Nghiên cứu biện pháp kích kháng bằng hóa chất đối với bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. trên cây hành lá (Allium fistulosum L.)Nghiên cứu biện pháp kích kháng bằng hóa chất đối với bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. trên cây hành lá (Allium fistulosum L.)Nghiên cứu biện pháp kích kháng bằng hóa chất đối với bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. trên cây hành lá (Allium fistulosum L.)Nghiên cứu biện pháp kích kháng bằng hóa chất đối với bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. trên cây hành lá (Allium fistulosum L.)Nghiên cứu biện pháp kích kháng bằng hóa chất đối với bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. trên cây hành lá (Allium fistulosum L.)Nghiên cứu biện pháp kích kháng bằng hóa chất đối với bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. trên cây hành lá (Allium fistulosum L.)Nghiên cứu biện pháp kích kháng bằng hóa chất đối với bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. trên cây hành lá (Allium fistulosum L.)Nghiên cứu biện pháp kích kháng bằng hóa chất đối với bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. trên cây hành lá (Allium fistulosum L.)Nghiên cứu biện pháp kích kháng bằng hóa chất đối với bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. trên cây hành lá (Allium fistulosum L.)Nghiên cứu biện pháp kích kháng bằng hóa chất đối với bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. trên cây hành lá (Allium fistulosum L.)Nghiên cứu biện pháp kích kháng bằng hóa chất đối với bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. trên cây hành lá (Allium fistulosum L.)Nghiên cứu biện pháp kích kháng bằng hóa chất đối với bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. trên cây hành lá (Allium fistulosum L.)Nghiên cứu biện pháp kích kháng bằng hóa chất đối với bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. trên cây hành lá (Allium fistulosum L.)Nghiên cứu biện pháp kích kháng bằng hóa chất đối với bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. trên cây hành lá (Allium fistulosum L.)Nghiên cứu biện pháp kích kháng bằng hóa chất đối với bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. trên cây hành lá (Allium fistulosum L.)Nghiên cứu biện pháp kích kháng bằng hóa chất đối với bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. trên cây hành lá (Allium fistulosum L.)Nghiên cứu biện pháp kích kháng bằng hóa chất đối với bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. trên cây hành lá (Allium fistulosum L.)Nghiên cứu biện pháp kích kháng bằng hóa chất đối với bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. trên cây hành lá (Allium fistulosum L.)Nghiên cứu biện pháp kích kháng bằng hóa chất đối với bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. trên cây hành lá (Allium fistulosum L.)Nghiên cứu biện pháp kích kháng bằng hóa chất đối với bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. trên cây hành lá (Allium fistulosum L.)Nghiên cứu biện pháp kích kháng bằng hóa chất đối với bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. trên cây hành lá (Allium fistulosum L.)Nghiên cứu biện pháp kích kháng bằng hóa chất đối với bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. trên cây hành lá (Allium fistulosum L.)Nghiên cứu biện pháp kích kháng bằng hóa chất đối với bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. trên cây hành lá (Allium fistulosum L.)Nghiên cứu biện pháp kích kháng bằng hóa chất đối với bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. trên cây hành lá (Allium fistulosum L.)Nghiên cứu biện pháp kích kháng bằng hóa chất đối với bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. trên cây hành lá (Allium fistulosum L.)Nghiên cứu biện pháp kích kháng bằng hóa chất đối với bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. trên cây hành lá (Allium fistulosum L.)Nghiên cứu biện pháp kích kháng bằng hóa chất đối với bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. trên cây hành lá (Allium fistulosum L.)Nghiên cứu biện pháp kích kháng bằng hóa chất đối với bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. trên cây hành lá (Allium fistulosum L.)Nghiên cứu biện pháp kích kháng bằng hóa chất đối với bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. trên cây hành lá (Allium fistulosum L.)Nghiên cứu biện pháp kích kháng bằng hóa chất đối với bệnh thán thư do nấm Colletotrichum spp. trên cây hành lá (Allium fistulosum L.)
Tính cấp thiết củaluận án
Theo thốngkêcủa FAO năm 2022, hành là một loại cây trồng rộng rãi, với sản lượng thế giới 20,9 triệu tấn trên diện tích khoảng 1,18 triệu ha Trung Quốcvà ẤnĐộ là các nước trồng hành chính, tiếp theo là Hoa Kỳ,AiCập, Iran, Thổ Nhĩ Kỳ, Pakistan, Brazil, Liên bang NgavàHàn Quốc (FAO, 2023) Trong canh tác, hành lá là một loại câytrồngngắnngàyđượctrồngởvĩđộthấp,hànhláthườngđượcgọilà"Nữhoàngcủa nhà bếp” do hương vị, mùi thơm được đánh giá caovàcác hợp chất có đặc tính y học của hành lá (Griffithset al., 2002) Về giá trị sử dụng, hành lá là loại rau được sử dụng trong suốt cả năm,vídụ như trong món cà ri, trong dạng gia vị, trong món salad như một loại giavịhoặc nấu với các loại rau khác chẳng hạn như luộc hoặc nướng (Koch& Lawson,1996).
Hành lá (Allium fistulosumL.) được nông dân trồng phổ biến tại Vĩnh Long với diện tích xấp xỉ 1.000 ha/năm do hiệu quả kinh tế cao (Trung Thành, 2020)vàĐồng Tháp (Lê Thị Trúc Phương & Dương Ngọc Thành, 2019) Tuy nhiên, canh tác hành lá chuyên canh luôn gặp nhiều khó khăn do nhiều loại mầm bệnh do nấmvà vikhuẩn gây hại như bệnh cháy đầu lá do nấmBotrytissp., bệnh đốm tím trên lá do nấmAlternariapori,bệnhcháyládovikhuẩnXanthomonasaxonopodispv.allii,chếtbuộidovikhu ẩnErwiniasp.,vàđặcbiệtlàbệnhthánthưdonấmColletotrichumsp.gâyhại.Đâylàmột trong những bệnh quan trọng và gây thiệt hại nặng đến sản lượngvànăng suất hành lá, nôngdânchủyếusửdụngnhiềuloạithuốchóahọcvàphunnhiềulầnđểphòngtrịbệnh (Lê Thị Trúc Phương & Dương Ngọc Thành, 2019) Việc lạm dụng thuốc bảovệthực vật có ảnh hưởng xấu đến môi trườngvàsức khỏe người sử dụng do lưu tồn của thuốc trên hành lá Một trong những biện pháp thân thiện môi trường đã được nghiên cứu và ứng dụng trên cây trồng là kích thích tính kháng bệnh, gọi tắt là kích kháng (induced resistance).Kíchkhánglàbiệnphápgiúpchocâytrồngtạođượcnhiềucơchếchốnglại mầmbệnh,dođómangtínhbềnvữngcao(TrầnThịThuThủy&PhạmVănKim,2016).
Nhiềuloạihóachấtcókhảnăngkíchkhángđãđượcghinhậntrênthếgiớinhưsalicylic acid(SA),dichloroisonicotinicacid(INA),benzothiazoles(Agrios,2005),Acibenzolar- S-Methyl,Tiadinil, Isotianil, Probenazole (PBZ), nhóm Imprimatin, Azelaic Acid(AZA), Glycerol-3- phosphate (G3P) (Tripathiaet al., 2019), acid oxalic, KH2PO4,CuCl2.H2O,vàchitosan(TrầnThịThuThủy&PhạmVănKim,2016).M ộ t trongnhữnghóachấtgiúp giảmbệnhcháylávàbệnhđốmnâutrênlúalàSA0,4mM(TrầnThịThu Thủy & Phạm Văn Kim,2016), chất này cũng thể hiện khả năng kích thích cây trồng sản sinh các chất giúp cây trồng kháng bệnh trên cây đậugà(Cicer arietinumL.) khi được xử lý với nồng độ1,5mM(Waret al.,2011); đồng thời, xử lý với nồng độ 2mMở giai đoạn sau thu hoạch giúp giảm bệnh thán thư trên xoài (Junyuet al., 2016) Bêncạnh đó, calcium chloride100mM(CaCl2) cũng được ghi nhận giúp kích thíchtính kháng bệnh thán thư trên dưa leo hoặc bệnh sọc trắng lá bắp Đồng thời cho hiệu quả giảmbệnhtốtvàbềnđốivớibệnhthánthưdưaleotrongđiềukiệnngoàiđồng, giúpgia tăng hoạt tính enzyme chitinase sớmvàđạt đỉnh cao vào 144 giờ sau khi phun nấm lây bệnh (Trần Thị Thu Thủy & Phạm Văn Kim, 2016) Calci trong hợp chất calci oxide còn giúp giảm bệnh cháy lá dovikhuẩnXanthomonastrên cây hành lá thông qua việc rải vào đất trồng (Tạ Duy Hùnget al., 2019) Các hóa chất này giúp giảm bệnh thông qua sự gia tăng hoạt tớnh của enzyme chitinase, ò-1,3-glucanase, peroxidase, cỏc chất dẫn truyền tín hiệu hoặc các hợp chất phenolic, lignin, …trên cây xoài, dưa leovàbắp (Junyuet al., 2016; Trần Thị Thu Thủy & Phạm Văn Kim,2016).
Việcnghiêncứuvềhiệuquảkíchthíchtínhkhángbệnhthánthưcủacácloạihóa chất tại Việt Nam trên các loại rau ăn lá còn rất ít, đặc biệt là cây hành lá Vì vậy, đềtài “Nghiêncứubiện pháp kích kháng bằng hóa chất đối với bệnh thán thư do nấm Colletotrichumspp trêncâyhànhlá( AlliumfistulosumL.)” đãđượcthựchiệnnhằmđánh giá hiệu quả quản lý bệnh thán thư bằng các hóa chất CaCl2vàSA,đồng thờinghiên cứu đi sâuvềmặt cơ chế kích thích tính kháng bệnh của các hóa chất triển vọng này trong chiến lược quản lý bệnh theo hướng an toàn tại Việt Nam.
Mục đíchnghiêncứu
Phân lập, đánh giá khả năng gây bệnh thán thư hành lá của một số chủngnấmColletotrichumspp thu thập tại Vĩnh LongvàĐồng Tháp, từ đó định danh loài gâyhạinặng Bên cạnh đó, xác định đượccơchế, hiệu quảvàkỹ thuật sử dụngCaCl2vàSAnhư một hoá chất kích kháng để hạn chế nấmCollectotrichumspp gây bệnh thán thư trên hành lá, góp phần hạn chế tác hại của bệnhvàsản xuất hành lá bền vững ở vùng đồng bằng sông CửuLong.
Nội dungnghiêncứu
Đề tài thực hiện gồm 3 nội dung chính:
- Nội dung 1.Thu thập, phân lập, đánh giá khả năng gây bệnh của các chủng nấm gâybệnhthánthưhànhláthuthậptạimộtsốtỉnhtrồnghànhláởĐBSCL.Đồng thời, định danh loài đối với chủng nấmColletotrichumcó khả năng gâybệnhnặng trên hànhlá.
- Nộidung2.NghiêncứukhảnăngkíchkhángvàkỹthuậtsửdụnghoáchấtCaCl2vàSA như một chất kích kháng để hạn chế nấmCollectotrichumgây bệnh thán thư hại hành.
- Nội dung 3.Khảo sát cơ chế kích kháng của CaCl2vàSA thông qua biểu hiệnmôhọc, sinh hoávàgen.
Tính mới củaluậnán
- Đã chứng tỏ 2 loại hóa chất CaCl 2 200mM và SA2mMcó tiềm năng áp dụngtrong thực tiễn phòng chống bệnh thán thư hànhlá.
- Đã chứng minh được 2 hóa chất CaCl 2 200 mMvàSA 2 mM có tạo tính khángtrên cây hành lá chống lại nấmC gloeosporioidesgây bệnh thán thư khi có sự gia tăngsớmvàcao của các hợp chất phenol, tế bào phát quang (khía cạnh mô học),củacácenzymeβ1,3glucanase,chitinase,peroxidase,catalase(khóacạnh sinh hóa)vàgen tổng hợp enzzyme chitinase (biểu hiệngen).
Đối tượngvàphạmvinghiên cứu
1.5.1 Đối tượng nghiêncứu Đối tượng nghiên cứu của luận án là cây hành lá, bệnh thán thư do nấm
Colletotrichum gloeosporioidesvà hóa chất kích kháng CaCl2, SA.
Thuthập mẫubệnhthánthưhànhláở2tỉnhVĩnhLongvàĐồngTháp,phânlậpvàtuyển chọn dòng nấm gây hại nặng trong điều kiện nhà lưới Dòng nấm này được địnhdanhdựavàoquansátđặcđiểmhìnhtháidướikínhhiểnviquanghọcvàgiảitrình tự gen để xác định loài Sau đó, các thí nghiệm xác định nồng độ, cách xử lý, số lầnphunCaCl 2h o ặ c SAđểđạtđượchiệuquảquảnlýbệnhthánthưvàtăngnăngsuấtđượcthực hiện ở điều kiện nhà lướivàngoài đồng Cuối cùng, cơ chế kích kháng được khảo sát thông qua các thay đổivềkhía cạnhmôhọc, sinh hóavàgen khi xử lý 2 loại hóachấtCaCl2200mM vàSA 2mM.
Ý nghĩa khoa họcvàthựctiễn
Luận án là công trình nghiên cứu có giá trị khoa học đi từ các nghiên cứucơbản đến nghiên cứu ứng dụngvềbệnh thán thư hành lávàbiện pháp phòng trừ bệnhbằnghóa chất kích kháng Kết quả của luận án đã xác định được loài gây bệnh thán thưnặng trên cây hành lá làColletotrichum gloeosporioides, xác định được nồng độ, cách xử lývàsốlầnphunCaCl 2và SAgiúpquảnlýcóhiệuquảđốivớibệnhnày.Ngoàira,nghiêncứucũngđãk ếthợpcácphântíchmôhọc,sinhhóavàbiểuhiệngenchitinaseđãchứngminh được 2 hóa chất CaCl2vàSA có tạo tính kháng trên cây hành lá chống lại nấmC.gloeosporioidesgây bệnh thánthư.
Luận án đã xác địnhvàđịnh danh loài nấm thán thư hành lá góp phần xác định tácnhângâybệnhcụthể Đồngthời,biệnpháp kíchthíchtínhkhángbệnhdophứchợploàiC.gloeosporioidestrên cây hành bằng CaCl2200mM vàSA 2mMlà biện phápphòng trừ phù hợp, thân thiện với môitrường.
TỔNG QUANTÀILIỆU
Sơlược chungvềcâyhànhlá
Hành lá có tên khoa họcAllium fistulosumL họ hành Aliliaceae (Mai Văn Quyền et al., 2000), có nguồn gốc từ loàiAllium altaicumhoang dại (Oyenet al., 1993).
Trong thời Cận Đại, những nhà thực vật học Nga đã tìm thấy loài hoang dã của chúng trong những dãy núi Altai Hành lá đến từ Nga qua ChâuÂuvào thời Trung CổvàđượctrồngrấtphổbiếnởphươngĐông(James,2009).Ngàynay,hànhláđượctrồng rộng rãi trong các khu vực ôn đớivàcận nhiệt đới trên thế giới (Kimet al., 2008).
Theo thống kê của FAO năm 2022, hành là một loại cây trồng rộng rãi, với sản lượng thế giới 20,9 triệu tấn trên diện tích khoảng 1,18 triệu ha Trung Quốc và Ấn Độ là các nước trồng hành chính, tiếp theo là Hoa Kỳ, Ai Cập, Iran, Thổ Nhĩ Kỳ, Pakistan, Brazil, Liên bang Nga và Hàn Quốc (FAO, 2023) Ở nước ta, hành lá được trồng nhiều tại các tỉnh Vĩnh Long, Đồng Tháp, An Giang và Nghệ An với diện tích xấp xỉ 1.000 ha/năm (Báo điện tử Đảng Cộng sản Việt Nam, 2015; Minh Hồ, 2016; Trung Thành, 2022; Đỗ Hương, 2023).
Cây thân thảo, sống lâu năm, có mùi đặc biệt.Láhình trụ rỗng, dài 30-50 cm, đường kính 4-8 mm, phía dưới phình lên, đầu thuôn nhọn, mỗi cây có 5-6 lá Hoa tự mọctrênmộtcánmanghoahìnhtrụ,rỗng.Hạthình3cạnh,màuđen(ĐườngHồngDật, 2003).
Hành được trồng khắp nơi, chủ yếu làm gia vị, là vị thuốc nam được dùng để chữa nhiều loại bệnh: thuốc ho, trừ đờm, lợi tiểu, sát trùng… (Trần Thị Baet al., 2008).
