Samples of Punjab, India Journal of Microbiology & Experimentation.Vol 1, Issue 60 Shirling E.B, Gotilieb D (1966) Methods for characterization of Streptomyces spectes, International Journal of Systematic Bacteriology, Vol 16, No 3, 313 - 340 61 Shivakumar K., Maloy Kumar Sahu and Kathiresai K (2002) Identification of antibiotic producing marine Streptomyces form Pichavaram mangrove Environment Journal of the Annamalai University, Part –B: 1-10 62 Valli S, Suvathi Sugasini S, Aysha OS, Nirmala P, Vinoth Kumar P and Reena A (2012) Antimicrobial potential of Actinomycetes species isolated from marine environment Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine, 469 - 473 63 Vorar Laidi Rabah., Elshafei, Mahrnoud Saker, Cheikh B and Kocine M (2007) Screening, isolation and characterization of a novel antimicronbial producing actinomycete, strain RAF 10 Biotechnology, 6:489-496 64 Waksman, S.A (1961) The actinomycetes Classification, identification and descriptions of genra and species, vol 2, The Williams & Wilkins Co., Baltimore, USA 65 William B Whitman,Aidan Parte,Michael Goodfellow,Peter Kämpfer,Hans-Jürgen Busse,Martha E Trujillo,Wolfgang Ludwig,Ken-ichiro Suzuki (2012) Bergey's Manual of Systematic Bacteriology: Vol.5 The Actinobacteria Part A 66 Wohlleben W, Mast Y, Muth G, Röttgen M, Stegmann E, Weber T (2012) Synthetic biology of secondary metabolite biosynthesis in actinomycetes: Engineering precursor supply as a way to optimize antibiotic production Copyright © 2012 Federation of European Biochemical Societies Published by Elsevier B.V All rights reserved 67 Xue-Chang Wu,Wei-Feng Chen , Chao-Dong Qian, On Liping Li, and Yan-Ping wen (2007) Isolation and identification of newly isolated antagonistic Streptomyces Sp strain Ap 19-2 Producing chromomycins The J of Microbiol, 499-504 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 68 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Các loại môi trường dùng đề tài (đơn vị g/l) - Môi trường Gauze I: Tinh bột tan 20; K2HPO4 0,5; KNO3 1; NaCl 0.5; FeSO4 0,01; MgSO4.7H2O 0,5; pH 7,2-7,4 - Môi trường TH4-47: Tinh bột tan 15; Glucose 10; Lactose 10; Đậu tương 10; (NH4)2SO4 5; pH - Môi trường A4H: Glocose 15; Bột đậu tương 15; NaCl 5; CaCO3 1; pH - Môi trường M1ASW: Tinh bột tan 10; Cao nấm men 4; peptone 2; pH - Môi trường XK: Cao malt 10; Cao nấm men 4; Glucose 4; pH 7±0,2 - Môi trường 7: Tinh bột tan 10; Glucose 5; peptone 6; (NH4)2SO4 2,5; CaCO3 2; pH 6,5-7 - Môi trường 79: Glucose 10; Peptone 10; Casein thủy phân 2; NaCl 6; K2HPO4 0,2; pH 7,2- 7,4 - Môi trường MN -ASW: Glucose 0,25; Cao nấm men 0,25; Cao malt 0,64; pH - Môi trường ISP1: Tryptone 5; Cao nấm men 3; pH - Môi trường ISP2: Cao nấm men 4; Cao malt 10; dextrose 4; pH 7,3 - Môi trường ISP3: Bột lúa mạch thủy phân 20; Muối vi lượng ml; pH 7,2 - Môi trường ISP4: Tinh bột tan 10; K2HPO4.2H2O 1; MgSO4.7H2O 1; NaCl 1; (NH4)2SO4 2; CaCO3 2; muối vi lượng ml - Môi trường ISP5: L.Asparagin 1; Glicerol 10; K2HPO4 1; pH 7-7,4; vi lượng ml - Môi trường ISP6: Peptone 19,7; Feric Amonium citrat 0,97; K2HPO4 0.98; cao nấm men 1; pH 7±0,2 - Môi trường ISP7: Glicerol 15; L.Tyrozine 0.5; L.Asparogine 1; K2HPO4 0,5; MgSO4.7H2O 0,5; NaCl 0,5; FeSO4.7H2O 0,01; vi lượng ml; pH 7,27,4 - Môi trường ISP8; D-Glucose 10; MgSO4.7H2O 0,5; NaCl 0,5; FeSO4.7H2O 0,01; K2HPO4 1; nguồn nitơ 0.1% (w/v) - Môi trường ISP9: (NH4)2SO4 2,64; KH2PO4 2,38; K2HPO4.3H2O 5,65; MgSO4.7H2O 1; vi lượng ml; pH 6,8- 7, nguồn đường 1% (w/v) - Môi trường LB: Cao nấm men 5; Tryptone 10; NaCl 5; pH Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 69 Phụ lục 2: Trình tự gen 16S-rDNA chủng VD111 >VD111 AGCAGGGAAGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCT AACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCGAGCGTTGTCCG GAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCTTGTCACGTCGGTTGTG AAAGCCCGGGGCTTAACCCCGGGTCTGCAGTCGATACGGGCAGGCTAG AGTTCGGTAGGGGAGATCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAG ATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTGGGCCGATACT GACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTG GTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGCACTAGGTGTGGGCGACATTCCACG TCGTCCGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGTGCCCCGCCTGGGGAGTACGG CCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGC GGAGCATGTGGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTT GACATACACCGGAAAGCATCAGAGATGGTGCCCCCCTTGTGGTCGGTGT ACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTA AGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCCGTGTTGCCAGCAGGCCCTTG TGGTGCTGGGGACTCACGGGAGACCGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGG TGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTGCACACG TGCTACAATGGCCGGTACAATGAGCTGCGATACCGCGAGGTGGAGCGA ATCTCAAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCC ATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGAAT ACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGTA ACACCCGAAGCCGGTGGCCCAACCCCTTGTGG Phụ lục 3: Trình tự gen 16S-rDNA chủng TB5.3 >TB5.3 CCTTCGGGAGGGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGCAAT CTGCCCTGCACTCTGGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTAATACCGGAT ACTGACCCGCTTGGGCATCCAAGCGGTTCGAAAGCTCCGGCGGTGCAGG ATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGG CGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTG AGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCAC AATGGGCGA AAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTA Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 70 AACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAGA AGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCG AGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCTTGTCA CGTCGGTTGTGAAAGCCCGGGGCTTAACCCCGGGTCTGCAGTCGATACG GGCAGGCTAGAGTTCGGTAGGGGAGATCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTG AAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTG GGCCGATACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATT AGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGCACTAGGTGTGGGCG ACATTCCACGTCGTCCGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGTGCCCCGCCTG GGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCG CACAAGCGGCGGAGCATGTGGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTT ACCAAGGCTTGACATACACCGGAAAGCATCAGAGATGGTGCCCCCCTTG TGGTCGGTGTACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCTTGAGA TGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCCGTGTTGCCAG CAGGCCCTTGTGGTGCTGGGGACTCACGGGAGACCGCCGGGGTCAACTC GGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTTGGG CTGCACACGTGCTACAATGGCCGGTACAATGAGCTGCGATACCGCGAGG TGGAGCGAATCTCAAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAAC TCGACCCCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTGCTG CGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGAA AGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGC Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 71 Phụ lục 4: Bảng số liệu động thái trình lên men chủng VD111 Giờ lên men VKK (mm) pH Sinh khối (mg/ml) 0 6,61 7,2 ± 0,1 12 6,61 8,4 ± 0,1 24 9,2 ± 0,1 6,64 8,8 ± 0,1 36 19,5 ± 0,1 6,69 9,1 ± 0,1 48 24,5 ± 0,1 7,02 11,1 ± 0,1 60 30,2 ± 0,1 7,29 12,1 ± 0,1 72 20,5 ± 0,1 7,34 10,6 ± 0,1 84 11,7 ± 0,1 7,64 10 ± 0,1 96 9,6 ± 0,1 7,79 9,6 ± 0,1 108 8,3 ± 0,1 7,85 9,3 ± 0,1 120 6,5 ± 0,1 7,99 9,2 ± 0,1 Phụ lục 5: Bảng số liệu động thái trình lên men chủng TB5.3 Giờ lên men VKK (mm) pH Sinh khối (mg/ml) 0 6,53 7,3 ± 0,1 12 6,53 8,7 ± 0,1 24 6,62 9,2 ± 0,1 36 11 ± 0,1 6,64 9,7 ± 0,1 48 11,7 ± 0,1 6,7 9,9 ± 0,1 60 13,5 ± 0,1 6,83 10,8 ± 0,1 72 19,5 ± 0,1 7,01 11,2 ± 0,1 84 27,9 ± 0,1 7,11 12,6 ± 0,1 96 36,8 ± 0,1 7,13 13,1 ± 0,1 108 31,6 ± 0,1 7,31 11,9 ± 0,1 120 25,6 ± 0,1 7,45 10,2 ± 0,1 132 18,5 ± 0,1 7,61 9,8 ± 0,1 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 72