Theo Lê Quang Khôi (2014), hành lá thuần trong nước ta được chia làm 3 giống:
- Giống hành gốc tím (hành Sậy hay hành Trâu): lá to, bụi lớn, năng suất 1-1,5 tấn/
- Giống hành gốc trắng (hành Hương): lá nhỏ, bụi nhỏ, có mùi thơm, năng suất 1 tấn/1000 m 2 , dễ bị bệnh vànglá.
- Giống hành đá: lá, bụi thuộc dạng trung gian, năng suất 1-1,5 tấn/1000 m 2 , trồng phổ biến, thị trường ưa chuộng, thích hợp trồng dàyngày.
NgoàiracòncócácgiốnghànhlaiF1củanướcngoàinhậpvàonướctacóbẹtrắng, lá to, ăn không thơm nhưng cho năng suất cao hơn nhiều so với các giống hành thuần trong nước (Lê QuangKhôi,2014).
Chọn những bụi hành tương đối đồng đều, đúng tuổi, sinh trưởng tốt, không nhiễm sâu bệnh để trồng.
Lượng giống: tùy vào chất lượng giống, khoảng 180-240 kg hành giống/1000 m 2 (Trần Thị Baet al., 2008).
Saukhithuhoạchcácloạiraumàuhoặchànhlávụtrước,tiếnhànhdọncỏ,vệsinhvàsửalạiliếptrồ ngbằngphẳng.Liếptrồnghànhrộng1-1,2m,cao20-30cm;rãnhrộng 20-25 cm Đất trồng trên các liếp được cuốc xới, bổ sung phân hữu cơvàvôi Lượng phân hữu cơvisinhvàvôi được bón với lượng lần lượt là 50kg và20-30 kg/1000m 2
Chọn những bụi hành tương đối đồng đều, đúng tuổi, sinh trưởng tốt, không quá già, không bị nhiễm sâu bệnh, còn phấn trắng trên lá để đem đi trồng Trồng hành với khoảng cách: hàng cách hàng 20 cm, cây cách cây 15 cm Rải một lớp rơm mỏng lên mặt liếp trước trồng nhằm giữa ẩm cho cây sau trồng Dùng chày có đầu nhọn dọng lỗ với độ sâu 2-3 cm rồi cấy mỗi hốc 2 tép hành vào, lấp lại bằng tro trấu.
Công thức phân bón của nông dân cho cây hành lá là 120N-120P2O5-90K2O, cao hơn khuyến cáo phân bón hành lá của Trần Thị Baet al.(2008) là 127,6N-173P2O5- 33K2O Theo đó, tổng lượng phân dùng cho 1000 m2gồm: phân chuồng hoai: 1 tấn;trotrấu: 30 kg; ure: 26 kg; super lân: 75 kg; kali: 15kg.
Lượng phân này được chia thành các lần bón gồm: bón lót: 1 tấn phân chuồng hoai + 30 kg tro trấu + 28 kg super lân + 5 kg kali; bón thúc vào các lần tiếp theo: phân hòa vào nước tưới, lần đầu khi hành hồi xanh (khoảng 7 ngày sau trồng), sau đó cứ 7 ngày tưới 1 lần (khoảng 4-5 lần/vụ) Ngưng tưới và phun phân bón trước khi thu hoạch 7-10 ngày Hành lá sau khi trồng khoảng 50-60 ngày có thể thu hoạch, có thể kéo dài thêm 10-15 ngày để thu hoạch có giá bán cao hơn.
2.1.4.4 Một số bệnh hại quantrọng
Hành bị nhiễm nhiều bệnh nấm trên lá, thân củvàrễ; hoặc bệnh cháy lá dovikhuẩn,thốithâncủdovikhuẩn,mộtsốvirútthựcvật,vàmộtvàibệnhrễdotuyếntrùng.
Cácbệnhdotuyếntrùngchủyếugâycòicọcvàítkhilàmcâychết,vìvậythườngkhông được chú ý đến (Burgesset al.,2009).
TheokếtquảkhảosátcủaLêThịTrúcPhương&DươngNgọcThành(2019)tại VĩnhLongvàĐồng Tháp, thì các bệnh gây hại nhiều trên hành là cháy đầu lá do nấmBotrytissp., chết buội dovikhuẩnErwiniasp., đốm tímdonấmAlternaria porri, cháy ládovikhuẩnXanthomonasaxonopodispv.alliivàthánthưdonấmColletotrichumsp.
(Hình 2.1) Bệnh chết buội xuất hiện 100% ở thời điểm sớm (đến 15 ngày sau trồng), bệnh cháy đầu lá và thán thư chủ yếu xuất hiện ở thời điểm 16-45 ngày, bệnh đốm tím và cháy lá do vi khuẩn xuất hiện ở các giai đoạn sau nhưng chủ yếu là từ 31 ngày đến thu hoạch Đồng thời trong tổng số 39 loại thuốc trừ bệnh đã được ghi nhận, đa phần nông dân sử dụng thuốc định kỳ và không đúng liều lượng khuyến cáo (trên 80%) với số lần phun thuốc trừ bệnh trung bình là 7,8 lần/vụ.
Bảng 2.1 Các bệnh hại do nấm phổ biến trên hành (Burgess et al , 2009)
STT Bệnh Tác nhân Dấu hiệu chẩn đoánchính
1 Cháyđầulá Colletotrichumsp Đầulábiến màu nâu trắng,cóđĩac à n h
3 ĐốmláStemp hylium Stemphyliumsp Đốmládạng giống đốmvòng
4 Thốicổrễ Botrytisbyssoidea Nấm màu nâu xám và các khối bàotử xuất hiện trên củ
5 Thối gốcmốctrắng Sclerotiumrolfsii Sợi nấm màu trắngvàhạch nấm màu nâu trên gốc
6 Thối (ướt)cuốnglá Sclerotiniasclerotiorum Sợi nấm màu trắng, hạch nấmtomàu đen.
7 ThốiFusarium Fusariumspp Sợi nấm cómàutrắng đến tímnhạt, không có hạch nấm
8 Mốc đen(thốicủ) Aspergillusniger Các đám bàotửnhưbộtmàuđen
(cũng là bệnh gây thối trong quá trình bảo quản )
Rễ màu hồng và vảy ngoài màu hồngNấm mọc dày trông như bông gòn với các túi bào tử đen rõ rệt a b c
Hình 2.1 Một số bệnh phổ biến trên cây hành lá: (a) cháy lá do vi khuẩn
Bệnh thán thư trênhànhlá
2.2.1 Phổkýchủ, tình hình phân bố và gâyhại
NấmColletotrichumspp có phổkíchủ gây hại trên nhiều loại cây trồng như ớt, cà chua, nho, dâu tây, táo, bơ, đu đủ, chuối… (Hydeet al., 2009a) Đặc biệt một sốloài cóphổkhíchủrấtrộngnhưC.gloeospoeioides(CABI,2001;Hydeetal.,2009a).NấmColletotric humcóthểgâythiệthạichonăngsuấtởcả2giaiđoạntrướcvàsauthuhoạch (Hydeet al.,2009a).
Bệnh thán thư trên hành được ghi nhận đầu tiên tại nước Anh vào năm 1851vàsau đó phổ biến rộng rãi ở ChâuÂu vàMỹ(Verma& Sharma, 1999) Bệnh thán thư trênhànhlàbệnhphổbiếnởchâuÂu,Mỹ,TrungQuốc,ẤnĐộvàNhậtBản.Bệnhthán thưgâyhạinặngvàomùamưa,thiệthạinăngsuấtướctínhtừ50-100%(Kanlongetal., 1988) Vào năm 1995, trên những cánh đồng trồng hành ở miền Nam Berlin nướcĐức xuất hiện một bệnh lạ làm mùa màng mất trắng, gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến nền kinh tế ở đây Năm 2004, đã xác định đâylàbệnh thán thư do nấmColletotrichumgloeosporioidesgây ra (Sikirouet al.,2011).
Theo Albertoet al.(2004), tại Philippines bệnh thán thư trên hành do nấmColletotrichum gloeosporioides(Penz.) Sacc gây ra xuất hiện đầu tiên vào những năm 2000và2001, dịch bệnh bùng phát đã gây ảnh hưởng nghiệm trọng đến kinh tế vùng trồng hành ở tỉnh Nueva EcijavàLuzon Đồng thời, nấmC gloeosporioidesgây bệnh nặng trên cả 3 giống hành phổ biến là Yellow Granex, Red CreolevàShallot (Alberto, 2014) Kết quả khảo sát của Rodríguez-Salamanca & Hausbeck (2018) trong
2 năm 2011và2012 tại bang Michigan (Mỹ) trên 16 giống hành tây (A cepaL.) chỉ có giống 'Hendrix' nhiễm bệnh thấp nhất, trong khi 'Highlander'và'Candy' có biểu hiện cáctriệu chứng bệnh thán thư ở cổvàlá hành nghiêm trọng Tại tỉnh Cam Túc (Trung Quốc), Chenet al.(2021) đã có báo cáo đầu tiênvềcác thiệt hại nghiêm trọng của bệnh thán thư hành lá tại đây với tỷ lệ mắc bệnh cao (khoảng 60%) do nhiễm nấmC.circinans. Ở Việt Nam, bệnh thán thư trên hành được nghiên cứu từ năm 1988 ở BắcNinh,Hải Dương, Hà Tây, Vĩnh Phúc, được ghi nhận có thể làm giảm năng suất từ 10-15%(VũTriệuMânetal.,2007).TạiSócTrăngvàonăm2005,cókhoảng50%diệntích hành vụ sớm bị nhiễm bệnh thán thư làm năng suất giảm nghiêm trọng (Đặng Thị Cúc, 2008) Đây cũng là một trong năm bệnh hại chính trên cây hành lá trồng tại Vĩnh Long và Đồng Tháp (Lê Thị Trúc Phương & Dương Ngọc Thành, 2019).
Bệnh có thể xuất hiện trong suốt thời gian sinh trưởng, trên các bộ phận của cây trên đồng ruộng Ngoài ra, bệnh cũng gây hại trong quá trình tồn trữ và vận chuyển (Verma & Sharma, 1999).
TheoTrầnThịBaetal.(2008),bệnhgâyhại cảtrênhànhlálẫnhànhcủ.Trênlá vết bệnh ban đầu có hình bầu dục, màu sáng trắng, xung quanh có viền màu vàng nhạt. Vếtbệnhđầutiênthườngxuấthiệnởgiữalá,ítgặpởchóplá.Sauđó,vếtbệnhlanrộngvàkéo dài theo chiều dài lá Trên vết bệnh xuất hiện rất nhiềuchấmđen nhỏ xếp thành vòng tròn đồng tâm, đó là các đĩa đài của nấm gây bệnh (Vũ Triệu Mânet al., 2007) Bệnh tấn công bất cứvịtrí nào trên cây, từ chóp lá đến phần gốc gần sát mặt đất Bệnh xuấthiệntrênlávàcổlá,vếtbệnhkhô,hìnhbầudục,trênvếtbệnhcónhữngmàuchấm sáng nhô lên sau đó vết bệnh lan rộng khắp bề mặt lá (Rodriguez –Salamancaet al., 2012) Ngoài ra, bệnh còn xuất hiện những đốm đen không đều trên các màng bọc lá làm cho lá khô cháy (Kimet al., 2008) Bệnh nặng khi vết bệnh nối liền nhau sẽlàmcháy lávàchết cây. Nếu bệnh nặng có thể chiếm hết phần mộtnửacủa lá với sự hình thành những khối bào tử ban đầu có màu hơi hồng sau đó chuyển sang đenvàcó thể quan sát thấy khối bào tử bằng mắt thường hoặc kính lúp cầm tay (Snowdon, 1990) (Hình 2.2và2.3) Triệu chứng bệnh cũng thay đổi theo nhiệt độvàẩm độ môi trường (Vũ Triệu Mânet al.,2007)
Hình 2.2 Triệu chứng bệnh thán thư trên hành lá
(https://www.plantwise.org/KnowledgeBank/pmdg/20147800332)
Hình2.3Triệuchứngthườnggặptrêncâyhànhdo C.gloeosporioidesgây ra.a,tổnthương màu trắng với các khối giống như chấm màu cam ở giữa.b,các khối màu cam xếp thành các vòng đồng tâm c, triệu chứng thán thư điển hình (Perez & Alberto,2020)
NấmColletotrichumspp gây bệnh thán thư trên cây hành là nấm thuộc bộ đĩa đài (Molaconiales) của lớp nấm bất toàn (Deuteromycetes) Ở giai đoạn sinh sản hữu tính nấmColletotrichumthuộc lớp nấm nang (Ascomycetes) có tên là Glomerella (Agrios, 2005; Hydeet al., 2009a).
Hydeetal.(2009)đãmôtả66loàiColletotrichumcóthểgâybệnhtrêncâytrồng, trong đóC. gloeosporioidesPenzvàC acutatumSimmonds là 2 loài gây hại phổ biến nhất.LoàiC.gloeosporioidesPenzcóthểtấncônggâybệnhcho khoảng470chikíchủ khácnhau,trongkhiC.acutatumSimmondscũngphânbốtrêntoànthếgiớitrên34chikíchủ thực vật thuộc 22 họ (Phuong Thi Hang Nguyen, 2010) Riêng trên cây ớt, Diaoetal.
(2017)cũngđãxácđịnhcó15loàiColletotrichumgâyhạivới5loàichủyếulàC.fioriniae,C.fructic ola,C.gloeosporioides,C.scovilleivàC.truncatum.Vềsốloàigây hại trên cây trồng, Cannonet al.(2012) đã tổng hợp được 119 loài nấmColletotrichumgây hại cây trồng, có loài phổ biến trên toàn thế giới nhưng cũng có loài chỉ gây hại ở một khu vực hẹp Đồng thời, dựa vào phân tích các vùng gen ITS, GADPH, CHS-1, HIS3, ACT, TUB2vàCAL, tác giả đã phân chúng vào 10 nhánh nấmColletotrichum, trongđócó9nhánhgồmcácloàicósựgầngũivềditruyềnvà1nhómgồmmộtsốloài riêngbiệt(Cannonetal.,2012).Cũngvớiphântíchvềmặtditruyền,Weiretal.(2012) đãxếp22loàivà1phânloàivàophứcloàiC.gloeosporioides,baogồm:C.asianum,
C cordylinicola,C fructicola,C gloeosporioides,C horii,C. kahawaesubsp.kahawae,C musae,C nupharicola,C psidii,C siamense,C. theobromicola,C.tropicale,C xanthorrhoeae,C aenigma,C aeschynomenes,C. alatae,C alienum,C.aotearoa,C clidemiae,C kahawaesubsp.ciggaro,C salsolae,C ti, cùng với phân loàiC queenslandicum(C gloeosporioidesvar.minus) Đồng thời, giai đoạn sinh sản hữu tính củaC gloeosporioidescũng được xác định làGlomerella cingulata.
Bảng 2.2 Một số loài nấm Colletotrichum spp gây bệnh thán thư trên cây họ hành (Kim et al , 2008; Dutta et al (2022))
C.truncatum Allium cepa, A fistulosumvàA.angulosum
BệnhthánthưtrênhànhđượcđãghinhậnbởinhiềuloàinấmColletotrichumspp. gâyratrêncácvùngtrồnghànhthuộcnhiềuquốcgiathế giới(Bảng2.2).Trênthế giới, bệnh thán thư trên hành lávàhành tây được ghi nhận gây ra bởi các loài nấm nhưC.gloeosporioides(Penzig) Penzig & Sacc (Albertoet al., 2004),C circinans(Berk) Voglino(Kimetal.,2008;Kiehretal.,2012;Chenetal.,2021),C.coccodes(Rodriguez
Salamanaetal.,2012),C.spaethianum(Santanaetal.,2015),C.theobromicolavàC.truncatum( Matoset al., 2017) Ở Việt Nam, bệnh thán thư trên hành được ghi nhận là gây ra bởi các loàiC circinans(Berk) Voglino (Vũ Triệu Mânet al., 2007; Đặng Vũ ThịThanh,2008),C.gloeosporioides(Penzig)Penzig&Sacc(TrầnThịBaetal.,2008; Nguyễn Tấn Đạt, 2019)vàC truncatum(Nguyễn Tấn Đạt,2019).
2.2.3.2 Đặc điểm hìnhthái ĐặcđiểmhìnhtháicủacácloàinấmColletotrichumrấtđadạng,chúngcósựthay đổitừdạngsợinấmpháttriển,hìnhdạng,kíchthướccủabàotửvàđĩaáp(NguyễnQuốc Thái, 2010; Dammet al., 2012,LêMinh Tườnget al., 2013;LêMinh Tường, 2014;LêMinhTường&NguyễnHồngQuí, 2016;HồVănTỏa,2016,BùiĐôngHồ, 2016;Diaoet al., 2017)
Sợi nấmColletotrichumđa bào, phân nhánh có màu sắcvàkích thước thay đổi, khicòn nonsợinấmkhôngmàu,khigiàcó màusẫm.Đĩacànhnằmchìmdướilớpbiểu bì của lá,môcủ khi thuần thục phávỡ môvà lộ ra bên ngoài (Vũ Triệu Mânet al., 2007) Đặc điểm một số loài nấmColletotrichumgây bệnh thán thư trên cây hành lá (Allium fistulosum) lần lượt được trình bày ở nội dung tiếp theo.
Hình 2.4 Đặc tính hình thái của nấm C circinan phân lập từ vết bệnh ở lá hànhA khuẩn lạc nuôi cấy trên môi trường PDA ở 20 ngày sau cấy, 24 0 C B Gai nhọn ở vết bệnh C Bào tử D Đĩa áp (Kimet al., 2008).
Kích thích tính kháng bệnh trêncâytrồng
Kích thích tính kháng thường được gọi tắt là “kích kháng”, là sự kích thích để tạo ra tính kháng bệnh của thực vật Hiện tượng này giúp cho giống cây trồng bị nhiễm trở nên có khả năng kháng được bệnh ở mức độ nào đó sau khi xử lý chất kích kháng.Phương pháp kích kháng không có tác dụng loại trừ trực tiếp mầm bệnh như những thuốc trừ dịch hại thông thường mà dựa trên sự kích thích của những cơ chế tự nhiên của cây trồng Chất kích kháng có thể là một loài vi sinh vật không gây bệnh, không mang tính độc đối với cây trồng hoặc có thể là một loại hóa chất nào đó không độc và không có tác động trực tiếp diệt mầm bệnh như những hóa chất được dùng trong nông dược (Phạm Văn Kim, 2002).
TheoPieterseetal.(1996),kíchkhángbệnhlàhiệntượngmàcâytrồngbiểuhiện mức độ kháng lại tác nhân gây bệnh sau khi nhận được sự kíchthíchthích hợp Cơ chế liên quan đến tính kích kháng bao gồm sự lignin hóa, sự hình thành những cấu trúc rào cảnvànhững protein liên quan đến sự phát sinh bệnh Ưu điểm của biện pháp này là không chuyên biệt, nghĩa là có nhiều cách xử lý kích kháng, cóthểáp dụng trên nhiều loại cây trồngvàvới nhiều đối tượng gây bệnh (Dann,2003).
Tính kháng tạo đượcIR(induced resistance) là “một trạng thái sinh lý của cây với khả năng phòng thủ được tăng cường nhờ được kích hoạt bởi các kích thích môi trường đặc biệt” Nhờ khả năng phòng thủ được tăng cường nàymàcây có thể chống lại được sự tấn công tiếp theo của các tác nhân gây bệnh Tính kháng tạo được mang tính phổ rộng, chống lại được nấm,vikhuẩn, virus, tuyến trùng, côn trùng Như vậy có thểthấytínhkhángtạođượcchỉhìnhthànhsaukhiđượckíchthíchbởinguồnkíchhoạt (elicitor). Dựa vào bản chất của nguồn kích hoạtvàđường dẫn truyền tín hiệu, tính kháng tạo được có thể được chia làm 2 loại chính là là tính kháng tập nhiễm hệ thống SAR (systemic acquired resistance)vàtính kháng hệ thống tạo được ISR (induced systemic resistance) (Hà Viết Cường,2011).
Tính kháng tập nhiễmhệthống SARlà loại tính kháng tạo được có tính lưu dẫn (hệ thống), phổ rộng (chống lại nhiều tác nhân gây bệnhvàthậm chí các ức chếvôsinh), thường dẫn tới biểu hiện protein PRvàthông qua đường dẫn truyền tín hiệuSA(salycilic acid) Nguồn tạoSARlàvisinh vật gồm nấm,vikhuẩn, virus… Cácvisinh vậtnàycóthểgâybệnhhoặckhônggâybệnhchocây.Ngoàira,SARcũngcóthểlàcác hóa chất nhưSA,INA BTH… Dấu hiệu phân tử tín hiệu đặc trưng của SAR làSAcó thể được tạo ra rất nhanh trong vòng vài giờ (4-6 giờ) sau lây nhiễmvànhân lên nhanh chóng; sau khoảng 24 giờ SAR đã biểu hiện toàn cây.Sựdi chuyển của SAR thường theo hướng từ dưới gốc lên trên ngọn Cây có thể duy trìSARtrong thời gian rất lâu, trong nhiều trường hợp kéo dài cả đời của cây (Hà Viết Cường,2011).
Tính kháng hệ thống tạo được ISR
TínhkhánghệthốngtạođượcISRlàloạitínhkhángtạođượccótínhlưudẫn(hệ thống),phổrộng(chốnglạinhiềutácnhângâybệnh),khôngdẫntớibiểuhiệnPRproteinvàthông qua đường dẫn truyền tín hiệu JA/ET (jasmonic acid và ethylen) Nguồn tạo ISR làvisinh vật vùng rễ không gây bệnh cho cây, điển hình là cácvikhuẩn vùng rễ nhưPseudomonas,BacillushoặcBradyrhizobium(Hà Viết Cường,2011).
Kíchkhánglàkếtquảcuốicùngcủaquátrìnhphứctạpcủasựthayđổichấttrongmôcâyvàviệc xác định diễn tiến quá trình này rất khó khăn (Steiner & Schonbeck,1995).Trongbộgencủatếbàocâycócácgenđiềukhiểntếbàotiếtracácchấtgiúpmô cây kháng với một bệnh nào đó hoặc nhiễm bệnh nào đó Tuy nhiên, trong tình trạng bình thường, các gen này bị một gen ức chế bên cạnh ức chế nó Khi ta phun tác nhân gâykíchkhánglênlácâyấy,tácnhângây kíchkhángtácđộnglênbềmặtlá,kíchthích các thụ thể có ở bề mặt lá Khi lá bị kích thích, các thụ thể này tạo tín hiệuvàchuyển tín hiệu này vào nhân của tế bàovàtác động vào gen điều tiết Gen điều tiết bị tácđộng nênkhônghoạtđộngvàkhôngcònứcchếgenkhángbệnh.Nhờđógenkhángbệnhđiều khiển tế bào tiết ra các chất kháng bệnh Nhờ các chất kháng bệnh nàymàcây trồng từ nhiễm bệnh trở thành kháng bệnh (Phạm Văn Kim,2000).
Khi mầm bệnh xâm nhập vào bên trongmôcủa cây, do cần phải lấy dinh dưỡng hầu cung cấp cho nhu cầu của chính bản thân mình, mầm bệnh phải thiết lập cho được mốiliênhệvềthựcphẩmvớikýchủ.Mầmbệnhphảitiếtracácenzyme,chấtđộcvàcả cáckíchthíchtốcầnthiết,tácđộngvàocâylàmchocâybịhại.Câytrồngbắtđầunhững phântửbáohiệuchỉrahiệndiệncủamầmbệnhtiếpxúcvớicâytrồng.Mầmbệnhphóng thích ra môi trường các chất như glycoprotein, carbohydrat, acid béovàpeptides, oligosaccharide (Agrios, 2005) Các chất này hoạt động như chất mồi (elicitor), chúng sẽtácđộnglênmặtngoàicủatếbàobiểubìkýchủ,kíchthích giúpkýchủbiếtđượccó mầm bệnh tấn côngvàmột loạt các phản ứng sinh hóavàsự thay đổi cấu trúc di truyền trong tế bào cây xảy ra nhằm cố gắng đẩy lùi mầm bệnhvànhững enzym gây độc.Sựnhận ra, chuyển tín hiệu báo động, phản ứng của tế bào nhanh hay chậm đã làm cho tế bào của ký chủ là nhiễm bệnh hay khángbệnh.
Chất mồi có nguồn gốc từ mầm bệnh được nhận biết bởikýchủ, những chuỗi báo hiệu được gởi ra protein tế bàokýchủvàđến những gen trong nhân làm chúng trở nên hoạt động, để sản xuất ra các chất ngăn chặn hoặc những sản phẩm hướng tới điểm tế bào bị tấn công Những chuỗi báo hiệu có khi chỉ có hiệu quả tại chỗvàcó khi được chuyểnđếntếbàolâncậnhayđượclưudẫnkhắpcây.TheoAgrios(2005),cáchợpchất tín hiệu kích thích sinh ra PR protein gồm các salicylic acid, acid jasmonic, ethylen, systeminvàcó thể những chất khác Các PR protein là các enzyme được sản sinh trong thựcvậttrongtrườnghợpcósựtấncôngcủamầmbệnh(VanLoon&VanStrien,1999).
Chúngđượcsinhranhưlàmộtphầncủasứcđềkhánglưudẫn.Sựxâmnhiễmcủamầm bệnh kích hoạt các gen tạo ra các PR protein Một trong số các PR protein này là các chất kháng nấm hoặcvikhuẩn.Sựxâm nhiễm cũng kích thích sự liên kết chéo của các phân tử trong thành tế bàovàsự tích tụ của lignin, phản ứng tạo ra một rào cản tại chổ làm chậm sự lây lan mầm bệnh sang các bộ phận khác của cây (Campbell & Reece, 2005).
PR protein được chính thức chia thành 17 nhóm lớn, chủ yếu dựa vào cấu trúc,trong đó có 6 PR protein có liên quan đến chức năng tăng cường sự tổng hợp của các enzyme β-1-3-glucanase, chitinase, peroxidase (Bảng 2.5) Ngoài ra, còn 1 nhóm mới đang nghiên cứu là Chitosanase Số lượng PR protein thay đổi tùy theo loại cây, cụ thể trên 16 PR protein ở khoai tây, trên 33 PR protein ở thuốc lá, 30 PR protein ở củ cải đường.
Bảng 2.5 Các loại PR protein liên quan sự kháng bệnh hại do nấm trên cây trồng
Loại PR Loại cây trồng đã ghi nhậnPRprotein Chứcnăng protein
PR-2 Lúa,lúa mì, lúamạch, bắp, khoai tây, cà chua, thuốc lá, tiêu, đậu cácloại β-1,3-glucanase
PR-3 Lúa, bắp, cà chua, tiêu, củ cải đường,cảidầu
Thuốclá,cà chua,caosu Chitinase
PR-9 Cà chua,lúa,khoai tây,lúamì Peroxidase
2.3.3 Dẫn truyền tín hiệu trong miễn dịch thựcvật
Phản ứng phòng thủ tạo được của cây điều khiển bởi một mạng lưới các đường dẫn truyền tín hiệu chồng chéo lên nhau Nhiều phân tử tham gia các đường dẫn truyền tín hiệu (Hà Viết Cường, 2011).
2.3.3.1 Đường hướng salicyclic acid (SA)
Salicyclic acid (SA) là một phytohormon, có vai trò quan trọng trong phát triển, quang hợp, hô hấp… của thực vật SA cũng là một phân tử tín hiệu nội sinh tham gia cảm ứng tính kháng tạo được của thực vât Vai trò của SA trong dẫn truyền tính kháng đã được chứng minh trong một số thí nghiệm:
- Xử lýSAtrên cây thuốc lá đã dẫn tới giảm triệu chứng bị nhiễm bởi TMVvàtích lũy nhiều PR protein (thí nghiệm của White,1970).
- Lây nhiễm TMV trên thuốc lá dẫn tới hàm lượng SA tăng cục bộ (tạivịtrí lây nhiễm)vàhệ thống (toàncây).
- CâyArabidopsischuyển gen NahG (naphthalene hydroxylase G) củavikhuẩnPseudomonas putida(là genmãhóa salicylate hydroxylase, một enzymechuyển SAthànhdạngbấthoạtlàcatechol)đãbiểuhiệntínhmẫncảmcaođối vớinhiều loại tác nhân gây bệnh khác nhau như nấm,vikhuẩnvàvirus.
- CâychứacácđộtbiếnmấtkhảnăngtíchlũySAnhưeds4,eds5(enhanceddisease susceptibility), sid1, sid2 (SA induction-deficient), pad4 (phytoalexin-deficient) biểu hiện tính mẫn cảm cao với tác nhân gâybệnh.
SA tương tác với catalase – là một enzyme xúc tác cho sự phân hủy H2O2thành
H2OvàO2.H2O2làphântửhoạtđộngphíathượnglưucủaquátrìnhdẫntruyềntínhiệu.Phía hạ lưu của đường dẫn truyền tín hiệu (phía sau SA) là một protein gọi là NPR1 (nonexpressor of PR1 protein) cần cho dẫn truyền SA Sản phẩm cuối cùng củađường dẫn truyền SA là các loại PR protein, trong đó quan trọng nhất là protein nhóm PR1. Đường dẫn truyền SA thường do các tác nhân gây bệnh nhóm sinh dưỡng (biotroph) gây ra (Hình 2.12) Nhìn chung các tác nhân gây bệnh này sinh trưởng trong gian bào và nhân lên trong mô nhiều ngày trước khi gây chết hoại mô (Hà Viết Cường, 2011).
Hình 2.12 Vai trò SA và NPR1 trong dẫn truyền tính kháng (Hà Viết Cường, 2011). 2.3.3.2 Đường dẫn truyền JA vàET
Jasmonic acid (JA) và ethylen (ET) cũng là các phytohormon Cả JA và ET đã được chứng minh có vai trò trong tính kháng bệnh như trong các ví dụ sau:
- CâyArabidopsismang đột biến mất khả năng hình thành JA như fad3/fad7/fad8 (3 đột biến gen fatty acid desaturase) hoặc mất khả năng tiếp nhận JA như coi1 (coronatine insensitive1) hoặc kháng JA như jar1 (jasmonic acid resistant1)biểu hiện tính mẫn cảm đối với một loạt tác nhân gây bệnh như nấmAlternariabrassicicola, Botrytis cinerea, Pythium,vikhuẩnErwiniacarotovora.
- CâyArabidopsismang đột biến trơ với ET như ein2 (ethylene insensitive2)biểu hiện tính mẫn cảm với nấmB cinereavà vikhuẩnE.carotovora.
Hóa chất được sử dụng trongthí nghiệm
Công thức hoá học: CaCl2
Tên gọi khác: canxi (II) clorua, canxi diclorua.
Hợp chất calcium chloride thường tồn tại dưới dạng kết tinh với 6 phân tử nướcCaCl 2 6H2Okhốilượngphântử219,08g/mol.Khiđunnóngcalciumchloridedễbịmất nướcvàtồn tại dưới dạng CaCl2.2H2O có khối lượng phân tử là 147,02 g/molvàCaCl2.4H2O có khối lượng phân tử là 183,04 g/mol Ở dạng ngậm nước, calciumchloridecókhốilượngriênglà1,68 g/m 3 vànóngchạyởnhiệtđộ29,92 o C.Ởtrạngthái vật lý, canxi clorua tồn tại ở dạng rắn, có màu trắng hoặc dạng tinh thể lớn không màu,vịmặnđắng.Dễdàngtantrongnướcvàetanol,íttantrongaxeton.Ởdạngtinhthểkhan, calcium chloride có khối lượng riêng là 2,512 g/cm 3 vànóng chảy ở nhiệt độ 772 o C, độ hòa tan trong nước ở 20 o C là 74,5 g/100ml. Ở thực vật, Ca liên kết chặt chẽ với cấu trúc tế bào, một phần khác có khả năng traođổitạiváchvàmặtngoàicủa màngtếbào.Cakếthợpvớipectintạothànhcalcium pectate trong lớp chung (middle lamella) cần thiết cho sự vững chắc của vách tế bàovà môthực vật Tỷ lệ calcium pectate trong vách tế bào cũng quan trọng cho sự mẫn cảm củamôthực vật đối với sự xâm nhiễm của nấmvà vikhuẩn (Lê Văn Hòa & Nguyễn BảoToàn,2004).KhônggiốngvớicáckhoángđalượngkhácCa 2+ tổnghiệndiệnởmột tỉlệcaotrongváchtếbàomôcây.SựphânbốCa 2+ nhưvậylàvìcónhiềuvịtrí kìmgiữ Ca 2+ ở vách tế bào, cũng như sự vận chuyển Ca 2+ đi qua màng tế bào vào trong tế bào chất bị giới hạn. Ở vùng middle lamella, calcium bị kèm giữa với nhóm R-COO - của polygalacturonicacid(pectins)ởdạngsẵnsàngtraođổiíthaynhiều.Ởcâyhailámầm, cókhảnăngtraođổicationlớnvàđặtbiệtkhimứcđộcungcấpCa 2+ thấpthìcótới50% Ca 2+ tổng số được kèm giữa như là dạng pectates Ở cácmôdự trữ của trái táo phần
Ca 2+ kèmgiữởváchtếbàolêntới90%Ca 2+ tổngsố.Ởlácủanhữngcâyđượccungcấp nhiều
Ca 2+ trong thờikỳsinh trưởng hoặc sinh trưởng trong điều kiện có cường độ ánh sáng cao, thì thấy một tỉ lệ lớn calcium pectate, nó làm gia tăng tính kháng củamôcây chống lại sự phân hủy của enzym polygalacturonase Người ta dựa vào tỷ lệ calcium pectate trong vách tế bào để xác định tính mẫn cảm củamôcây dưới sự xâm nhiễmcủa nấmvàquá trình chín trái (Nguyễn Bảo Vệ & Nguyễn Huy Tài,2010).
Trọng lượng phân tử: 138,12 g/mol
Dạng kết tinh màu trắng hoặc dạng bột
Salicylic acid có nhiệt độ nóng chảy trong khoảng 158-161 o C, nhiệt độ sôi là
211 o C.SAhòatanlâutrongnướclạnh,tannhanhtrongnướcsôi,dễdànghòatantrong ete hoặcetanol.
SA(salicyclicacid)đượcbiếtlàmộtphytohormonenộibàothamgiadẫntruyền tín hiệu nhằm điều khiển nhiều quá trình sinh lý của cây như nảymầm,tăng trưởng tế bào,hôhấp,đóngmởkhíkhổng,giàhóa.SAcũngkhởiđộngcácphảnứngkhángchống lại các ức chế (stress)vôsinh như hạn, mặnvàhữu sinh như tác nhân gây bệnh Trong cây SA được tổng hợp bằng 2 đường hướngenzyme:
- Từ chorismate nhờ enzyme Isochrosimate synthase (ICS) và isochrosimate pyruvate lyase(IPL)
Vì SA tự do ở nồng độ cao có thể ảnh hưởng bất lợi đến các đường hướng sinh hóacủacâynêntrongcâynênđểtránhnồngđộgâyđộc,SAđượccâytổnghợpraphần lớn được chuyển hóa thành dạng SA O-β-glucoside (SAG)vàđược dự trữ trong không bào, ngoài ra SA cũng được chuyển hóa thành các dạng methyl salicylate (MeSA), methylsalicylateO-β-glucoside(MeSAG),vàsalicyloylglucoseester(SGE).Tấtcảcác hợp chất này là dạng bất hoạt của SAvàkhông gây độc tế bào Khi cần thiết, các hợp chất trên lại được chuyển hóa lại thànhSA(Hà Viết Cường,2011).
Salicylicacidđóngmộtvaitròtínhiệuquantrọngtrongviệckíchhoạtcácphản ứngbảovệthựcvậtkhácnhausausựtấncôngcủamầmbệnh.Nhữngphảnứngnàybao gồm cảm ứng sự kháng bệnh tại chỗvàtoàn thân, khả năng gây chết tế bào vật chủvàngănchặnsựlâylanmầmbệnh(Dempseyetal.,1999).T h e o Hayatetal.(2007),trong thực vật, SA có vai trò như một tín hiệu nội bào, bảovệcây trồng, kích hoạt hệ thống khángbệnhcủacâytrồngvàgiếtchếttếbàotạinơibịmầmbệnhxâmnhiễmbằngcáchtạo ra nhiều oxygen như các chất O2, H2O2vàoxalate oxidase cũng như ligin hóa váchtếbàocủavùngbị mầmbệnhxâmnhiễmdocóperoxidaseliên kếtchéocấutạo váchtế bào. Trong điều kiện bình thường không có sự xâm nhiễm của mầm bệnh, hàm lượng SArấtthấp,khicósựxâmnhiễmcủamầmbệnhthìhàmlượngSAtrongtếbàocâytăng lên, có thể tới
200 lần.Sựgia tăng này của SA đã kích thích hệ thống kháng của thực vậtđốivớimầmbệnh.Tácdụngđểkhángchủyếulàhạnchếsựgiãnnởcủatếbào,làm màng tế bào dàyvàcứng hơn để chống lại sự xâm nhiễm của mầm bệnh Phun SA lên cây để làm tăng tính kháng cho cây, hạn chế sự xâm nhiễmvàgây hại củavisinh vật gâyhại.SAphòngtrịđượcnhiềuloạibệnhdovikhuẩnvànấmtrênnhiềuloạicâytrồng khácnhaunhưbệnhhéorũ,thốinhũn,sươngmaitrêncácloạirau,dưa,càchua,câyăn trái, bệnh đạo ônvàbệnh bạc lá lúa, bệnh héo xanh dovikhuẩn hại cà chua (Nguyễn Mạnh Chinh,2012).
- Tên thương mại: Mataxyl 25WP, Ridomil 240EC, Alfamil25WP
- Tên hóa học: N-(2,6-Dimethylphenyl)-N-(methoxyacetyl)- DL-alanine methylester.
- Tínhchất:Thuốckỹthuậtởdạngbột,tantrongnước(7,1g/l),tan65%trongmethanol, 55% trongbenzene.
- Nhóm độc II, LD 50 qua miệng 669 mg/kg, LD50qua da 3100 mg/kg.Ítđộc với cávàong. TGCL 10 ngày.
- Côngdụng:thuốctrừnấm, tácđộngnộihấp,cókhảnănglưudẫnmạnh.Phổtácdụng rộng, đặc biệt có hiệu quả với các nấmPhytophthora,Pythium.
- Sửdụng:Metalaxylphòngtrừcácbệnhmốcsươngcàchuakhoaitây,bệnhsươngmai hại dưa, nho, vải, hồ tiêu, bệnh chết cây con thuốc lá, rau, bệnh thối quả nho, nhãn,vải, bệnh nứt thân xìmủdưa hấu, cam quít, sầu riêng, bệnh loét mặt cạo caosu.
Chế phẩm 25 –35% hoạt chất sử dụng liều lượng 1,5 – 2 kg/ha, pha nước với nồng độ 0,3 – 04 %, phun ướt đều lên cây Pha 20g/1l nước quét lên chỗ nứt thân xì mủ và mặt cạo cao su.
Khả năng hỗn hợp: Có dạng hỗn hợp với Mancozeb (Ridomil-MZ), với Copper Oxychloride(Viroxyl).Khisửdụngcóthểphachungvớinhiềuthuốctrừsâubệnhkhác.
- Tên thương mại: Anvil 5 SC; Atulvil 5SC, Bright Co 5SC, Judi5SC
- Tên hóa học:(RS)-2-(2,4-dichlorophenyl)-1-(1H-1,2,4-triazole-1-yl)hexan-2-ol.
- Tínhchất:Thuốckỹthuậtdạngtinhthểrắn,điểmnóngchảy111°C.Taníttrongnước (18 mg/l), tan trong nhiều dung môi hữucơ.
- Nhóm độc III, LD 50 qua miệng 2189 – 6071 mg/kg, LD50qua da > 2000 mg/kg.Ítđộcvới cávàong TGCL 7ngày.
- Công dụng: thuốc trừ nấm, tác động nội hấp, phổ tác dụngrộng.
- Sửdụng: phòng trừ bệnh khô vằn, lem hạt lúa, bệnh đốm lá,gỉsắt hại đậu, bệnh phấn trắng hại rau, bầu bí, bệnh thán thư,gỉsắt cà phê, bệnh phấn trắng nho, bệnh phồng lá chè, bệnh sẹo táo, bệnh phấn trắng,gỉsắt cho cây hoacảnh.
- Anvil 5SCsử dụng với liều lượng 0,75 – 1,5 l/ha, pha nước với nồng độ 0,15 – 0,3% phun ướt đều lêncây.
- Khảnănghỗnhợp:CódạnghỗnhợpvớiSulfur,Carbendazim,Chlorothalonil.Khisử dụng có thể pha chung với nhiều thuốc trừ sâu bệnhkhác.
- Tên thương mại: Totan 200WP, Xantocin 40WP, TT-biomycin40.5WP
- Tên hóa học: 2-bromo-2-nitro-1,3-propanediol
- Tính chất: Chất rắn màu trắng đến vàng nhạt, không mùi, dễ tan trong các dung môi phân cực như nước, etanol, propylen glycol, nhưng Bronopol khó tan trong các dung môikhôngphâncựcnhưcloroform,axeton,benzen.Bronopolcótácdụngkhángkhuẩn phổ rộng Nó có tác dụng kháng khuẩnvàdiệt khuẩn tốt đối vớivikhuẩn gram dương, âm tính, nấmvàxạ khuẩn (Nanjing Chemical Material Corp,2024)
- Nhóm độc II, TGCL 7ngày
- Công dụng: thuốc có tác dụng tiếp xúcvànội hấp cực mạnh Bronopol oxi hóa nhóm MercaptocủaenzymevikhuẩnvàứcchếmenDehidrogenazalàmtêliệtmàngbào,phávỡcấutrúc màngtếbàovikhuẩn.Hiệuquảcủathuốcthểhiệnởthờiđiểm2-3ngàysau khi phunvàcó tác động ngăn không chovikhuẩn tấn công sang lúa chưa nhiễmbệnh.
- Sửdụng: phòng trị hữu hiệu cảvikhuẩn gram âm và gram dươnggây ra các bệnh phổ biến như bệnh thối nhũn, đốm lá trên các cây rau màu; bệnh loét trên cây có múi; bệnh thối gốc, cháy bìa lá, lép vàng trên lúa Ngoài ra, hoạt chất này còn diệt ngoạikýsinh,vinấm gây bệnh trên tôm, cávàcác động vật thủy sinh khác Kiểm soát sự phát triển củavikhuẩnvànấmtrongquátrìnhsảnxuấtgiấyvàbộtgiấy.Làmchấtbảoquảntrong dầu cắt gọt kim loại, giúp ngăn ngừa sự phát triển củavikhuẩnvànấm Bronopol còn được sử dụng như một chất bảo quản trong một số sản phẩm dược phẩm.
- Khả năng hỗn hợp: không phối trộn với những thuốc quá kiềm hay quá acid Có thể phối trộn với các loại thuốc trừ bệnhvàsâu rầy (không có tínhkiềm).
VẬT LIỆU, ĐỐI TƯỢNG VÀPHƯƠNGPHÁP
Vật liệu, đối tượng, dụng cụthínghiệm
- Trang thiết bịvàvật liệu trong phòng thí nghiệm: tủ cấyvisinh, tủ thanh trùng khô, thanh trùng ướt, cân điện tử, giấy thấm, lam đếm mật số, bình tam giác, đĩa Petri, ống nghiệm, kính hiển vi, chlorine1%.
- Vật liệu nấu môi trường: khoai tây, đường,agar.
- Các loại môi trường nuôi cấy nấm (Burgesset al., 2009):
Môi trường thạch nước cất (WA - WaterAgar)
6,5 Môi trường thạch đường khoai tây (PDA-Potato DextroseAgar)
6,5 Môi trường thạch cà rốt khoai tây (PCA-Potato CarrotAgar)
Môi trường được thanh trùng ở nhiệt độ 121 0 C trong 20 phút.
- Hóa chất kích kháng: CaCl 2 , SA (salicylicacid)
- Thuốc trừ bệnh: Totan 200WP (hoạt chất Bronopol), Mataxyl 500WG (hoạt chất Metalaxyl)vàAnvil 5SC (hoạt chấtHexaconazole).
- Phân bón hóa học: ure, DAP, NPK 20-20-15,KCl
- Giống hành sậy: được mua từ Hợp tác xã Hành lá Tân Bình, Bình Tân, VĩnhLong.
- CácphươngtiệndùngđểthựchiệnphảnứngPCR:tube,pipet,waterbath,máylytâm lạnh, máy ly tâm chân không, máy lắc, vortex, máy PCR, máy điện di, máy chụp hình gel…
- Hóa chất trích DNA: EB (Extraction buffer), SDS (Sodium dodecyl sulfate), Isopropanol, TE buffer (10mM Tris HCl, 1mM EDTA), CTAB (Tris HCl + NaCl + EDTA + CTAB + SDS + mercaptoethanol), Chloroform: Isoamyl Alcohol (24:1),Ethanol 70%, BiH 2 O (nước cất hai lầnvôtrùng).
- Hóachấttrongđiệndi:TAE,loadingbuffer,EthidiumBromide,Agarose,thangchuẩn Genruler 100bpladder.
- Hóa chất tẩy diệp lục tốvànhuộm màu tế bào: ethanol – acetic acid (tỷ lệ 3:1);dungdịch lactoglycerol (lactic acid + glycerin + nước cất với tỷ lệ 1:1:1); aniline blue 0,5%; Toluidine Blue O 0,05%,pH=6,8.
- Hóa chấtvàdụng cụ cho phân tích enzyme: máy đo quang phổ Shimazdu UV-1900; nitơ lỏng; Na-Acetate buffer, pH=5,2; ống eppendorf; 4-methylumbelliferone (4MU); dimethyl sulfoxide (DMSO); sodium carbonate; sodium acetate; laminarin; nước cấtthanhtrùng;phosphatebuffer(pH=6,8);EDTA1mM;H 2 O275mM;H2O21%;guaiacol4%.
- Hóa chấtvàdụng cụ tách chiết RNA tổng sốvàtổng hợp cDNA: Kit RN-Sure Plant(Apro Science, Tokushima, Nhật Bản), máy đo quang phổ (Biotek, Hoa KSurekit M-MLV reverse transcriptase (Enzynomics, HànQuốc).
Phương phápthínghiệm
3.3.1 Nộidung1.Thuthập,phânlậpvàđánhgiákhảnănggâybệnhcủacácchủng nấm gây bệnh thán thư hành lá thu thập tại Vĩnh Long và Đồng Tháp; đồng thời định danh loài nấmnày.
3.3.1.1 Thu thập, phân lập và đánh giá khả năng gây bệnh của các chủng nấmgây bệnh thán thư hành lá thu thập tại Vĩnh Long và ĐồngTháp
Mục tiêu:xác định chủng nấmColletotrichumsp có độc tính cao để dùng cho các thí nghiệm tiếp theo.
Thu thập, phân lập nấm bệnh: mẫu bệnh được thu thập từ các ruộng hành lá tại tỉnh Đồng Tháp và Vĩnh Long, cho vào túi nilon, bên ngoài ghi ký chủ, địa điểm thu mẫu và đem về phòng thí nghiệm.
SauđónấmgâybệnhthánthưđượcphânlậptrênmôitrườngWAbằngcáchrửa thật sạch mẫu bệnhvàđể trên giấy thấm cho ráo nước, sau đó cắt từng mẫu nhỏ(2-3mm 2 ) giữa ranh giới vết bệnhvàphần không bệnh Khử trùng bằng dung dịch Chlorine 1% trong 1 phút, rửa mẫu với nước cất thanh trùng 3 lần trong tủ cấyvôtrùng Đặt các mẫutrongđĩapetriđãhấpkhửtrùngcólót giấythấmvôtrùngchoráonướcvàcấytrên môitrườngWA,mỗimẫubệnhđượccấytrên5đĩapetriđãđượckhửtrùng,mỗiđĩacấy 3vịtrí.
Các đĩa cấy mẫu được để ở điều kiện phòng thí nghiệm Khi trên mẫu bệnh xuất hiện khuẩn ty nấm thì cấy chuyền sang môi trường PDA (Burgesset al., 2009).
Trước khi bố trí thí nghiệm, các chủng nấm thu thập được xác định là chiColletotrichumspp bằng nguyên tắc Koch (Koch's postulates), có ghi nhận hình dạng tản nấmvàhình dạng, kích thước bào tử Sau đó, các chủng nấmColletotrichumnày đượcnuôicấytrong96giờchosợinấmpháttriển,tảnnấmđượcđụckhoanhtrònởgần mép rìa khuẩn lạc có đường kính 5 mmvàcấy vào tâm đĩa petri chứa 10ml môi trường PDA.Miệngđĩapetriđượcquấnmàngparafinđểtránhmấthơinướctrongthờigianthí nghiệmvàngăn chặn kiếnvànhện xâmnhiễm.
Bảng 3.1 Các chủng nấm Colletotrichum sp gây bệnh thán thư trên cây hành lá được thu thập tại tỉnh Vĩnh Long và Đồng Tháp.
STT Ký hiệu Địa điểm thu thập (xã, huyện, tỉnh)
1 BT6VL Tân Bình, Bình Tân, Vĩnh Long
2 BT7VL Tân Bình, Bình Tân, Vĩnh Long
3 BT9VL Tân Hưng, Bình Tân, Vĩnh Long
4 BT12VL Tân Hưng, Bình Tân, Vĩnh Long
5 BT13VL Tân Bình, Bình Tân, Vĩnh Long
6 BT14VL Tân Bình, Bình Tân, Vĩnh Long
7 LHVL1 Lộc Hòa, Long Hồ, Vĩnh Long
8 LHVL2 Lộc Hòa, Long Hồ, Vĩnh Long
9 PH2 Phước Hậu, Long Hồ, Vĩnh Long
10 PH3 Phước Hậu, Long Hồ, Vĩnh Long
11 ĐT1 Phú Thuận A, Hồng Ngự, Đồng Tháp
12 ĐT2 Phú Thuận A, Hồng Ngự, Đồng Tháp
13 ĐT3 Long Thuận, Hồng Ngự, Đồng Tháp
14 ĐT4 Long Thuận, Hồng Ngự, Đồng Tháp
15 ĐT5 Long Khánh A, Hồng Ngự, Đồng Tháp
16 ĐT6 Long Khánh A, Hồng Ngự, Đồng Tháp
17 ĐT7 Long Khánh B, Hồng Ngự, Đồng Tháp
18 ĐT8 Phú Thuận B, Hồng Ngự, Đồng Tháp
19 ĐT9 Phú Thuận B, Hồng Ngự, Đồng Tháp
20 ĐT10 Định An, Lấp Vò, Đồng Tháp
Trồng hành lá: hành được trồng chậu nhựa có đường kính 20cm, cao 15cm Giá thể trồng gồm đất, sơ dừa, tro trấu trộn với tỷ lệ 1:1:1 Mỗi chậu hành trồng 2 tép Các tép hành được chọn đồng đều về đường kính gốc, chiều cao cây và màu lá Hành được chăm sóc bón phân và phòng ngừa sâu bệnh thường xuyên Sau 15 ngày trồng thì dùng cho thí nghiệm.
Thu bào tử nấm: 20 chủng nấm được nuôi cấy trong môi trường PDA đến thời điểm 10 NSC tiến hành thu lấy bào tử nấm và tính mật số bào tử Sau đó pha loãng về mật số 10 6 bào tử/ml, dùng cho lây nhiễm bệnh trên hành.
Bố trí thí nghiệm: bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên (HTNN) một nhân tố là 20 chủng nấmColletotrichumsp với 5 lần lặp lại (Bảng 3.1) Mỗi lần lặp lại 1 chậu hành (3 tép/chậu) Tiến hành lây nhiễm bệnh nhân tạo bằng cách phun huyền phù bào tử nấmColletotrichumspp mật số 10 6 bt/ml lên toàn cây đến khi bề mặt phủ một lớp sương huyền phù bào tử nấm thì ngưng Các chậu trồng cây được để trong phòng tối ủ bệnh 2 ngày (nhiệt độ 25 0 C), sau đó đem ra nhà lưới và chăm sóc bình thường.
Chỉ tiêu về tỷ lệ bệnh và chỉ số bệnh được thu thập vào các thời điểm 5, 7, 9, 11 và 13 ngày sau lây bệnh (NSLB) dựa vào số lá bệnh và tổng số lá trên buội, cấp bệnh trên giống hành sậy theo Bộ Nông nghiệp & Phát triển nông thôn (2013) Từ đó suy ra tỷ lệ bệnh và chỉ số bệnh theo công thức như sau:
Tỷlệbệnh/tỷlệhại(%)= Tổng số lábị bệnh
Tổng số lá điều tra X100
N1là số lá bị bệnh ở cấp 1;
N3là số lá bị bệnh ở cấp 3; …
Nnlà số lá bị bệnh ở cấpn.
N là tổng số lá điều tra. n là cấp bệnh cao nhất (cấp 9).
Cấp 1: ≤ 1% diện tích lá bị bệnh, vết bệnh tròn, nhỏ
Cấp 3: > 1% - 5% diện tích lá bị bệnh, vết bệnh lõm xuống
Cấp 5: > 5% - 25% diện tích lá bị bệnh, vết bệnh có màu đen
Cấp 7: > 25% - 50% diện tích lá bị bệnh, vết bệnh biến màu, thối đen
Cấp 9: > 50% diện tích lá bị bệnh, xuất hiện nhiều vết bệnh trên lá, các vết bệnh có thể liên kết lại với nhau.
Xử lý số liệu:tổng hợp số liệu về các chỉ tiêu ghi nhận ở các nghiệm thức, phân tích phương sai và trắc nghiệm phân hạng với kiểm định Duncan 5% bằng phần mềmSPSS 22.0.
3.3.1.2 Định danh loài đối với chủng nấm Colletotrichum có khả năng gây bệnh nặng trên hànhlá
Mụctiêu:XácđịnhtênloàicủachủngnấmColletotrichumgâyhạinặngtrêncây hành lá đã tuyển chọn từ thí nghiệm3.3.1.1
Tiếnhành:dùngquecấylấyđỉnhsinhtrưởngcủakhuẩntynấmcâyvàotâmcủa đĩa petri chứa
10ml môi trường PDA Miệng đĩa petri được quấn parafin để tránh mất hơi nước trong thời gian thí nghiệmvàngăn chặn nhện xâmnhiễm. Định danh loài nấm bằng hình thái: sự phát triểnvàhình dạng, màu sắc của tảnnấmđượcquansát.Bêncạnhđó,bàotửnấmgâybệnhcũngđượcquansátdướikính hiểnviquang họcvềhình dạng, màu sắc, kích thước Mẫu nấm được cấy trên lame với môitrườngPCAđểtạođĩaápvàtiếptụcquansáthìnhdạng,kíchthướcvàmàusắccủa đĩa áp dưới kính hiển vi Đối sánh với miêu tả của Sutton (1980)vàBarnet & Hunter (1998) để xác định chi nấm gâybệnh. Định danh loài nấm bằng kỹ thuật giải trình tự vùng rDNA-ITS
DNA tổng số của nấm được tách chiết bằng kít Fungi/Yeast DNA Extraction (Norgen, Canada) Phản ứng PCR khuếch đại gen vùng rDNA-ITS của mẫu nấm được thực hiện với cặp mồi đặc hiệu ITS1 (mồi xuôi) (5’- TCCGTAGGTGAACCTGCGG - 3’); và ITS4 (mồi ngược) (5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC - 3’) được mô tả bởi Whiteet al.(1990) Thể tớch cho mỗi phản ứng PCR là 25 àl gồm PCR buffer 1X [Tris
- HCl 10mM(pH 8,8 ở 25oC), KCl 50 mM, triton X-100 50 mM], MgCl2 1,5 mM,0,2 mM mỗi loại dNTP, 0,4 àM mồi mỗi loại, 0,5 U DNA Polymerase: GoTagR Green Master Mix (Promega) và 25 ng DNA mẫu.
Phản ứng khuếch đại được thực hiện trong máy luân nhiệt (MJ Research PTC-
100, USA) với nhiệt độ biến tính ban đầu là94 0 Ctrong 2 phút, sau đó là 35 chukỳvới nhiệtđộbiếntínhlà94 0 Ctrong20giây,nhiệtđộbắtcặplà53 0 Ctrong30giây,nhiệtđộ kéo dài là
72 0 C trong 30 giâyvànhiệt độ kéo dài cuối cùng là 72 0 C trong 5 phút Kiểm tra đoạn DNA được khuếch đại bằng phương pháp điện di trên gel Gel được quan sát dưới đèn UVvàchụp ảnh bằng máy chuyên dụng (GelDoc-ItImaging System UVP, USA) Kích thước của các đoạn DNA khuếch đại được so sánh với thang DNA chuẩn 100 bps.
Sản phẩm PCR được tinh sạch, giải trình tự trên máy đọc trình tự tự động ABI PRISM®3100-AvantgeneticAnalyzer(AppliedBiosystems,FosterCity,CA,USA)tại
CôngtyTNHHMTVSinhHóaPhùSa.CáctrìnhtựđượcxửlýbằngphầnmềmBioEdit (ver 6.0.7, Mỹ)vàso sánh với các trình tự tương ứng của các chủng đã được đăngkýtrên genBank bằng công cụ BLAST trên NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov) Cây phả hệ được xây dựng bằng phần mềm Mega (ver.11) theo phương pháp Neighbor - Joining với khoảng cách di truyền giữa các trình tự được xác định dựa trênmôhình thay thế Kimura hai tham số.Giá trị ở các nốt là giá trị thốngkêBoostrap dưới dạng % (1000 lần lặp).
Xửlýsốliệu:cáckếtquảkhảosátvềhìnhtháiđượcđốichiếuvớicáckhóaphân loạinấmđểxácđịnhloài;bêncạnhđó,kếtquảxâydựngcâyphảhệtừtrìnhtựgenvùng
3.3.2 Nội dung 2 Nghiên cứu khả năng kích kháng và kỹ thuật sửdụng hoá chấtCaCl 2 và SA như một chất kích kháng để hạn chế nấm Collectotrichum gây bệnhthán thư hạihành.
3.3.2.1 Thí nghiệm 1 Khảo sát ảnh hưởng của các chất kích kháng đến sự sinh trưởng của nấm Colletotrichum
Mục tiêu:đánh giá khả năng ức chế sự phát triển nấmColletotrichumcủa các chất kích kháng
Tiến hành:nấmColletotrichumdùng để bố trí trong thí nghiệm này là chủng nấmColletotrichumxác định có tính độc mạnh ở nội dung 1 được nuôi cấy trên môi trườngPDAtrong3ngày.Thínghiệmđượcthựchiệntheophươngphápkhuếchtánđĩa(Abussaud et al., 2013); bố trí với 7 lần lặp lại, các hóa chất thử nghiệm gồm: CaCl2nồng độ 100 mM; CaCl2nồng độ 200 mM; CaCl2nồng độ 300 mM; salicylic acidnồngđộ 1 mM; salicylic acid nồng độ 2 mM; salicylic acid nồng độ 4 mM; đối chứng (dùng nước) Ở mỗi lần lặp lại, 1 đĩa petri có chứa môi trường PDA được dùng để đặt đồng thời 1 khoanh nấmColletotrichum(đường kính 6mm)và1 khoanh giấy thấm (đường kính 6 mm) với 1 trong các loại hóa chất trên, khoảng cách giữa 2 khoanh là 3 cm Sau đó, đĩa petri được đậy nắp lại, quấn parafinvàđể ở điều kiện phòng thínghiệm.
Ghi nhận bán kính vòng tròn kháng nấm ở các khoanh giấy thấm hóa chất khi nấm phát triển đến khoanh giấy đối chứng.
3.3.2.2 Thí nghiệm 2 Nghiên cứu hiệu quả hạn chế bệnh thán thư khi sử dụngCaCl 2 và SA ở các nồng độ và phương phápxửlý khácnhau
Mục tiêu:so sánh hiệu quả kích kháng của hóa chất qua 2 cách xử lý là nhúng và phun.
Tiến hành:thí nghiệm được thực hiện trong điều kiện nhà lưới của trường Đại học Cửu Longvàbố trí theo thể thức thừa số 2 nhân tố trên giống hành sậy, thể thức HTNN5lầnlặplại,mỗilặplạilà3chậu,mỗichậutrồng3téphành.NhântốAlà2loạihóa chất ở 3 nồng độ, gồm CaCl2100 mM; CaCl2200mM vàCaCl2300 mM; salicylicacid 1 mM; salicylic acid 2 mM; salicylic acid 4 mM;vàđối chứng (nước cất); nhân tố B là 2 phương pháp xử lý gồm nhúng gốc (nhúng gốc hành vào hóa chất)vàphun lá (phun hóa chất lên láhành).
KẾT QUẢ VÀTHẢO LUẬN
Nội dung 1 Thu thập, phân lậpvàđánh giá khả năng gây bệnh của các chủngnấm gây bệnh thán thư hành lá thu thập tại Vĩnh LongvàĐồng Tháp; đồng thờiđịnh danh loài nấmnày
4.1.1 Thu thập và phân lập các chủng nấm gây bệnh thán thư hành lá thu thập tại Vĩnh Long và ĐồngTháp.
Các mẫu bệnh với triệu chứng điển hình của bệnh thán thư hành lá như Hình4.1 được thu thậpvàđược phân lập tại phòng thí nghiệm với môi trường WAvànuôi cấy trên môi trường PDA Sau đó, các mẫu này được quan sát hình thái tản nấm, hình dạngvàkíchthướcbàotử;vàtiếptụclâynhiễmbệnhnhântạođểxácđịnhcácmẫunấmgây bệnh là loài nấmColletotrichumgây bệnh nhờ vào nguyên tắc Koch Kết quả đã phân lậpvànuôi cấy 20 chủng nấm từ các mẫu bệnh thán thư hành lá từ Vĩnh LongvàĐồng Tháp.HìnhdạngcủacáctảnnấmColletotrichumđượctrìnhbàyởHình4.2chothấysự màu sắcvàtốc độ phát triển khác nhau giữa các chủngnấm.
Hình 4.1 Triệu chứng bệnh thán thư trên bông hành (a) và trên lá hành (b) thu tại ruộng hành lá ở huyện Bình Tân, Vĩnh Long vào tháng 9/2017.
BT6VL BT14VL ĐT1 ĐT6
Mặt trên Mặt dưới Mặttrên Mặt dưới Mặt trên Mặt dưới Mặt trên Mặt dưới
BT7VL LHVL1 ĐT2 ĐT7
BT9VL LHVL2 ĐT3 ĐT8
BT12VL PH2 ĐT4 ĐT9
BT13VL PH3 ĐT5 ĐT10
Hình 4.2 Hình thái tản nấm của các chủng Colletotrichum spp phân lập từ mẫu bệnh thán thư hành lá thu thập tại Vĩnh Long và Đồng Tháp
4.1.2 Đánh giá khả năng gây bệnh của các chủng nấm gây bệnh thán thư hành lá thu thập tại Vĩnh Long và ĐồngTháp
Khả năng gây hại của 20 chủng nấm trên hành lá được ghi nhận ở 5 thời điểm5, 7,9,11và13NSLB.KếtquảvềtỷlệbệnhtrênlávàchỉsốbệnhđượcghinhậntạiBảng 4.1và4.2.
Tỷ lệ bệnh (%) Ở thời điểm 5NSLB, tất cả các nghiệm thức đều có sự xuất hiện của vết bệnh thán thư, chủng nấm BT7VL có tỷ lệ bệnh cao nhất, khác biệt so với đối chứng nhưng không cao hơn ở PH3 và một số chủng nấm khác Đến thời điểm 7NSLB, chủng nấm PH3 vượt lên cao nhất, đạt 28,18%, chỉ không khác biệt so với ở chủng ĐT4 và ĐT9 (lần lượt đạt 18,52% và 20,99%) (Bảng 4.1).
Bảng 4.1 Tỷ lệ bệnh thán thư (%) khi lây nhiễm 20 chủng nấm Colletotrichum sp trên hành lá tại thời điểm 5, 7, 9, 11 và 13 NSLB.
Chủng nấm 5NSLB 7NSLB 9NSLB 11NSLB 13NSLB Đối chứng 6,13 e-g 2,21 d 9,42 b-d 6,37 cd 6,71 c-e ĐT10 13,52 a-e 16,77 b 9,84 b-d 6,59 b-d 4,88 e ĐT9 14,71 a-c 20,99 ab 9,67 b-d 7,69 b-d 5,40 de ĐT8 8,72 a-f 16,72 b 8,34 b-d 7,32 b-d 9,06 c-e ĐT7 10,82 a-f 16,90 b 8,73 b-d 5,46 cd 7,92 c-e ĐT6 8,45 a-f 14,60 b 10,18 b-d 5,17 cd 5,87 de ĐT5 14,26 a-d 16,67 b 8,12 b-e 8,26 b-d 5,09 e ĐT4 12,22 a-e 18,52 ab 7,79 b-e 7,42 b-d 6,69 c-e ĐT3 7,51 b-g 13,86 b 8,58 b-d 7,32 b-d 8,53 c-e ĐT2 12,98 a-e 17,05 b 8,11 b-e 6,19 cd 6,95 c-e ĐT1 12,39 a-e 14,52 b 6,57 c-e 6,37 cd 5,13 e
Ghi chú: số liệu được chuyển sang√𝑥 + 0,5trước khi xử lý thống kê, các số trong cùng một cột có cùng ký tựtheo sau thì không khác biệt qua phân tích thống kê ở Duncan 5%, **: khác biệt mức ý nghĩa 1%
Cho đến thời điểm 9 và 13NSLB, chủng nấm PH3 gây nên tỷ lệ lá bị bệnh thán thư cao nhất và vượt trội so với 19 chủng nấm còn lại, đạt lần lượt 21,4% và 20,47%. a b c d
Một số lá có nhiều vết bệnh liên kết lại với nhau làm lá bị khô nên đến thời điểm 13NSLB, mặc dù chủng PH3 không phải là chủng nấm có tỷ lệ bệnh cao nhất nhưng cũng không khác biệt so với ở chủng nấm PH2 (cao nhấtvàđạt 23,42%) (Bảng4.1).
Hình4.3.Triệuchứngbệnhthánthưdo3chủngnấm Colletotrichumsp gâyhạinặngtrên cây hành lá; (a) chủng BTVL7, (b) chủng PH2, (c) chủng PH3 so với (d) cây đốichứng
Chỉ số bệnh (%) cho biết bệnh gây hại trên từng buội nặng hay nhẹ thông quacó nhiều vết bệnh cấp cao trên lá Ghi nhận ở 5 NSLB, chủng BT7VL cũng gây hại nhanh nhất, đạt chỉ số bệnh cao nhất,tương tự như ghi nhận trên chỉ tiêu tỷ lệ bệnh, nhưng cũng không khác biệt so với ở chủng PH3 Đến 7NSLB, chỉ số bệnh(%) ở PH3 vươn lênmứccao nhất, tương đương với chủng ĐT2, ĐT4, ĐT5, ĐT7vàĐT9 Ở9NSLB, PH3cóchỉsốbệnhđạt8,66%;caonhấttrongcácchủngnấmthửnghiệm.Ở2thờiđiểm ghinhậntiếptheolà11và13NSLB,chủngnấmPH3 vẫnluônduytrìởmứccaoso với các chủng nấm khác (Bảng4.2).
Bảng 4.2 Chỉ số bệnh thán thư (%) khi lây nhiễm 20 chủng nấm Colletotrichum sp trên hành lá tại thời điểm 5, 7, 9, 11 và 13 NSLB.
Chủng nấm 5NSLB 7NSLB 9NSLB 11NSLB 13NSLB Đối chứng 1,33 e-g 1,08 e 2,77 b-d 1,10 b 1,02 cd ĐT10 2,51 a-g 5,83 ab 2,54 cd 1,18 b 0,88 d ĐT9 3,81 a-c 9,04 a 2,14 c-e 2,23 b 0,72 d ĐT8 1,79 b-g 4,97 bc 1,61 c-e 1,76 b 1,70 b-d ĐT7 2,32 b-g 5,73 ab 2,11 c-e 1,15 b 1,27 b-d ĐT6 1,92 b-g 5,09 bc 2,10 c-e 1,06 b 0,99 cd ĐT5 3,27 a-d 6,15 ab 2,11 c-e 1,85 b 0,76 d ĐT4 2,90 a-f 6,97 ab 1,65 c-e 1,68 b 1,10 cd ĐT3 1,28 d-g 4,55 bc 2,42 c-e 1,79 b 1,60 b-d ĐT2 3,11 a-e 6,10 ab 1,79 c-e 1,03 b 1,39 b-d ĐT1 3,03 a-f 3,66 b-d 1,24 c-e 1,15 b 1,30 b-d
BT13VL 1,19 fg 1,48 de 2,83 b-d 1,96 b 1,05 cd
Ghi chú: số liệu được chuyển sang√𝑥 + 0,5trước khi xử lý thống kê, các số trong cùng một cột có cùng ký tựtheo sau thì không khác biệt qua phân tích thống kê ở Duncan 5%, **: khác biệt mức ý nghĩa 1%
Như vậy, chủng nấm PH2, PH3vàBTVL7 là các chủng có khả năng gây bệnh thán thư nặng trên cây hành lá khi có tỷ lệ bệnhvàchỉ số bệnh cao trong 20 chủng nấm khảosát(Hình4.3).ChủngnấmPH3đượcchọnđểdùngtrongcácthínghiệmtiếptheo.
4.1.3 Kếtquảđịnh danh loài nấm Colletotrichum có khả năng gây bệnh nặng trên hànhlá
Kết quả khảo sát hình thái nấm Colletotrichumsp
Trênvếtbệnh,đĩađàicủanấmcónhiềugainhọn,phóngthíchnhiềubàotử,dạng hìnhtrụ,khôngváchngăn.Nấmgâyhạisaukhiphânlậpđượcnuôicấytrênmôitrường
PDAđến15ngàysaucấythìtiếnhànhquansáthìnhdạngvàđokíchthướcbàotử.Theo đó, chủng nấm tại PH3 cú bào tử dạng hỡnh trụ, khụng màu Bào tử cú kớch thướctrung bỡnh 12,7x2,7 àm(Hình4.4). a 10 àm b
Sau khi áp dụng kỹ thuật nuôi cấy trên lame, chủng nấm PH3 tạo đĩa áp với 4 dạng gồm: dạng hình chùy, dạng hình trứng, dạng hình trứng ngược và dạng hình xẻ thùy Kích thước của từng loại đĩa áp như sau:
Các đặc điểm hình thái trên chứng tỏ nấm gây bệnh thuộc chi nấmColletotrichum khi phù hợp với mô tả của Sutton (1990) và Barnet & Hunter (1998).
Hình 4.4 Đĩa áp và đơn bào tử của chủng nấm Colletotrichum PH3, a: đĩa đài, b: bào tử, c:khuẩntynấmpháttriểntrênmôitrườngPDA,d:đĩaáptạonêntrênmôitrườngPCA.
Kết quả định danh bằng phương pháp sinh học phântử ĐịnhdanhnấmColletotrichumdựavàocácđặcđiểmhìnhtháithườngkhôngđủ để phân loại tớimứcloài nên đã có nhiều nhầm lẫn trong phân loại chi nấm này (Hydeet al.,2009b) Do đó, định danh nấmColletotrichumdựa trên phân tích phân tử ngày càng phổ biếnvàdẫn tới nhiều thay đổi trong phân loại các loài thuộc chi này (Cannonet al.,2012) Hiện nay, có nhiều chỉ thị phântửlà công cụ hữu ích trong nhận diệnvàphân nhóm đặc điểm di truyền của nấm bệnh ởmứcđộ loàivàdưới loài Giải trình tự vùng rDNA-ITS là một phương pháp rất hữu dụng để định danhvànghiên cứu quan hệ di truyền của nấm (Whiteet al.,1990).
VùngrDNA-ITSnằmgiữavùngSSU(SmallSubunitDNA)vàvùngLSU(Large Subunit DNA) với 2 vùng ITS1vàITS2 (Internal Transcribed Spacer)vàtiểu đơn vị 5,8S rDNA gen trong nhân Trình tự vùng rDNA-ITS được ứng dụng rộng rãi để tìmra mối quan hệ di truyền giữa các loài nấm, cũng như để phát hiện và định danhnấm(Nguyễn Đôn Hiệuet al.,2023). Ápdụng quy trình ly trích DNA từ sinh khối của tản nấmColletotrichumspp. phânlậpđược,DNAbộgencủadòngnấmthểhiệnhàmlượngDNAsángrõvàđủchất lượng để thực hiện phản ứng PCR Sau khi thực hiện nhân đoạn genITS,DNA củagen ITS được điện di trên gel agarose (Hình4.5).
Hai mẫu nấm được nuôi cấy từ chủng PH3 là PH3.1 (nhân nuôi từ đỉnh sinh trưởng) và PH3.2 (nhân nuôi từ bào tử nấm) được dùng để chạy PCR, khuếch đại đoạn gen ITS của nấm có kích thước khoảng 550bp Sau đó được tiến hành giải trình tự genvàtracứusựtươngđồngcủachuỗigen(Blasting)trênGenBankcủaNCBI.Kếtquảtra cứu được biểu hiện bằng cây phả hệ như Hình4.6.
Hình 4.5 Kết quả điện di sản phẩm PCR mẫu nấm phân lập từ mẫu bệnh thán thư trên cây hành lá tại Long Hồ, Vĩnh Long: (1): mẫu chuẩn, (2): mẫu PH3.1, (3): mẫu PH3.2
Dựa vào cây phả hệ cho thấy mẫu nấm phân lập được có độ tương đồng caotrên 99% với các đại diện thuộc loàiC gloeosporioides,C tropicale,C siamense,Glomerella cingulata.Theo Weiret al.(2012),Glomerella cingulatalà tên củaC.gloeosporioidesở giai đoạn hữu tính, 3 loài còn lại làC gloeosporioides,C.t r o p i c a l e,
C siamensecũng thuộc phức loàiC gloeosporioides.Như vậy, trình tự gen này không cho phép phân biệt tớimứcloài của nhiều nấmColletotrichum,vàchỉ có thể xác định đâylàC.gloeosporioidessensulato,cónghĩalàthuộcphứchợploàiC.gloeosporioides.
Nội dung 2 Kết quảvềnghiên cứu khả năng kích khángvà kỹthuật sử dụng hoá chất CaCl 2 vàSA như một chất kích kháng để hạn chế nấmCollectotrichumgloeosporioidesgây bệnh thán thưhạihành
Kết quả ghi nhận tại Bảng 4.3 cho thấy các hóa chất CaCl2nồng độ 100 đến 300mM vàSA nồng độ từ 1 đến 3mMkhông làm ảnh hưởng đến sự phát triển của nấmColletotrichum gloeosporioidesgây bệnh Nấm gây bệnh phát triểnvềphía các khoanh giấy tẩm hóa chấtmàkhông có biểu hiện bị ức chế lên tản nấm (Hình 4.7) Kết quảnày phù hợp với khái niệm chất kích kháng truyền thống khi các hóa chất không tác động trực tiếp lên mầm bệnh nhưng có tác động kích thích cây kháng bệnh được xem là chất kích kháng (Phạm Văn Kim,2002). a b c d e f g
Bảng 4.3 Bán kính trung bình (mm) của vòng tròn kháng nấm Collectotrichumgloeosporioldes tại thời điểm nấm phát triển đến khoanh giấy đối chứng ở 4 ngày sau cấy khi xử lý các chất kích kháng.
Nghiệm thức Trung bình bán kính vòng tròn kháng nấm (mm)
Ghi chú: số liệu được chuyển sang√𝑥 + 0,5trước khi xử lý thống kê, các số trong cột có cùng ký tự theo sau thìkhông khác biệt qua phân tích thống kê ở Duncan 5%, ns: không khác biệt ý nghĩa
Hình 4.7 Sự phát triển của nấm C.gloeosporioides về phía khoanh giấy có thấm chấtkíchkháng ở thời điểm 4 NSC: a-c: lần lượt CaCl 2 100mM, CaCl 2 200 mM, CaCl 2 300 mM; d-f: lần lượt SA 1 mM, SA 2 mM, SA 4 mM và g: đối chứng (nước cất thanhtrùng).
4.2.2 KếtquảnghiêncứuhiệuquảhạnchếbệnhthánthưkhisửdụngCaCl 2v à SAở các nồng độ và phương pháp xử lý khácnhau.
Kết quả nghiên cứu ở điều kiện nhà lưới cho thấy khả năng hạn chế bệnh thán thư không khác biệt ở 2 phương pháp xử lý, tuy nhiên có sự khác biệt về nồng độ của các hóa chất áp dụng Ở thời điểm 0 NSLB, không có vết bệnh thán thư trên các cây hành thí nghiệm (số liệu không được trình bày) Ở các thời điểm quan sát sau đó chothấy, nghiệm thức được xử lý với CaCl 2 200 mM, CaCl2300 mM, SA 2 mM hoặc
SA 4mM có khả năng hạn chế tỷ lệ bệnh đến 13 NSLB, còn các nồng độ thấp hơn chỉ kéo dài khả năng hạn chế tỷ lệ bệnh đến 11 NSLB (Bảng 4.4).
Bảng 4.4 Tỷlệbệnh thán thư (%) trên hànhlásau khixử lýCaCl 2 và SA trong điềukiệnnhà lưới,2020.
NSLB NSLB NSLB NSLB NSLB NSLB NSLB
Chất CaCl2100 mM 11,6 b 13,4 b 19,4 b 17,9 bc 22,1 ab 19,1 26,4 kích CaCl2200 mM 10,4 b 11,4 b 14,9 cd 13,3 c 16,7 c 19,6 23,6 kháng CaCl2300 mM 12,0 b 14,2 b 15,9 b-d 14,7 bc 15,6 c 20,9 26,3
SA 4 mM 12,7 b 11,0 b 15,2 b-d 16,7 bc 18,8 bc 19,4 24,5 Đối chứng 23,3 a 22,2 a 29,1 a 25,0 a 25,7 a 24,9 29,2
Cách xử Nhúng 13,5 13,7 18,8 16,6 19,1 20,8 25,8 lý (B) Phun 13,6 13,9 17,3 18,1 20,5 20,5 25,2
F B ns ns ns ns ns ns ns
Ghi chú: các số trong cột có cùng ký tự theo sau thì không khác biệt qua phân tích thống kê ở Duncan 5%,
**:khác biệt ý nghĩa 1%, ns: không khác biệt ý nghĩa, SA: salicylic acid, nhúng: nhúng gốc vào chất kích kháng, phun: phun chất kích kháng lên lá
Về chỉ số bệnh, các nghiệm thức xử lý với CaCl2200 mM, 300 mM hoặc SA 2mM, 4 mM thấp tương đương nhau và kéo dài đến 11 NSLB, đạt hiệu quả giảm bệnh ởthời điểm này từ 33,9% đến 36,4% (Bảng 4.5 và 4.6) Xử lý CaCl 2 hoặc SA với nồngđộ thấp hơn cũng giúp giảm chỉ số bệnh nhưng thời gian có hiệu quả ngắn hơn, chỉ đến 7 NSLB, đạt hiệu quả giảm bệnh từ 31,1% đến 36,5%.
Bảng 4.5 Chỉ số bệnh thán thư (%) trên hành lá sau khi xử lý CaCl 2 và SA trong điềukiện nhà lưới, 2020
NSLB NSLB NSLB NSLB NSLB NSLB NSLB
Chất CaCl2100 mM 12,0 b 11,9 b 14,2 a 16,6 a 13,4 16,9 14,6 kích CaCl2200 mM 13,7 b 12,9 b 9,8 b 12,1 b 16,1 17,7 13,2 kháng CaCl2300 mM 13,4 b 12,6 b 8,8 b 12,0 b 13,1 17,2 13,0
Cách xử Nhúng 13,6 13,3 12,2 14,0 14,8 17,9 13,8 lý (B) Phun 13,9 13,6 11,8 14,6 14,5 16,9 13,6
F B ns ns ns ns ns ns ns
Ghi chú: các số trong cột có cùng ký tự theo sau thì không khác biệt qua phân tích thống kê ở Duncan 5%,
**:khác biệt ý nghĩa 1%, ns: không khác biệt ý nghĩa, SA: salicylic acid, nhúng: nhúng gốc vào chất kích kháng, phun: phun chất kích kháng lên lá
Nhưvậy,việcxửlýCaCl2hoặcSAcóhiệuquảgiảmbệnhthánthưtrêncâyhành lá.Trongđó,CaCl2200mMhoặcSA2mMcóảnhhưởnggiảmtỷlệbệnhđến13NSLBvàchỉ số bệnh đến 11 NSLB Hiệu quả giảm bệnh của các nghiệm thức xử lý chấtkích kháng kéo dài đến 13NSLB,đạt hiệu quả giảm tỷ lệ trung bình từ 11,3% đến 22,7% so với đối chứng Mặt khác, các chất kích kháng này cũng có hiệu quả giảm bệnh tương đương nhau khi xử lý bằng cách nhúng gốc hoặc phun lên lá.
Như vậy, CaCl2200 mM, SA 2 mM và phương pháp phun hóa chất kích khángqua lá được chọn để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo.
Bảng4.6.Hiệuquảgiảmbệnhthánthư(%)trênhànhlásaukhixửlýCaCl 2 vàSAtrongđiều kiện nhà lưới,2020.
Chấtkích CaCl2100mM 32,1 ab 36,5 a 8,7 b 13,1 b 22,4 a 7,9 NSLB3,7 bc kháng(A) CaCl2200mM 22,6 ab 31,3 a 37,2 a 34,1 a 9,8 b 5,8 11,5 ab
CaCl2300 mM 24,5 ab 32,9 a 43,5 a 34,7 a 21,1 a 6,4 13,4 ab SA1mM 24,7 ab 35,9 a 4,2 bc 10,0 b 13,1 ab 2,9 4,6 a-c
SA 4 mM 34,2 a 32,0 a 35,3 a 33,9 a 15,0 ab 7,0 9,1 ab Đối chứng 0,0 c 0,0 b 0,0 c 0,0 c 0,0 c 0,0 0,0 c
Cách xử Nhúng 24,0 29,5 23,8 23,7 12,3 3,9 7,8 lý (B) Phun 20,8 27,5 23,5 22,6 16,5 5,4 8,5
F B ns ns ns ns ns ns ns
Ghichú:các sốtrongcột cócùngkýtựtheosauthì khôngkhác biệt quaphântíchthốngkêởDuncan5%,sốliệuđược chuyển sang√𝑥trước khi xử lý, **: khác biệt ý nghĩa1%,*: khác biệt ý nghĩa5%,ns: không khác biệt ýnghĩa, SA: salicylic acid, nhúng: nhúng gốc vào chất kích kháng, phun: phun chất kích kháng lênlá
4.2.3 Hiệuquảhạn chế bệnh thán thư và gia tăng năng suất khi sử dụng CaCl 2 vàSA với các tần suất khác nhau ở điều kiện nhàlưới.
4.2.3.1 Ảnh hưởng của số lần phun calcium chloride hoặc salicylic acid đến tỷ lệ bệnh và chỉ số bệnh thánthư. Ở thời điểm lây nhiễm bệnh nhân tạo (0NSLB), không có vết bệnh thán thư trên các cây hành thí nghiệm (số liệu không được trình bày) Kết quả cho thấy tỷ lệ bệnhvàchỉsốbệnhởcácnghiệmthứcphunCaCl 2h o ặc SAthấptươngđươngnhauvàthấphơnso với đối chứng, tác động kéo dài đến 42NSLB (Bảng 4.7và4.8).
Bảng 4.7 Tỷ lệ bệnh thán thư (%) khi phun các chất CaCl 2 và SA lên cây hành lá trongđiều kiện nhà lưới, 2020-2021.
NSLB NSLB NSLB NSLB NSLB NSLB NSLB NSLB
Chất kích CaCl 2 200 mM 11,68 b 14,00 b 16,87 b 18,78 b 21,73 b 25,16 b 26,42 b 26,69 b kháng SA 2 mM 11,86 b 13,47 c 16,95 b 19,22 b 21,96 b 25,00 b 26,69 b 27,12 b
Số lần 2 lần 14,03 15,99 b 18,66 b 20,68 b 25,77 a 27,73 a 27,84 a 28,18 a phun (B) 3 lần 13,82 15,99 b 17,92 c 20,14 b 22,15 b 25,26 b 27,67 a 28,05 a
Ghi chú: các số trong cột có cùng ký tự theo sau thì không khác biệt qua phân tích thống kê ở Duncan 5%,
**:khác biệt ý nghĩa 1%, ns: không khác biệt ý nghĩa, SA: salicylic acid
Ghi nhậnvềtỷ lệ bệnh khi phun 2 lần thì thấp hơn phun 1 lầnvàkéo dài đến22NSLB,phun3lầnkéodàiđến32NSLB,phun4lầnkéodàiđến42NSLB.PhunCaCl 2 200mMđ ạthiệuquảtrungbìnhvềgiảmchỉsốbệnhlà27,3%;trongkhiởnghiệmthức phun SA 2mMcũng đạt 27,2% (Bảng 4.9) Hiệu quả của các chất kích kháng khi phun 2, 3 hoặc 4 lần giúp giảm chỉ số bệnh đến42NSLB.
Bảng 4.8 Chỉ số bệnh thán thư (%) khi phun các chất CaCl 2 và SA lên cây hành lá trongđiều kiện nhà lưới, 2020-2021.
NSLB NSLB NSLB NSLB NSLB NSLB NSLB NSLB
Chất kích CaCl 2 200 mM 2,33 b 3,00 b 4,38 b 4,87 c 6,36 b 7,73 b 8,42 b 8,63 b kháng SA 2 mM 2,34 b 2,92 b 4,40 b 5,15 b 6,35 b 7,65 b 8,39 b 8,62 b
Số lần 2 lần 3,12 3,78 bc 5,29 b 5,95 b 7,70 b 8,75 b 8,84 b 9,06 b phun (B) 3 lần 3,01 3,86 b 5,17 b 5,40 c 6,36 c 7,67 c 8,89 b 9,12 ab
Ghi chú: các số trong cột có cùng ký tự theo sau thì không khác biệt qua phân tích thống kê ở Duncan 5%,
**:khác biệt ý nghĩa 1%, ns: không khác biệt ý nghĩa, SA: salicylic acid
Bảng 4.9 Hiệu quả giảm bệnh (%) thán thư sau khi phun CaCl 2 và SA lên cây hành látrong điều kiện nhà lưới, 2020-2021.
NSLB NSLB NSLB NSLB NSLB NSLB NSLB NSLB
Chất kích CaCl 2 200 mM 23,1 a 22,3 a 23,1 a 26,2 a 14,9 a 10,9 a 7,3 a 7,1 a kháng SA 2 mM 22,7 a 24,3 a 22,6 a 21,9 b 13,0 a 9,0 a 5,0 a 4,9 a
Số lần 2 lần 12,2 17,4 b 18,2 a 14,8 c 1,4 c 0,3 c 1,8 b 1,4 b phun (B) 3 lần 16,3 16,5 b 21,3 a 22,6 b 14,5 b 9,3 b 0,8 b 1,0 b
Ghichú:các sốtrongcột cócùngkýtựtheosauthì khôngkhác biệt quaphântíchthốngkêởDuncan5%,sốliệuđược chuyển sang√𝑥trước khi xử lý, **: khác biệt ý nghĩa1%,ns: không khác biệt ý nghĩa, SA: salicylicacid
Bảng 4.10 thể hiện sự biến động của tỷ lệ bệnhvàchỉ số bệnh theo số lần phuncủa các chất kích kháng CaCl 2 hoặc SA Ở trung bình tỷ lệ bệnh cho thấy, phunCaCl21 lần có tỷ lệ bệnh thấp hơn phunSA1 lần, phun CaCl22 hoặc 3 lần tương đương với tỷ lệ bệnh ở phunSA2 hoặc 3 lần, phun CaCl24 lần có tỷ lệ bệnh thấp hơn phunSA4 lần Về trung bình chỉ số bệnh, cho kết quả tương đương nhau giữa CaCl2vàSA vớicùng số lần phun, đặc biệt khi tăng số lần phun thì chỉ số bệnh càng giảm Về chất kíchkhángCaCl 2 ,phun1lầngiúpgiảmtỷlệbệnhđến17NSLB,phun2-3lầngiúptỷlệbệnh giảm đến42NSLB Đặc biệt, phun CaCl24 lần giúp giảm tỷ lệ bệnh thấp hơn so vớiphun 2-3 lầnvàkéo dài đến 42NSLB,mứcđộ bệnh thấp hơn 31,9% so với đối chứng Đối với chất kích kháng SA, phun 1 lần kéo dài hiệu quả giảm tỷ lệ bệnh đến17NSLB, phun 2 lần kéo dài đến 27NSLB, phun 3-4 lần giúp giảm tỷ lệ bệnh đến 42NSLB nhưng phun 4 lần thì tỷ lệ bệnh thấp hơn phun 3 lần từ ngày 22NSLB trở đi.
Bảng 4.10 Tỷ lệ bệnh (%) và chỉ số bệnh (%) thán thư khi thay đổi số lần phun các chấtCaCl 2 và SA lên cây hành lá trong điều kiện nhà lưới, 2020 – 2021.
Tổhợp Tỷ lệ bệnh (%) nghiệm thức 7 12 17 22 27 32 37 42
NSLB NSLB NSLB NSLB NSLB NSLB NSLB NSLB
CaCl 2 200 mM–1 lần 11,84 bc 16,44 b 22,06 b 25,58 a 25,73 b 28,17 a 28,48 a 28,74 ab CaCl 2 200 mM–2 lần 11,81 bc 13,56 d 16,54 c 18,11 b 25,42 b 27,36 a 27,36 b 27,69 bc CaCl 2 200 mM–3 lần 11,64 bc 13,92 d 14,76 d 16,60 c 19,25 c 23,02 c 27,17 b 27,33 c CaCl 2 200 mM–4 lần 11,44 bc 12,08 e 14,12 d 14,82 d 16,51 d 22,10 c 22,65 d 23,02 d
SA 2 mM–3 lần 11,83 bc 12,61 e 15,24 d 17,59 bc 19,98 c 24,39 b 27,16 b 27,57 c
SA 2 mM–4 lần 11,97 bc 12,32 e 15,02 d 15,35 d 17,17 d 20,69 d 24,11 c 24,46 d Đối chứng 17,95 a 21,16 a 23,19 a 25,46 a 26,95 a 28,37 a 28,60 a 28,97 a
CaCl 2 200 mM–1 lần 2,10 b 3,49 b 6,09 b 7,58 b 7,90 b 9,31 a 9,53 a 9,75 a CaCl 2 200 mM–2 lần 2,45 b 2,92 c 3,93 c 4,50 d 7,54 b 8,65 bc 8,65 c 8,90 b CaCl 2 200 mM–3 lần 2,29 b 3,02 c 3,70 c 3,67 e 5,32 de 6,74 e 8,91 a-c 9,06 ab CaCl 2 200 mM–4 lần 2,46 b 2,56 d 3,78 c 3,72 e 4,67 f 6,21 e 6,58 e 6,80 d
SA 2 mM–1 lần 2,33 b 3,56 b 5,95 b 7,63 b 7,75 b 8,67 bc 8,80 bc 9,02 ab
SA 2 mM–4 lần 2,26 b 2,57 d 3,75 c 3,58 e 4,94 ef 6,19 e 7,59 d 7,79 c Đối chứng 4,41 a 5,66 a 7,72 a 8,27 a 8,53 a 9,22 ab 9,40 ab 9,67 a
Ghi chú: các số trong cột có cùng ký tự theo sau thì không khác biệt qua phân tích thống kê ở Duncan 5%,
**:khác biệt mức ý nghĩa 1%; SA: salicylic acid
Bảng 4.11 Hiệu quả giảm bệnh (%) thán thư khi thay đổi số lần phun các chất
CaCl 2 vàSA lên cây hành lá trong điều kiện nhà lưới, 2020 – 2021.
Tổ hợp nghiệm 7 12 17 22 27 32 37 42 thức NSLB NSLB NSLB NSLB NSLB NSLB NSLB NSLB
CaCl2200 mM–1 lần 30,5 a 9,5 c 0,0 b 0,0 d 0,0 e 0,8 d 1,4 cd 1,1 c CaCl2200 mM–2 lần 19,0 b 24,3 b 28,5 a 26,1 b 0,7 e 0,7 d 2,8 cd 2,4 c CaCl2200 mM–3 lần 24,1 ab 21,7 b 32,7 a 39,8 a 24,9 b 17,7 b 0,4 cd 0,8 c CaCl2200 mM–4 lần 18,7 b 33,7 a 31,2 a 39,0 a 34,1 a 24,2 a 24,7 a 24,2 a
SA 2 mM–1 lần 22,9 ab 7,8 c 1,1 b 0,0 d 0,0 e 1,3 d 2,4 cd 2,0 c
SA 2 mM–3 lần 24,8 ab 27,9 ab 31,1 a 27,9 b 18,5 c 10,1 c 2,0 cd 2,4 c
SA 2 mM–4 lần 25,4 ab 33,4 a 31,8 a 41,3 a 30,2 ab 24,5 a 13,2 b 13,2 b Đối chứng 0,0 c 0,0 d 0,0 b 0,0 d 0,0 e 0,0 d 0,0 d 0,0 c
Ghi chú: các số trong cột có cùng ký tự theo sau thì không khác biệt qua phân tích thống kê ở Duncan 5%,
**:khác biệt mức ý nghĩa 1%; SA: salicylic acid
Bảng 4.11 cho thấy hiệu quả về giảm chỉ số bệnh của phun CaCl21-2 lần giảm thấp đến 27NSLB, phun CaCl23 lần giảm đến 32NSLB, còn phun CaCl24 lần kéo dài đến 42NSLB,mứcđộ giảm chỉ số bệnh trung bình đạt 41,5% Mặt khác, phunSA1lần giảm chỉ số bệnh đến 27NSLB, nhưng tăng số lần phunSAlên 2-4 lần thì chỉ số bệnh giảmđến42NSLB,mứcđộ giảmchỉsốbệnhtrungbình đạttừ25,3%đến38,5%so vớiđối chứng Do đó, việc phun chất kích kháng CaCl2hoặc SA 4 lần sẽ giúp quản lýbệnhthán thư hành lá tốthơn.
4.2.3.2 Ảnh hưởng của số lần phun calcium chloride hoặc salicylic acid đến năng suất hànhlá.
Việc gia tăng số lần phun CaCl2200mMhoặc SA 2mMgiúp gia tăng tổngkhốilượngthuhoạchvàkhốilượngthươngphẩmhànhlá.TrongđóphunSA2mMchotổngkhối lượng thu hoạchvàkhối lượng thương phẩm cao hơn CaCl2200mM.
Bảng 4.12 Năng suất hànhlá(g/chậu) theo số lần phun chất CaCl 2 và SA trong điều kiệnnhà lưới, 2021.
Tổ hợp nghiệm thức Tổng khối lượng thu hoạch
SA 2 mM–4 lần 340,8 a 319,0 a Đối chứng 217,0 e 179,6 f
Ghi chú: các số trong cột có cùng ký tự theo sau thì không khác biệt qua phân tích thống kê ở Duncan 5%,
Ngoài ra, phun CaCl22 lần có năng suất tương đương với phun CaCl23 lần, cao hơn khi chỉ phun CaCl21 lần, nhưng thấp hơn phun CaCl24 lần Phun 4 lần chất SA2mM cho tổng khối lượng thu hoạch và khối lượng thương phẩm cao nhất so với các nghiệm thức còn lại (Bảng 4.12) Kết quả này cho thấy phun chất kích kháng giúp làm giảm bệnh thán thư nhưng nếu không phun nhắc lại sẽ làm cây hành lá vẫn nhiễm bệnh nhiều, cây có nhiều vết bệnh hơn, lá thải loại nhiều hơn nên khối lượng thương phẩm đạt được thấp.
4.2.4 Hiệuquảquảnlýbệnhthánthưvàmộtsốbệnhhạichínhkháctrêncâyhành lá của calcium chloride hoặc salicylic acid ở điều kiện ngoàiđồng.
4.2.4.1 Hiệu quả của các chất kích kháng đối với các bệnh chính trên cây hành lá tại Bình Tân, VĩnhLong Đối với bệnh thán thư, phun 2 chất kích kháng CaCl2200mM vàSA2mMgiúpgiảmtỷlệbệnhvàchỉsốbệnhtrêncâyhànhlá(Bảng4.13và4.14).Hiệuquảgiảmbệnh trung bình tương đương nhau, đạt từ 53,7 - 57,1% (Bảng 4.15) Nghiệm thức sử dụng thuốchóahọcđểphòngtrịbệnhthánthưcủanôngdânvẫnmanglạihiệuquảgiảmbệnh caonhất(71,2%).Điềunàycóthểlý giảidonôngdânvẫnưachuộngsửdụngthuốctrừ bệnhhóahọctrongsảnxuấthànhlá(LêThịTrúcPhương&DươngNgọcThành,2019).
Bảng 4.13 Tỷ lệ bệnh thán thư (%) khi phun chất kích kháng ở các thời điểm 15-55 NST tại Bình Tân, Vĩnh Long
Nghiệm thức 15NST 25NST 35NST 45NST 55NST AUDPC
Xử lý theo nông dân 15,0 17,6 c 16,9 c 19,7 c 11,8 d 677,0 c Đối chứng 14,9 39,6 a 48,6 a 53,0 a 54,1 a 1757,0 a
Ghi chú: Các số trong cùng một cột có cùng kí tự theo sau thì không khác biệt qua phân tích thống kê ở
Duncan5%, **: khác biệt mức ý nghĩa 1%; ns: không khác biệt ý nghĩa
Bảng 4.14 Chỉ số bệnh thán thư (%) khi phun chất kích kháng tại các thời điểm 15-55 NST tại Bình Tân, tỉnh Vĩnh Long
Nghiệm thức 15NST 25NST 35NST 45NST 55NST
Xử lý theo nông dân 3,5 4,6 b 4,6 c 4,9 c 2,4 c Đối chứng 3,6 10,8 a 19,0 a 21,3 a 22,1 a
Ghi chú: Các số trong cùng một cột có cùng kí tự theo sau thì không khác biệt qua phân tích thống kê ở
Duncan5%, **: khác biệt mức ý nghĩa 1%; ns: không khác biệt ý nghĩa
Bảng 4.15 Hiệu quả giảm bệnh (%) thán thư khi phun chất kích kháng tại các thời điểm 15-55 NST tại Bình Tân, tỉnh Vĩnh Long
Nghiệm thức 25NST 35NST 45NST 55NST TB
Xử lý theo nông dân 51,7 73,8 74,0 a 88,4 a 71,2 a
Ghi chú: Các số trong cùng một cột có cùng kí tự theo sau thì không khác biệt qua phân tích thống kê ở
Duncan5%, **: khác biệt mức ý nghĩa 1%; ns: không khác biệt ý nghĩa Đối với bệnh cháy lá dovikhuẩnXanthomonas, phun chất kích kháng CaCl2hoặc
Nội dung 3 Kết quảvềkhảo sát cơ chế kích kháng của CaCl 2và SA
4.3.1 Khảo sát phản ứng phát sáng của tế bàokýchủ khi đượcxửlý với CaCl 2 vàSA
Kết quả ghi nhận tại thời điểm 24 GSLB, nghiệm thức SA và CaCl2có dấu hiệuphát sáng tế bào, nhưng chỉ có nghiệm thức SA có tỷ lệ đĩa áp tạo phát sáng tế bào(1,50%), số vách tế bào phát sáng/đĩa áp (1,08 tế bào); tỷ lệ đĩa áp tạo phát sáng tế bào mức + (91,67%) cao hơn khác biệt có ý nghĩa so với các nghiệm thức còn lại (Bảng4.24). Đếnthờiđiểm36GSLB,đĩaáptạophảnứngphátsángxuấthiệnđềuởtấtcảcácnghiệm thức (Bảng 4.25) Đặc biệt, nghiệm thức CaCl2đã có sự gia tăng nhanh chóngvềtỷlệđĩaáptạophátsángtếbào,đạt5,25%,tươngđươngvớinghiệmthứcSA(6,00%)vàcao hơn nghiệm thức đối chứng (3,00%) Về số vách tế bào phát sáng, nghiệm thức SA đạt 3,75 tế bào/đĩa áp, cao hơn khác biệtcóý nghĩa so với nghiệm thức đối chứng Ở thời điểm này, các nghiệm thức đều cómứcđộ phát sáng của tế bào hầu hết ởmức+vàtương đương nhau giữa các nghiệm thức.
Bảng 4.24 Phản ứng phát sáng của tế bào lá hành khi chủng nấm Colletotrichumgloeosporioides tại thời điểm 24 GSLB
Nghiệm thức Tỷ lệ đĩa áp tạo phát sáng tế bào (%)
Số vách tế bào phát sáng/đĩa áp
Tỷ lệ đĩa áp tạo phát sáng tế bào mức + (%)
Ghi chú: các số trong cùng một cột có cùng kí tự theo sau thì không khác biệt qua phân tích thống kê ở Duncan5%,; Số liệu được chuyển sang√𝑥, logx khi xử lý thống kê, **: khác biệt mức ý nghĩa 1%
Bảng 4.25 Phản ứng phát sáng của tế bào lá hành khi chủng nấm Colletotrichumgloeosporioides tại thời điểm 36 GSLB.
Nghiệm thức Tỷ lệ đĩa áp tạo phát sáng tế bào (%)
Số vách tế bào phát sáng/đĩa áp
Tỷ lệ đĩa áp tạo phát sáng tế bào mức + (%)
CaCl2200 mM 5,25 a 2,65 ab 70,60 Đối chứng 3,00 b 1,40 b 64,58
Ghi chú: các số trong cùng một cột có cùng kí tự theo sau thì không khác biệt qua phân tích thống kê ở Duncan5%,; Số liệu được chuyển sang√𝑥, logx khi xử lý thống kê, *: khác biệt mức ý nghĩa 5%, ns: không khác biệt ýnghĩa
Bảng 4.26 Phản ứng phát sáng của tế bào lá hành khi chủng nấm Colletotrichumgloeosporioides tại thời điểm 48 GSLB.
Nghiệm thức Tỷ lệ đĩa áp tạo phát sáng tế bào (%)
Số vách tế bào phát sáng/đĩa áp
Tỷ lệ đĩa áp tạo phát sáng tế bào mức ++ (%)
Ghi chú: các số trong cùng một cột có cùng kí tự theo sau thì không khác biệt qua phân tích thống kê ở Duncan5%,; Số liệu được chuyển sang√𝑥, logx khi xử lý thống kê, **: khác biệt mức ý nghĩa 1%, ns: không khác biệt ýnghĩa Ở thời điểm 48 GSLB, tỷ lệ đĩa áp tạo phát sáng tế bào ở cả hai nghiệm thức cóxử lý kích kháng đều cao hơn nghiệm thức đối chứng, lần lượt đạt 15,50% ở
CaCl2,14,75% ở SA và 7,25% ở nghiệm thức đối chứng nhưng số vách tế bào phát sáng/đĩa a b c áp;mứcđộ phát sáng của tế bào ởmức++ tương đương nhau ở các nghiệm thức (Bảng 4.26)
Hình4.8Sựphátsángtếbào(a),phátsángtếbàothịtlá(b)ởthờiđiểm48GSLBvàphát sáng tế bào mức ++ Ởthờiđiểm72GSLB,nghiệmthứccóxửlýCaCl2vàSAcótỷlệđĩaáptạophátsáng tế bào tương đương nhau, lần lượt là 13,25%và14,00%, cao hơn so với nghiệmthức đối chứng (8,00%) Đồng thời, nghiệm thức xử lý CaCl2có tỷ lệ đĩa áp tạo phảnứng phát sáng tế bào ++ cao nhất.Sốlượng vách tế bào phát sáng ở các nghiệm thức đều không khác biệt nhau (Bảng4.27).
Bảng 4.27 Phản ứng phát sáng của tế bào lá hành khi chủng nấm Colletotrichumgloeosporioides tại thời điểm 72 GSLB
Nghiệm thức Tỷ lệ đĩa áp tạo phát sáng tế bào (%)
Số vách tế bào phát sáng/đĩa áp
Tỷ lệ đĩa áp tạo phát sáng tế bào mức ++ (%)
Ghi chú: các số trong cùng một cột có cùng kí tự theo sau thì không khác biệt qua phân tích thống kê ở Duncan5%,; Số liệu được chuyển sang√𝑥, logx khi xử lý thống kê, **: khác biệt mức ý nghĩa 1%, ns: không khác biệt ýnghĩa
Nhưvậy,ởthờiđiểm24GSLB,khảnăngkíchthíchtínhkhángcủaSAtrongcâyhành lá thể hiện sớm Đến thời điểm 36, 48 và 72 GSLB, cả hai hóa chất SAvàCaCl2đều có khả năng kích kháng thể hiện qua sự gia tăng phát sáng tế bào (Hình 4.8) Kết quả tương tự được ghi nhận bởi Huỳnh Minh Châu (2003); Nguyễn Hồng Tín (2005) khi xử lý kích kháng trên cây lúa để chống lại bệnh cháy lá do nấmPyricularia griseagây ra;vàtương tự bởi Trần Thị Thu Thủy & Phạm Văn Kim (2016) khi xử lý kích kháng trên cây cà chuavàtrên cây dưa leo để chống lại bệnh thán thư do nấmColletotrichumsp.vànấmC. lagenariumgâyra. Ở thời điểm 96 GSLB, nghiệm thức xử lý CaCl2,SAtiếp tục gia tăng sự phát sáng tế bào Trong đó, CaCl2có tỷ lệ đĩa áp tạo phát sáng tế bào; tỷ lệ đĩa áp tạo phátsáng tế bàomức++ lần lượt là 19,25%và17,65%, cao hơn khác biệt có ý nghĩa so với nghiệm thức xử lý SA (16,75%và11,76%)vànghiệm thức đối chứng (9,75% và1,47%).Khôngcósựkhácbiệtvềsốváchtếbàophátsáng/đĩaápởcácnghiệmthứccó kích khángvàkhông kích kháng (Bảng 4.28) Đặc biệt, cũng tại thời điểm này tỷ lệđĩa áp tạo phát sáng tế bào thịt lá và diện tích phát sáng ở các nghiệm thức có xử lý kích kháng đều thấp hơn so với nghiệm thức đối chứng.
Bảng 4.28 Phản ứng phát sáng của tế bào lá hành khi chủng nấm Colletotrichumgloeosporioides tại thời điểm 96 GSLB
Nghiệm thức Tỷlệđĩa áp tạo phátsáng tếbào(%)
Số vách tế bào phát sáng/đĩa áp
Tỷlệđĩa áp tạo phátsáng tếbào thịtlá
Diện tích phát sáng/đĩa áp (àm 2 )
Tỷlệđĩa áp tạo phátsáng tếbàomức++
Ghi chú: các số trong cùng một cột có cùng kí tự theo sau thì không khác biệt qua phân tích thống kê ở Duncan5%,; Số liệu được chuyển sang√𝑥, logx khi xử lý thống kê, **: khác biệt mức ý nghĩa 1%, ns: không khác biệt ýnghĩa
Kết quả thí nghiệm còn ghi nhận tại thời điểm này có sự hình thành vết bệnh ở nghiệm thức đối chứng, đĩa đài hình thành trên bề mặt lá hành với nhiều gai cứng màu nâukhiquansátdướikínhhiểnvi.ĐâycóthểlàlúcnấmColletotrichumchuyểntừgiai đoạn sinh dưỡng (biotroph) sang giai đoạn hoại dưỡng (necrotroph) Kết quả tương tự cũngđãđượcghinhậnbởiSonghaietal.(2001)vàLatunde-Dada&Lucas(2007).Theo Kumaret al. (2002), giai đoạn phát triển ở dạng hoại dưỡng (necrotroph) đượcmôtả bằng sự tấn công vàomôtế bào thịt lávàlàm chết tế bàokýchủ, tế bào chết sẽ tự phát sángmàu vàngkhiquansátdướitiaUV.Điềukiệnquyếtđịnhchosựxâmnhiễmthành côngcủanấmbệnhthuộcloạibánsinhdưỡng(hemibiotroph)tronggiaiđoạnpháttriển ở dạng hoại dưỡng (necrotroph) là phụ thuộc vào sự chết của tế bào câykýchủ, tế bào chết sẽ cung cấp dinh dưỡngvànơi ở cho mầm bệnh để có thể phát triểnvàlây lan Do đó, sự phát sáng tế bào thịt lá, diện tích phát sángvàmức độ phát sáng ở giai đoạn saulại liên đến sự phát triển của bệnh Như vậy, đến thời điểm 96 GSLB thì SAvàCaCl2vẫn cho hiệu quả kích kháng thể hiện qua tỷ lệ đĩa áp tạo phản ứng phát sáng tếbào. Đến thời điểm 120 GSLB, tỷ lệ đĩa áp tạo phản ứng phát sáng tế bào ở nghiệmthức xử lý CaCl 2 , SA tiếp tục ởmứccao (20,00%và17,50%), khác biệt so với nghiệmthứcđốichứng(14,50%).Sốváchtếbàophátsángvàmứcđộphátsángtếbào++ởcác nghiệmthứcxửlý kích khángvàđốichứngđềutươngđươngnhau.Tuynhiên,tỷlệđĩa áptạophátsángtếbàothịtlávàdiệntíchphátsángởnghiệmthứcxửlýkíchkhángđều thấp hơn đối chứng (Bảng4.29).
Cho đến thời điểm 144 GSLB, chỉ có nghiệm thức xử lý SA có tỷ lệ đĩa áp tạo phát sáng tế bào cao.Sốvách tế bào phát sáng ở hai nghiệm thức xử lý kích kháng đều không khác biệt so với nghiệm thức đối chứng Tại thời điểm này, tỷ lệ đĩa áp tạo phát sángtếbàothịtlá,diệntíchphátsángvàmứcđộphátsángởcácnghiệmthứcxửlýkích khángđềuthấphơnnghiệmthứcđốichứng(Bảng4.30).Tómlại,hóachấtSAchohiệu quả kích kháng sớm nhất, ở 24 GSLBvàkéo dài đến 144 GSLB,kếđến là hóac h ấ t
CaCl2, có hiệu quả kéo dài đến 120 GSLB thể hiện qua phần trăm đĩa áp tạo phát sángtế bào.
Bảng 4.29 Phản ứng phát sáng của tế bào lá hành khi chủng nấm Colletotrichumgloeosporioides tại thời điểm 120 GSLB
Nghiệm thức Tỷlệđĩaáp tạo phát sángtếbào
Số váchtế bào phát sáng/đĩaáp
Diện tích phát sáng/đĩa áp (àm 2 )
Tỷ lệ đĩa áp tạo phát sáng tế bào mức ++
Ghi chú: các số trong cùng một cột có cùng kí tự theo sau thì không khác biệt qua phân tích thống kê ở Duncan5%,; Số liệu được chuyển sang√𝑥, logx khi xử lý thống kê, **: khác biệt mức ý nghĩa 1%, ns: không khác biệt ýnghĩa
Bảng 4.30 Phản ứng phát sáng của tế bào lá hành khi chủng nấm Colletotrichumgloeosporioides tại thời điểm 144 GSLB
Nghiệm thức Tỷ lệ đĩa áp tạo phát sáng tế bào (%)
Số váchtế bào phát sáng/đĩaáp
Diện tích phát sáng/đĩa áp (àm 2 )
Tỷ lệ đĩa áp tạo phát sáng tế bào mức ++
Ghi chú: các số trong cùng một cột có cùng kí tự theo sau thì không khác biệt qua phân tích thống kê ở Duncan5%,; Số liệu được chuyển sang√𝑥, logx khi xử lý thống kê, **: khác biệt mức ý nghĩa 1%, ns: không khác biệt ýnghĩa
Sựphát sáng của vách tế bào được xem như là phản ứng tựvệcủa cây trồng đối với sự xâm nhiễm của mầm bệnh (Trần Thị Thu Thủy & Phạm Văn Kim, 2016)vìtế bào phát sáng phản ánh tế bào đang xảy ra phản ứng siêu nhạy cảm (Hypersensitive Reaction,HR)(Kogaetal.,1988;Jứrgensenetal.,1998).Phảnứngtựphỏtsỏngđơntế bào hoặc đatếbàocó thểdophản ứngsiêunhạycảmtạoradocáctíchlũynồngđộcaocác chất oxi hóa khử (H2O2, OH-, )vàcác hợp chất khác như phenol, lignin, callose.Những phản ứng này nhằm tiêu diệt mầm bệnh cũng như ngăn cản việc lấy dinh dưỡng từ cây chủ của mầm bệnh (Trần Thị Thu Thủy & Phạm Văn Kim, 2016) Ảnh hưởng của HR đối với mầm bệnh có thể có hại hoặc có lợi tùy thuộc vào loại mầm bệnh (Greenberg,1997).
Phản ứng siêu nhạy cảm là phản ứng tựvệcó hiệu quả của cây trồng đối với các mầmbệnhthuộcloạisinhdưỡng(biotroph)(Thordal-Christensenetal.,1997;Carveretal.,
1999),vídụ như nấmBlumeria graminis(Thordal- Christensenet al.,1 9 9 7 ;
Hückelhovenet al., 1999).Sựphát sáng của tế bào có thể ngăn cản hoàn toàn sự phát triển của nấm sinh dưỡng (biotrophic pathogens) (Aist & Israel, 1986; Kogaet al., 1988) Đối với mầm bệnh thuộc loại bán sinh dưỡng (hemibiotroph), giai đoạn đầu khi xâm nhiễm câykýchủ nấm tấn công ở dạng sinh dưỡng (biotroph) nên HR ở giai đoạn đầu sẽ ức chế sự phát triển của mầm bệnh, tuy nhiên ở giai đoạn sau khi nấm chuyển sang dạng hoại dưỡng (necrotroph), thì HR sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho nấm xâm nhiễm nhiều hơn (Aist & Israel, 1986; Tiedemann, 1997) Còn đối với loại nấm hoại dưỡng (necrotroph) nhưBotrytis cinereathì HR lại tương quan thuận với sự phát triển của mầm bệnh (Tiedemann, 1997; Govrin & Levine, 2000) Tuy nhiên, HR xảy ra sớmvànhanh ở giai đoạn đầu khi nấm xâm nhiễm cũng được ghi nhận có hiệu quả ức chế sựpháttriểnmầmbệnhhoạidưỡng(necrotroph)nhưnấmBotrytiscinereaởcâycàchuavàcây đậu (Ungeret al.,2005).